肺癌的早期診斷對于降低其死亡率、提高生存率有重要意義，傳統的肺癌早期診斷方法具有自身的局限性，人體呼出氣可以反映機體的疾病狀態，在肺癌的早期診斷上具有巨大潛力。本文對肺癌的診斷及呼出氣檢測技術用于肺癌診斷的研究現狀及進展進行了綜述。
引用本文： 謝少華, 向潤, 謝天鵬, 李強. 呼出氣分析與肺癌診斷的研究現狀及進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2022, 29(9): 1197-1209. doi: 10.7507/1007-4848.202112078 復制
據世界衛生組織國際癌癥研究機構發布的《世界癌癥報告》2020版數據顯示，肺癌的發病率居全球第二，而死亡率仍居所有惡性腫瘤之首[1]。中國的新發癌癥人數和癌癥死亡人數均為全球第一，其中肺癌死亡人數遠高于其它癌種。與歐美發達國家相比，我國癌癥的死亡率高，5年、10年生存率較低。究其原因，是我國癌癥的早期診斷率較低[2]。癌癥患者早、晚期診斷的5年生存率相差巨大，早期診斷者生存率可達到70%～90%，而晚期則驟降至12%[3-4]。早期肺癌并沒有特征性的臨床癥狀，所以大多數患者出現明顯癥狀而就診時已經處于中晚期[5]。因此，提高肺癌的早期診斷率對于降低其死亡率、提高生存率至關重要。傳統肺癌診斷方法有胸部X線片、胸部CT、痰液脫落細胞學檢查等，都具有各自的局限性，因此目前需要一種簡單、快速、靈敏、無創的診斷方法用于肺癌的早期篩查及診斷。呼出氣的檢測分析具有快速、無創、重復性好等特點，在肺癌的早期診斷上顯現出巨大潛力，有望成為肺癌的早期篩查工具[6-7]。
1 傳統肺癌診斷方法現狀
血液中的腫瘤標志物和痰液脫落細胞學檢查在肺癌診斷上的靈敏度和特異度均較低[8-9]，而電子支氣管鏡活檢更適用于中央型肺癌的診斷[8]。使用胸部X線片作為肺癌篩查工具可提高早期肺癌的檢出率、生存率，卻無法降低死亡率[10-12]，其顯示的是重疊影像且對肺小結節的顯影不佳，容易造成漏診[13]。正電子發射計算機斷層顯像（positron emission tomography-CT，PET-CT）的檢測費用昂貴，同時對直徑＜7 mm的肺結節診斷靈敏度不高，不適合應用于肺癌篩查[14]。目前臨床上廣泛用于肺癌篩查的是低劑量CT（low-dose computed tomography，LDCT）。其輻射劑量低、肺小結節檢出率高，可使肺癌的死亡率降低20%[15]，已被各大指南推薦作為高危人群的肺癌篩查手段。但伴隨LDCT高檢出率導致的高假陽性率及過度診斷[15]，而后的活檢確診及CT隨訪都加重了患者及社會的經濟負擔[16-17]。長期的LDCT隨訪對患者造成了心理壓力，同時帶來了輻射暴露風險，這些都是LDCT作為大規模人群早期肺癌篩查工具的局限性。
2 呼出氣分析與肺癌診斷
肺是人體代謝最活躍的器官之一，人體組織產生的代謝產物一部分釋放入血，在肺部進行物質交換并通過呼吸道排出體外，因此呼出氣可以反映機體的疾病狀態。臨床上早有將呼出氣用于疾病診斷的經驗，如糖尿病患者酮癥酸中毒時出現爛蘋果味的呼出氣，肝臟疾病患者的呼出氣可呈魚腥臭味[18]，這都提示患病狀態下的呼出氣與健康狀態下不同，早期肺癌患者的呼出氣成分可能已經出現類似改變，因此針對呼出氣的檢測分析有望成為早期肺癌的無創篩查手段。呼出氣的組成成分大致可分為3類：（1）無機化合物，如：氧氣、二氧化碳（carbon dioxide，CO2）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、氮氣等；（2）可揮發性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs），如各類飽和及不飽和烴、酮類、醇類、酯類等[19]；（3）不可揮發性有機化合物，如各種細胞因子、腫瘤標志物等[18]。其中VOCs及不可揮發性有機化合物與肺癌的關系是國內外研究的重點。
2.1 可揮發性有機化合物的檢測分析與肺癌診斷
呼出氣中VOCs按其來源可分為內源性和外源性兩大類。內源性VOCs是指機體自身組織各種代謝途徑產生的并經過呼吸道排出體外的代謝產物，其最能反映肺癌的異常代謝狀態。外源性VOCs被認為是由環境污染或食物等外部來源引入呼吸道內的，是需要分辨并排除的干擾因素。
2.1.1 基于質譜分析技術的可揮發性有機化合物檢測與肺癌診斷
2.1.1.1 氣相色譜質譜技術
質譜技術（mass spectrometry，MS）能準確測定出生物大分子的分子量，被廣泛應用于有機分子的鑒定。氣相色譜技術（gas chromatography，GC）是針對氣態化合物進行分離和分析的技術，它檢測的靈敏度高，對VOCs的檢測可達到十億分比（part per billion，ppb）濃度水平，是目前對呼出氣進行分析的最常用技術。GC常與MS聯用，可以獲得呼出氣中所含化合物的準確信息，因此氣相色譜-質譜法（gas chromatography mass spectrometry，GCMS）成為呼出氣VOCs檢測分析最常用且準確性相對較高的技術。
1971年，Pauling等[20]首先開始對健康人呼出氣成分進行探索，由此啟發了學者對呼出氣的深入研究。1985年，Gordon等[21]率先使用GCMS檢測分析了肺癌患者呼出氣中的VOCs，其引發了學者們探索呼出氣VOCs在肺癌領域的診斷價值的熱情。Phillips作為呼出氣VOCs研究領域的佼佼者，使用GCMS方法在50名健康志愿者的呼出氣中檢測發現了3 481種不同VOCs，其中有27種VOCs在所有志愿者的呼出氣中均可檢出[22]。1999年，Phillips等[23]納入肺癌及非肺癌受試者，對比篩選出22種VOCs作為肺癌標志物，這些VOCs主要為烷烴類及其衍生物以及苯的衍生物。以此建立的肺癌診斷模型可明顯區分出肺癌及非肺癌受試者，其靈敏度為71.7%、特異度為66.7%。2007年，Phillips等[24]的后續研究擴大樣本量并采用了不同統計分析及建模方法。他們按照2∶1比例將404例受試者分為建模組和驗證組，最后共篩選出16種VOCs作為標志物，診斷模型的靈敏度為84.6%，特異度為80.0%。Rudnicka 等[25]通過GCMS方法鑒定出呼出氣中88種VOCs，使用判別函數分析、因子分析和人工神經網絡等統計方法組合，最終篩選出7種對肺癌鑒別能力最高的VOCs，在測試組中的靈敏度和特異度均為86.36%。
2005年，Poli等[26]將固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技術與GCMS技術相結合，對呼出氣樣品的預處理方法進行了技術優化，加快了樣品分析檢測的速度。該研究共納入非小細胞肺癌（non-small cell cancer，NSCLC）、慢性阻塞性肺疾病和無癥狀的吸煙/非吸煙者4類人群，篩選出13種VOCs（主要為烯烴、烷烴及其衍生物）建立的診斷模型可將82.5%的受試者正確分類，特異度達到93.6%，而敏感度為72.2%。另外該研究在對肺癌受試者的術后隨訪中發現，其呼出氣中異戊二烯和癸烷的濃度水平相較于手術前明顯降低。2010年，Poli團隊[27]再次使用SPME-GCMS技術對醛類在NSCLC中的診斷潛力進行了評估。結果顯示，直醛與NSCLC的關系密切，可作為診斷的生物標志物，其增加了前期確定的VOCs診斷模式的靈敏度和特異度。Fuchs團隊[28]的研究也發現，肺癌受試者呼出氣中多種醛類包括戊醛、己醛、辛酸和壬醛的濃度顯著升高，這同樣提示呼出氣中的醛類物質可能作為肺癌診斷的標志物之一。Long等[29]的研究表明，使用SPME-GCMS對呼出氣VOCs檢測分析，即使針對Ⅰ、Ⅱ期的肺癌也能展現出良好的診斷能力，靈敏度和特異度可達到90%和88%。Koureas 等[30]將肺癌、肺良性疾病和健康受試者納入研究，用SPME-GCMS技術對呼出氣VOCs進行分析，分別進行了靶向性和非靶向性呼出氣分析，結果將靶向性呼出氣分析以外的VOCs納入非靶向性分析仍能夠區分肺癌與非肺癌受試者。
2.1.1.2 質子轉移反應質譜技術
GCMS痕量分析技術可為研究者提供最詳細的分析信息，信息量大、覆蓋面廣、精確度高，并且可識別出單一氣體成分，成為目前用于呼出氣檢測最常用最經典的技術之一。但GCMS同樣存在其局限性，其常常需要結合SPME等預濃縮技術進行樣品預處理，同時該技術設備系統價格昂貴，檢測分析程序復雜、耗時較長，并且操作人員需要經過高度專業的培訓，這些都限制了該技術在臨床上的推廣應用。直接使用MS可以簡化樣品的制備，并提高時間分辨率，研究者們使用直接MS對呼出氣VOCs檢測分析并進行了較多的研究。
質子轉移反應質譜（proton-transfer-reaction mass spectrometry，PTR-MS）是一種基于質子轉移反應的軟電離質譜技術，主要原理為被檢測化合物與H3O+發生質子轉移反應，而后進行質譜分析，從而測定化合物的分子量[31]。Moser等[32]使用PTR-MS描述了健康受試者的呼出氣特征，并首次將平均患者樣本的質譜特征描述為可能的參考值。Feinberg等[33]使用PTR-MS證實了口服葡萄糖耐量試驗對肺癌患者的呼出氣VOCs特征影響很小。Wehinger等[34]用PTR-MS對原發性肺癌及非肺癌患者的呼出氣VOCs進行檢測分析，發現質荷比為31和43的VOCs最能區分肺癌和非肺癌組的呼出氣。Bajtarevic等[35]使用PTR-MS和SPME-GCMS兩種方法對比了肺癌及健康受試者的呼出氣。他們認為兩種方法各有優勢，PTR-MS檢測下限比SPME-GCMS更低，同時不需要預濃縮等預處理措施，但PTR-MS的主要缺點在于不能確定化合物。
