引用本文： 陸思芬, 魏小珍, 牟必琴, 胡瓊霞, 鄧竹君, 張文庚. 基于生物信息數據探究VCAN在食管鱗狀細胞癌預后中的作用. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2022, 29(8): 1031-1041. doi: 10.7507/1007-4848.202201072 復制
食管癌是世界上第八大最常見癌癥和第六大癌癥致死原因[1]。食管癌可以分為食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma， ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC），其中90%以上都是ESCC [2]。在亞洲，ESCC的發病率一直在顯著上升[3]。ESCC是目前侵襲性最強的鱗狀細胞癌之一，5年生存率低于20% [4]，因此，食管癌的早期預后監測對食管癌的治療具有重要意義。然而，盡管這些年在手術、放化療和生物治療等治療方案方面取得了進展，但ESCC的預后仍較差[5]。因此，為ESCC尋找新的治療分子靶點和預后監測生物標志物十分重要。
多功能蛋白聚糖（versican，VCAN），也被稱為CSPG2，是Aggrecan/Versican蛋白多糖家族的一員，它對腫瘤特異性細胞外基質的形成至關重要。VCAN可通過抑制腫瘤壞死因子信號通路介導的細胞凋亡促進腫瘤發生，通過刺激基質金屬蛋白酶表達促進腫瘤的侵襲轉移[6-7]。據研究[8-10]報道，VCAN與胃癌、乳腺癌和白血病等多種腫瘤細胞的增殖和轉移有很強的關聯。總之，VCAN可能與這些腫瘤的預后有關。然而，關于VCAN在ESCC預后中的研究卻較少。
本研究，同時基于RNA芯片數據和RNA高通量測序數據，通過相關的生物信息學軟件和數據庫進行綜合分析，旨在探討VCAN在ESCC預后中的作用，可為臨床醫生對ESCC治療提供初步指導。
1 材料與方法
1.1 數據收集
首先，從GEO數據庫（
表1
3個RNA芯片數據集中的樣本信息［例 /
］
1.2 差異表達基因分析
首先，采用XPN算法[16] 調整3個RNA芯片數據集之間可能的批次處理影響，分別合并所有ESCC組織的數據和癌旁正常組織的數據，將批次效應最小化。然后，基于合并后的358個ESCC組織和358個癌旁正常組織的表達量數據（去掉其中的lncRNAs和重復的mRNAs），采用R包“limma” [17]鑒定差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），并設定閾值為 |log2Fold-Change|≥2 和校正 P≤0.050[18]。log2Fold-Change>0 和 log2Fold-Change<0分別定義為上調差異表達基因和下調差異表達基因的閾值。
1.3 蛋白互作網絡和模塊分析
首先，采用數據庫STRING（
1.4 KEGG通路富集分析
采用KOBAS數據庫（
1.5 基因的表達量驗證和生存分析
首先，選擇來自TCGA 和GTEx 數據庫中的RNA高通量測序樣本（包括286個癌旁正常組織和182個 ESCC 組織）的表達量數據驗證被選基因的表達量，然后，采用數據庫Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA，
1.6 VCAN的腫瘤免疫學特性分析
采用數據庫The Tumor Immune Estimation Resource（TIMER，
1.7 構建VCAN和miRNAs的調控網絡
首先，基于TCGA數據庫的182個ESCC 組織和65個癌旁正常組織，采用R包“limma”[17] 分析差異表達的miRNAs（Differentially expressed miRNAs，DEmiRNAs），并設定閾值為：|log2Fold-Change|≥1 和校正 P≤0.050。然后，采用TargetScan（Release 7.2，
1.8 統計學分析
采用軟件 R（版本 4.0.3）進行統計和作圖。選擇乘積極限法（Kaplan-Meier，KM）對生存數據進行計算，選擇對數秩檢驗（log-rank test）做統計分析并計算P值，然后繪制生存曲線。P≤0.050 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 鑒定差異表達基因
