miR-190a-5p 靶向 C/EBPα-PU.1 通路促進骨髓巨噬細胞 M1 型向 M2 型極化_《中國胸心血管外科臨床雜志》

作者：

楊磊 , 薛松 , 王亞祥 ,  連鋒

上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院心血管外科（上海 200127）;

關鍵詞：

miR-190a-5p 巨噬細胞 C/EBPα 極化實驗

DOI：

10.7507/1007-4848.202012109

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目的探討 miR-190a-5p 對脂多糖誘導的骨髓巨噬細胞（bone-marrow-derived macrophage，BMDM）向 M1、M2 型極化的影響。方法以細菌脂多糖誘導的 BMDM（M1 型）為 M1 組，陰性對照 miRNA 模擬物干預巨噬細胞 M1 型為 NC 組，miR-190a-5p 模擬物干預巨噬細胞 M1 型為 miR-190a-5p 組。顯微鏡下觀察巨噬細胞形態學改變，流式細胞儀檢測 M2 型巨噬細胞（CD206+，F4/80）占整體比例。利用熒光定量 PCR 檢測與巨噬細胞極化相關的精氨酸酶-1（arginase 1，Arg1）、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、靶基因 CCAAT/增強子結合蛋白-α（CCAAT enhancer-binding protein α，C/EBPα）、PU.1 的 mRNA 表達水平，驗證 C/EBPα、PU.1 是否為 miR-190a-5p 的潛在靶基因。Western blotting 實驗檢測通路蛋白 C/EBPα、PU.1 的表達情況。結果 miR-190a-5p 模擬物干預巨噬細胞 M1 型后，巨噬細胞觸角伸長，呈長索狀 M2 型細胞形態特征。miR-190a-5p 模擬物干預巨噬細胞 M1 型 24 h，M2 型巨噬細胞增加。miR-190a-5p 模擬物干預巨噬細胞 M1 型對 mRNA 表達水平的影響：iNOS 和 TNF-α 的表達顯著降低（P<0.05），M2 巨噬細胞標志 Arg1 的表達顯著升高（P<0.05），靶基因 C/EBPα、PU.1 的 mRNA 表達水平顯著降低（P<0.05）。Western blotting 實驗結果顯示，過表達 miR-190a-5p 明顯抑制 C/EBPα、PU.1 蛋白表達，miR-190a-5p 抑制劑促進 C/EBPα、PU.1 蛋白表達（P<0.05）。結論 miR-190a-5p 可促進 BMDM 從 M1 型極化為 M2 型。

引用本文： 楊磊, 薛松, 王亞祥, 連鋒. miR-190a-5p 靶向 C/EBPα-PU.1 通路促進骨髓巨噬細胞 M1 型向 M2 型極化. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2022, 29(8): 1042-1048. doi: 10.7507/1007-4848.202012109 復制

巨噬細胞是機體內具有吞噬功能的免疫細胞，在免疫和炎癥反應中發揮重要作用^[1]。在不同刺激因素的作用下，巨噬細胞可轉化成具有不同功能的表型，這個過程稱為極化^[2]。巨噬細胞可分為兩種極化類型，經典活化巨噬細胞（M1 型）和替代活化巨噬細胞（M2 型）。M1 巨噬細胞具有強大的抗菌特性并促進炎癥反應。M2 巨噬細胞可以抑制免疫應答，參與炎癥消退，誘導血管生成^[3-9]。核轉錄因子 κB（nuclear factor κB，NF-κB）、CCAAT/增強子結合蛋白-α（CCAAT enhancer-binding protein α，C/EBPα）、PU.1 和干擾素調節因子 5 參與 M1 激活，信號傳導及轉錄激活蛋白 6、氧化物酶體增殖活化受體-γ、C/EBPβ 等參與 M2 表型的極化^[10-13]。

巨噬細胞在心血管系統中起到了重要的調控作用，早期心肌梗死（心梗）的局部炎癥反應影響了梗死后心肌的修復。M2 型巨噬細胞能夠吞噬、清除凋亡壞死細胞，以及抑制促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）-6，誘導抗炎因子 IL-10、轉化生長因子-β 發揮抗炎效應。目前的研究^[14-20]已發現 miRNA 在免疫細胞的發育、分化、存活及功能成熟中起重要作用。通過對巨噬細胞極化過程中 C/EBPα 靶點與 miRNA 相互作用進行預測，發現有關 miR-190a-5p 對巨噬細胞極化的影響目前尚未見報道，本文將對此進行研究。通過體外實驗發現 miR-190a-5p 能夠通過靶向 C/EBPα、PU.1 增強 M2 極化，抑制促炎細胞因子 TNF-α、一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）。這些研究表明 miR-190a-5p 具有調控巨噬細胞的極性，進而降低心梗區炎癥作用的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性 BALB/C 小鼠 10 只，SPF 級，30～45 d 齡，體重 28～30 g，購于上海杰思捷實驗動物有限公司，動物許可證號：SYXK（上海）2016-0009。