2.1.1.3 選擇離子流管質譜技術
選擇離子流管質譜（selected ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS）技術，將流動管技術、化學電離和質譜相結合，選擇性應用H3O+等初始離子，可對樣本中的VOCs進行多組分實時在線分析[36-37]。Diskin 等[38]使用SIFT-MS對5例受試者30 d內的呼出氣中丙酮、異戊二烯、乙醇、氨和乙醛的濃度進行了分析，結果表明5例受試者呼出氣中的上述VOCs沒有明顯的分布模式。Smith等[39]在一項針對SK-MES和 CALU-1兩種細胞系的體外實驗中，使用SIFT-MS對細胞培養的頂空氣中乙醛的濃度進行檢測分析，發現兩種細胞系的乙醛產生速率不同并且乙醛的濃度與癌細胞的數量成正比。Sulé-Suso等[40]的研究中，在NL20正常肺上皮細胞培養基的頂空氣中通過SIFT-MS同樣檢測到乙醛的釋放，但是同時檢測到CO2的含量很少，故推測其正常代謝受到抑制。2021年，Tsou等[41]報道的一項研究中納入了148例肺癌受試者和168名健康受試者，使用GC-MS檢測了呼出氣中116種VOCs，并使用SIFT-MS 進行定量分析，結合極端梯度增強（XGBoost）的機器學習方法建立了一個肺癌預測模型，預測模型在調整了混雜因素的影響后準確度為92%，靈敏度為96%，特異度為88%，曲線下面積為0.98。SIFT-MS 作為一種靈敏度高的實時在線分析技術，具有較大的臨床應用潛力。但是該技術需要微波電離源，這使檢測成本增加。另外，待測樣品與初級離子間的質子親和勢差異是待測樣品離子的產生基礎，因此該技術只能檢測到部分VOCs，提供的信息相對較少。
2.1.1.4 傅立葉變換離子回旋共振質譜技術
傅立葉變換離子回旋共振質譜技術（Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，FT-ICR MS）是基于測量磁場中離子回旋頻率而獲得離子質荷比信息的分析技術。其超高的分辨率（>1 000 000）、高質量精度（<1 μppm）等分析特性，使它成為代謝組學、蛋白質組學、石油組學和復雜混合物研究的重要工具[42]。2014年，Fu等[43]使用FT-ICR MS對肺癌受試者、健康吸煙/不吸煙受試者和肺良性結節受試者的呼出氣進行檢測分析，結果顯示肺癌患者呼出氣中2-丁酮、2-羥基乙醛、3-羥基-2-丁酮和4-羥基己烯醛濃度明顯高于健康對照組和肺良性結節對照組。同時，在NSCLC組中Ⅱ～Ⅳ期受試者呼出氣中2-丁酮濃度明顯高于Ⅰ期受試者。2015年，Li等[44]應用FT-ICR MS分析發現6種VOCs在肺癌受試者中的濃度大于對照組，以此建立的分類模型可將肺癌與不吸煙者、吸煙者、肺良性結節者準確區分，準確度分別為97%、95%和89%。
2.1.1.5 萃取電噴霧電離-質譜技術
萃取電噴霧電離-質譜技術（extractive electrospray ionization mass spectrometry，EESI-MS）作為一種新興的MS，其原理是用電噴霧通道將樣品和帶電試劑（甲醇或水）噴射到離子源空間，樣品中的化合物被提取到帶電試劑的液滴中，經過去溶以獲得分析物的離子，用于后續的質譜檢測。EESI具有較高的長期穩定性和靈敏度，可對待測VOCs直接電離，不需對樣品進行預處理，可以實現快速、實時的在線分析[45]。Zuo等[46]的研究中采用EESI-MS技術試圖尋找肺癌的特定診斷標志物VOCs。結果表明，肺癌患者呼出氣中的丁二烯、乳清酸、四氫生物蝶呤和N-苯基乙酰谷氨酰胺的含量與對照組和肺部感染組明顯不同。
2.1.2 基于傳感器技術的可揮發性有機化合物檢測與肺癌診斷
人類對于氣味的分辨是個復雜的過程，鼻子吸入的空氣中的氣味分子與神經細胞受體結合，而后神經沖動信號傳遞到大腦形成對氣味的判斷。類似于人類鼻子，研究人員將一種由具有部分靈敏度的電子化學傳感器陣列和能夠識別簡單或復雜氣味的模式識別系統組成的儀器定義為電子鼻，即人工嗅覺系統[47]。電子鼻不能對VOCs的具體物質進行識別和定量，而是對VOCs組合的混合模式識別，因此電子鼻需要經過訓練后再用于疾病診斷。相較于MS的高成本和復雜性，電子鼻技術更便捷、快速、廉價，這也引起了研究者們的濃厚興趣。電子鼻技術包含了傳感器陣列、數據采集系統、信號處理系統、數據存儲單元，以及用于檢測和分析各種蒸氣形式的化學物質的人工智能系統[48]。傳感器是電子鼻的基本組成之一，理想的傳感器應具有準確度高、靈敏度高、特異度高、重復性好、受環境影響小、快速便捷等特點，因此傳感器的原理和制作工藝一直是研究人員關注的重點。傳感器包含了光學氣體傳感器、導電聚合物傳感器、電化學傳感器、壓電傳感器、金屬氧化物半導體等多種類型[49]。
2.1.2.1 導電聚合物傳感器
導電聚合物傳感器的工作原理是基于傳感器電阻會因氣體在傳感器表面的吸收而改變，這些傳感器通過涂覆不同的材料以提高傳感器在環境溫度下工作時對VOCs的靈敏度[50]。目前使用較多的基于導電聚合物氣體傳感器的電子鼻是Cyranose 320，它使用了32個碳黑聚合物復合化學電阻器陣列，是較早投入商用的電子鼻之一。2005年，Machado 等[51]將 Cyranose 320電子鼻用于呼出氣檢測，可以將肺癌和對照組區分，靈敏度為71.4%，特異度為91.9%。McWilliams等[52]使用Cyranose 320對比了191例受試者的呼出氣樣本，發現其可將肺癌與高危吸煙對照組明顯區分，準確率大于80%。Hubers 等[53]使用Cyranose 320區分肺癌和對照組的靈敏度為80%，特異度為48%。當將Cyranose 320與痰液中RASSF1A高甲基化相聯合應用時，診斷肺癌的靈敏度可達到100%。Tirzīte等[54]將Cyranose 320與支持向量機數據分析方法結合，可以在87.3%的病例中正確分類肺癌及非肺癌受試者。其中非肺癌受試者中包含了慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺炎、肺栓塞、良性肺腫瘤受試者和健康受試者。Bikov等[55]發現，呼出氣流速、屏氣時間和解剖死腔的存在均顯著影響了Cyranose 320電子鼻對肺癌的辨別能力。Rodríguez-Aguilar 等[56]的橫斷面研究中，將肺癌、乳腺癌、慢性阻塞性肺疾病和健康對照受試者納入研究，使用Cyranose 320電子鼻結合主成分分析方法可以將患癌組與對照組區分，準確率為100%。
2.1.2.2 壓電氣體傳感器
石英晶體微天平（quartz microbalance，QMB）和聲表面波（surface-acoustic waves，SAW）器件是現有電子鼻系統中使用的兩種重要的壓電氣體傳感器。QMB的工作原理是將氣敏聚合物或半導體金屬氧化物涂覆在石英晶體壓電盤上，VOCs吸附在石英晶體表面后會引起石英晶體的質量和振蕩頻率改變[57-58]。Di Natale等[59]使用由8個QMB組成的電子鼻檢測呼出氣中VOCs，同時使用偏最小二乘法判別分析方法進行數據處理，結果可以很好地將肺癌與對照組區分。Gasparri 等[60]的研究中同樣使用了由8個QMB組成的電子鼻，其區分肺癌與對照組的靈敏度為81%，特異度為91%，并且在Ⅰ期肺癌中觀察到最大的靈敏度，可達到92%。D'Amico等[61]使用QMB分別對肺癌、肺部其它疾病和健康受試者的呼出氣VOCs檢測。建立的模型區分肺癌和健康受試者的靈敏度和特異性分別為85%和100%，區分肺癌和其它肺疾病受試者的準確率為85.7%，靈敏度為92.8%，特異度為78.6%。Rocco等[62]使用包含QMB傳感器的BIONOTE多傳感系統，在參加肺癌篩查計劃的患者中進行檢測，其肺癌識別的總體靈敏度和特異度分別達到86%和95%。同時作者認為，使用BIONOTE系統可降低LDCT篩查肺癌時帶來的假陽性率。
類似地，SAW氣體傳感器的工作原理是通過涂有傳感材料的壓電襯底測量氣體引起的聲波傳播頻率的變化[63]。Chen等[64]使用了一種帶有固相微萃取和毛細管柱的電子鼻，用以對VOCs進行濃縮和分離，加上一對表面涂有薄聚異丁烯薄膜的SAW傳感器對VOCs進行檢測。最終發現11種VOCs可被認定為肺癌生物標志物，并且電子鼻與改進的人工神經網絡算法結合成像方法進行模式識別可用于臨床肺癌患者的診斷。
壓電式氣體傳感器具有靈敏度高、響應時間短、功耗低、體積小、穩定性好等優點。但是，這些壓電傳感器工作在非常高的頻率下導致其信噪比很低，并且需要復雜的電子電路來描述其信號響應，因此很難作為高效電子鼻系統的支撐元件[49]。
2.1.2.3 金屬氧化物半導體氣體傳感器
基于金屬氧化物半導體的氣體傳感器被認為是最具吸引力的傳感器之一。固態電阻型金屬氧化物氣體傳感器具有靈敏度高、結構簡單、穩定性好、成本較低等優點，因而受到關注。多種半導體金屬氧化物如二氧化錫、氧化鋅、氧化銅、二氯化鈦、三氧化鎢和氧化鎳已被用來制作傳感器元件用以檢測VOCs[49]。
SpiroNose 電子鼻裝置是一種包含5個相同金屬氧化物的半導體傳感器陣列，已被用于氣體檢測。2015年，de Vries 等[65]研究發現，使用SpiroNose 電子鼻系統可以充分區分肺癌、健康、哮喘和慢性阻塞性肺疾病受試者。2019年，de Vries團隊[66]的一項前瞻性觀察性研究納入了擬行抗細胞程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein-1，PD-1）治療的143例NSCLC，結果使用SpiroNose電子鼻裝置可以明顯區分對抗PD-1治療3個月后有無反應的肺癌患者，因此作者認為使用電子鼻檢測VOCs可以預測患者對免疫療法的反應。
