引用本文： 李杰, 李政, 李斌, 余琦瑤, 毛文杰, 孟于琪, 朱多杰, 馮海明, 尹泚, 肖翠. 敲減 DUS4L 對人 A549 肺腺癌細胞基因表達調控的影響及差異基因分析. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2022, 29(6): 761-769. doi: 10.7507/1007-4848.202102059 復制
惡性腫瘤已經成為嚴重威脅人類健康的主要公共衛生問題之一。根據 2020 年世界衛生組織國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）研究數據顯示，在所有癌癥類型中，肺癌仍然是死亡率最高的惡性腫瘤，發病率居乳腺癌之下。2020 年全球新發肺癌病例約 220 萬，因肺癌死亡約 176 萬，占所有因腫瘤死亡人數的 18%[1]。近年來肺腺癌發病率不斷上升，目前已經超越肺鱗狀細胞癌（鱗癌）成為肺癌中最常見的病理類型[2]。在過去幾十年中，盡管國內外對于肺癌的治療方案層出不窮，如分子靶向治療、立體定向放射治療（stereotactic radiotherapy，SBRT）、免疫治療等，并且成功拯救了成千上萬的肺癌患者[3-4]，但是由于早期肺癌發病隱匿，難以診斷，約 70% 患者在確診時就已經到了癌癥后期（Ⅲ～Ⅳ期），導致肺癌患者 5 年生存率僅不到 20%[5]。由癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、國際癌癥基因組聯盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC）等數據庫開展的研究，最終產生了大量的基因組數據，這些數據清楚地表明，與其它肺癌亞型相比，肺腺癌與明顯的基因組改變有關，并突出了這種疾病背后廣泛存在的分子異質性[6]。因此，從基因組學層面更加深入地了解肺腺癌發生發展的調控機制，識別更加敏感、有效的肺癌早期生物標志物對改善肺癌患者預后具有重要意義。本研究旨在探索敲減類二氫尿苷合酶 4（dihydrouridine synthase 4-like，DUS4L）基因后肺腺癌基因表達的改變，為肺腺癌發生發展的分子機制、尋找新的生物標志物、提高診斷及預后等提供新思路。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 臨床樣本獲取
檢索并下載 TCGA 數據庫（
1.1.2 主要試劑與器材
主要試劑包括人肺腺癌 A549 細胞（中國科學院細胞庫）、胎牛血清（Ausbian）、1640 培養基（Invitrogen）、shRNA 序列（上海吉凱基因化學技術有限公司合成）、T4 DNA 連接酶（Thermo Scientific）、GV115 慢病毒載體（GnenChem）、RIPA 裂解液（上海鼎國生物技術有限公司）、M-MLV 試劑盒（Promega）、BCA 蛋白分析試劑盒（碧云天生物技術有限公司）、EDU 試劑盒（銳博）、DUS4L 抗體（Abcam）、GAPDH 抗體（Santa-Cruz）和 ECL Western blotting Substrate 試劑盒（Thermo Scientific）等，主要儀器（耗材）包括 SDS-PAGE 蛋白電泳儀（上海天能）、PVDF 膜（Millipore）、熒光顯微鏡（Olympus）和 RT-PCR 儀（Roche）等。
1.2 方法
1.2.1 RNAi 慢病毒載體構建
KD 組 shRNA 序列為 5’-ACATCAGCAATCATAGATT-3’，NC 組 shRNA 序列為 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’，通過 T4 DNA 連接酶將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈 DNA 連接，慢病毒載體轉染 293T 細胞，48 h 后收集上清液，離心濃縮去除雜質，進行慢病毒質量檢測。
1.2.2 慢病毒載體感染 A549 細胞
分別用 DUS4L shRNA 與陰性對照 shRNA 慢病毒載體感染肺腺癌 A549 細胞，感染 12 h 后更換常規培養液繼續培養。感染 72 h 后，于熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白 GFP 表達情況，熒光率達 70%，細胞匯合度達 80%，收集細胞進行下游實驗。
1.2.3 qPCR 檢測目的基因敲減效率
