引用本文： 夏彥民, 朱建飛, 王文辰, 姜濤. 不可逆電穿孔消融技術對食管癌治療作用的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2021, 28(9): 1095-1101. doi: 10.7507/1007-4848.202010066 復制
食管癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，全世界每年因其死亡人數高達 30 萬[1]。目前，手術依然是其治療的主要方式。對于不可切除食管癌患者的治療方法是以放療和化療為主的綜合治療，但總體效果不滿意。其它局部治療多采取消融技術來緩解癥狀，或減小腫瘤以達到可再次手術的目的，如射頻消融、冷凍消融及微波消融[2-4]。然而，這些方法主要是以熱效應發揮作用，對組織缺乏選擇性。不可逆電穿孔（irreversible electroporation，IRE）技術又稱納米刀，是一種能有效消融腫瘤的新技術。IRE 主要是通過釋放高壓直流電，利用電極傳遞電脈沖，產生強力的電場，改變細胞跨膜電位，使磷脂雙分子層重排，從而在細胞膜上產生永久性的納米孔，影響細胞穩態，導致細胞凋亡[5]。與常見的消融術相比，IRE 依賴瞬間的高壓電場而不是熱效應來發揮作用，因此其不受大血管血流的熱沉作用影響，且組織選擇性較好，能保存被消融區的重要結構，如神經、大血管等[6]。IRE 在實質性腫瘤如肝癌、胰腺癌、腎腫瘤及前列腺癌等治療應用中已經有了廣泛研究[7-10]，而對食管癌這種空腔臟器方面研究較少。本研究擬應用電穿孔杯和平板電極分別對食管癌細胞、裸鼠皮下移植瘤及兔正常食管施行 IRE 處理，探索 IRE 對食管癌消融的有效性和安全性。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 主要實驗儀器和試劑
此研究涉及的儀器包括ECM830 細胞電穿孔儀、4 mm 電穿孔杯、平板電極（美國 BTX 公司），TP3090 高壓電脈沖發生器（大連泰思曼科技有限公司），數字示波器（北京普源精電科技有限公司），全自動酶標儀（Cole Parmer 公司），蛋白電泳轉膜儀、紫外成像分析儀（Bio-Rad 公司）。本研究所使用的主要試劑包括RPMI-1640 培養基、胰蛋白酶（Gibco 公司），胎牛血清（Ausbian 公司），噻唑藍 MTT（Sigma 公司），RIPA 裂解液、BCA 試劑盒（碧云天公司），caspase-3 抗體、cleaved caspase-3 抗體（Santa Cruz 公司），GAPDH 抗體（Abcam 公司），山羊抗兔二抗（Sigma 公司），ECL 顯色液（美國 GE 公司），戊巴比妥鈉（Sigma 公司），蘇木素、伊紅、中性樹脂（西安晶彩生物科技有限公司）。
1.1.2 細胞培養
人食管鱗癌細胞 EC109、KYSE30 由空軍軍醫大學唐都醫院胸外科實驗室提供，用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養基進行培養，靜置于 37℃，5% CO2 培養箱中。取對數生長期的細胞進行后續實驗。
1.1.3 實驗動物
所需實驗動物由空軍軍醫大學實驗動物中心提供。5 周齡健康雌性 BALB/c 裸鼠 8 只，均在 SPF 級環境下飼養；雌性新西蘭大白兔 10 只，體重 2.5 ～ 3.5 kg，在清潔實驗條件下飼養。實驗前飼養1周以熟悉環境。
1.2 實驗方法
1.2.1 MTT 細胞存活率檢測
EC109、KYSE30 細胞生長到對數期時，用胰蛋白酶消化，800 g 離心 5 min，用 PBS 重懸，將細胞濃度調整為 1×106個/mL。然后將 600 μL 細胞重懸液加到 4 mm 電穿孔杯中，用 ECM830 電穿孔儀進行 IRE 處理，施加直流方波脈沖 50 個，脈沖長度 100 μs，脈沖間隔 1 s，按電壓不同，分為對照、500 V/cm、1000 V/cm、1500 V/cm、2 000 V/cm 5組。IRE 處理后細胞分別接種到 96 孔板中，24 h 后每孔中加入 20 μL MTT 溶液，孵育 4 h，吸棄上清液，每孔再加入 150 μL DMSO，振蕩 10 min 后在全自動酶標儀上檢測各孔的吸光度值。
1.2.2 Western blotting 檢測