eNose公司生產的Aeonos電子鼻，包含3個微熱板金屬氧化物傳感器，已投入商用。Kort 等[67]的一項前瞻性多中心研究共納入NSCLC及健康受試者共290人，使用10個Aeonos電子鼻裝置對呼出氣進行分析，結果發現使用該裝置排除肺癌的靈敏度達到94.4%，同時對各種肺癌亞型具有很高的隱形預測價值。Marzorati 等[68]設計開發的電子鼻包含了4種商用金屬氧化物氣體傳感器陣列（TGS2600、TGS2602、TGS822、MQ3），該電子鼻對對肺癌的識別靈敏度、特異度和準確度分別為85.7%、100%和93.8%。但該研究納入的病例數較少，僅納入肺癌受試者6例和健康受試者10名。
2.1.2.4 比色傳感器
比色傳感器由化學敏感的化合物組成，這些化合物與VOCs相互作用時顏色會改變[69]。然后，由具有精確定時的高質量系統拍攝圖像，并對所產生的圖像內容進行處理，以確定待檢測的VOCs含量[49]。Mazzone團隊長期致力于使用比色傳感器分析呼出氣，他們將NSCLC患者、健康對照者和其它肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病、結節病等患者作為受試者，使用比色傳感器陣列系統對受試者呼出氣進行分析，建立的預測模型的敏感度為73.3%，特異度為72.4%。在后期的研究[70]中，他們將受試者的吸煙狀況、年齡和性別共同納入預測模型中，進一步提高了模型預測的準確度。Huo等[71]使用具有金納米棒-金屬卟啉聚合物的比色傳感器陣列檢測了肺癌的6種標志性VOCs，包括癸烷、十一烷、己醛、庚醛、苯和1，2，4-三甲苯。結果發現該傳感器可快速準確識別VOCs，有望用于肺癌篩查。Zhong 等[72]使用一個比色傳感器陣列成功地區分了與肺癌相關的20種VOCs，并且在不同濕度下該裝置仍能呈現出良好的重復性和穩定性。
2.1.2.5 金納米傳感器
Peng等[73]開發了一種基于包覆不同化合物的金納米顆粒構成的傳感器陣列的電子鼻。該電子鼻可以將肺癌和健康受試者的呼出氣區分開，并且不受高濕度環境的影響。Shlomi等[74]的研究表明，使用金納米傳感器可以區分早期肺癌和肺良性結節受試者，準確度達87%。同時該傳感器可以將人類表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變型和野生型的肺癌受試者區分開，準確度為83%，靈敏度為79%，特異度為85%。Barash等[75]使用金納米顆粒傳感器對不同細胞系的頂空氣體進行檢測分析，結果該傳感器可將不同肺癌組織細胞系與正常對照細胞系區分開來，準確度為93%，敏感度為96%，特異度為86%。同時該傳感器可區分小細胞與NSCLC細胞系、腺癌與鱗狀細胞癌細胞系。Peled等[76] 用GCMS法檢測了不同基因突變的肺癌細胞系的頂空氣體VOCs，共篩選出5種VOCs與研究的目的致癌基因相關聯。同時使用基于金納米傳感器陣列構建的VOCs模式識別方法，可以很好區分出EGFR、間變性淋巴瘤激酶、Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因突變的細胞系。
2.1.2.6 其它傳感器
Chen等[77]使用氧化石墨烯和不同金屬離子組成的柔性電子鼻，借助人工神經網絡，對肺癌的診斷可達95.8%的靈敏度和96.0%的特異度。Huang 等[78]的一項前瞻性研究中，使用碳納米管傳感器陣列分析肺癌及健康對照受試者呼出氣，建立的肺癌診斷模型在外部驗證中使用線性判別分析和支持向量機的受試者工作特征曲線下面積均≥0.9。Davies等[79]在探索肺細胞TP53和KRAS突變特定揮發特征的研究中，在熱脫附-氣相色譜質譜分析中單個化合物區分細胞系的能力有限。但通過應用由金納米顆粒和單壁碳納米管組成的交叉反應化學電阻傳感器陣列，在使用20個VOCs的組合時可以成功區分所有細胞類型，準確率為80%～100%。Chen的團隊[80]自行開發的電子鼻系統包含了11個氣體傳感器和2個溫濕度傳感器，使用內核主成分分析與XGBoost相結合的模型可以很好地將肺癌與健康受試者區分，準確度、靈敏度和特異度分別為93.59%、95.60%和91.09%。并且該系統可將Ⅲ期與Ⅳ期肺癌區分開，準確率超過80%。
2.1.3 犬類檢測
犬類擁有高度發達的嗅覺，基于犬對氣味高度敏感的特點，經過訓練的工作犬已廣泛應用于緝毒、刑偵、海關等特殊工種中。Williams等[81]和Church等[82]曾報道2例患者的皮膚病變吸引了犬的注意，其中1例患者后來確診為黑色素瘤，而另1例確診為基底細胞癌。一個奇怪的現象是在患者切除病灶后，犬并未展現出進一步的興趣。這些現象提示，腫瘤可能會產生獨特的氣味分子，而這些特殊氣味可以被犬的嗅覺系統捕獲并分辨出來。2006年，McCulloch等[83]訓練了5只普通家犬來分辨肺癌受試者的呼出氣樣本。與活檢結果相比，犬識別出肺癌的靈敏度為99%，特異度為99%，同時犬對呼出氣的分辨不受腫瘤分期、受試者年齡、吸煙習慣等因素的干擾。而Ehmann等[84]的研究增加了慢性阻塞性肺疾病病種及患者入組例數，結果發現經過訓練后的犬對肺癌受試者呼出氣的識別敏感度為71%，特異度為93%。Guirao等[85]的研究顯示，訓練有素的犬可以通過嗅聞呼出氣從惡性孤立性肺結節中準確識別出肺癌結節，靈敏度為97%，特異度為99%。
研究人員也嘗試對犬類識別肺癌的原因進行了探索。Buszewski等[86]使用訓練后的犬對肺癌受試者呼出氣進行分別，同時將呼出氣中VOCs用GCMS法進行分析并對比，結果顯示乙酸乙酯和2-戊酮與犬的反應正相關，而乙腈、丙醛和正丙醇與犬的反應呈負相關。因此可以看出，犬能根據特定的氣味分子來識別不同呼出氣標本，但目前尚不明確犬分辨出的氣味分子是單一成分還是多種成分的混合物，以及其具體是哪種VOC。Mazzola 等[87]對嗅探犬的工作穩定性進行了研究，在訓練完成間隔1年后，嗅探犬仍然能夠通過尿液辨別出肺癌患者，1年的時間中斷和測試環境的變化并沒有導致犬的感知能力出現統計學上的顯著差異。Biehl等[88]的研究表明，犬之間識別肺癌的準確性差異巨大，其準確性取決于犬的訓練方式和呼出氣采樣載體材料。
2.1.4 其它可揮發性有機化合物檢測技術與肺癌診斷
離子遷移譜法（ion mobility spectrometry，IMS）通過使用電離源將氣體化合物分解成離子，然后以離子漂移時間的差別來進行離子的分離定性[89]。其結構簡單、靈敏度高，適合揮發性有機化合物的痕量檢測。Westhoff等[90]對肺癌和健康受試者呼出氣的IMS分析結果顯示，通過IMS色譜圖中23個峰區域的組合可以實現兩組的完美區分，準確率為100%。Handa 等[91]對50例肺癌受試者和39名健康受試者的呼出氣進行IMS分析，發現10種明顯不同的VOC峰并作為區分兩組的重要化合物，使用以正十二烷為起點的決策樹算法區分兩組的靈敏度和特異度分別達到76%和100%。同時發現，肺腺癌患者中EGFR突變陽性患者的正十二烷峰明顯高于EGFR突變陰性患者。Darwiche 等[92]使用柔性支氣管鏡收集肺癌患者患側肺及健側肺呼出氣，使用IMS技術進行VOCs檢測，通過比較兩側肺中VOCs的差異，作者認為肺癌患者的VOCs是在腫瘤內部或周圍局部產生的。
Xia等[93]開發了一種智能蒸汽發生紙基薄膜微萃取系統。該系統可以實現對揮發性甲醛靈敏的實時熒光檢測和準確的表面增強拉曼光譜量化，既可以準確區分肺癌和對照組，又為實時智能傳感器的設計開辟了思路。Li等[94]則開發了一種即時測試紙用于檢測呼出氣中的醛類物質。該試紙將探針分子4-氨基硫酚錨定在紙基材料上并與質譜儀直接耦合，具有靈敏、便捷和低成本的特點。結果顯示，肺癌患者呼出氣中醛標志物含量明顯高于健康對照組。
2.2 不可揮發性有機化合物的檢測分析與肺癌診斷
呼出氣中包含一些不可揮發性有機化合物如蛋白質和核酸分子，其來自于呼吸道中，雖不具有揮發性但可以以氣溶膠的方式隨呼出氣排出體外。在經過溫度為–196℃的冷凝管時，呼出氣中的氣溶膠沉淀下來并形成一種冷凝物，常被稱為呼出氣冷凝物（exhaled breath condensate，EBC）[95]。EBC的采集具有簡單、安全、可重復的特點，而EBC中存在的大分子有機物包含了更多的生物信息，這為肺癌的無創診斷指引了新方向。
Carpagnano的團隊[96-97]在長期關于EBC的研究中發現，NSCLC患者與健康對照組相比，EBC中內皮素-1和白細胞介素-6的濃度明顯升高，而且這種差異與分期明顯相關。研究同時發現，有14例肺癌受試者的EBC中內皮素-1濃度在手術后顯著降低。上述結果提示EBC中的內皮素-1有望成為肺癌診斷及隨訪的標志物之一。陳琳等[98]的研究同樣發現，EBC中內皮素-1可作為NSCLC診斷標志物，其診斷肺癌的靈敏度和特異度分別為95.12%和53.33%。Carpagnano等[99]又對EBC中的腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-2、瘦素展開研究，發現肺癌患者EBC中上述物質的濃度明顯高于對照者并且與腫瘤分期密切相關。秦娥等[100]的研究發現，NSCLC組EBC中轉移生長因子β1水平明顯高于對照組，并且這種差異與組織分型、病理分期均相關。董敬軍等[101]和陳琳[102]均報道了NSCLC受試者的EBC中癌胚抗原的含量明顯高于對照組。鄒瑩暢[103]首次報道在EBC中檢測出鱗狀細胞癌抗原和神經元特異性烯醇化酶兩種腫瘤標記物，并且發現相較于對照組，NSCLC組鱗狀細胞癌抗原、神經元特異性烯醇化酶、癌胚抗原的濃度更高。
