引用本文： 王靈杰, 趙懂華, 黃章鋒, 李蒙君, 國鵬飛, 王勇杰. 替米沙坦通過Wnt/β-catenin信號通路影響非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移和凋亡的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2022, 29(1): 100-105. doi: 10.7507/1007-4848.202010077 復制
肺癌是世界上發病率最高的惡性腫瘤，并且呈逐年遞增的趨勢，全球每年約有 180 萬的新發肺癌患者，約占全部類型腫瘤發生率的 12.9%。在 2012 年全球約有 160 萬人因肺癌死亡，占全部類型腫瘤死亡的 19.4%[1]。臨床上主要將肺癌分為小細胞性肺癌和非小細胞性肺癌，其中非小細胞肺癌約占 80%。目前對非小細胞性肺癌的治療為綜合治療，主要包括手術、放化療和靶向治療，但非小細胞性肺癌的 5 年生存率僅為 4%～17% [2-3]。所以急需尋找治療非小細胞肺癌新的治療方式。
替米沙坦是一種血管緊張素受體抑制劑，通過作用于血管緊張素受體 1 起到降血壓的作用。近年來，不斷有研究報道替米沙坦具有抗腫瘤的作用，可以在體內和體外起到抑制卵巢癌[4]、胃癌[5]、前列腺癌[6]細胞的作用，有少量研究報道替米沙坦單獨應用或者與其它抗腫瘤藥物共同應用在動物實驗中具有抗肺癌的作用[7-8]，但其具體分子機制仍未完全明確，有進一步研究的價值。
Wnt 信號通路是一個高度保守的控制許多細胞功能的蛋白家族，可以影響器官的形成，干細胞的更新以及細胞的存活等。Wnt 信號通路在許多疾病中都起到重要作用，如中樞神經系統損傷、骨折以及各種類型的腫瘤等。Wnt 信號通路在肺癌中呈高表達狀態，在動物實驗中使用 Wnt 信號通路抑制劑可以抑制腫瘤的增大[9]。因此 Wnt 信號通路是非小細胞肺癌的一個潛在治療靶點。
為了研究替米沙坦是否可以作為肺癌的治療藥物及其作用機制，我們進行了本次研究，結果發現替米沙坦在體外可以有效抑制肺癌細胞的增殖活性、遷徙和侵襲能力，并且能促進凋亡的發生。并且這一效應可能是部分通過 Wnt/β-catenin 信號通路產生的。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
非小細胞肺癌細胞株 A549 購買自中國科學院細胞生物科學研究所。替米沙坦購自上海邦葳生物科技有限公司（Rhawn，R029372-1G），胎牛血清購自杭州昊鑫生物科技公司，DMEM 完全培養基、CCK-8 試劑盒、Hoechst 試劑盒購自上海邦葳生物科技有限公司。β-肌動蛋白（β-actin）（# 4970S）、增殖細胞核抗原（PCNA）（# 13110S）、Bax（# 89477S）、Bcl-2（# 15071S）、β-連環蛋白（β-catenin）（# 8480S）、絲氨酸蛋白激酶3β（p-GSK-3β）（# 5558S）、糖原合成酶及酶-3β（GSK-3β）（# 12456S）、Wnt-3a（# 2721S）、c-myc（# 18583S）等抗體購買自 Cell Signaling Technology。
1.2 細胞培養
非小細胞肺癌細胞株 A549 使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基培養，培養環境為 37℃，5% 二氧化碳培養箱。隔天換液，取對數生長期的細胞用于實驗。替米沙坦溶于二甲基亞砜，二甲基亞砜的最終濃度小于 0.1%。
1.3 CCK-8 法細胞增殖實驗
取對數生長期的 A549 細胞，接種于 96 孔板中，每孔 5×103個，置于 37℃ 培養箱中培養 24 h。加入不同濃度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液進行處理，每個濃度設置 4 個復孔，分別培養 24 h、48 h 后，吸掉 96 孔板內原有培養液，加入 CCK-8 溶液 10 μL，37℃ 下孵育 1 h，酶標儀 452 nm 波長下檢測各孔吸光度，利用公式計算細胞生長抑制率。