首先，整理從GEO數據庫下載到的3個RNA芯片數據集的表達量數據，采用XPN算法調整合并3個數據集，得到358個 ESCC 組織和358個癌旁正常組織的表達量數據，去掉其中的lncRNAs和重復的mRNAs。然后，采用R包“limma”鑒定差異表達基因，并設定閾值為：|log2Fold-Change|≥2 和校正 P≤0.050。共鑒定出630個DEGs（圖1a），包括192個上調DEGs和438個下調差異表達基因，其中VCAN是一個上調差異表達基因。差異表達基因的結果表明ESCC腫瘤組織的基因表達與癌旁正常組織的基因表達明顯不同。
圖1
基于RNA芯片數據鑒定食管鱗狀細胞癌的差異表達基因和hub 基因
a：差異表達基因的火山圖（基于358個食管鱗狀細胞癌組織和358個癌旁正常組織的表達量數據）；b：蛋白互作網絡中的模塊1 ［分子復合體識別法（MCODE）score = 14.471，Nodes = 18 ］；c：蛋白互作網絡中的模塊2 （MCODE score=13.077，Nodes=14）；差異表達基因的閾值為： |log2Fold-Change|≥2 和校正
2.2 差異表達基因的蛋白互作網絡和模塊分析
首先，為了探究這些DEGs之間的交互關系，采用STRING數據庫分析上述630個DEGs的PPI網絡。我們構建出了一個包含629個節點和1 470條邊的PPI網絡。然后，采用MCODE 軟件分析該PPI網絡中的模塊，并選出結果排名最靠前的2個模塊（一共包括32個hub 基因），具體為：模塊1（MCODE score=14.471）包括18個hub 基因，模塊2 （MCODE score=13.077）包括14個hub 基因。這兩個模塊的PPI網絡圖見圖1b～c。
然后，進行這32個hub 基因的KEGG通路富集分析，結果顯示，它們主要富集于蛋白消化吸收、細胞外基質受體相互作用和松弛素信號通路（圖2）。據文獻 [18, 31-32]報道這些通路與癌癥的生存或進展有關，提示這些hub基因可能與ESCC的預后有關。
圖2
hub 基因的KEGG富集分析統計圖
Qvalue：校正
2.3 差異表達基因的表達量驗證和生存曲線分析
首先，使用TCGA 和 GTEx數據庫中的RNA高通量測序樣本（包括286個癌旁正常組織和182個 ESCC 組織）的表達量數據，驗證上面被挑選出來的32個hub 基因的表達量。結果發現，只有14個基因是差異表達的（P≤0.050），包括BUB1、CEP55、COL1A1、 COL1A2、COL3A1、COL5A1、ELN、LUM、MMP1、SPARC、SPP1、 TOP2A、TPX2 和 VCAN（圖3）。然后，分析這14個基因在ESCC中的生存曲線（圖4），結果發現只有5個基因的表達量越高它們對應的DFS越低，包括COL1A1 （P=0.046）、 COL1A2 （P=0.036）、 SPARC（P=0.023）、SPP1（P=0.001） 和VCAN （P=0.050），而其它基因的生存曲線不存在顯著性結果（P>0.050）。
圖3
用RNA高通量測序數據驗證hub 基因的表達量
與286個癌旁正常組織相比，只有 BUB1、CEP55、COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL5A1、ELN、LUM、MMP1、SPARC、SPP1、TOP2A、TPX2 和VCAN 在182個 ESCC組織中是顯著高表達的；紅色表示ESCC組織；黑色表示正常組織；顯著差異表達的條件：*
圖4
hub基因在ESCC中的生存分析曲線
a：COL1A1；b：COL1A2；c：SPARC；d：SPP1 和e：VCAN的高表達與ESCC的預后不良顯著有關（
另外，我們發現在之前的研究中，COL1A1、COL1A2、SPARC和SPP1已經被報道為ESCC的預后標志物 [33-34]，所以，本研究只選擇VCAN用于后續的分析，作為ESCC的候選預后標志物。
2.4 VCAN的KEGG通路富集分析
為了探索VCAN可能的分子功能，我們采用KOBAS數據庫進行VCAN的KEGG通路富集分析。結果發現，VCAN可以富集在細胞粘附分子通路（圖1），據文獻[35]報道該通路在調節免疫和腫瘤微環境中發揮重要作用。結果提示VCAN可能與ESCC的免疫環境有關。