將 KD 組和 NC 組細胞接種于 6 孔板，各設置 3 個生物學重復，待細胞匯合度達 80%，用 Trizol 試劑盒提取總 RNA。按照說明書，利用 M-MLV 逆轉錄試劑盒得到 c-DNA，再進行 PCR 擴增。PCR 引物序列如下：DUS4L 上游引物序列 5’-GCCCATTGATTGTTCAGTTTGC-3’，下游引物序列 5’-AACTCCTGTTGCTTCAGCCTTT-3’；GAPDH 上游引物序列 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列 5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。目的基因相對定量分析采用 2?△△Ct法。
1.2.4 Western blotting 檢測目的基因蛋白表達
收集目的細胞，用 RIPA 裂解，提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，將蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，轉移到 PVDF 膜上，TBST 溶液室溫封閉 1 h 或 4℃ 過夜，然后分別與一抗和二抗孵育，最后按照 ECL Western blotting Substrate 說明書顯影。
1.2.5 EDU 細胞增殖檢測
取對數生長期細胞，以每孔 2 000 接種于 96 孔板，培養至正常生長階段。每孔加入 100 μL 50 μmol/L EDU 溶液孵育 2 h 后進行細胞固定、Apollo 染色、清洗、Hoechst 復染，染色完成后于熒光顯微鏡下采集圖像（×100）。利用 Image Pro Plus 5.0 軟件分析結果，計算 EDU 陽性率（EDU 陽性率=EDU 陽性細胞數/總細胞數×100%）。
1.2.6 RNA-seq 數據質量控制及預處理
用 Trizol 試劑盒提取總 RNA，后續建庫及測序由上海吉凱基因化學技術有限公司完成。測序完成后使用 FastQC 對原始測序數據進行質量控制，包括原始數據過濾、測序錯誤率檢查、GC 含量分布檢查。用 hisat2 軟件分別將 KD 組和 NC 組 RNA-seq 數據對比到人類參考基因組上，對比完成后，再采用 subread 軟件中的 featureCounts（1.5.0-p3 版本）工具進行基因水平定量和標準化處理。
1.3 統計學分析
采用 R 語言（3.5.2 版本）對標準化處理后的 RNA-seq 測序數據進行主成分分析，評估組間差異及組內樣本重復情況。采用 DESeq2（1.16.1 版本）對基因進行差異分析，差異基因篩選條件如下：|log2（fold change）|>1 且 Padj<0.05。采用 clusterProfiler（3.4.4 版本）軟件對差異基因集進行 GO 功能富集分析。GO 功能富集分析以 Padj<0.05 作為顯著性富集的閾值。采用 GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）數據庫分析 DUS4L mRNA 在非配對的肺腺癌組織與癌旁正常肺組織之間表達的差異；采用 Wilcoxon signed-rank 檢驗法分析 DUS4L 在配對的肺腺癌組織與癌旁正常組織之間的表達差異。采用 Mann-Whitney U 檢驗分析 DUS4L 基因在肺腺癌中表達水平與患者 T 和 TNM 分期是否存在相關性。
2 結果
2.1 生物信息學分析
DUS4L mRNA 在肺腺癌組織中的表達高于非配對或配對的癌旁正常組織；見圖 1。DUS4L mRNA 的表達與肺腺癌患者的臨床 T 和 TNM 分期相關；見表 1。
圖1
DUS4L 表達差異圖
a：非配對腫瘤組織與癌旁正常組織 DUS4L 表達差異圖；b：配對腫瘤組織與癌旁正常組織 DUS4L 差異表達圖
表1
DUS4L 基因表達與疾病分期的關系（例）
2.2 驗證 DUS4L 敲減效率
從 qPCR 結果可以看出，經 shRNA 慢病毒感染后，KD 組 A549 細胞中 DUS4L 基因在 mRNA 水平的表達受到抑制（P<0.05），敲減效率達 64.5%。Western blotting 結果顯示，KD 組與 NC 組相比，DUS4L 蛋白表達明顯降低；見圖 2。
圖2
DUS4L 敲減結果驗證
a：DUS4L 敲減結果的 qPCR 驗證；b：DUS4L 敲減結果的 Western blotting 驗證
2.3 EDU 細胞增殖