2005年，Carpagnano等[104]將NSCLC及健康受試者納入研究，對其EBC和全血中染色體3p區的5個微衛星變異情況進行了分析對比。結果顯示，NSCLC受試者中在53%的EBC-DNA和10%的全血DNA信息基因座中發現了微衛星變異，其變異頻率明顯高于健康受試者的13%和2%。研究還發現，NSCLC受試者EBC-DNA中檢測到的微衛星變異數量與吸煙量顯著相關。Carpagnano等[105]的后續研究中，進一步將NSCLC受試者的EBC與肺癌組織中的DNA進行對比，發現EBC與其相應肺癌組織的DNA微衛星變異譜相對應，提示我們可能通過檢測EBC中DNA變異來推測肺癌組織的DNA變異情況。Gessner等[106]的研究發現，36.4% NSCLC受試者的EBC-DNA中發現了p53基因突變，而對照組中卻沒有發現。一個有趣的現象是，在EBC-DNA中發現p53突變的病例，并未在其相對應的肺癌組織DNA中檢測到匹配的p53基因突變。但該研究入組病例數較少，NSCLC受試者11例，健康受試者10名，還需進行大樣本深入研究。2019年，黃芬芬等[107]的研究發現，在NSCLC受試者的EBC中可檢測出p16基因突變，其總突變率為14.8%，而對照組中未檢測出p16基因突變。
2.3 其它潛在可用于肺癌診斷的呼出氣檢測技術
2.3.1 量子級聯激光器
2～20 μm的小型可集成的光源在遠距離探測、大氣污染監控、醫學診斷等方面具有迫切的應用需求。1994年，Faist等[108]首先利用量子阱子帶間的電子躍遷現象研制成功了新型紅外激光光源，波長為4.2 μｍ的激光器“量子級聯激光器”（quantum cascade laser，QCL）。隨著QCL材料體系研究的不斷進展，器件性能不斷提高，可滿足于2～20 μm不同最佳波段的應用。大多數原子、分子轉動振動躍遷在中紅外波段具有很強的特征吸收譜線，因此單模、寬波長調諧中紅外激光器在毒品和爆炸物監測上顯現出巨大優勢。隨著QCL在生物醫學領域的廣泛應用，其在醫學診斷上也顯示出巨大潛力[109]。
Weidmann等[110]實現了第一個基于QCL的CO2同位素分析。Rubin等[111]使用基于QCL的裝置測定人體呼出氣中的12CO2/13CO2比率，從而用于測試肝功能。內源性產生的一氧化碳（carbon monoxide，CO）被認為可能是反映肺部炎癥或氧化應激的指標。Ghorbani等[112]利用MHF調諧范圍為2 080～2 173 cm?1的連續波外腔調諧量子級聯激光器（continuous wave external cavity quantum cascade laser，CW-EC-QCL）同時實時測量呼出的CO和CO2。發現采用有效路徑長度為3.99 m的圓形多通池和2f-WMS曲線擬合，CO和CO2的檢測下限分別可在0.14 s的光譜采集時間內達到9 ppbv和650 ppmv。在人體新陳代謝中，NO參與了許多與免疫反應和神經傳遞有關的重要代謝過程[113]。McCurdy等[114]報道了一種基于集成腔輸出光譜的光譜儀，該光譜儀采用工作頻率為1 915 cm-1的分布反饋式連續準直輸出量子級聯激光器（continuous wave distributed-feedback quantum cascade laser，CW-DFB-QCL），能夠在單個呼吸周期內實時測量NO和CO2。呼出氣中氨濃度升高與肝腎疾病和幽門螺桿菌感染有關，Manne等[115]研制了一種基于脈沖腔衰蕩光譜的呼出氣分析儀用于檢測呼出氣中的氨含量，采用DFB-QCL，工作頻率在970 cm?1附近，積分時間為20 s，用于人體呼出氣分析的靈敏度為50 ppbv。Owen等[116]開發了一種基于CW-DFB-QCL的氨呼出氣傳感器，該傳感器工作在1103.44 cm-1附近，采用2f/1f-WMS探測，最低可檢測到的氨氣濃度為7 ppbv。
QCL技術還被用于分析呼出氣中的有機化合物。眾多標志性有機化合物已經成為利用QCL進行光譜分析的目標[117-118]。丙酮是肺部內源性釋放的最豐富的揮發性化合物，它的含量變化可以反映出人體的疾病狀態，比如人體呼出氣中丙酮水平升高與Ⅰ型糖尿病有關[119]。Ciaffoni等[120]開發了一種將工作在約8.2 mm（1 216.5 cm?1）的CW-DFB-QCL與腔增強吸收光譜相結合的光譜儀裝置。在實驗去除水蒸氣后，獲得與質譜法相似的丙酮濃度，最低檢出限為0.51 ppmv。Reyes-Reyes等[121]采用覆蓋850～1250 cm?1之間光譜區域的脈沖EC-QCL，使用光程約為55 m的多程氣體室進行光譜的直接吸收。在去除吸水線之后，通過多線擬合計算獲得丙酮濃度，檢測下限為0.15 ppmv。
研究學者除了關注于單一氣體種類檢測的方法外，還嘗試在呼出氣樣本中進行多種氣體的分析。Shorter等[122-123]研制出一個綜合檢測系統，該系統包括用于多呼出氣流動的呼吸采樣系統和相關的泵送系統，以及2個氣體傳感器，采用75 m多通池和脈沖DFB-QCL，分別在1 900 cm?1下分析NO和CO2，在2 190 cm?1下分析 CO和N2O。對CO2的監測提供了確定死腔體積的額外價值。對于NO，在1 s的積分時間下檢測下限為0.9 ppbv。該傳感器設備允許以10 Hz的采集速率采集實時數據。這個裝置是第一個基于QCL的用于對哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者呼出氣臨床研究的系統。
QCL在呼出氣檢測中已經進行了大量的基礎研究工作，同時已經有關于呼出氣中常見的無機化合物的檢測系統在臨床進行測試，其操作簡單、攜帶方便、無創、可重復等優點突出，在疾病診斷的應用上擁有巨大潛力。遺憾的是，QCL用于呼出氣檢測在肺癌診斷方面尚缺乏相關研究報道，原因可能與呼出氣中有機化合物成分復雜以及尚未發現可靠、準確性較高的標志物有關。
2.3.2 二次電子噴霧電離質譜
二次電子噴霧電離質譜（secondary electrospray ionization-mass spectrometry，SESI-MS）同樣是一種基于質譜的VOCs分析方法。在這種方法中，呼出的氣體與噴灑的溶劑混合，從而導致被分析化合物的電離，然后再進行質譜分析[124]。Li等[125]推薦使用高分辨率設置的二次電子噴霧電離質譜儀來分析呼出氣中的VOCs。Sinues等[126]使用SESI-MS對12名志愿者的1 d內不同時段的呼出氣進行檢測，初步探索了人呼出氣成分的晝夜變化規律。后來他們將乳腺癌患者和健康受試者納入研究 [127]，用SESI-MS對呼出氣進行檢測分析并使用支持向量機建立模型，該模型可以很好地將乳腺癌與健康受試者進行區分，靈敏度和特異度均高于0.9。SESI-MS進行呼出氣VOCs檢測已經在醫學診斷領域顯示出較大能力，但目前鮮有將此技術用于肺癌診斷的報道。
3 前景展望
肺癌仍是我國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，提高肺癌的早期診斷率是提高肺癌生存率降低死亡率的重要措施。相較于目前常見的肺癌診斷方法，針對呼出氣的檢測具有無創、便捷、可重復等特點，其在肺癌的早期診斷領域擁有巨大潛力。有關呼出氣分析與肺癌診斷的相關研究已有數十年，眾多研究取得了較高的準確度、靈敏度和特異度（表1），但呼出氣分析用于肺癌診斷仍存在不足。
表1
VOCs分析在肺癌檢測中的臨床應用
GCMS作為VOCs分析的經典方法，其技術高度標準化，可兼容如SPME的預濃縮技術以進一步提高檢測靈敏度。但是GCMS價格昂貴，分析時間長，對操作人員的要求較高。基于傳感器技術的電子鼻具有廉價、便攜、快速的特點，但其是VOCs的模式識別，無法確定VOCs物質，而電子鼻中的傳感器種類眾多，在VOCs檢測上各具優勢，結合不同的數據分析模式，診斷肺癌的準確度、靈敏度、特異度各不同，目前尚沒有公認的最適合用于肺癌診斷的電子鼻。雖然用經過訓練的犬進行氣味辨別似乎相對簡單和廉價，但是受制于訓練方法等因素影響，該方法的重復性差、臨床推廣難。在VOCs的收集和保存上同樣存在眾多影響因素，包括環境中VOCs、收集材料自身VOCs的干擾，呼出氣時相、呼出氣流速和過度通氣對VOCs采集的影響，溫濕度及儲存時間對標本的影響。另外在診斷模型的建立中，應充分考慮年齡、性別、飲食、藥物、吸煙等因素對VOCs的影響。
EBC雖然能提供更多的生物信息，但目前的研究仍處在篩選標志物的階段，還需要更多涉及蛋白質及核酸分子層面的深入研究來達到早期診斷肺癌的目的。SESI-MS 作為MS的一種，已有研究證實其用于呼出氣VOCs是可行的，目前缺乏的是在肺癌領域的應用。QCL技術在氣體檢測上具有檢測迅速、無需對氣體進行處理、操作簡單、重復性好等優勢，可能在肺癌呼出氣診斷上潛力巨大。但目前QCL技術在肺癌呼出氣檢測領域的研究極度缺乏，原因可能與尚未發現靈敏度、特異度均較高的肺癌呼出氣標志物有關。
呼出氣分析在肺癌早期篩查及診斷上潛力無窮，有望在肺癌的二級預防上做出貢獻[128]。但目前呼出氣相關檢測分析在肺癌的早期診斷上仍處于探索階段，距離臨床推廣應用還有很多工作要做。首先，目前仍需要尋找肺癌VOCs標志物及標志物組合用于肺癌診斷。這需要進行深入的代謝組學研究，明確肺癌內源性VOCs的產生及外源性VOCs的代謝轉化，這將有助于肺癌VOCs標志物的尋找。其次，應用于肺癌篩查的呼出氣檢測分析系統應具有無創、快速、便捷、重復性好等特點，QCL和電子鼻是理想的肺癌篩查的載體，性能更優良、更智能的材料及儀器的開發仍然是需要的，但基于肺癌VOCs標志物及其組合的儀器開發將會事半功倍。最后，需要對呼出氣采集的流程、條件進行標準化，努力實現各研究成果的可比性。