2.5 分析VCAN在ESCC免疫環境中的作用
為了探索VCAN在ESCC免疫環境中的潛在作用，我們用TIMER數據庫分析VCAN與ESCC TIICs 之間的關系，因為有報道稱部分TIICs與ESCC的預后不良有關[36-37]。結果發現（圖5a），VCAN與ESCC中的巨噬細胞（macrophages）浸潤水平呈現正相關（R=0.576，P<0.001）， 而與其它的免疫細胞相關性很小，包括腫瘤純度、B 細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞（R<0.300， P>0.050），因為相關系數小于0.300被認為是可以忽略的相關[38]。因此，我們只重點關注VCAN與巨噬細胞的相關性。而且，據文獻[39]報道，巨噬細胞有兩種不同的表型，包括抑制腫瘤的M1表型和支持腫瘤的M2表型。Nitric oxide synthase 2 （NOS2）、 interferon regulatory factor 5（IRF5）和prostaglandin-endoperoxide synthase 2（PTGS2）是M1的基因標志物，而CD163 molecule（CD163）、V-set and immunoglobulin domain–containing 4 （VSIG4） 和membrane spanning 4-domains A4A （MS4A4A）是M2的基因標志物。我們分析了VCAN和這些基因標志物之間的關系。結果發現，VCAN的表達量與CD163 （R=0.481，P<0.001），VSIG4（R=0.526，P<0.001），MS4A4A（R= 0.520，P<0.001）的豐度呈現顯著正相關的關系，它們均為M2巨噬細胞的標志物（圖5b）；而VCAN與NOS2、IRF5和PTGS2豐度的相關性可以忽略不計（R<0.300），這些都是M1巨噬細胞的標志物（圖5c）。而且，腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated mecrophages TAMs）可以分化為M2表型，并促進疾病的進展，有文獻[37]稱浸潤性CD204+ TAMs的升高與ESCC的預后不良相關。因此，我們也分析了VCAN與CD204豐度的相關性，結果發現，VCAN的豐度與CD204的豐度呈現正相關（圖5d， R=0.621， P<0.001）。這些結果提示VCAN確實可以在ESCC的免疫環境中發揮作用，主要表現為VCAN的表達量與M2巨噬細胞及其基因標志物的豐度顯著正相關。
圖5
食管鱗狀細胞癌中VCAN的豐度和TIICs的豐度的關系
a：VCAN的豐度與B 細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞之間的Spearman相關性分析圖；VCAN的豐度和巨噬細胞的基因標志物的豐度之間的關系；b：M2的基因標志物；c：M1的基因標志物；d：與TAMs有關的CD204；TIICs：腫瘤浸潤性免疫細胞；TAMs：腫瘤相關巨噬細胞；相關性顯著的閾值為
2.6 構建ESCC中VCAN與miRNAs的調控網絡
接下來，我們評估了ESCC中VCAN與miRNAs相互作用的潛力，因為有一些miRNAs與ESCC的發展和進展相關，例如has-miR-135b-5p[40]。首先，使用TCGA-ESCC隊列中的182個ESCC樣本和65個正常樣本的miRNAs數據鑒定出64個上調差異表達和21個下調差異表達的DEmiRNAs（圖6a）。然后，基于ESCC中的miRNAs數據，采用Targetscan軟件預測出24個能夠靶向VCAN的miRNAs （圖6b），同時采用miRDB軟件預測出74個能夠靶向VCAN的miRNAs（圖6b），取交集后得到15個miRNAs（圖6b）。這15個miRNAs用于構建miRNAs和VCAN的調控網絡（圖6c），其中hsa-mir-135b 是ESCC中的上調差異表達DEmiRNA。這些結果表明VCAN可以與ESCC中的miRNAs相互作用，其中有些miRNAs與ESCC的預后有關。
圖6
食管鱗狀細胞癌中VCAN與miRNAs之間的關系