經 EDU 染色的細胞呈現紅色熒光，Hoechst 復染的細胞核呈現藍色熒光。EDU 染色結果顯示 KD 組肺腺癌 A549 細胞增殖能力較 NC 組弱（P<0.05）；見圖 3。
圖3
EDU 實驗檢測細胞增殖能力
a：EDU 染色圖片；b：EDU 染色陽性率統計結果
2.4 數據質量控制
經過原始數據過濾、測序錯誤率檢查、GC 含量分布檢查，獲得后續分析使用的 clean reads 見表 2。
表2
數據質量控制后各樣本 clean reads
2.5 RNA-seq 樣本相關性及聚類
根據各組基因 FPKM（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）值計算組內及組間 Pearson 相關系數平方（R2），繪制熱圖，圖中各重復組內相關系數大于組間，提示實驗可靠性較高，樣本選擇合理；見圖 4。RNA-seq 測序數據主成分分析顯示，圖中 KD 組三個重復聚為一類，并與 NC 組明顯區別，表明兩組細胞間基因表達具有顯著差異；見圖 5。
圖4
樣本間相關性熱圖
圖5
主成分分析圖
2.6 差異分析結果
篩選兩組樣本在不同狀態下表達水平顯著差異的基因，得到表達上調基因 289 個，下調基因 167 個。火山圖可直觀展示每個比較組合的差異基因分布情況，縱坐標表示基因在兩組中表達差異的顯著性水平，上調基因用紅色點表示，下調基因用綠色點表示；見圖 6。差異基因聚類分析，將表達模式相近的基因聚在一起，能更加直接地反映基因在兩組細胞中的差異表達；見圖 7。
圖6
差異基因火山圖［|log2（fold change）|>1，Padj<0.05］
圖7
差異基因聚類分析圖
2.7 GO 功能富集分析結果
DUS4L 基因敲減后，對差異基因進行 GO 功能富集分析，結果顯示差異基因主要富集于白細胞介素-8（interleukin-8， IL-8）的產生、血管生成、血管內皮細胞增殖等生物學過程和信號通路；見圖 8。
圖8
GO 功能富集分析
3 討論
DUS4L 基因又稱 DUS4 或 PP35，根據基因卡數據庫信息（https://www.genecards.org），我們發現人 DUS4L 基因位于染色體 7q22.3 上，由 15 040 bp 組成，有 8 個外顯子。DUS4L 基因編碼 DUS4L 蛋白，該蛋白由 317 個氨基酸組成，分子量約為 36 kDa，其作用為催化合成二氫尿嘧啶（大多數 tRNA 的 D-環中發現的修飾堿基）。DUS4L 基因在人類癌癥中的作用報道尚較少。Kim 等[7]通過轉錄組測序技術及生物信息學篩選出胃癌細胞系中的 DUS4L-BCAP29 融合轉錄本，并發現 siRNA 敲除 DUS4L-BCAP29 后胃癌細胞增殖受到抑制，軟瓊脂試驗進一步證實了 DUS4L-BCAP29 融合轉錄本在胃癌中的致瘤潛力。Nacu 等[8]對 3 例人前列腺癌組織及相應的正常標本進行轉錄組測序后分析發現，DUS4L-BCAP29 融合轉錄本在前列腺癌組織中的表達相較于正常組織更高，并可能在腫瘤組織中起作用。而有研究[9-11]發現 DUS4L-BCAP29 融合轉錄本也存在于非癌癥上皮細胞及成纖維細胞系中，并認為 DUS4L-BCAP29 融合轉錄本的促生長作用并非癌細胞獨有。此外，也有學者[12-13]報道 DUS4L 基因與骨性關節炎相關。我們前期已經通過實驗研究發現敲減 DUS4L 可以誘導肺腺癌 A549 細胞周期阻滯，影響細胞的克隆能力，并促進細胞凋亡[14]。現在我們通過對敲減 DUS4L 后的肺腺癌 A549 細胞測序，并對測序結果進行生物信息學分析，旨在尋找 DUS4L 影響肺腺癌 A549 細胞增殖、克隆和凋亡的可能分子機制。
我們通過檢索 TCGA 數據庫，發現 DUS4L mRNA 在肺腺癌組織中的表達較癌旁及正常組織顯著升高，并且其表達水平與患者 T 分期及 TNM 分期存在相關性。利用慢病毒 shRNA 干擾技術成功敲減肺腺癌 A549 細胞中 DUS4L 基因，隨后 EDU 細胞增殖實驗提示，敲減 DUS4L 基因能夠抑制肺腺癌 A549 細胞的增殖能力。利用轉錄組測序技術研究了 DUS4L 基因敲減對肺腺癌 A549 細胞基因表達調控的影響及其在肺腺癌中的作用。DUS4L 基因敲除后，肺腺癌 A549 細胞基因表達發生改變，共測得差異基因 456 個，提示 DUS4L 對肺腺癌 A549 細胞基因表達有著廣泛的調控作用。其中，STC2 和 TRIB3 兩個基因顯著下調。STC2 在多種腫瘤中均有促癌作用，其在結直腸癌、食管鱗癌、腎癌及胃癌中高表達，且與患者生存率呈負相關[15-18]。