利益沖突：無。
作者貢獻：謝少華、向潤撰寫、修改文章；謝天鵬、李強設計、修改文章。
據世界衛生組織國際癌癥研究機構發布的《世界癌癥報告》2020版數據顯示，肺癌的發病率居全球第二，而死亡率仍居所有惡性腫瘤之首[1]。中國的新發癌癥人數和癌癥死亡人數均為全球第一，其中肺癌死亡人數遠高于其它癌種。與歐美發達國家相比，我國癌癥的死亡率高，5年、10年生存率較低。究其原因，是我國癌癥的早期診斷率較低[2]。癌癥患者早、晚期診斷的5年生存率相差巨大，早期診斷者生存率可達到70%～90%，而晚期則驟降至12%[3-4]。早期肺癌并沒有特征性的臨床癥狀，所以大多數患者出現明顯癥狀而就診時已經處于中晚期[5]。因此，提高肺癌的早期診斷率對于降低其死亡率、提高生存率至關重要。傳統肺癌診斷方法有胸部X線片、胸部CT、痰液脫落細胞學檢查等，都具有各自的局限性，因此目前需要一種簡單、快速、靈敏、無創的診斷方法用于肺癌的早期篩查及診斷。呼出氣的檢測分析具有快速、無創、重復性好等特點，在肺癌的早期診斷上顯現出巨大潛力，有望成為肺癌的早期篩查工具[6-7]。
1 傳統肺癌診斷方法現狀
血液中的腫瘤標志物和痰液脫落細胞學檢查在肺癌診斷上的靈敏度和特異度均較低[8-9]，而電子支氣管鏡活檢更適用于中央型肺癌的診斷[8]。使用胸部X線片作為肺癌篩查工具可提高早期肺癌的檢出率、生存率，卻無法降低死亡率[10-12]，其顯示的是重疊影像且對肺小結節的顯影不佳，容易造成漏診[13]。正電子發射計算機斷層顯像（positron emission tomography-CT，PET-CT）的檢測費用昂貴，同時對直徑＜7 mm的肺結節診斷靈敏度不高，不適合應用于肺癌篩查[14]。目前臨床上廣泛用于肺癌篩查的是低劑量CT（low-dose computed tomography，LDCT）。其輻射劑量低、肺小結節檢出率高，可使肺癌的死亡率降低20%[15]，已被各大指南推薦作為高危人群的肺癌篩查手段。但伴隨LDCT高檢出率導致的高假陽性率及過度診斷[15]，而后的活檢確診及CT隨訪都加重了患者及社會的經濟負擔[16-17]。長期的LDCT隨訪對患者造成了心理壓力，同時帶來了輻射暴露風險，這些都是LDCT作為大規模人群早期肺癌篩查工具的局限性。
2 呼出氣分析與肺癌診斷
肺是人體代謝最活躍的器官之一，人體組織產生的代謝產物一部分釋放入血，在肺部進行物質交換并通過呼吸道排出體外，因此呼出氣可以反映機體的疾病狀態。臨床上早有將呼出氣用于疾病診斷的經驗，如糖尿病患者酮癥酸中毒時出現爛蘋果味的呼出氣，肝臟疾病患者的呼出氣可呈魚腥臭味[18]，這都提示患病狀態下的呼出氣與健康狀態下不同，早期肺癌患者的呼出氣成分可能已經出現類似改變，因此針對呼出氣的檢測分析有望成為早期肺癌的無創篩查手段。呼出氣的組成成分大致可分為3類：（1）無機化合物，如：氧氣、二氧化碳（carbon dioxide，CO2）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、氮氣等；（2）可揮發性有機化合物（volatile organic compounds，VOCs），如各類飽和及不飽和烴、酮類、醇類、酯類等[19]；（3）不可揮發性有機化合物，如各種細胞因子、腫瘤標志物等[18]。其中VOCs及不可揮發性有機化合物與肺癌的關系是國內外研究的重點。
2.1 可揮發性有機化合物的檢測分析與肺癌診斷
呼出氣中VOCs按其來源可分為內源性和外源性兩大類。內源性VOCs是指機體自身組織各種代謝途徑產生的并經過呼吸道排出體外的代謝產物，其最能反映肺癌的異常代謝狀態。外源性VOCs被認為是由環境污染或食物等外部來源引入呼吸道內的，是需要分辨并排除的干擾因素。
2.1.1 基于質譜分析技術的可揮發性有機化合物檢測與肺癌診斷
2.1.1.1 氣相色譜質譜技術
質譜技術（mass spectrometry，MS）能準確測定出生物大分子的分子量，被廣泛應用于有機分子的鑒定。氣相色譜技術（gas chromatography，GC）是針對氣態化合物進行分離和分析的技術，它檢測的靈敏度高，對VOCs的檢測可達到十億分比（part per billion，ppb）濃度水平，是目前對呼出氣進行分析的最常用技術。GC常與MS聯用，可以獲得呼出氣中所含化合物的準確信息，因此氣相色譜-質譜法（gas chromatography mass spectrometry，GCMS）成為呼出氣VOCs檢測分析最常用且準確性相對較高的技術。
1971年，Pauling等[20]首先開始對健康人呼出氣成分進行探索，由此啟發了學者對呼出氣的深入研究。1985年，Gordon等[21]率先使用GCMS檢測分析了肺癌患者呼出氣中的VOCs，其引發了學者們探索呼出氣VOCs在肺癌領域的診斷價值的熱情。Phillips作為呼出氣VOCs研究領域的佼佼者，使用GCMS方法在50名健康志愿者的呼出氣中檢測發現了3 481種不同VOCs，其中有27種VOCs在所有志愿者的呼出氣中均可檢出[22]。1999年，Phillips等[23]納入肺癌及非肺癌受試者，對比篩選出22種VOCs作為肺癌標志物，這些VOCs主要為烷烴類及其衍生物以及苯的衍生物。以此建立的肺癌診斷模型可明顯區分出肺癌及非肺癌受試者，其靈敏度為71.7%、特異度為66.7%。2007年，Phillips等[24]的后續研究擴大樣本量并采用了不同統計分析及建模方法。他們按照2∶1比例將404例受試者分為建模組和驗證組，最后共篩選出16種VOCs作為標志物，診斷模型的靈敏度為84.6%，特異度為80.0%。Rudnicka 等[25]通過GCMS方法鑒定出呼出氣中88種VOCs，使用判別函數分析、因子分析和人工神經網絡等統計方法組合，最終篩選出7種對肺癌鑒別能力最高的VOCs，在測試組中的靈敏度和特異度均為86.36%。
2005年，Poli等[26]將固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）技術與GCMS技術相結合，對呼出氣樣品的預處理方法進行了技術優化，加快了樣品分析檢測的速度。該研究共納入非小細胞肺癌（non-small cell cancer，NSCLC）、慢性阻塞性肺疾病和無癥狀的吸煙/非吸煙者4類人群，篩選出13種VOCs（主要為烯烴、烷烴及其衍生物）建立的診斷模型可將82.5%的受試者正確分類，特異度達到93.6%，而敏感度為72.2%。另外該研究在對肺癌受試者的術后隨訪中發現，其呼出氣中異戊二烯和癸烷的濃度水平相較于手術前明顯降低。2010年，Poli團隊[27]再次使用SPME-GCMS技術對醛類在NSCLC中的診斷潛力進行了評估。結果顯示，直醛與NSCLC的關系密切，可作為診斷的生物標志物，其增加了前期確定的VOCs診斷模式的靈敏度和特異度。Fuchs團隊[28]的研究也發現，肺癌受試者呼出氣中多種醛類包括戊醛、己醛、辛酸和壬醛的濃度顯著升高，這同樣提示呼出氣中的醛類物質可能作為肺癌診斷的標志物之一。Long等[29]的研究表明，使用SPME-GCMS對呼出氣VOCs檢測分析，即使針對Ⅰ、Ⅱ期的肺癌也能展現出良好的診斷能力，靈敏度和特異度可達到90%和88%。Koureas 等[30]將肺癌、肺良性疾病和健康受試者納入研究，用SPME-GCMS技術對呼出氣VOCs進行分析，分別進行了靶向性和非靶向性呼出氣分析，結果將靶向性呼出氣分析以外的VOCs納入非靶向性分析仍能夠區分肺癌與非肺癌受試者。
2.1.1.2 質子轉移反應質譜技術
GCMS痕量分析技術可為研究者提供最詳細的分析信息，信息量大、覆蓋面廣、精確度高，并且可識別出單一氣體成分，成為目前用于呼出氣檢測最常用最經典的技術之一。但GCMS同樣存在其局限性，其常常需要結合SPME等預濃縮技術進行樣品預處理，同時該技術設備系統價格昂貴，檢測分析程序復雜、耗時較長，并且操作人員需要經過高度專業的培訓，這些都限制了該技術在臨床上的推廣應用。直接使用MS可以簡化樣品的制備，并提高時間分辨率，研究者們使用直接MS對呼出氣VOCs檢測分析并進行了較多的研究。
質子轉移反應質譜（proton-transfer-reaction mass spectrometry，PTR-MS）是一種基于質子轉移反應的軟電離質譜技術，主要原理為被檢測化合物與H3O+發生質子轉移反應，而后進行質譜分析，從而測定化合物的分子量[31]。Moser等[32]使用PTR-MS描述了健康受試者的呼出氣特征，并首次將平均患者樣本的質譜特征描述為可能的參考值。Feinberg等[33]使用PTR-MS證實了口服葡萄糖耐量試驗對肺癌患者的呼出氣VOCs特征影響很小。Wehinger等[34]用PTR-MS對原發性肺癌及非肺癌患者的呼出氣VOCs進行檢測分析，發現質荷比為31和43的VOCs最能區分肺癌和非肺癌組的呼出氣。Bajtarevic等[35]使用PTR-MS和SPME-GCMS兩種方法對比了肺癌及健康受試者的呼出氣。他們認為兩種方法各有優勢，PTR-MS檢測下限比SPME-GCMS更低，同時不需要預濃縮等預處理措施，但PTR-MS的主要缺點在于不能確定化合物。
2.1.1.3 選擇離子流管質譜技術