1.4 克隆形成實驗
取對數生長期的 A549 細胞，接種于 6 孔板中，每孔 800 個，置于 37℃ 培養箱中培養 24 h。加入不同濃度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液進行處理，每 3 d 換液一次，2 周后吸去原有培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗 2 次，使用多聚甲醛固定 1 h，結晶紫染色 2 h，拍照后，顯微鏡下進行克隆集落計數細胞數>50 個的集落。
1.5 劃痕實驗
取對數生長期的 A549 細胞，接種于 6 孔板中，每孔 2×105個，置于 37℃ 培養箱中培養 48 h。當細胞密度達到 100% 時，用 200 μL 的槍頭在培養皿上垂直劃過。用不同濃度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液進行處理，在不同的時間點（0 h、24 h、48 h）顯微鏡下觀察劃痕的愈合情況。
1.6 Hoechst 染色分析
取對數生長期的 A549 細胞，接種于 24 孔板中，每孔 5×104個，置于 37℃ 培養箱中培養 48 h。用不同濃度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液進行處理，根據試劑盒說明書進行 Hoechst 染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞的形態改變。
1.7 蛋白免疫印跡實驗
取對數生長期的 A549 細胞，接種于 24 孔板中，每孔 1×105個，置于 37℃ 培養箱中培養 24 h。用不同濃度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液進行處理 24 h，棄去原有培養液，PBS 沖洗 2 次，加入 RIPA 裂解液 200 μL 使細胞充分裂解，冰上裂解 30 min，使用細胞刮板，將細胞及溶液刮到一側，收集溶液后，4℃ 離心收集上清液，100℃ 金屬浴煮沸 5 min，每個上樣孔取 20 μg 蛋白量，進行蛋白凝膠電泳，根據電泳、轉膜、封閉、一抗孵育（工作濃度：β-actin 1∶1000、PCNA 1∶1000、Bax 1∶1000、Bcl-2 1∶1000、β-catenin 1∶1000、p-GSK-3β 1∶1000、GSK-3β 1∶1000、Wnt-3a 1∶1000、c-myc 1∶1000）、二抗孵育、ECL 顯色的順序進行蛋白免疫印跡實驗。利用凝膠成像儀發光成像，Image J 軟件進行灰度分析。
1.8 統計學分析
實驗數據使用 SPSS 18.0 統計軟件進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P≤0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 替米沙坦抑制 A549 細胞增殖
CCK-8 實驗說明，替米沙坦可以明顯抑制 A549 細胞的增殖能力，并存在濃度依賴性和時間依賴性，低濃度組相對于對照組有明顯的抑制效果，高濃度組的抑制效果優于低濃度組，差異有統計學意義；見圖 1。克隆形成實驗顯示替米沙坦明顯降低 A549 細胞的克隆形成，差異有統計學意義；見圖 2。Western blotting 結果顯示替米沙坦降低 PCNA 的表達水平，具有一定的濃度依賴性；見圖 3。以上結果表明替米沙坦可以抑制 A549 細胞的增殖能力。