Na 等[19]證實 STC2 mRNA 和蛋白在肺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，且體外研究顯示敲減 STC2 后，腫瘤細胞遷移和侵襲能力明顯降低。STC2 蛋白可與內質網鈣離子傳感器 STIM1 結合，抑制質膜儲存鈣內流，保護細胞免于凋亡[20]。STC2 還能通過激活 Jun-Axl-Erk 信號軸促進肺癌細胞對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）的耐藥性[21]。TRIB3 可與 EGFR 相互作用，招募蛋白激酶 Cα（protein kinase Cα，PKCα），誘導 Thr654 磷酸化，并誘導膜旁區域 Lys689 泛素化，增強 EGFR 的循環性、穩定性、下游活性，促進非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發生發展。Yu 等[22]提出以 TRIB3-EGFR 相互作用為靶點促進 EGFR 降解來治療 EGFR 相關 NSCLC 病例。因此，我們推測 DUS4L 可能通過調節 STC2 和 TRIB3 的表達來促進肺腺癌的發生發展，并增加肺腺癌對 EGFR TKIs 的耐藥性。
GO 功能富集分析顯示，差異基因主要富集于 IL-8 產生的調控、血管生成、血管內皮細胞增殖等生物學過程。IL-8 是一種促炎趨化因子，它與 2 個 G 蛋白偶聯受體 CXCR1 和 CXCR2 結合，負責將中性粒細胞吸引到損傷和炎癥部位。IL-8 可由巨噬細胞和內皮細胞分泌，而其相應的受體則表達于單核細胞、粒細胞和內皮細胞[23]。IL-8 已被證實是一種強有力的血管生成因子[24]，其能以濃度依賴的方式刺激內皮細胞增殖和毛細血管生成，并且這一作用可被抗 IL-8 抗體阻斷[25]。在正常細胞中，IL-8 的表達可能通過炎性刺激的誘導而啟動，而在腫瘤進展的過程中，由于微環境氧壓的降低而 IL-8 表達增加。增加的 IL-8 通過與內皮細胞上 Duffy 抗原趨化因子受體結合，以及與白細胞上 CXC 趨化因子受體 1 和 CXC 趨化因子受體 2 結合誘導白細胞浸潤和活化，直接和/或間接促進血管生成。血管生成在所有實體惡性腫瘤的發生、發展中起著至關重要的作用。在沒有局部毛細血管增生的情況下，腫瘤直徑可能不會超過 2～3 mm[26]。Yuan 等[27]通過 qRT-PCR 檢測了 58 例 NSCLC 患者（鱗癌 29 例，腺癌 29 例）腫瘤和非腫瘤肺組織中 IL-8 mRNA 的表達并與患者的臨床病理特征、血管生成和預后進行了相關性分析，發現 IL-8 mRNA 在腫瘤組織中的表達明顯增強，高表達與晚期腫瘤（ⅢA/ⅢB）、遠處淋巴結轉移、腫瘤微血管計數（microvascular count，MC）增高密切相關。多因素分析顯示，IL-8 mRNA 表達和瘤內 MC 是影響患者生存和復發的最重要的預測因素。IL-8 不僅介導了肺癌血管生成中內皮細胞的趨化作用[28]，并通過其血管生成特性作為 NSCLC 腫瘤生長的促進劑。Arenberg 等[29]使用 IL-8 抗體處理 A549 荷瘤小鼠并與對照組相比發現，處理組腫瘤血管減少 58%，瘤體減小 40%。鑒于癌癥患者的 IL-8 主要由腫瘤細胞本身產生，其血清濃度已被證明與腫瘤負荷相關[30]，并且在誘導免疫耐藥方面具有重要作用[31-32]。有學者[33-34]提出 IL-8 可作為一種血清生物標志物，用于免疫治療臨床療效的檢測和預測。基于 IL-8 在腫瘤細胞上皮間充質轉化、血管生成、誘導免疫耐藥中的作用[35]，IL-8 已被提出作為腫瘤治療的靶點，將免疫治療和 IL-8 中和抗體聯合使用，能夠提高腫瘤免疫治療的療效[36-37]。
綜上所述，DUS4L mRNA 在肺腺癌腫瘤組織中的表達顯著升高，敲減 DUS4L 基因后能夠抑制肺腺癌 A549 細胞的增殖能力；DUS4L 能廣泛調控肺腺癌 A549 細胞基因表達，差異基因主要富集在 IL-8 的產生、血管生成、血管內皮細胞增殖等信號通路，提示 DUS4L 可能參與 IL-8 生成的調控，并對肺腺癌血管發育產生影響，從而在腫瘤發展、侵襲、遠處轉移中起著潛在作用。但 DUS4L 是如何調控 IL-8 的產生及血管發育還不明確，要了解其具體機制，還需要做進一步研究。總之，本研究為進一步探索 DUS4L 在肺腺癌中的作用機制、尋找腫瘤標志物及治療靶點提供了線索。
利益沖突：無。