a：食管鱗狀細胞癌中的上調差異表達和下調差異表達miRNAs；b：Targetscan和miRDB軟件預測得到的能夠靶向VCAN的miRNAs；c：食管鱗狀細胞癌中VCAN和miRNAs的調控網絡，其中has-mir-135b可能與食管鱗狀細胞癌的進展相關
3 討論
由于ESCC的高發病率和低生存率，尋找新的預后標志物和有效靶點是迫切需要的[10]。VCAN已被報道與幾種腫瘤的預后有關[8-10]，然而VCAN在ESCC預后中的作用尚未見明確報道。本研究基于3個RNA芯片數據集的358個 ESCC 組織和358個癌旁正常組織的表達量數據，鑒定出630個DEGs和32個hub基因，然后使用182個 ESCC 組織和286個癌旁正常組織的RNA高通量測序的表達量數據對這32個hub基因的表達量進行驗證，結果發現只有14個hub基因差異表達，這14個基因的生存曲線分析結果顯示，只有COL1A1、COL1A2、SPARC、SPP1 和 VCAN 跟ESCC的預后顯著相關，直接提示VCAN在ESCC預后中的作用。有趣的是，我們通過綜合分析發現，VCAN的豐度與M2巨噬細胞及其基因標志物的豐度顯著正相關，其中有一些M2巨噬細胞的基因標志物與ESCC的預后相關；并且VCAN可以被 ESCC中的miRNAs調控，其中有一些miRNAs與ESCC的進展相關，這些結果間接提示VCAN在ESCC預后中的作用。
本研究的結果表明，與癌旁正常組織相比，VCAN在ESCC組織中明顯高表達，且VCAN的高表達可以導致ESCC的DFS顯著縮短，直接提示VCAN在ESCC預后中的作用。這些結果與之前關于VCAN在ESCC組織間質細胞中高表達的研究基本一致，主要原因為VCAN與侵襲、淋巴結轉移、淋巴管及靜脈浸潤陽性密切相關[41]。
KEGG通路富集分析結果表明VCAN在Cell adhesion molecules中富集，而且據文獻[35]報道該通路可以在調節免疫和腫瘤微環境中發揮關鍵作用，這提示VCAN可能與ESCC的免疫環境有關。同時，以往研究[36-37]已經認識到一些免疫相關的TIICs在預測ESCC不良預后方面的關鍵作用，因此，我們分析VCAN與TIICs之間的關系，以間接考察VCAN對ESCC預后的影響。結果發現，VCAN的豐度與M2巨噬細胞的豐度顯著正相關，而與其它TIICs細胞（B 細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞）相關性不大；同時VCAN的表達與CD163和CD204的表達顯著正相關。據文獻[42]報道，在腫瘤組織中，巨噬細胞可表現為M1表型和M2表型，M2表型占70%以上；M1表型是腫瘤抑制型，而M2表型是腫瘤支持型，與癌癥的預后不良有關。另外，據文獻[36]報道，CD163+ M2的高密度可能是ESCC的獨立預后不良因素。此外，TAMs可以分化為M2表型，并促進疾病的進展，且有報道[37]稱浸潤性CD204+ TAMs的增加與ESCC的預后不良相關。因此，從這個角度來看，VCAN的高表達可能與ESCC的預后不良有關。據我們所知，本研究通過結合VCAN和TIICs之間的關系來探討VCAN在ESCC預后中的價值，為VCAN的首次相關研究。
最后，VCAN可被ESCC中的miRNAs調控，包括hsa-mir-135b；而且據文獻[40]報道，has-miR-135b-5p與ESCC的總生存時間相關。miRNAs的特定功能是通過互補序列抑制翻譯或促進相應靶標mRNA的降解來發揮[40]；因此，VCAN的表達量變化可能與has-miR-135b-5p的表達量變化有關，而has-miR-135b-5p與ESCC的進展有關，間接暗示VCAN與ESCC的預后有關。雖然更詳細的機制還有待進一步闡明，但本研究結果表明，VCAN可能通過參與miRNAs有關的調控，在ESCC的進展中發揮作用。
但是，本研究存在一個不足之處，本研究中的生物信息學分析結果需要在未來的生物實驗中得到證實。未來我們將進一步探討VCAN在ESCC進展中的潛在分子機制。
綜上所述，本研究共鑒定出630個DEGs和32個hub基因，其中VCAN是一個上調差異表達基因。高表達的VCAN與ESCC的預后不良有關。
利益沖突：無。