圖1
CCK-8 法檢測替米沙坦對 A549 細胞的增殖活性抑制情況
**表示與 0 μM 組相比，
圖2
克隆形成實驗檢測替米沙坦對 A549 細胞集落形成能力的抑制情況
**表示與 0 μM 組相比，
圖3
Western blotting法檢測替米沙坦對增殖細胞核抗原（PCNA）表達的影響
2.2 替米沙坦抑制 A549 細胞遷移
細胞劃痕實驗顯示，替米沙坦可以抑制 A549 細胞的遷移能力，并存在劑量依賴性，高濃度的替米沙坦對細胞遷移能力的抑制效果更強，差異有統計學意義；見圖 4。
圖4
劃痕實驗檢測替米沙坦對 A549 細胞遷移能力的影響
**表示與 0 μM 組相比，???????
2.3 替米沙坦促進 A549 細胞凋亡
Hoechst 染色顯示替米沙坦處理 48 h后，細胞的形態較正常組之間有差異性，替米沙坦處理組出現了更多的細胞和細胞核的皺縮；見圖 5。Western blotting 結果顯示，替米沙坦可以促進 Bax 的表達，抑制 Bcl-2 的表達，存在劑量依賴性，以上結果說明替米沙坦可以促進 A549 細胞的凋亡，且濃度與促凋亡效果正相關；見圖 6。
圖5
Hoechst 染色檢測替米沙坦對 A549 凋亡的影響
圖6
Western blotting 法檢測 Bax 和 Bcl-2 的表達情況
2.4 替米沙坦抑制 Wnt 信號通路
Western blotting結果顯示替米沙坦處理可以明顯抑制 Wnt-3a、β-catenin、c-myc、p-GSK-3β 的表達，增加 GSK-3β 的表達，說明替米沙坦可以抑制 A549 細胞中的 Wnt/β-catenin 信號通路；見圖 7。
圖7
Western blotting 法檢測 β-catenin、c-myc、Wnt-3a、p-GSK-3β、GSK-3β 的表達情況
3 討論
近年來，傳統老藥，如阿司匹林和二甲雙胍，在傳統應用領域外的研究已成為新的熱點，研究人員不斷發現老藥有新的治療潛力。替米沙坦是一種血管緊張素受體抑制劑，廣泛應用于心血管疾病的治療[10]，但替米沙坦在人體內的應用是否會導致腫瘤發生率的增高仍存在爭議，有臨床研究[11]表明替米沙坦控制血壓的短期應用十分安全，不會引起腫瘤發生率的增高。另外，一項 Meta 分析[12]報道稱包括替米沙坦在內的血管緊張素受體抑制劑的應用可能會導致新發癌癥的風險輕度增加，肺癌的新發風險明顯增加。盡管如此，近些年仍不斷有研究[5, 13-17]報道，替米沙坦單獨應用或與抗腫瘤藥物合用在動物實驗和細胞實驗中可以抑制黑色素瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌、胃腸道間質瘤的生長。基礎研究[18]顯示，替米沙坦可以在動物模型上改善腫瘤的灌注，減少短暫性缺氧的發生，改善腫瘤對放療的敏感性。如在肺癌的基礎研究中，替米沙坦單獨應用可以通過 PPARgamma、P13K/AKT、TRAIL 抑制肺癌細胞的生長[8, 19-20]，替米沙坦與多西他賽合用可以明顯抑制裸鼠腫瘤的生長，改善腫瘤細胞的耐藥性[21]。替米沙坦促進熒光聚苯乙烯納米顆粒在腫瘤內的分布情況，說明替米沙坦有腫瘤治療藥物的潛力，可以促進納米顆粒包裹的化療藥物達到腫瘤區域[22]。Martínez 等[23]對利用鋅元素與替米沙坦進行復合，制成新的復合物，可以顯著促進其誘導肺腫瘤細胞凋亡的效果，并對非腫瘤細胞無毒性作用。