選擇離子流管質譜（selected ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS）技術，將流動管技術、化學電離和質譜相結合，選擇性應用H3O+等初始離子，可對樣本中的VOCs進行多組分實時在線分析[36-37]。Diskin 等[38]使用SIFT-MS對5例受試者30 d內的呼出氣中丙酮、異戊二烯、乙醇、氨和乙醛的濃度進行了分析，結果表明5例受試者呼出氣中的上述VOCs沒有明顯的分布模式。Smith等[39]在一項針對SK-MES和 CALU-1兩種細胞系的體外實驗中，使用SIFT-MS對細胞培養的頂空氣中乙醛的濃度進行檢測分析，發現兩種細胞系的乙醛產生速率不同并且乙醛的濃度與癌細胞的數量成正比。Sulé-Suso等[40]的研究中，在NL20正常肺上皮細胞培養基的頂空氣中通過SIFT-MS同樣檢測到乙醛的釋放，但是同時檢測到CO2的含量很少，故推測其正常代謝受到抑制。2021年，Tsou等[41]報道的一項研究中納入了148例肺癌受試者和168名健康受試者，使用GC-MS檢測了呼出氣中116種VOCs，并使用SIFT-MS 進行定量分析，結合極端梯度增強（XGBoost）的機器學習方法建立了一個肺癌預測模型，預測模型在調整了混雜因素的影響后準確度為92%，靈敏度為96%，特異度為88%，曲線下面積為0.98。SIFT-MS 作為一種靈敏度高的實時在線分析技術，具有較大的臨床應用潛力。但是該技術需要微波電離源，這使檢測成本增加。另外，待測樣品與初級離子間的質子親和勢差異是待測樣品離子的產生基礎，因此該技術只能檢測到部分VOCs，提供的信息相對較少。
2.1.1.4 傅立葉變換離子回旋共振質譜技術
傅立葉變換離子回旋共振質譜技術（Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，FT-ICR MS）是基于測量磁場中離子回旋頻率而獲得離子質荷比信息的分析技術。其超高的分辨率（>1 000 000）、高質量精度（<1 μppm）等分析特性，使它成為代謝組學、蛋白質組學、石油組學和復雜混合物研究的重要工具[42]。2014年，Fu等[43]使用FT-ICR MS對肺癌受試者、健康吸煙/不吸煙受試者和肺良性結節受試者的呼出氣進行檢測分析，結果顯示肺癌患者呼出氣中2-丁酮、2-羥基乙醛、3-羥基-2-丁酮和4-羥基己烯醛濃度明顯高于健康對照組和肺良性結節對照組。同時，在NSCLC組中Ⅱ～Ⅳ期受試者呼出氣中2-丁酮濃度明顯高于Ⅰ期受試者。2015年，Li等[44]應用FT-ICR MS分析發現6種VOCs在肺癌受試者中的濃度大于對照組，以此建立的分類模型可將肺癌與不吸煙者、吸煙者、肺良性結節者準確區分，準確度分別為97%、95%和89%。
2.1.1.5 萃取電噴霧電離-質譜技術
萃取電噴霧電離-質譜技術（extractive electrospray ionization mass spectrometry，EESI-MS）作為一種新興的MS，其原理是用電噴霧通道將樣品和帶電試劑（甲醇或水）噴射到離子源空間，樣品中的化合物被提取到帶電試劑的液滴中，經過去溶以獲得分析物的離子，用于后續的質譜檢測。EESI具有較高的長期穩定性和靈敏度，可對待測VOCs直接電離，不需對樣品進行預處理，可以實現快速、實時的在線分析[45]。Zuo等[46]的研究中采用EESI-MS技術試圖尋找肺癌的特定診斷標志物VOCs。結果表明，肺癌患者呼出氣中的丁二烯、乳清酸、四氫生物蝶呤和N-苯基乙酰谷氨酰胺的含量與對照組和肺部感染組明顯不同。
2.1.2 基于傳感器技術的可揮發性有機化合物檢測與肺癌診斷
人類對于氣味的分辨是個復雜的過程，鼻子吸入的空氣中的氣味分子與神經細胞受體結合，而后神經沖動信號傳遞到大腦形成對氣味的判斷。類似于人類鼻子，研究人員將一種由具有部分靈敏度的電子化學傳感器陣列和能夠識別簡單或復雜氣味的模式識別系統組成的儀器定義為電子鼻，即人工嗅覺系統[47]。電子鼻不能對VOCs的具體物質進行識別和定量，而是對VOCs組合的混合模式識別，因此電子鼻需要經過訓練后再用于疾病診斷。相較于MS的高成本和復雜性，電子鼻技術更便捷、快速、廉價，這也引起了研究者們的濃厚興趣。電子鼻技術包含了傳感器陣列、數據采集系統、信號處理系統、數據存儲單元，以及用于檢測和分析各種蒸氣形式的化學物質的人工智能系統[48]。傳感器是電子鼻的基本組成之一，理想的傳感器應具有準確度高、靈敏度高、特異度高、重復性好、受環境影響小、快速便捷等特點，因此傳感器的原理和制作工藝一直是研究人員關注的重點。傳感器包含了光學氣體傳感器、導電聚合物傳感器、電化學傳感器、壓電傳感器、金屬氧化物半導體等多種類型[49]。
2.1.2.1 導電聚合物傳感器
導電聚合物傳感器的工作原理是基于傳感器電阻會因氣體在傳感器表面的吸收而改變，這些傳感器通過涂覆不同的材料以提高傳感器在環境溫度下工作時對VOCs的靈敏度[50]。目前使用較多的基于導電聚合物氣體傳感器的電子鼻是Cyranose 320，它使用了32個碳黑聚合物復合化學電阻器陣列，是較早投入商用的電子鼻之一。2005年，Machado 等[51]將 Cyranose 320電子鼻用于呼出氣檢測，可以將肺癌和對照組區分，靈敏度為71.4%，特異度為91.9%。McWilliams等[52]使用Cyranose 320對比了191例受試者的呼出氣樣本，發現其可將肺癌與高危吸煙對照組明顯區分，準確率大于80%。Hubers 等[53]使用Cyranose 320區分肺癌和對照組的靈敏度為80%，特異度為48%。當將Cyranose 320與痰液中RASSF1A高甲基化相聯合應用時，診斷肺癌的靈敏度可達到100%。Tirzīte等[54]將Cyranose 320與支持向量機數據分析方法結合，可以在87.3%的病例中正確分類肺癌及非肺癌受試者。其中非肺癌受試者中包含了慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺炎、肺栓塞、良性肺腫瘤受試者和健康受試者。Bikov等[55]發現，呼出氣流速、屏氣時間和解剖死腔的存在均顯著影響了Cyranose 320電子鼻對肺癌的辨別能力。Rodríguez-Aguilar 等[56]的橫斷面研究中，將肺癌、乳腺癌、慢性阻塞性肺疾病和健康對照受試者納入研究，使用Cyranose 320電子鼻結合主成分分析方法可以將患癌組與對照組區分，準確率為100%。
2.1.2.2 壓電氣體傳感器
石英晶體微天平（quartz microbalance，QMB）和聲表面波（surface-acoustic waves，SAW）器件是現有電子鼻系統中使用的兩種重要的壓電氣體傳感器。QMB的工作原理是將氣敏聚合物或半導體金屬氧化物涂覆在石英晶體壓電盤上，VOCs吸附在石英晶體表面后會引起石英晶體的質量和振蕩頻率改變[57-58]。Di Natale等[59]使用由8個QMB組成的電子鼻檢測呼出氣中VOCs，同時使用偏最小二乘法判別分析方法進行數據處理，結果可以很好地將肺癌與對照組區分。Gasparri 等[60]的研究中同樣使用了由8個QMB組成的電子鼻，其區分肺癌與對照組的靈敏度為81%，特異度為91%，并且在Ⅰ期肺癌中觀察到最大的靈敏度，可達到92%。D'Amico等[61]使用QMB分別對肺癌、肺部其它疾病和健康受試者的呼出氣VOCs檢測。建立的模型區分肺癌和健康受試者的靈敏度和特異性分別為85%和100%，區分肺癌和其它肺疾病受試者的準確率為85.7%，靈敏度為92.8%，特異度為78.6%。Rocco等[62]使用包含QMB傳感器的BIONOTE多傳感系統，在參加肺癌篩查計劃的患者中進行檢測，其肺癌識別的總體靈敏度和特異度分別達到86%和95%。同時作者認為，使用BIONOTE系統可降低LDCT篩查肺癌時帶來的假陽性率。
類似地，SAW氣體傳感器的工作原理是通過涂有傳感材料的壓電襯底測量氣體引起的聲波傳播頻率的變化[63]。Chen等[64]使用了一種帶有固相微萃取和毛細管柱的電子鼻，用以對VOCs進行濃縮和分離，加上一對表面涂有薄聚異丁烯薄膜的SAW傳感器對VOCs進行檢測。最終發現11種VOCs可被認定為肺癌生物標志物，并且電子鼻與改進的人工神經網絡算法結合成像方法進行模式識別可用于臨床肺癌患者的診斷。
壓電式氣體傳感器具有靈敏度高、響應時間短、功耗低、體積小、穩定性好等優點。但是，這些壓電傳感器工作在非常高的頻率下導致其信噪比很低，并且需要復雜的電子電路來描述其信號響應，因此很難作為高效電子鼻系統的支撐元件[49]。
2.1.2.3 金屬氧化物半導體氣體傳感器
基于金屬氧化物半導體的氣體傳感器被認為是最具吸引力的傳感器之一。固態電阻型金屬氧化物氣體傳感器具有靈敏度高、結構簡單、穩定性好、成本較低等優點，因而受到關注。多種半導體金屬氧化物如二氧化錫、氧化鋅、氧化銅、二氯化鈦、三氧化鎢和氧化鎳已被用來制作傳感器元件用以檢測VOCs[49]。
SpiroNose 電子鼻裝置是一種包含5個相同金屬氧化物的半導體傳感器陣列，已被用于氣體檢測。2015年，de Vries 等[65]研究發現，使用SpiroNose 電子鼻系統可以充分區分肺癌、健康、哮喘和慢性阻塞性肺疾病受試者。2019年，de Vries團隊[66]的一項前瞻性觀察性研究納入了擬行抗細胞程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein-1，PD-1）治療的143例NSCLC，結果使用SpiroNose電子鼻裝置可以明顯區分對抗PD-1治療3個月后有無反應的肺癌患者，因此作者認為使用電子鼻檢測VOCs可以預測患者對免疫療法的反應。