作者貢獻：張文庚為負責人，負責指導研究；陸思芬和魏小珍共同負責整體研究設計，具體實施研究，分析數據并匯總，撰寫論文；牟必琴參與研究實施，負責數據收集和下載；胡瓊霞和鄧竹君參與研究實施，負責文獻下載和整理；全體作者參與文章撰寫及文章審閱。
食管癌是世界上第八大最常見癌癥和第六大癌癥致死原因[1]。食管癌可以分為食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma， ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC），其中90%以上都是ESCC [2]。在亞洲，ESCC的發病率一直在顯著上升[3]。ESCC是目前侵襲性最強的鱗狀細胞癌之一，5年生存率低于20% [4]，因此，食管癌的早期預后監測對食管癌的治療具有重要意義。然而，盡管這些年在手術、放化療和生物治療等治療方案方面取得了進展，但ESCC的預后仍較差[5]。因此，為ESCC尋找新的治療分子靶點和預后監測生物標志物十分重要。
多功能蛋白聚糖（versican，VCAN），也被稱為CSPG2，是Aggrecan/Versican蛋白多糖家族的一員，它對腫瘤特異性細胞外基質的形成至關重要。VCAN可通過抑制腫瘤壞死因子信號通路介導的細胞凋亡促進腫瘤發生，通過刺激基質金屬蛋白酶表達促進腫瘤的侵襲轉移[6-7]。據研究[8-10]報道，VCAN與胃癌、乳腺癌和白血病等多種腫瘤細胞的增殖和轉移有很強的關聯。總之，VCAN可能與這些腫瘤的預后有關。然而，關于VCAN在ESCC預后中的研究卻較少。
本研究，同時基于RNA芯片數據和RNA高通量測序數據，通過相關的生物信息學軟件和數據庫進行綜合分析，旨在探討VCAN在ESCC預后中的作用，可為臨床醫生對ESCC治療提供初步指導。
1 材料與方法
1.1 數據收集
首先，從GEO數據庫（
表1
3個RNA芯片數據集中的樣本信息［例 /］
1.2 差異表達基因分析
首先，采用XPN算法[16] 調整3個RNA芯片數據集之間可能的批次處理影響，分別合并所有ESCC組織的數據和癌旁正常組織的數據，將批次效應最小化。然后，基于合并后的358個ESCC組織和358個癌旁正常組織的表達量數據（去掉其中的lncRNAs和重復的mRNAs），采用R包“limma” [17]鑒定差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），并設定閾值為 |log2Fold-Change|≥2 和校正 P≤0.050[18]。log2Fold-Change>0 和 log2Fold-Change<0分別定義為上調差異表達基因和下調差異表達基因的閾值。
1.3 蛋白互作網絡和模塊分析
首先，采用數據庫STRING（
1.4 KEGG通路富集分析
采用KOBAS數據庫（
1.5 基因的表達量驗證和生存分析
首先，選擇來自TCGA 和GTEx 數據庫中的RNA高通量測序樣本（包括286個癌旁正常組織和182個 ESCC 組織）的表達量數據驗證被選基因的表達量，然后，采用數據庫Gene Expression Profiling Interactive Analysis（GEPIA，
1.6 VCAN的腫瘤免疫學特性分析
采用數據庫The Tumor Immune Estimation Resource（TIMER，
1.7 構建VCAN和miRNAs的調控網絡
首先，基于TCGA數據庫的182個ESCC 組織和65個癌旁正常組織，采用R包“limma”[17] 分析差異表達的miRNAs（Differentially expressed miRNAs，DEmiRNAs），并設定閾值為：|log2Fold-Change|≥1 和校正 P≤0.050。然后，采用TargetScan（Release 7.2，
1.8 統計學分析
采用軟件 R（版本 4.0.3）進行統計和作圖。選擇乘積極限法（Kaplan-Meier，KM）對生存數據進行計算，選擇對數秩檢驗（log-rank test）做統計分析并計算P值，然后繪制生存曲線。P≤0.050 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 鑒定差異表達基因