在本研究中，我們將替米沙坦應用于非小細胞肺癌 A549 細胞，CCK-8 細胞增殖實驗結果說明替米沙坦可以抑制 A549 細胞的增殖，并且 PCNA 的表達水平受到抑制，具有時間和濃度依賴性。PCNA 是一種與細胞活性相關的蛋白，其表達水平越高，細胞的活性程度越高，因此替米沙坦可以有效抑制 A549 細胞的增殖活性。在細胞遷移實驗中，替米沙坦可以明顯抑制 A549 細胞的遷移能力。Hoechst 和 Western blotting 的實驗結果證明，替米沙坦可以明顯促進 A549 細胞的凋亡。Western blotting 的結果顯示，經替米沙坦處理后，Wnt 信號通路的關鍵蛋白 Wnt-3a、β-catenin、c-myc、p-GSK-3β 表達下降，GSK-3β 表達增多，p-GSK-3β/GSK-3β 的比例下降，說明 Wnt 信號通路受到抑制。Wnt 信號通路是一個與胚胎、器官發育密切相關的信號家族，在腫瘤的增殖與轉移中起到重要作用，與腫瘤干細胞關系密切。此前有相關學者研究發現替米沙坦具有抗肺癌的作用，但均無直接證據顯示替米沙坦在肺癌中對 Wnt 信號通路的影響。Green 等[7]研究發現放線菌素與替米沙坦合用直接注射到裸鼠腫瘤模型腫瘤區域，可以明顯抑制裸鼠腫瘤的生長，并且可以降低 β-catenin 的表達水平。但并沒有證明替米沙坦可以直接抑制肺癌中 Wnt 信號通路的表達。我們的研究直接證明了替米沙坦可以通過調控 Wnt/β-catenin 信號通路有效抑制肺癌細胞的增殖、遷移和促進凋亡。
本次研究有以下幾點不足：（1）我們沒有研究替米沙坦對肺癌細胞化療耐藥的影響。肺癌治療的失敗與肺癌化療后期產生的耐藥性關聯密切，耐藥性產生的一個重要原因是腫瘤干細胞的存在，在化療的過程中，腫瘤干細胞不斷向耐化療藥物的表型分化，以至化療藥物在后期無法產生好的療效。（2）沒有分析替米沙坦對肺癌干細胞的影響，Wnt 信號通路對維持腫瘤干細胞的特性具有十分重要的作用[24]，在本研究中，我們證明替米沙坦可以通過 Wnt 信號通路抑制肺癌，但我們沒有進一步探究替米沙坦是否通過 Wnt 信號通路起到抑制肺癌干細胞的作用。（3）我們沒有進行體內實驗以及關注替米沙坦治療腫瘤的安全性。有研究[25]發現替米沙坦在小鼠腫瘤模型中會加劇順鉑誘導的腎毒性，因此有必要關注在腫瘤治療過程中，替米沙坦是否會產生或者影響化療藥物帶來的毒性反應。
替米沙坦可能在非小細胞肺癌 A549 的增殖、遷移和凋亡中起到作用，抑制 Wnt/β-catenin 信號通路可能是其中的一個機制。但仍需更深入的研究，比如動物實驗、耐藥性實驗、腫瘤干細胞實驗。
利益沖突：無。
作者貢獻：王靈杰負責實驗設計及參與全部實驗；趙懂華及黃章鋒負責細胞實驗；李蒙君及國鵬飛負責分子生物學實驗；王勇杰負責實驗設計及文章審校。
肺癌是世界上發病率最高的惡性腫瘤，并且呈逐年遞增的趨勢，全球每年約有 180 萬的新發肺癌患者，約占全部類型腫瘤發生率的 12.9%。在 2012 年全球約有 160 萬人因肺癌死亡，占全部類型腫瘤死亡的 19.4%[1]。臨床上主要將肺癌分為小細胞性肺癌和非小細胞性肺癌，其中非小細胞肺癌約占 80%。目前對非小細胞性肺癌的治療為綜合治療，主要包括手術、放化療和靶向治療，但非小細胞性肺癌的 5 年生存率僅為 4%～17% [2-3]。所以急需尋找治療非小細胞肺癌新的治療方式。
替米沙坦是一種血管緊張素受體抑制劑，通過作用于血管緊張素受體 1 起到降血壓的作用。近年來，不斷有研究報道替米沙坦具有抗腫瘤的作用，可以在體內和體外起到抑制卵巢癌[4]、胃癌[5]、前列腺癌[6]細胞的作用，有少量研究報道替米沙坦單獨應用或者與其它抗腫瘤藥物共同應用在動物實驗中具有抗肺癌的作用[7-8]，但其具體分子機制仍未完全明確，有進一步研究的價值。
Wnt 信號通路是一個高度保守的控制許多細胞功能的蛋白家族，可以影響器官的形成，干細胞的更新以及細胞的存活等。Wnt 信號通路在許多疾病中都起到重要作用，如中樞神經系統損傷、骨折以及各種類型的腫瘤等。Wnt 信號通路在肺癌中呈高表達狀態，在動物實驗中使用 Wnt 信號通路抑制劑可以抑制腫瘤的增大[9]。因此 Wnt 信號通路是非小細胞肺癌的一個潛在治療靶點。
為了研究替米沙坦是否可以作為肺癌的治療藥物及其作用機制，我們進行了本次研究，結果發現替米沙坦在體外可以有效抑制肺癌細胞的增殖活性、遷徙和侵襲能力，并且能促進凋亡的發生。并且這一效應可能是部分通過 Wnt/β-catenin 信號通路產生的。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