作者貢獻：李杰負責實驗操作、數據整理分析、論文撰寫；李政負責數據處理、論文審閱；李斌負責論文設計、實驗指導、論文審閱；余琦瑤、毛文杰、孟于琪、朱多杰、馮海明、尹泚、肖翠負責對文章的知識性內容做批判性審閱。
惡性腫瘤已經成為嚴重威脅人類健康的主要公共衛生問題之一。根據 2020 年世界衛生組織國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）研究數據顯示，在所有癌癥類型中，肺癌仍然是死亡率最高的惡性腫瘤，發病率居乳腺癌之下。2020 年全球新發肺癌病例約 220 萬，因肺癌死亡約 176 萬，占所有因腫瘤死亡人數的 18%[1]。近年來肺腺癌發病率不斷上升，目前已經超越肺鱗狀細胞癌（鱗癌）成為肺癌中最常見的病理類型[2]。在過去幾十年中，盡管國內外對于肺癌的治療方案層出不窮，如分子靶向治療、立體定向放射治療（stereotactic radiotherapy，SBRT）、免疫治療等，并且成功拯救了成千上萬的肺癌患者[3-4]，但是由于早期肺癌發病隱匿，難以診斷，約 70% 患者在確診時就已經到了癌癥后期（Ⅲ～Ⅳ期），導致肺癌患者 5 年生存率僅不到 20%[5]。由癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）、國際癌癥基因組聯盟（International Cancer Genome Consortium，ICGC）等數據庫開展的研究，最終產生了大量的基因組數據，這些數據清楚地表明，與其它肺癌亞型相比，肺腺癌與明顯的基因組改變有關，并突出了這種疾病背后廣泛存在的分子異質性[6]。因此，從基因組學層面更加深入地了解肺腺癌發生發展的調控機制，識別更加敏感、有效的肺癌早期生物標志物對改善肺癌患者預后具有重要意義。本研究旨在探索敲減類二氫尿苷合酶 4（dihydrouridine synthase 4-like，DUS4L）基因后肺腺癌基因表達的改變，為肺腺癌發生發展的分子機制、尋找新的生物標志物、提高診斷及預后等提供新思路。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 臨床樣本獲取
檢索并下載 TCGA 數據庫（
1.1.2 主要試劑與器材
主要試劑包括人肺腺癌 A549 細胞（中國科學院細胞庫）、胎牛血清（Ausbian）、1640 培養基（Invitrogen）、shRNA 序列（上海吉凱基因化學技術有限公司合成）、T4 DNA 連接酶（Thermo Scientific）、GV115 慢病毒載體（GnenChem）、RIPA 裂解液（上海鼎國生物技術有限公司）、M-MLV 試劑盒（Promega）、BCA 蛋白分析試劑盒（碧云天生物技術有限公司）、EDU 試劑盒（銳博）、DUS4L 抗體（Abcam）、GAPDH 抗體（Santa-Cruz）和 ECL Western blotting Substrate 試劑盒（Thermo Scientific）等，主要儀器（耗材）包括 SDS-PAGE 蛋白電泳儀（上海天能）、PVDF 膜（Millipore）、熒光顯微鏡（Olympus）和 RT-PCR 儀（Roche）等。
1.2 方法
1.2.1 RNAi 慢病毒載體構建
KD 組 shRNA 序列為 5’-ACATCAGCAATCATAGATT-3’，NC 組 shRNA 序列為 5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’，通過 T4 DNA 連接酶將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈 DNA 連接，慢病毒載體轉染 293T 細胞，48 h 后收集上清液，離心濃縮去除雜質，進行慢病毒質量檢測。
1.2.2 慢病毒載體感染 A549 細胞
分別用 DUS4L shRNA 與陰性對照 shRNA 慢病毒載體感染肺腺癌 A549 細胞，感染 12 h 后更換常規培養液繼續培養。感染 72 h 后，于熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白 GFP 表達情況，熒光率達 70%，細胞匯合度達 80%，收集細胞進行下游實驗。
1.2.3 qPCR 檢測目的基因敲減效率