首先，整理從GEO數據庫下載到的3個RNA芯片數據集的表達量數據，采用XPN算法調整合并3個數據集，得到358個 ESCC 組織和358個癌旁正常組織的表達量數據，去掉其中的lncRNAs和重復的mRNAs。然后，采用R包“limma”鑒定差異表達基因，并設定閾值為：|log2Fold-Change|≥2 和校正 P≤0.050。共鑒定出630個DEGs（圖1a），包括192個上調DEGs和438個下調差異表達基因，其中VCAN是一個上調差異表達基因。差異表達基因的結果表明ESCC腫瘤組織的基因表達與癌旁正常組織的基因表達明顯不同。
圖1
基于RNA芯片數據鑒定食管鱗狀細胞癌的差異表達基因和hub 基因
a：差異表達基因的火山圖（基于358個食管鱗狀細胞癌組織和358個癌旁正常組織的表達量數據）；b：蛋白互作網絡中的模塊1 ［分子復合體識別法（MCODE）score = 14.471，Nodes = 18 ］；c：蛋白互作網絡中的模塊2 （MCODE score=13.077，Nodes=14）；差異表達基因的閾值為： |log2Fold-Change|≥2 和校正
2.2 差異表達基因的蛋白互作網絡和模塊分析
首先，為了探究這些DEGs之間的交互關系，采用STRING數據庫分析上述630個DEGs的PPI網絡。我們構建出了一個包含629個節點和1 470條邊的PPI網絡。然后，采用MCODE 軟件分析該PPI網絡中的模塊，并選出結果排名最靠前的2個模塊（一共包括32個hub 基因），具體為：模塊1（MCODE score=14.471）包括18個hub 基因，模塊2 （MCODE score=13.077）包括14個hub 基因。這兩個模塊的PPI網絡圖見圖1b～c。
然后，進行這32個hub 基因的KEGG通路富集分析，結果顯示，它們主要富集于蛋白消化吸收、細胞外基質受體相互作用和松弛素信號通路（圖2）。據文獻 [18, 31-32]報道這些通路與癌癥的生存或進展有關，提示這些hub基因可能與ESCC的預后有關。
圖2
hub 基因的KEGG富集分析統計圖
Qvalue：校正
2.3 差異表達基因的表達量驗證和生存曲線分析
首先，使用TCGA 和 GTEx數據庫中的RNA高通量測序樣本（包括286個癌旁正常組織和182個 ESCC 組織）的表達量數據，驗證上面被挑選出來的32個hub 基因的表達量。結果發現，只有14個基因是差異表達的（P≤0.050），包括BUB1、CEP55、COL1A1、 COL1A2、COL3A1、COL5A1、ELN、LUM、MMP1、SPARC、SPP1、 TOP2A、TPX2 和 VCAN（圖3）。然后，分析這14個基因在ESCC中的生存曲線（圖4），結果發現只有5個基因的表達量越高它們對應的DFS越低，包括COL1A1 （P=0.046）、 COL1A2 （P=0.036）、 SPARC（P=0.023）、SPP1（P=0.001） 和VCAN （P=0.050），而其它基因的生存曲線不存在顯著性結果（P>0.050）。
圖3
用RNA高通量測序數據驗證hub 基因的表達量
與286個癌旁正常組織相比，只有 BUB1、CEP55、COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL5A1、ELN、LUM、MMP1、SPARC、SPP1、TOP2A、TPX2 和VCAN 在182個 ESCC組織中是顯著高表達的；紅色表示ESCC組織；黑色表示正常組織；顯著差異表達的條件：*
圖4
hub基因在ESCC中的生存分析曲線
a：COL1A1；b：COL1A2；c：SPARC；d：SPP1 和e：VCAN的高表達與ESCC的預后不良顯著有關（
另外，我們發現在之前的研究中，COL1A1、COL1A2、SPARC和SPP1已經被報道為ESCC的預后標志物 [33-34]，所以，本研究只選擇VCAN用于后續的分析，作為ESCC的候選預后標志物。
2.4 VCAN的KEGG通路富集分析
為了探索VCAN可能的分子功能，我們采用KOBAS數據庫進行VCAN的KEGG通路富集分析。結果發現，VCAN可以富集在細胞粘附分子通路（圖1），據文獻[35]報道該通路在調節免疫和腫瘤微環境中發揮重要作用。結果提示VCAN可能與ESCC的免疫環境有關。
2.5 分析VCAN在ESCC免疫環境中的作用