非小細胞肺癌細胞株 A549 購買自中國科學院細胞生物科學研究所。替米沙坦購自上海邦葳生物科技有限公司（Rhawn，R029372-1G），胎牛血清購自杭州昊鑫生物科技公司，DMEM 完全培養基、CCK-8 試劑盒、Hoechst 試劑盒購自上海邦葳生物科技有限公司。β-肌動蛋白（β-actin）（# 4970S）、增殖細胞核抗原（PCNA）（# 13110S）、Bax（# 89477S）、Bcl-2（# 15071S）、β-連環蛋白（β-catenin）（# 8480S）、絲氨酸蛋白激酶3β（p-GSK-3β）（# 5558S）、糖原合成酶及酶-3β（GSK-3β）（# 12456S）、Wnt-3a（# 2721S）、c-myc（# 18583S）等抗體購買自 Cell Signaling Technology。
1.2 細胞培養
非小細胞肺癌細胞株 A549 使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基培養，培養環境為 37℃，5% 二氧化碳培養箱。隔天換液，取對數生長期的細胞用于實驗。替米沙坦溶于二甲基亞砜，二甲基亞砜的最終濃度小于 0.1%。
1.3 CCK-8 法細胞增殖實驗
取對數生長期的 A549 細胞，接種于 96 孔板中，每孔 5×103個，置于 37℃ 培養箱中培養 24 h。加入不同濃度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液進行處理，每個濃度設置 4 個復孔，分別培養 24 h、48 h 后，吸掉 96 孔板內原有培養液，加入 CCK-8 溶液 10 μL，37℃ 下孵育 1 h，酶標儀 452 nm 波長下檢測各孔吸光度，利用公式計算細胞生長抑制率。
1.4 克隆形成實驗
取對數生長期的 A549 細胞，接種于 6 孔板中，每孔 800 個，置于 37℃ 培養箱中培養 24 h。加入不同濃度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液進行處理，每 3 d 換液一次，2 周后吸去原有培養液，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗 2 次，使用多聚甲醛固定 1 h，結晶紫染色 2 h，拍照后，顯微鏡下進行克隆集落計數細胞數>50 個的集落。
1.5 劃痕實驗
取對數生長期的 A549 細胞，接種于 6 孔板中，每孔 2×105個，置于 37℃ 培養箱中培養 48 h。當細胞密度達到 100% 時，用 200 μL 的槍頭在培養皿上垂直劃過。用不同濃度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液進行處理，在不同的時間點（0 h、24 h、48 h）顯微鏡下觀察劃痕的愈合情況。
1.6 Hoechst 染色分析
取對數生長期的 A549 細胞，接種于 24 孔板中，每孔 5×104個，置于 37℃ 培養箱中培養 48 h。用不同濃度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液進行處理，根據試劑盒說明書進行 Hoechst 染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞的形態改變。
1.7 蛋白免疫印跡實驗