分別收集正常及 IRE 處理的 EC109、KYSE30 細胞，提取蛋白并用 BCA 法測定各樣品的蛋白濃度，按 1∶4 加入蛋白上樣緩沖液，煮沸、離心。進行 SDS-PAGE 電泳，每孔上樣量 20 μg，再轉移至硝酸纖維素（PVDF）膜上，BSA 室溫封閉 1.5 ～ 2 h，TBST 洗膜后加入稀釋好的 caspase-3（1∶1000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）抗體，4℃ 過夜；次日用 TBST 洗膜，再加入稀釋好的山羊抗兔二抗，室溫 1 ～ 1.5 h，TBST 洗膜后加入 ECL 顯色液，顯影照相。
1.2.3 裸鼠皮下移植瘤的建立
用胰蛋白酶消化處于對數生長期的 EC109 細胞，PBS 清洗兩次，PBS 重懸細胞并調整濃度為 2.5×107個/mL。8 只 6 周齡雌性 BALB/c 裸鼠平均分為兩組（對照組、IRE 組），取 200 μL EC109 細胞懸液注入裸鼠右側背部皮下，每隔一天檢測腫瘤生長情況。
1.2.4 IRE 處理裸鼠腫瘤
當裸鼠腫瘤生長至 6 ～ 8 mm 時，腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉進行麻醉，固定于操作臺上，調整平板電極間距并加持腫瘤，行 IRE 處理，設備輸出參數：50 個脈沖，場強 2 000 V/cm（電壓/電極間距），波長 100 μs，間隔 1 s，頻率為 1 Hz。IRE 處理 14 d 后，處死裸鼠，剝離取出瘤體，稱量瘤體重量，并用游標卡尺測量瘤體的大小，根據公式（體積=長徑×短徑2×0.5）計算瘤體體積。
1.2.5 IRE 處理兔食管
將 10 只新西蘭大白兔平均分成兩組（對照組、IRE 組），禁食水 24 h 后，按 30 mg/kg 經耳緣靜脈注入 3% 戊巴比妥鈉麻醉，然后仰臥位固定于操作臺上，沿腹正中切口暴露腹腔，找到腹段食管。IRE 組將平板電極間距加持食管，并輸出脈沖：50 個脈沖，場強 2 000 V/cm，波長 100 μs，間隔 1 s；對照組操作同 IRE 組，但不輸出脈沖。術后縫合切口，并連續 3 d 給予肌肉注射 40 萬單位青霉素抗感染治療。7 d 后，將實驗兔安樂死，取腹段食管組織，進行組織病理檢測。
1.2.6 HE 染色
將獲得的食管組織置于多聚甲醛中，脫水后進行石蠟包埋，將切片機調成 5 μm 厚度進行切片，經二甲苯、梯度酒精脫蠟，蘇木精溶液浸泡 2 min 染色，弱堿液中反藍，再用自來水沖洗干凈，脫水，中性樹脂封片，顯微鏡觀察。
1.2.7 Masson 染色
將食管組織石蠟切片進行脫蠟，蘇木精溶液浸泡 10 min 染色，水洗后用 1% 的鹽酸-乙醇分化 1 ～ 3 s，水洗后放入促藍液中，再水洗后用立春紅酸性復紅液浸泡 10 min 染色，2% 冰醋酸溶液水洗后用 1% 磷鉬酸溶液分化 3 ～ 5 min，再用苯胺藍染色 5 min，0.2% 冰醋酸溶液水洗，脫水，中性樹脂封片，顯微鏡觀察。
1.3 統計學分析
采用 SPSS 19.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（
±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P≤0.05 表示差異有統計學意義。
1.4 倫理審查
本研究已通過空軍軍醫大學實驗動物倫理委員會審批，批準號：20191106。
2 結果
2.1 IRE 促進食管癌細胞的凋亡
為了檢測不同電場強度對食管癌細胞的滅活作用，用 MTT 法檢測 IRE 處理后食管癌細胞 EC109、KYSE30 的增殖情況，結果顯示當電場強度較小時（500 V/cm），IRE 處理后食管癌細胞的增殖與對照組無差異，而隨著電場強度的增加，IRE 對食管癌細胞增殖的影響逐漸加重，當達到 2 000 V/cm 時，IRE 處理后基本上無增殖（P<0.001，圖 1）。用 Western blotting 方法檢測 IRE 處理后，食管癌細胞 EC109、KYSE30 凋亡相關蛋白 caspase-3、cleaved caspase-3 的表達，以 caspase-3/GAPDH 及 cleaved caspase-3/GAPDH 相對灰度度值為結果計算相對表達量，結果顯示 IRE 處理能夠增加 EC109、KYSE30 凋亡相關蛋白 cleaved caspase-3 的表達，提示 IRE 可以促進食管癌細胞的凋亡（圖 2）。
圖1