將 KD 組和 NC 組細胞接種于 6 孔板，各設置 3 個生物學重復，待細胞匯合度達 80%，用 Trizol 試劑盒提取總 RNA。按照說明書，利用 M-MLV 逆轉錄試劑盒得到 c-DNA，再進行 PCR 擴增。PCR 引物序列如下：DUS4L 上游引物序列 5’-GCCCATTGATTGTTCAGTTTGC-3’，下游引物序列 5’-AACTCCTGTTGCTTCAGCCTTT-3’；GAPDH 上游引物序列 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物序列 5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。目的基因相對定量分析采用 2?△△Ct法。
1.2.4 Western blotting 檢測目的基因蛋白表達
收集目的細胞，用 RIPA 裂解，提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，將蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，轉移到 PVDF 膜上，TBST 溶液室溫封閉 1 h 或 4℃ 過夜，然后分別與一抗和二抗孵育，最后按照 ECL Western blotting Substrate 說明書顯影。
1.2.5 EDU 細胞增殖檢測
取對數生長期細胞，以每孔 2 000 接種于 96 孔板，培養至正常生長階段。每孔加入 100 μL 50 μmol/L EDU 溶液孵育 2 h 后進行細胞固定、Apollo 染色、清洗、Hoechst 復染，染色完成后于熒光顯微鏡下采集圖像（×100）。利用 Image Pro Plus 5.0 軟件分析結果，計算 EDU 陽性率（EDU 陽性率=EDU 陽性細胞數/總細胞數×100%）。
1.2.6 RNA-seq 數據質量控制及預處理
用 Trizol 試劑盒提取總 RNA，后續建庫及測序由上海吉凱基因化學技術有限公司完成。測序完成后使用 FastQC 對原始測序數據進行質量控制，包括原始數據過濾、測序錯誤率檢查、GC 含量分布檢查。用 hisat2 軟件分別將 KD 組和 NC 組 RNA-seq 數據對比到人類參考基因組上，對比完成后，再采用 subread 軟件中的 featureCounts（1.5.0-p3 版本）工具進行基因水平定量和標準化處理。
1.3 統計學分析
采用 R 語言（3.5.2 版本）對標準化處理后的 RNA-seq 測序數據進行主成分分析，評估組間差異及組內樣本重復情況。采用 DESeq2（1.16.1 版本）對基因進行差異分析，差異基因篩選條件如下：|log2（fold change）|>1 且 Padj<0.05。采用 clusterProfiler（3.4.4 版本）軟件對差異基因集進行 GO 功能富集分析。GO 功能富集分析以 Padj<0.05 作為顯著性富集的閾值。采用 GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）數據庫分析 DUS4L mRNA 在非配對的肺腺癌組織與癌旁正常肺組織之間表達的差異；采用 Wilcoxon signed-rank 檢驗法分析 DUS4L 在配對的肺腺癌組織與癌旁正常組織之間的表達差異。采用 Mann-Whitney U 檢驗分析 DUS4L 基因在肺腺癌中表達水平與患者 T 和 TNM 分期是否存在相關性。
2 結果
2.1 生物信息學分析
DUS4L mRNA 在肺腺癌組織中的表達高于非配對或配對的癌旁正常組織；見圖 1。DUS4L mRNA 的表達與肺腺癌患者的臨床 T 和 TNM 分期相關；見表 1。
圖1
DUS4L 表達差異圖
a：非配對腫瘤組織與癌旁正常組織 DUS4L 表達差異圖；b：配對腫瘤組織與癌旁正常組織 DUS4L 差異表達圖
表1
DUS4L 基因表達與疾病分期的關系（例）
2.2 驗證 DUS4L 敲減效率
從 qPCR 結果可以看出，經 shRNA 慢病毒感染后，KD 組 A549 細胞中 DUS4L 基因在 mRNA 水平的表達受到抑制（P<0.05），敲減效率達 64.5%。Western blotting 結果顯示，KD 組與 NC 組相比，DUS4L 蛋白表達明顯降低；見圖 2。
圖2
DUS4L 敲減結果驗證
a：DUS4L 敲減結果的 qPCR 驗證；b：DUS4L 敲減結果的 Western blotting 驗證
2.3 EDU 細胞增殖
經 EDU 染色的細胞呈現紅色熒光，Hoechst 復染的細胞核呈現藍色熒光。EDU 染色結果顯示 KD 組肺腺癌 A549 細胞增殖能力較 NC 組弱（P<0.05）；見圖 3。
圖3
EDU 實驗檢測細胞增殖能力
a：EDU 染色圖片；b：EDU 染色陽性率統計結果