取對數生長期的 A549 細胞，接種于 24 孔板中，每孔 1×105個，置于 37℃ 培養箱中培養 24 h。用不同濃度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液進行處理 24 h，棄去原有培養液，PBS 沖洗 2 次，加入 RIPA 裂解液 200 μL 使細胞充分裂解，冰上裂解 30 min，使用細胞刮板，將細胞及溶液刮到一側，收集溶液后，4℃ 離心收集上清液，100℃ 金屬浴煮沸 5 min，每個上樣孔取 20 μg 蛋白量，進行蛋白凝膠電泳，根據電泳、轉膜、封閉、一抗孵育（工作濃度：β-actin 1∶1000、PCNA 1∶1000、Bax 1∶1000、Bcl-2 1∶1000、β-catenin 1∶1000、p-GSK-3β 1∶1000、GSK-3β 1∶1000、Wnt-3a 1∶1000、c-myc 1∶1000）、二抗孵育、ECL 顯色的順序進行蛋白免疫印跡實驗。利用凝膠成像儀發光成像，Image J 軟件進行灰度分析。
1.8 統計學分析
實驗數據使用 SPSS 18.0 統計軟件進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P≤0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 替米沙坦抑制 A549 細胞增殖
CCK-8 實驗說明，替米沙坦可以明顯抑制 A549 細胞的增殖能力，并存在濃度依賴性和時間依賴性，低濃度組相對于對照組有明顯的抑制效果，高濃度組的抑制效果優于低濃度組，差異有統計學意義；見圖 1。克隆形成實驗顯示替米沙坦明顯降低 A549 細胞的克隆形成，差異有統計學意義；見圖 2。Western blotting 結果顯示替米沙坦降低 PCNA 的表達水平，具有一定的濃度依賴性；見圖 3。以上結果表明替米沙坦可以抑制 A549 細胞的增殖能力。
圖1
CCK-8 法檢測替米沙坦對 A549 細胞的增殖活性抑制情況
**表示與 0 μM 組相比，
圖2
克隆形成實驗檢測替米沙坦對 A549 細胞集落形成能力的抑制情況
**表示與 0 μM 組相比，
圖3
Western blotting法檢測替米沙坦對增殖細胞核抗原（PCNA）表達的影響
2.2 替米沙坦抑制 A549 細胞遷移
細胞劃痕實驗顯示，替米沙坦可以抑制 A549 細胞的遷移能力，并存在劑量依賴性，高濃度的替米沙坦對細胞遷移能力的抑制效果更強，差異有統計學意義；見圖 4。
圖4
劃痕實驗檢測替米沙坦對 A549 細胞遷移能力的影響
**表示與 0 μM 組相比，???????
2.3 替米沙坦促進 A549 細胞凋亡
Hoechst 染色顯示替米沙坦處理 48 h后，細胞的形態較正常組之間有差異性，替米沙坦處理組出現了更多的細胞和細胞核的皺縮；見圖 5。Western blotting 結果顯示，替米沙坦可以促進 Bax 的表達，抑制 Bcl-2 的表達，存在劑量依賴性，以上結果說明替米沙坦可以促進 A549 細胞的凋亡，且濃度與促凋亡效果正相關；見圖 6。
圖5
Hoechst 染色檢測替米沙坦對 A549 凋亡的影響
圖6
Western blotting 法檢測 Bax 和 Bcl-2 的表達情況
2.4 替米沙坦抑制 Wnt 信號通路
Western blotting結果顯示替米沙坦處理可以明顯抑制 Wnt-3a、β-catenin、c-myc、p-GSK-3β 的表達，增加 GSK-3β 的表達，說明替米沙坦可以抑制 A549 細胞中的 Wnt/β-catenin 信號通路；見圖 7。
圖7
Western blotting 法檢測 β-catenin、c-myc、Wnt-3a、p-GSK-3β、GSK-3β 的表達情況
3 討論