eNose公司生產的Aeonos電子鼻，包含3個微熱板金屬氧化物傳感器，已投入商用。Kort 等[67]的一項前瞻性多中心研究共納入NSCLC及健康受試者共290人，使用10個Aeonos電子鼻裝置對呼出氣進行分析，結果發現使用該裝置排除肺癌的靈敏度達到94.4%，同時對各種肺癌亞型具有很高的隱形預測價值。Marzorati 等[68]設計開發的電子鼻包含了4種商用金屬氧化物氣體傳感器陣列（TGS2600、TGS2602、TGS822、MQ3），該電子鼻對對肺癌的識別靈敏度、特異度和準確度分別為85.7%、100%和93.8%。但該研究納入的病例數較少，僅納入肺癌受試者6例和健康受試者10名。
2.1.2.4 比色傳感器
比色傳感器由化學敏感的化合物組成，這些化合物與VOCs相互作用時顏色會改變[69]。然后，由具有精確定時的高質量系統拍攝圖像，并對所產生的圖像內容進行處理，以確定待檢測的VOCs含量[49]。Mazzone團隊長期致力于使用比色傳感器分析呼出氣，他們將NSCLC患者、健康對照者和其它肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病、結節病等患者作為受試者，使用比色傳感器陣列系統對受試者呼出氣進行分析，建立的預測模型的敏感度為73.3%，特異度為72.4%。在后期的研究[70]中，他們將受試者的吸煙狀況、年齡和性別共同納入預測模型中，進一步提高了模型預測的準確度。Huo等[71]使用具有金納米棒-金屬卟啉聚合物的比色傳感器陣列檢測了肺癌的6種標志性VOCs，包括癸烷、十一烷、己醛、庚醛、苯和1，2，4-三甲苯。結果發現該傳感器可快速準確識別VOCs，有望用于肺癌篩查。Zhong 等[72]使用一個比色傳感器陣列成功地區分了與肺癌相關的20種VOCs，并且在不同濕度下該裝置仍能呈現出良好的重復性和穩定性。
2.1.2.5 金納米傳感器
Peng等[73]開發了一種基于包覆不同化合物的金納米顆粒構成的傳感器陣列的電子鼻。該電子鼻可以將肺癌和健康受試者的呼出氣區分開，并且不受高濕度環境的影響。Shlomi等[74]的研究表明，使用金納米傳感器可以區分早期肺癌和肺良性結節受試者，準確度達87%。同時該傳感器可以將人類表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變型和野生型的肺癌受試者區分開，準確度為83%，靈敏度為79%，特異度為85%。Barash等[75]使用金納米顆粒傳感器對不同細胞系的頂空氣體進行檢測分析，結果該傳感器可將不同肺癌組織細胞系與正常對照細胞系區分開來，準確度為93%，敏感度為96%，特異度為86%。同時該傳感器可區分小細胞與NSCLC細胞系、腺癌與鱗狀細胞癌細胞系。Peled等[76] 用GCMS法檢測了不同基因突變的肺癌細胞系的頂空氣體VOCs，共篩選出5種VOCs與研究的目的致癌基因相關聯。同時使用基于金納米傳感器陣列構建的VOCs模式識別方法，可以很好區分出EGFR、間變性淋巴瘤激酶、Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因突變的細胞系。
2.1.2.6 其它傳感器
Chen等[77]使用氧化石墨烯和不同金屬離子組成的柔性電子鼻，借助人工神經網絡，對肺癌的診斷可達95.8%的靈敏度和96.0%的特異度。Huang 等[78]的一項前瞻性研究中，使用碳納米管傳感器陣列分析肺癌及健康對照受試者呼出氣，建立的肺癌診斷模型在外部驗證中使用線性判別分析和支持向量機的受試者工作特征曲線下面積均≥0.9。Davies等[79]在探索肺細胞TP53和KRAS突變特定揮發特征的研究中，在熱脫附-氣相色譜質譜分析中單個化合物區分細胞系的能力有限。但通過應用由金納米顆粒和單壁碳納米管組成的交叉反應化學電阻傳感器陣列，在使用20個VOCs的組合時可以成功區分所有細胞類型，準確率為80%～100%。Chen的團隊[80]自行開發的電子鼻系統包含了11個氣體傳感器和2個溫濕度傳感器，使用內核主成分分析與XGBoost相結合的模型可以很好地將肺癌與健康受試者區分，準確度、靈敏度和特異度分別為93.59%、95.60%和91.09%。并且該系統可將Ⅲ期與Ⅳ期肺癌區分開，準確率超過80%。
2.1.3 犬類檢測
犬類擁有高度發達的嗅覺，基于犬對氣味高度敏感的特點，經過訓練的工作犬已廣泛應用于緝毒、刑偵、海關等特殊工種中。Williams等[81]和Church等[82]曾報道2例患者的皮膚病變吸引了犬的注意，其中1例患者后來確診為黑色素瘤，而另1例確診為基底細胞癌。一個奇怪的現象是在患者切除病灶后，犬并未展現出進一步的興趣。這些現象提示，腫瘤可能會產生獨特的氣味分子，而這些特殊氣味可以被犬的嗅覺系統捕獲并分辨出來。2006年，McCulloch等[83]訓練了5只普通家犬來分辨肺癌受試者的呼出氣樣本。與活檢結果相比，犬識別出肺癌的靈敏度為99%，特異度為99%，同時犬對呼出氣的分辨不受腫瘤分期、受試者年齡、吸煙習慣等因素的干擾。而Ehmann等[84]的研究增加了慢性阻塞性肺疾病病種及患者入組例數，結果發現經過訓練后的犬對肺癌受試者呼出氣的識別敏感度為71%，特異度為93%。Guirao等[85]的研究顯示，訓練有素的犬可以通過嗅聞呼出氣從惡性孤立性肺結節中準確識別出肺癌結節，靈敏度為97%，特異度為99%。
研究人員也嘗試對犬類識別肺癌的原因進行了探索。Buszewski等[86]使用訓練后的犬對肺癌受試者呼出氣進行分別，同時將呼出氣中VOCs用GCMS法進行分析并對比，結果顯示乙酸乙酯和2-戊酮與犬的反應正相關，而乙腈、丙醛和正丙醇與犬的反應呈負相關。因此可以看出，犬能根據特定的氣味分子來識別不同呼出氣標本，但目前尚不明確犬分辨出的氣味分子是單一成分還是多種成分的混合物，以及其具體是哪種VOC。Mazzola 等[87]對嗅探犬的工作穩定性進行了研究，在訓練完成間隔1年后，嗅探犬仍然能夠通過尿液辨別出肺癌患者，1年的時間中斷和測試環境的變化并沒有導致犬的感知能力出現統計學上的顯著差異。Biehl等[88]的研究表明，犬之間識別肺癌的準確性差異巨大，其準確性取決于犬的訓練方式和呼出氣采樣載體材料。
2.1.4 其它可揮發性有機化合物檢測技術與肺癌診斷
離子遷移譜法（ion mobility spectrometry，IMS）通過使用電離源將氣體化合物分解成離子，然后以離子漂移時間的差別來進行離子的分離定性[89]。其結構簡單、靈敏度高，適合揮發性有機化合物的痕量檢測。Westhoff等[90]對肺癌和健康受試者呼出氣的IMS分析結果顯示，通過IMS色譜圖中23個峰區域的組合可以實現兩組的完美區分，準確率為100%。Handa 等[91]對50例肺癌受試者和39名健康受試者的呼出氣進行IMS分析，發現10種明顯不同的VOC峰并作為區分兩組的重要化合物，使用以正十二烷為起點的決策樹算法區分兩組的靈敏度和特異度分別達到76%和100%。同時發現，肺腺癌患者中EGFR突變陽性患者的正十二烷峰明顯高于EGFR突變陰性患者。Darwiche 等[92]使用柔性支氣管鏡收集肺癌患者患側肺及健側肺呼出氣，使用IMS技術進行VOCs檢測，通過比較兩側肺中VOCs的差異，作者認為肺癌患者的VOCs是在腫瘤內部或周圍局部產生的。
Xia等[93]開發了一種智能蒸汽發生紙基薄膜微萃取系統。該系統可以實現對揮發性甲醛靈敏的實時熒光檢測和準確的表面增強拉曼光譜量化，既可以準確區分肺癌和對照組，又為實時智能傳感器的設計開辟了思路。Li等[94]則開發了一種即時測試紙用于檢測呼出氣中的醛類物質。該試紙將探針分子4-氨基硫酚錨定在紙基材料上并與質譜儀直接耦合，具有靈敏、便捷和低成本的特點。結果顯示，肺癌患者呼出氣中醛標志物含量明顯高于健康對照組。
2.2 不可揮發性有機化合物的檢測分析與肺癌診斷
呼出氣中包含一些不可揮發性有機化合物如蛋白質和核酸分子，其來自于呼吸道中，雖不具有揮發性但可以以氣溶膠的方式隨呼出氣排出體外。在經過溫度為–196℃的冷凝管時，呼出氣中的氣溶膠沉淀下來并形成一種冷凝物，常被稱為呼出氣冷凝物（exhaled breath condensate，EBC）[95]。EBC的采集具有簡單、安全、可重復的特點，而EBC中存在的大分子有機物包含了更多的生物信息，這為肺癌的無創診斷指引了新方向。
Carpagnano的團隊[96-97]在長期關于EBC的研究中發現，NSCLC患者與健康對照組相比，EBC中內皮素-1和白細胞介素-6的濃度明顯升高，而且這種差異與分期明顯相關。研究同時發現，有14例肺癌受試者的EBC中內皮素-1濃度在手術后顯著降低。上述結果提示EBC中的內皮素-1有望成為肺癌診斷及隨訪的標志物之一。陳琳等[98]的研究同樣發現，EBC中內皮素-1可作為NSCLC診斷標志物，其診斷肺癌的靈敏度和特異度分別為95.12%和53.33%。Carpagnano等[99]又對EBC中的腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-2、瘦素展開研究，發現肺癌患者EBC中上述物質的濃度明顯高于對照者并且與腫瘤分期密切相關。秦娥等[100]的研究發現，NSCLC組EBC中轉移生長因子β1水平明顯高于對照組，并且這種差異與組織分型、病理分期均相關。董敬軍等[101]和陳琳[102]均報道了NSCLC受試者的EBC中癌胚抗原的含量明顯高于對照組。鄒瑩暢[103]首次報道在EBC中檢測出鱗狀細胞癌抗原和神經元特異性烯醇化酶兩種腫瘤標記物，并且發現相較于對照組，NSCLC組鱗狀細胞癌抗原、神經元特異性烯醇化酶、癌胚抗原的濃度更高。