2.4 數據質量控制
經過原始數據過濾、測序錯誤率檢查、GC 含量分布檢查，獲得后續分析使用的 clean reads 見表 2。
表2
數據質量控制后各樣本 clean reads
2.5 RNA-seq 樣本相關性及聚類
根據各組基因 FPKM（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）值計算組內及組間 Pearson 相關系數平方（R2），繪制熱圖，圖中各重復組內相關系數大于組間，提示實驗可靠性較高，樣本選擇合理；見圖 4。RNA-seq 測序數據主成分分析顯示，圖中 KD 組三個重復聚為一類，并與 NC 組明顯區別，表明兩組細胞間基因表達具有顯著差異；見圖 5。
圖4
樣本間相關性熱圖
圖5
主成分分析圖
2.6 差異分析結果
篩選兩組樣本在不同狀態下表達水平顯著差異的基因，得到表達上調基因 289 個，下調基因 167 個。火山圖可直觀展示每個比較組合的差異基因分布情況，縱坐標表示基因在兩組中表達差異的顯著性水平，上調基因用紅色點表示，下調基因用綠色點表示；見圖 6。差異基因聚類分析，將表達模式相近的基因聚在一起，能更加直接地反映基因在兩組細胞中的差異表達；見圖 7。
圖6
差異基因火山圖［|log2（fold change）|>1，Padj<0.05］
圖7
差異基因聚類分析圖
2.7 GO 功能富集分析結果
DUS4L 基因敲減后，對差異基因進行 GO 功能富集分析，結果顯示差異基因主要富集于白細胞介素-8（interleukin-8， IL-8）的產生、血管生成、血管內皮細胞增殖等生物學過程和信號通路；見圖 8。
圖8
GO 功能富集分析
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DUS4L 基因又稱 DUS4 或 PP35，根據基因卡數據庫信息（https://www.genecards.org），我們發現人 DUS4L 基因位于染色體 7q22.3 上，由 15 040 bp 組成，有 8 個外顯子。DUS4L 基因編碼 DUS4L 蛋白，該蛋白由 317 個氨基酸組成，分子量約為 36 kDa，其作用為催化合成二氫尿嘧啶（大多數 tRNA 的 D-環中發現的修飾堿基）。DUS4L 基因在人類癌癥中的作用報道尚較少。Kim 等[7]通過轉錄組測序技術及生物信息學篩選出胃癌細胞系中的 DUS4L-BCAP29 融合轉錄本，并發現 siRNA 敲除 DUS4L-BCAP29 后胃癌細胞增殖受到抑制，軟瓊脂試驗進一步證實了 DUS4L-BCAP29 融合轉錄本在胃癌中的致瘤潛力。Nacu 等[8]對 3 例人前列腺癌組織及相應的正常標本進行轉錄組測序后分析發現，DUS4L-BCAP29 融合轉錄本在前列腺癌組織中的表達相較于正常組織更高，并可能在腫瘤組織中起作用。而有研究[9-11]發現 DUS4L-BCAP29 融合轉錄本也存在于非癌癥上皮細胞及成纖維細胞系中，并認為 DUS4L-BCAP29 融合轉錄本的促生長作用并非癌細胞獨有。此外，也有學者[12-13]報道 DUS4L 基因與骨性關節炎相關。我們前期已經通過實驗研究發現敲減 DUS4L 可以誘導肺腺癌 A549 細胞周期阻滯，影響細胞的克隆能力，并促進細胞凋亡[14]。現在我們通過對敲減 DUS4L 后的肺腺癌 A549 細胞測序，并對測序結果進行生物信息學分析，旨在尋找 DUS4L 影響肺腺癌 A549 細胞增殖、克隆和凋亡的可能分子機制。
我們通過檢索 TCGA 數據庫，發現 DUS4L mRNA 在肺腺癌組織中的表達較癌旁及正常組織顯著升高，并且其表達水平與患者 T 分期及 TNM 分期存在相關性。利用慢病毒 shRNA 干擾技術成功敲減肺腺癌 A549 細胞中 DUS4L 基因，隨后 EDU 細胞增殖實驗提示，敲減 DUS4L 基因能夠抑制肺腺癌 A549 細胞的增殖能力。利用轉錄組測序技術研究了 DUS4L 基因敲減對肺腺癌 A549 細胞基因表達調控的影響及其在肺腺癌中的作用。DUS4L 基因敲除后，肺腺癌 A549 細胞基因表達發生改變，共測得差異基因 456 個，提示 DUS4L 對肺腺癌 A549 細胞基因表達有著廣泛的調控作用。其中，STC2 和 TRIB3 兩個基因顯著下調。STC2 在多種腫瘤中均有促癌作用，其在結直腸癌、食管鱗癌、腎癌及胃癌中高表達，且與患者生存率呈負相關[15-18]。Na 等[19]證實 STC2 mRNA 和蛋白在肺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，且體外研究顯示敲減 STC2 后，腫瘤細胞遷移和侵襲能力明顯降低。