為了探索VCAN在ESCC免疫環境中的潛在作用，我們用TIMER數據庫分析VCAN與ESCC TIICs 之間的關系，因為有報道稱部分TIICs與ESCC的預后不良有關[36-37]。結果發現（圖5a），VCAN與ESCC中的巨噬細胞（macrophages）浸潤水平呈現正相關（R=0.576，P<0.001）， 而與其它的免疫細胞相關性很小，包括腫瘤純度、B 細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞（R<0.300， P>0.050），因為相關系數小于0.300被認為是可以忽略的相關[38]。因此，我們只重點關注VCAN與巨噬細胞的相關性。而且，據文獻[39]報道，巨噬細胞有兩種不同的表型，包括抑制腫瘤的M1表型和支持腫瘤的M2表型。Nitric oxide synthase 2 （NOS2）、 interferon regulatory factor 5（IRF5）和prostaglandin-endoperoxide synthase 2（PTGS2）是M1的基因標志物，而CD163 molecule（CD163）、V-set and immunoglobulin domain–containing 4 （VSIG4） 和membrane spanning 4-domains A4A （MS4A4A）是M2的基因標志物。我們分析了VCAN和這些基因標志物之間的關系。結果發現，VCAN的表達量與CD163 （R=0.481，P<0.001），VSIG4（R=0.526，P<0.001），MS4A4A（R= 0.520，P<0.001）的豐度呈現顯著正相關的關系，它們均為M2巨噬細胞的標志物（圖5b）；而VCAN與NOS2、IRF5和PTGS2豐度的相關性可以忽略不計（R<0.300），這些都是M1巨噬細胞的標志物（圖5c）。而且，腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated mecrophages TAMs）可以分化為M2表型，并促進疾病的進展，有文獻[37]稱浸潤性CD204+ TAMs的升高與ESCC的預后不良相關。因此，我們也分析了VCAN與CD204豐度的相關性，結果發現，VCAN的豐度與CD204的豐度呈現正相關（圖5d， R=0.621， P<0.001）。這些結果提示VCAN確實可以在ESCC的免疫環境中發揮作用，主要表現為VCAN的表達量與M2巨噬細胞及其基因標志物的豐度顯著正相關。
圖5
食管鱗狀細胞癌中VCAN的豐度和TIICs的豐度的關系
a：VCAN的豐度與B 細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞之間的Spearman相關性分析圖；VCAN的豐度和巨噬細胞的基因標志物的豐度之間的關系；b：M2的基因標志物；c：M1的基因標志物；d：與TAMs有關的CD204；TIICs：腫瘤浸潤性免疫細胞；TAMs：腫瘤相關巨噬細胞；相關性顯著的閾值為
2.6 構建ESCC中VCAN與miRNAs的調控網絡
接下來，我們評估了ESCC中VCAN與miRNAs相互作用的潛力，因為有一些miRNAs與ESCC的發展和進展相關，例如has-miR-135b-5p[40]。首先，使用TCGA-ESCC隊列中的182個ESCC樣本和65個正常樣本的miRNAs數據鑒定出64個上調差異表達和21個下調差異表達的DEmiRNAs（圖6a）。然后，基于ESCC中的miRNAs數據，采用Targetscan軟件預測出24個能夠靶向VCAN的miRNAs （圖6b），同時采用miRDB軟件預測出74個能夠靶向VCAN的miRNAs（圖6b），取交集后得到15個miRNAs（圖6b）。這15個miRNAs用于構建miRNAs和VCAN的調控網絡（圖6c），其中hsa-mir-135b 是ESCC中的上調差異表達DEmiRNA。這些結果表明VCAN可以與ESCC中的miRNAs相互作用，其中有些miRNAs與ESCC的預后有關。
圖6
食管鱗狀細胞癌中VCAN與miRNAs之間的關系
a：食管鱗狀細胞癌中的上調差異表達和下調差異表達miRNAs；b：Targetscan和miRDB軟件預測得到的能夠靶向VCAN的miRNAs；c：食管鱗狀細胞癌中VCAN和miRNAs的調控網絡，其中has-mir-135b可能與食管鱗狀細胞癌的進展相關