2005年，Carpagnano等[104]將NSCLC及健康受試者納入研究，對其EBC和全血中染色體3p區的5個微衛星變異情況進行了分析對比。結果顯示，NSCLC受試者中在53%的EBC-DNA和10%的全血DNA信息基因座中發現了微衛星變異，其變異頻率明顯高于健康受試者的13%和2%。研究還發現，NSCLC受試者EBC-DNA中檢測到的微衛星變異數量與吸煙量顯著相關。Carpagnano等[105]的后續研究中，進一步將NSCLC受試者的EBC與肺癌組織中的DNA進行對比，發現EBC與其相應肺癌組織的DNA微衛星變異譜相對應，提示我們可能通過檢測EBC中DNA變異來推測肺癌組織的DNA變異情況。Gessner等[106]的研究發現，36.4% NSCLC受試者的EBC-DNA中發現了p53基因突變，而對照組中卻沒有發現。一個有趣的現象是，在EBC-DNA中發現p53突變的病例，并未在其相對應的肺癌組織DNA中檢測到匹配的p53基因突變。但該研究入組病例數較少，NSCLC受試者11例，健康受試者10名，還需進行大樣本深入研究。2019年，黃芬芬等[107]的研究發現，在NSCLC受試者的EBC中可檢測出p16基因突變，其總突變率為14.8%，而對照組中未檢測出p16基因突變。
2.3 其它潛在可用于肺癌診斷的呼出氣檢測技術
2.3.1 量子級聯激光器
2～20 μm的小型可集成的光源在遠距離探測、大氣污染監控、醫學診斷等方面具有迫切的應用需求。1994年，Faist等[108]首先利用量子阱子帶間的電子躍遷現象研制成功了新型紅外激光光源，波長為4.2 μｍ的激光器“量子級聯激光器”（quantum cascade laser，QCL）。隨著QCL材料體系研究的不斷進展，器件性能不斷提高，可滿足于2～20 μm不同最佳波段的應用。大多數原子、分子轉動振動躍遷在中紅外波段具有很強的特征吸收譜線，因此單模、寬波長調諧中紅外激光器在毒品和爆炸物監測上顯現出巨大優勢。隨著QCL在生物醫學領域的廣泛應用，其在醫學診斷上也顯示出巨大潛力[109]。
Weidmann等[110]實現了第一個基于QCL的CO2同位素分析。Rubin等[111]使用基于QCL的裝置測定人體呼出氣中的12CO2/13CO2比率，從而用于測試肝功能。內源性產生的一氧化碳（carbon monoxide，CO）被認為可能是反映肺部炎癥或氧化應激的指標。Ghorbani等[112]利用MHF調諧范圍為2 080～2 173 cm?1的連續波外腔調諧量子級聯激光器（continuous wave external cavity quantum cascade laser，CW-EC-QCL）同時實時測量呼出的CO和CO2。發現采用有效路徑長度為3.99 m的圓形多通池和2f-WMS曲線擬合，CO和CO2的檢測下限分別可在0.14 s的光譜采集時間內達到9 ppbv和650 ppmv。在人體新陳代謝中，NO參與了許多與免疫反應和神經傳遞有關的重要代謝過程[113]。McCurdy等[114]報道了一種基于集成腔輸出光譜的光譜儀，該光譜儀采用工作頻率為1 915 cm-1的分布反饋式連續準直輸出量子級聯激光器（continuous wave distributed-feedback quantum cascade laser，CW-DFB-QCL），能夠在單個呼吸周期內實時測量NO和CO2。呼出氣中氨濃度升高與肝腎疾病和幽門螺桿菌感染有關，Manne等[115]研制了一種基于脈沖腔衰蕩光譜的呼出氣分析儀用于檢測呼出氣中的氨含量，采用DFB-QCL，工作頻率在970 cm?1附近，積分時間為20 s，用于人體呼出氣分析的靈敏度為50 ppbv。Owen等[116]開發了一種基于CW-DFB-QCL的氨呼出氣傳感器，該傳感器工作在1103.44 cm-1附近，采用2f/1f-WMS探測，最低可檢測到的氨氣濃度為7 ppbv。
QCL技術還被用于分析呼出氣中的有機化合物。眾多標志性有機化合物已經成為利用QCL進行光譜分析的目標[117-118]。丙酮是肺部內源性釋放的最豐富的揮發性化合物，它的含量變化可以反映出人體的疾病狀態，比如人體呼出氣中丙酮水平升高與Ⅰ型糖尿病有關[119]。Ciaffoni等[120]開發了一種將工作在約8.2 mm（1 216.5 cm?1）的CW-DFB-QCL與腔增強吸收光譜相結合的光譜儀裝置。在實驗去除水蒸氣后，獲得與質譜法相似的丙酮濃度，最低檢出限為0.51 ppmv。Reyes-Reyes等[121]采用覆蓋850～1250 cm?1之間光譜區域的脈沖EC-QCL，使用光程約為55 m的多程氣體室進行光譜的直接吸收。在去除吸水線之后，通過多線擬合計算獲得丙酮濃度，檢測下限為0.15 ppmv。
研究學者除了關注于單一氣體種類檢測的方法外，還嘗試在呼出氣樣本中進行多種氣體的分析。Shorter等[122-123]研制出一個綜合檢測系統，該系統包括用于多呼出氣流動的呼吸采樣系統和相關的泵送系統，以及2個氣體傳感器，采用75 m多通池和脈沖DFB-QCL，分別在1 900 cm?1下分析NO和CO2，在2 190 cm?1下分析 CO和N2O。對CO2的監測提供了確定死腔體積的額外價值。對于NO，在1 s的積分時間下檢測下限為0.9 ppbv。該傳感器設備允許以10 Hz的采集速率采集實時數據。這個裝置是第一個基于QCL的用于對哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者呼出氣臨床研究的系統。
QCL在呼出氣檢測中已經進行了大量的基礎研究工作，同時已經有關于呼出氣中常見的無機化合物的檢測系統在臨床進行測試，其操作簡單、攜帶方便、無創、可重復等優點突出，在疾病診斷的應用上擁有巨大潛力。遺憾的是，QCL用于呼出氣檢測在肺癌診斷方面尚缺乏相關研究報道，原因可能與呼出氣中有機化合物成分復雜以及尚未發現可靠、準確性較高的標志物有關。
2.3.2 二次電子噴霧電離質譜
二次電子噴霧電離質譜（secondary electrospray ionization-mass spectrometry，SESI-MS）同樣是一種基于質譜的VOCs分析方法。在這種方法中，呼出的氣體與噴灑的溶劑混合，從而導致被分析化合物的電離，然后再進行質譜分析[124]。Li等[125]推薦使用高分辨率設置的二次電子噴霧電離質譜儀來分析呼出氣中的VOCs。Sinues等[126]使用SESI-MS對12名志愿者的1 d內不同時段的呼出氣進行檢測，初步探索了人呼出氣成分的晝夜變化規律。后來他們將乳腺癌患者和健康受試者納入研究 [127]，用SESI-MS對呼出氣進行檢測分析并使用支持向量機建立模型，該模型可以很好地將乳腺癌與健康受試者進行區分，靈敏度和特異度均高于0.9。SESI-MS進行呼出氣VOCs檢測已經在醫學診斷領域顯示出較大能力，但目前鮮有將此技術用于肺癌診斷的報道。
3 前景展望
肺癌仍是我國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，提高肺癌的早期診斷率是提高肺癌生存率降低死亡率的重要措施。相較于目前常見的肺癌診斷方法，針對呼出氣的檢測具有無創、便捷、可重復等特點，其在肺癌的早期診斷領域擁有巨大潛力。有關呼出氣分析與肺癌診斷的相關研究已有數十年，眾多研究取得了較高的準確度、靈敏度和特異度（表1），但呼出氣分析用于肺癌診斷仍存在不足。
表1
VOCs分析在肺癌檢測中的臨床應用
GCMS作為VOCs分析的經典方法，其技術高度標準化，可兼容如SPME的預濃縮技術以進一步提高檢測靈敏度。但是GCMS價格昂貴，分析時間長，對操作人員的要求較高。基于傳感器技術的電子鼻具有廉價、便攜、快速的特點，但其是VOCs的模式識別，無法確定VOCs物質，而電子鼻中的傳感器種類眾多，在VOCs檢測上各具優勢，結合不同的數據分析模式，診斷肺癌的準確度、靈敏度、特異度各不同，目前尚沒有公認的最適合用于肺癌診斷的電子鼻。雖然用經過訓練的犬進行氣味辨別似乎相對簡單和廉價，但是受制于訓練方法等因素影響，該方法的重復性差、臨床推廣難。在VOCs的收集和保存上同樣存在眾多影響因素，包括環境中VOCs、收集材料自身VOCs的干擾，呼出氣時相、呼出氣流速和過度通氣對VOCs采集的影響，溫濕度及儲存時間對標本的影響。另外在診斷模型的建立中，應充分考慮年齡、性別、飲食、藥物、吸煙等因素對VOCs的影響。
EBC雖然能提供更多的生物信息，但目前的研究仍處在篩選標志物的階段，還需要更多涉及蛋白質及核酸分子層面的深入研究來達到早期診斷肺癌的目的。SESI-MS 作為MS的一種，已有研究證實其用于呼出氣VOCs是可行的，目前缺乏的是在肺癌領域的應用。QCL技術在氣體檢測上具有檢測迅速、無需對氣體進行處理、操作簡單、重復性好等優勢，可能在肺癌呼出氣診斷上潛力巨大。但目前QCL技術在肺癌呼出氣檢測領域的研究極度缺乏，原因可能與尚未發現靈敏度、特異度均較高的肺癌呼出氣標志物有關。
呼出氣分析在肺癌早期篩查及診斷上潛力無窮，有望在肺癌的二級預防上做出貢獻[128]。但目前呼出氣相關檢測分析在肺癌的早期診斷上仍處于探索階段，距離臨床推廣應用還有很多工作要做。首先，目前仍需要尋找肺癌VOCs標志物及標志物組合用于肺癌診斷。這需要進行深入的代謝組學研究，明確肺癌內源性VOCs的產生及外源性VOCs的代謝轉化，這將有助于肺癌VOCs標志物的尋找。其次，應用于肺癌篩查的呼出氣檢測分析系統應具有無創、快速、便捷、重復性好等特點，QCL和電子鼻是理想的肺癌篩查的載體，性能更優良、更智能的材料及儀器的開發仍然是需要的，但基于肺癌VOCs標志物及其組合的儀器開發將會事半功倍。最后，需要對呼出氣采集的流程、條件進行標準化，努力實現各研究成果的可比性。
利益沖突：無。
作者貢獻：謝少華、向潤撰寫、修改文章；謝天鵬、李強設計、修改文章。