1.1.2 主要試劑及儀器

試劑：miR-190a-5p 模擬物（吉瑪公司）、NC-inhibitor（吉瑪公司）、miR-190a-5p inhibitor（擎科生物公司）、胎牛血清（Gibco 公司）、DMEM（Gibco 公司）、脂多糖（Sigma 公司）、M-CSF（Peprotech 公司）、Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司）、Trizol 試劑（Invitrogen 公司）、PrimeScrip RT Master Mix 試劑盒（TAKARA 公司）、TB Green Premix Ex Taq（TAKARA 公司），Arg1、iNOS、TNF-α 及內參基因 GAPDH 引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。儀器：高速冷凍離心機（Eppendorf 5810R，德國）、紫外-可見分光光度計（Beckman Du730，美國）、熒光定量 PCR 儀（ABI7500，美國）。

1.2 方法

1.2.1 巨噬細胞培養

頸椎脫臼法處死小鼠，剪開股骨、脛骨兩端，用 1 mL 無菌注射器吸取 PBS 溶液沖出骨髓；避光裂解紅細胞 3 min；PBS 吹打清洗，低溫 250×g 離心 3 min，重復清洗 2 遍；加入巨噬細胞集落刺激因子（40 μg/L）條件培養基（90%DMEM+體積分數為 10% 小牛血清+1% 青霉素、鏈霉素+50 μg/L 巨噬細胞集落刺激因子），37 °C、體積分數為 5% CO₂ 細胞培養箱培養；培養 3 d 后換液，再培養 4 d 后收集貼壁細胞即為骨髓來源的巨噬細胞（bone-marrow-derived macrophage，BMDM），為下一步實驗做準備。

1.2.2 BMDM細胞的形態學觀察

將BMDM種在 6 孔細胞培養板中，5×10⁵/孔，培養過夜待細胞完全伸展后，利用 Zeiss 熒光顯微鏡觀察及采集巨噬細胞形態圖像。

1.2.3 細胞處理

將處于對數生長期的 BMDM 細胞按 5×10⁵個/mL 接種于 6 孔板中，2 mL/孔，設 M1 組、NC 組、miR-190a-5p 組，每組 3 個復孔培養細胞生長至 90% 融合狀態時，加入 200 ng/mL 的脂多糖誘導 1 d，第 2 d NC組及 miR-190a-5p 組按照轉染試劑盒 Lipofectamine 3000 操作說明書轉染BMDM 細胞，24 h 后換液并收集細胞進行下一步實驗。對于抑制 miR-190a-5p 操作過程為將處于對數生長期的 BMDM 細胞按 5×10⁵ 個/mL 接種于 6 孔板中，2 mL/孔，設 M2 組、NC-i組、190a-i 組，每組 3 個復孔培養細胞生長至 90% 融合狀態時，加入 200 ng/mL 的脂多糖誘導 1 d，第 2 d 三組都加入 IL-4 至濃度為 20 μg/mL 誘導巨噬細胞為 M2 表型 1 d，第 3 d 使用 miR-190a-5p inhibitor 及 NC-inhibitor 按照轉染試劑盒Lipofectamine 3000 操作說明書分別轉染 190a-i 和 NC-i 組，24 h 后換液并收集細胞進行下一步實驗。

1.2.4 BMDM細胞的鑒定

將脂多糖誘導 1 d 的 BMDM 細胞以及轉染 NC、miR-190a-5p 模擬物的 BMDM 細胞，利用多聚甲醛（4%）室溫固定收取的 EP 管中細胞 30 min，接著用含 2% BSA 的 PBS 洗滌細胞 2 次，用含 5% BSA 的 PBS 封閉細胞表面抗原 15 min，再用 F4/80、CD11b、CD206 抗體孵育 30 min（室溫），最后洗滌細胞 2 次，用含 2% BSA 的 PBS 重懸震蕩成充分混勻的懸液待上機，用流式細胞儀檢測， F4/80、CD11b 雙陽性即為巨噬細胞，F4/80、CD206 雙陽性即為 M2 巨噬細胞。