近年來，傳統老藥，如阿司匹林和二甲雙胍，在傳統應用領域外的研究已成為新的熱點，研究人員不斷發現老藥有新的治療潛力。替米沙坦是一種血管緊張素受體抑制劑，廣泛應用于心血管疾病的治療[10]，但替米沙坦在人體內的應用是否會導致腫瘤發生率的增高仍存在爭議，有臨床研究[11]表明替米沙坦控制血壓的短期應用十分安全，不會引起腫瘤發生率的增高。另外，一項 Meta 分析[12]報道稱包括替米沙坦在內的血管緊張素受體抑制劑的應用可能會導致新發癌癥的風險輕度增加，肺癌的新發風險明顯增加。盡管如此，近些年仍不斷有研究[5, 13-17]報道，替米沙坦單獨應用或與抗腫瘤藥物合用在動物實驗和細胞實驗中可以抑制黑色素瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌、胃腸道間質瘤的生長。基礎研究[18]顯示，替米沙坦可以在動物模型上改善腫瘤的灌注，減少短暫性缺氧的發生，改善腫瘤對放療的敏感性。如在肺癌的基礎研究中，替米沙坦單獨應用可以通過 PPARgamma、P13K/AKT、TRAIL 抑制肺癌細胞的生長[8, 19-20]，替米沙坦與多西他賽合用可以明顯抑制裸鼠腫瘤的生長，改善腫瘤細胞的耐藥性[21]。替米沙坦促進熒光聚苯乙烯納米顆粒在腫瘤內的分布情況，說明替米沙坦有腫瘤治療藥物的潛力，可以促進納米顆粒包裹的化療藥物達到腫瘤區域[22]。Martínez 等[23]對利用鋅元素與替米沙坦進行復合，制成新的復合物，可以顯著促進其誘導肺腫瘤細胞凋亡的效果，并對非腫瘤細胞無毒性作用。
在本研究中，我們將替米沙坦應用于非小細胞肺癌 A549 細胞，CCK-8 細胞增殖實驗結果說明替米沙坦可以抑制 A549 細胞的增殖，并且 PCNA 的表達水平受到抑制，具有時間和濃度依賴性。PCNA 是一種與細胞活性相關的蛋白，其表達水平越高，細胞的活性程度越高，因此替米沙坦可以有效抑制 A549 細胞的增殖活性。在細胞遷移實驗中，替米沙坦可以明顯抑制 A549 細胞的遷移能力。Hoechst 和 Western blotting 的實驗結果證明，替米沙坦可以明顯促進 A549 細胞的凋亡。Western blotting 的結果顯示，經替米沙坦處理后，Wnt 信號通路的關鍵蛋白 Wnt-3a、β-catenin、c-myc、p-GSK-3β 表達下降，GSK-3β 表達增多，p-GSK-3β/GSK-3β 的比例下降，說明 Wnt 信號通路受到抑制。Wnt 信號通路是一個與胚胎、器官發育密切相關的信號家族，在腫瘤的增殖與轉移中起到重要作用，與腫瘤干細胞關系密切。此前有相關學者研究發現替米沙坦具有抗肺癌的作用，但均無直接證據顯示替米沙坦在肺癌中對 Wnt 信號通路的影響。Green 等[7]研究發現放線菌素與替米沙坦合用直接注射到裸鼠腫瘤模型腫瘤區域，可以明顯抑制裸鼠腫瘤的生長，并且可以降低 β-catenin 的表達水平。但并沒有證明替米沙坦可以直接抑制肺癌中 Wnt 信號通路的表達。我們的研究直接證明了替米沙坦可以通過調控 Wnt/β-catenin 信號通路有效抑制肺癌細胞的增殖、遷移和促進凋亡。
本次研究有以下幾點不足：（1）我們沒有研究替米沙坦對肺癌細胞化療耐藥的影響。肺癌治療的失敗與肺癌化療后期產生的耐藥性關聯密切，耐藥性產生的一個重要原因是腫瘤干細胞的存在，在化療的過程中，腫瘤干細胞不斷向耐化療藥物的表型分化，以至化療藥物在后期無法產生好的療效。（2）沒有分析替米沙坦對肺癌干細胞的影響，Wnt 信號通路對維持腫瘤干細胞的特性具有十分重要的作用[24]，在本研究中，我們證明替米沙坦可以通過 Wnt 信號通路抑制肺癌，但我們沒有進一步探究替米沙坦是否通過 Wnt 信號通路起到抑制肺癌干細胞的作用。（3）我們沒有進行體內實驗以及關注替米沙坦治療腫瘤的安全性。有研究[25]發現替米沙坦在小鼠腫瘤模型中會加劇順鉑誘導的腎毒性，因此有必要關注在腫瘤治療過程中，替米沙坦是否會產生或者影響化療藥物帶來的毒性反應。
替米沙坦可能在非小細胞肺癌 A549 的增殖、遷移和凋亡中起到作用，抑制 Wnt/β-catenin 信號通路可能是其中的一個機制。但仍需更深入的研究，比如動物實驗、耐藥性實驗、腫瘤干細胞實驗。
利益沖突：無。
作者貢獻：王靈杰負責實驗設計及參與全部實驗；趙懂華及黃章鋒負責細胞實驗；李蒙君及國鵬飛負責分子生物學實驗；王勇杰負責實驗設計及文章審校。