STC2 蛋白可與內質網鈣離子傳感器 STIM1 結合，抑制質膜儲存鈣內流，保護細胞免于凋亡[20]。STC2 還能通過激活 Jun-Axl-Erk 信號軸促進肺癌細胞對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）的耐藥性[21]。TRIB3 可與 EGFR 相互作用，招募蛋白激酶 Cα（protein kinase Cα，PKCα），誘導 Thr654 磷酸化，并誘導膜旁區域 Lys689 泛素化，增強 EGFR 的循環性、穩定性、下游活性，促進非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的發生發展。Yu 等[22]提出以 TRIB3-EGFR 相互作用為靶點促進 EGFR 降解來治療 EGFR 相關 NSCLC 病例。因此，我們推測 DUS4L 可能通過調節 STC2 和 TRIB3 的表達來促進肺腺癌的發生發展，并增加肺腺癌對 EGFR TKIs 的耐藥性。
GO 功能富集分析顯示，差異基因主要富集于 IL-8 產生的調控、血管生成、血管內皮細胞增殖等生物學過程。IL-8 是一種促炎趨化因子，它與 2 個 G 蛋白偶聯受體 CXCR1 和 CXCR2 結合，負責將中性粒細胞吸引到損傷和炎癥部位。IL-8 可由巨噬細胞和內皮細胞分泌，而其相應的受體則表達于單核細胞、粒細胞和內皮細胞[23]。IL-8 已被證實是一種強有力的血管生成因子[24]，其能以濃度依賴的方式刺激內皮細胞增殖和毛細血管生成，并且這一作用可被抗 IL-8 抗體阻斷[25]。在正常細胞中，IL-8 的表達可能通過炎性刺激的誘導而啟動，而在腫瘤進展的過程中，由于微環境氧壓的降低而 IL-8 表達增加。增加的 IL-8 通過與內皮細胞上 Duffy 抗原趨化因子受體結合，以及與白細胞上 CXC 趨化因子受體 1 和 CXC 趨化因子受體 2 結合誘導白細胞浸潤和活化，直接和/或間接促進血管生成。血管生成在所有實體惡性腫瘤的發生、發展中起著至關重要的作用。在沒有局部毛細血管增生的情況下，腫瘤直徑可能不會超過 2～3 mm[26]。Yuan 等[27]通過 qRT-PCR 檢測了 58 例 NSCLC 患者（鱗癌 29 例，腺癌 29 例）腫瘤和非腫瘤肺組織中 IL-8 mRNA 的表達并與患者的臨床病理特征、血管生成和預后進行了相關性分析，發現 IL-8 mRNA 在腫瘤組織中的表達明顯增強，高表達與晚期腫瘤（ⅢA/ⅢB）、遠處淋巴結轉移、腫瘤微血管計數（microvascular count，MC）增高密切相關。多因素分析顯示，IL-8 mRNA 表達和瘤內 MC 是影響患者生存和復發的最重要的預測因素。IL-8 不僅介導了肺癌血管生成中內皮細胞的趨化作用[28]，并通過其血管生成特性作為 NSCLC 腫瘤生長的促進劑。Arenberg 等[29]使用 IL-8 抗體處理 A549 荷瘤小鼠并與對照組相比發現，處理組腫瘤血管減少 58%，瘤體減小 40%。鑒于癌癥患者的 IL-8 主要由腫瘤細胞本身產生，其血清濃度已被證明與腫瘤負荷相關[30]，并且在誘導免疫耐藥方面具有重要作用[31-32]。有學者[33-34]提出 IL-8 可作為一種血清生物標志物，用于免疫治療臨床療效的檢測和預測。基于 IL-8 在腫瘤細胞上皮間充質轉化、血管生成、誘導免疫耐藥中的作用[35]，IL-8 已被提出作為腫瘤治療的靶點，將免疫治療和 IL-8 中和抗體聯合使用，能夠提高腫瘤免疫治療的療效[36-37]。
綜上所述，DUS4L mRNA 在肺腺癌腫瘤組織中的表達顯著升高，敲減 DUS4L 基因后能夠抑制肺腺癌 A549 細胞的增殖能力；DUS4L 能廣泛調控肺腺癌 A549 細胞基因表達，差異基因主要富集在 IL-8 的產生、血管生成、血管內皮細胞增殖等信號通路，提示 DUS4L 可能參與 IL-8 生成的調控，并對肺腺癌血管發育產生影響，從而在腫瘤發展、侵襲、遠處轉移中起著潛在作用。但 DUS4L 是如何調控 IL-8 的產生及血管發育還不明確，要了解其具體機制，還需要做進一步研究。總之，本研究為進一步探索 DUS4L 在肺腺癌中的作用機制、尋找腫瘤標志物及治療靶點提供了線索。
利益沖突：無。
作者貢獻：李杰負責實驗操作、數據整理分析、論文撰寫；李政負責數據處理、論文審閱；李斌負責論文設計、實驗指導、論文審閱；余琦瑤、毛文杰、孟于琪、朱多杰、馮海明、尹泚、肖翠負責對文章的知識性內容做批判性審閱。