3 討論
由于ESCC的高發病率和低生存率，尋找新的預后標志物和有效靶點是迫切需要的[10]。VCAN已被報道與幾種腫瘤的預后有關[8-10]，然而VCAN在ESCC預后中的作用尚未見明確報道。本研究基于3個RNA芯片數據集的358個 ESCC 組織和358個癌旁正常組織的表達量數據，鑒定出630個DEGs和32個hub基因，然后使用182個 ESCC 組織和286個癌旁正常組織的RNA高通量測序的表達量數據對這32個hub基因的表達量進行驗證，結果發現只有14個hub基因差異表達，這14個基因的生存曲線分析結果顯示，只有COL1A1、COL1A2、SPARC、SPP1 和 VCAN 跟ESCC的預后顯著相關，直接提示VCAN在ESCC預后中的作用。有趣的是，我們通過綜合分析發現，VCAN的豐度與M2巨噬細胞及其基因標志物的豐度顯著正相關，其中有一些M2巨噬細胞的基因標志物與ESCC的預后相關；并且VCAN可以被 ESCC中的miRNAs調控，其中有一些miRNAs與ESCC的進展相關，這些結果間接提示VCAN在ESCC預后中的作用。
本研究的結果表明，與癌旁正常組織相比，VCAN在ESCC組織中明顯高表達，且VCAN的高表達可以導致ESCC的DFS顯著縮短，直接提示VCAN在ESCC預后中的作用。這些結果與之前關于VCAN在ESCC組織間質細胞中高表達的研究基本一致，主要原因為VCAN與侵襲、淋巴結轉移、淋巴管及靜脈浸潤陽性密切相關[41]。
KEGG通路富集分析結果表明VCAN在Cell adhesion molecules中富集，而且據文獻[35]報道該通路可以在調節免疫和腫瘤微環境中發揮關鍵作用，這提示VCAN可能與ESCC的免疫環境有關。同時，以往研究[36-37]已經認識到一些免疫相關的TIICs在預測ESCC不良預后方面的關鍵作用，因此，我們分析VCAN與TIICs之間的關系，以間接考察VCAN對ESCC預后的影響。結果發現，VCAN的豐度與M2巨噬細胞的豐度顯著正相關，而與其它TIICs細胞（B 細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞）相關性不大；同時VCAN的表達與CD163和CD204的表達顯著正相關。據文獻[42]報道，在腫瘤組織中，巨噬細胞可表現為M1表型和M2表型，M2表型占70%以上；M1表型是腫瘤抑制型，而M2表型是腫瘤支持型，與癌癥的預后不良有關。另外，據文獻[36]報道，CD163+ M2的高密度可能是ESCC的獨立預后不良因素。此外，TAMs可以分化為M2表型，并促進疾病的進展，且有報道[37]稱浸潤性CD204+ TAMs的增加與ESCC的預后不良相關。因此，從這個角度來看，VCAN的高表達可能與ESCC的預后不良有關。據我們所知，本研究通過結合VCAN和TIICs之間的關系來探討VCAN在ESCC預后中的價值，為VCAN的首次相關研究。
最后，VCAN可被ESCC中的miRNAs調控，包括hsa-mir-135b；而且據文獻[40]報道，has-miR-135b-5p與ESCC的總生存時間相關。miRNAs的特定功能是通過互補序列抑制翻譯或促進相應靶標mRNA的降解來發揮[40]；因此，VCAN的表達量變化可能與has-miR-135b-5p的表達量變化有關，而has-miR-135b-5p與ESCC的進展有關，間接暗示VCAN與ESCC的預后有關。雖然更詳細的機制還有待進一步闡明，但本研究結果表明，VCAN可能通過參與miRNAs有關的調控，在ESCC的進展中發揮作用。
但是，本研究存在一個不足之處，本研究中的生物信息學分析結果需要在未來的生物實驗中得到證實。未來我們將進一步探討VCAN在ESCC進展中的潛在分子機制。
綜上所述，本研究共鑒定出630個DEGs和32個hub基因，其中VCAN是一個上調差異表達基因。高表達的VCAN與ESCC的預后不良有關。
利益沖突：無。
作者貢獻：張文庚為負責人，負責指導研究；陸思芬和魏小珍共同負責整體研究設計，具體實施研究，分析數據并匯總，撰寫論文；牟必琴參與研究實施，負責數據收集和下載；胡瓊霞和鄧竹君參與研究實施，負責文獻下載和整理；全體作者參與文章撰寫及文章審閱。