1.2.5 qPCR 檢測基因表達

將脂多糖誘導的 BMDM 細胞，以及轉染 miR-190a-5p 模擬物的巨噬細胞經 Trizol（1 mL/孔）處理后，加入 0.2 mL 氯仿，劇烈震蕩 15 s，室溫靜置 2 min 后，12000 r/min，4°C 離心 15 min，吸取上層無色水相，轉移入另一 EP 管中（約 0.5 mL），加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置 10 min 后，12000 r/min，4°C 離心 15 min，棄上清，加入 75% 乙醇 1 mL 洗滌沉淀，12000 r/min，4°C 離心 15 min。棄上清，風干 10～15 min，每管加入 20 μL DEPC 水溶解沉淀。紫外分光光度計測定所提 RNA 的濃度和純度，含量為 1.5～2.0 g/L，OD260/OD280 在 1.8～2.0 之間。

然后按逆轉錄試劑盒說明書操作要求，將 RNA 逆轉錄成 cDNA。熒光定量 PCR：按照 SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行 PCR 反應，95°C 預變性 30 s，95°C 變性 5 s，60°C 退火 30 s，40 個循環，每次擴增設置 GAPDH 為內參對照。反應體系為 SYBR Green 染料 5 μL，上游引物 0.2 μL，下游引物 0.2 μL，ddH₂O 3.6 μL，cDNA 模板 1 μL。制作標準曲線，根據標準曲線擴增效率的一致性，選用 2^-ΔΔCt 法分析樣本中 iNOS、TNF-α、精氨酸酶-1（ arginase 1，Arg1）、C/EBPα、PU.1 的 mRNA 的相對表達量。熒光定量 PCR 引物序列見表1。

表1 熒光定量 PCR 引物序列

表選項

下載CSV

Primer	Sequence（5’-3’）	Size（bp）
iNOS	F：ACCCACATCTGGCAGAATGAG	21
	R：AGCCATGACCTTTCGCATTAG	21
TNF-α	F：GGACTAGCCAGGAGGGAGAA	20
	R：CGCGGATCATGCTTTCTGTG	20
Arg1	F：AGCACTGAGGAAAGCTGGTC	20
	R：TACGTCTCGCAAGCCAATGT	20
C/EBPα	F：CCCTTGCTTTTTGCACCTCC	20
	R：TGCCCCCATTCTCCATGAAC	20
PU.1	F：AAAATCAGGAACTTGTGCTGGC	22
	R：GCCGAGAGAGAAAGGTGTCG	20
iNOS：一氧化氮合酶；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；Arg1：精氨酸酶-1；C/EBPα：CCAAT/增強子結合蛋白-α

1.2.6 Western blotting 法檢測 C/EBPα、PU.1 蛋白表達

上述方法分組處理好巨噬細胞后，用 4°C 的 PBS 清洗 3 次，每孔加入 150 μL RIPA 裂解液，刮取細胞蛋白存于 1.5 mL EP 管中靜置冰上 30 min，充分裂解后，4°C、14000 r/min 離心 30 min 棄除上清液，用 BCA 法進行蛋白定量。配制 SDS-PAGE 凝膠，各組等量蛋白上樣、電泳分離，電泳后將蛋白轉移至 PVDF 膜上。室溫下 5% 脫脂牛奶封閉 PVDF 膜 2 h，用 TBST 清洗 PVDF 膜兩次，C/EBPα 一抗（1∶1000）孵膜，4°C 過夜。TBST 洗膜 3 次后。室溫孵育二抗（1∶5000）1 h，TBST 洗膜 3 次后成像系統顯影，GAPDH 為內參，用 Image J 軟件進行灰度值分析。

1.3 統計學分析

數據分析采用 SPSS 22.0 軟件。服從正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）描述，組間比較采用 One-Way ANOVA 檢驗。P≤0.05 為差異有統計學意義。

1.4 倫理審查

本研究已通過上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院實驗動物倫理與使用委員會批準，批準號：A2020124。

2 結果

2.1 巨噬細胞形態學

巨噬細胞在加入脂多糖的完全培養基中培養 1 d 時，主要呈扁平圓形，透光性較差，煎蛋樣，其觸角較短，為 M1 型細胞形態特征。轉染 NC、miR-190a-5p 模擬物的 BMDM 細胞培養 24 h 后，NC 組主要呈扁平圓形，為 M1 型細胞形態特征。miR-190a-5p 組巨噬細胞觸角伸長，透光性較好，細胞呈長索狀，為 M2 型細胞形態特征；見圖1。

圖1 巨噬細胞形態　

a～c：分別為 M1、NC 和 miR-190a-5p 組巨噬細胞形態；M1 組與 NC 組巨噬細胞主要呈扁平圓形，透光性較差，煎蛋樣，其觸角較短，為 M1 型細胞形態特征（×100）；miR-190a-5p 組巨噬細胞觸角伸長，透光性較好，細胞呈長索狀，為 M2 型細胞形態特征（×100）

圖選項

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《中國胸心血管外科臨床雜志》

miR-190a-5p 靶向 C/EBPα-PU.1 通路促進骨髓巨噬細胞 M1 型向 M2 型極化

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