不同電場強度 IRE 對食管癌細胞 EC109（a）、KYSE30（b）的作用
NS：與對照組比較，差異無統計學意義；**：與對照組比較，
圖2
Western blotting 檢測凋亡蛋白的表達
a：Western blotting 檢測 IRE 處理后食管癌細胞 caspase-3、cleaved caspase-3 表達情況的代表性圖像；b：Caspase-3 表達的半定量分析；c：Cleaved caspase-3 表達的半定量分析；NS：與對照組比較，差異無統計學意義；**：與對照組比較，
2.2 IRE 能夠抑制食管腫瘤的生長
采用 TP3090 高壓脈沖發生器（圖 3a）產生穩定的電脈沖，用示波器（圖 3b）顯示脈沖的波形以保證各項參數的準確性，用平板電極（圖 3c）輸出電脈沖以發揮作用；建立裸鼠皮下 EC109 食管癌移植瘤，用平板電極行 IRE 處理（圖 4a），到達時間節點后處死裸鼠，剝離瘤體（圖 4b），測量其體積及重量，結果顯示，IRE 處理后裸鼠移植瘤體積減小、重量減輕（P<0.05，圖 4c、d），表明 IRE 能夠抑制食管腫瘤的生長。
圖3
進行動物 IRE 實驗相關儀器
a：TP3090 高壓脈沖發生器；b：示波器；c：平板電極
圖4
IRE 對裸鼠皮下移植瘤的作用
a：用平板電極對裸鼠進行 IRE 處理；b：裸鼠皮下移植瘤剝離后大體觀；c：瘤體體積統計圖；d：瘤體重量統計圖；*：與對照組比較，
2.3 IRE 處理對實驗兔食管是安全的
用平板電極對實驗兔食管行 IRE 處理（圖 5a），與對照組相比，IRE 組實驗兔1 d后開始進食進水，觀察 1 周，實驗兔體重未發生明顯變化，沒有發生食管瘺的情況；病理學檢測可見，食管組織中，食管內膜細胞及肌細胞等發生凋亡，而間質組織受到破壞較小，對后期食管組織的恢復有著重大作用（圖 5b、c、d、e）；而 Masson 染色顯示，正常食管組織與 IRE 治療后的食管組織的纖維分布較一致，IRE 對纖維組織沒有影響，保持了組織的框架結構，有利于 IRE 治療后正常組織的恢復（圖 6）；表明 IRE 處理應用到食管組織也是安全有效的。
圖5
實驗兔食管組織 HE 染色
a：用平板電極對兔食管進行 IRE 處理；b、c：分別為對照組 HE 染色（100×）、（200×）；d、e：分別為IRE 處理后 HE 染色（100×）、（200×）
圖6
實驗兔食管組織 Masson 染色
用平板電極對兔食管進行 IRE 處理；a、b：分別為對照組 Masson 染色（100×）、（200×）；c、d：分別為IRE 處理后 Masson 染色（100×）、（200×）
3 討論
食管癌是常見的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率均居惡性腫瘤前列。在我國，食管癌在男性新發惡性腫瘤中排第3位，在女性新發惡性腫瘤中排第5位[1,11]。手術是食管癌治療的主要方式，但由于早期診斷困難，多數患者就診時已屬中晚期，失去手術切除機會。對無法手術的患者，臨床大多采用姑息性放療、化療等綜合治療，總體效果不滿意[12]。除此之外，局部微創消融治療也可減輕腫瘤負荷，緩解癥狀，甚至通過減小腫瘤以達到再次手術目的。然而，像射頻、冷凍和微波消融等局部消融方法，發揮作用的機理都是通過熱效應來實現，對組織選擇性差，在殺死腫瘤細胞的同時，對間質組織也會產生巨大的破壞，不利于治療后組織的恢復[13]。另外能量多少不易控制，在消融區易發生粘連甚至食管瘺[14]。
IRE 作為一種新的軟組織消融技術，其主要是通過高壓直流電在消融區內的細胞膜上不可逆地產生多個納米級小孔，從而導致細胞死亡。由于其發揮作用依賴的是微秒級的超短電脈沖，因此在消融過程中幾乎不產熱[15-16]。與傳統的局部消融手段相比，其主要有以下特點：因不依賴于熱效應，所以不受大血管的冷熱消除效應的影響；消融過程中對膠原等纖維結締組織無影響，不易損傷大血管、神經等重要組織結構；消融邊界清晰，易于對消融效果做出準確判斷；消融區炎癥反應輕微；治療時間短，可多次消融[17-19]。目前，IRE 已被用于多種實質性腫瘤的研究應用當中，如胰腺癌、肝癌、前列腺癌等[7-10]，甚至因毗鄰重要結構無法用傳統消融方法治療的腫瘤類型，如肝門腫瘤，且顯示出良好的作用[20]。然而 IRE 在食管癌方面的研究較少。
本研究旨在探討 IRE 在食管癌方面的治療效果及安全性。首先，利用相關細胞實驗，檢測 IRE 的作用并篩選出合適的參數。IRE 大多采用脈寬為 100 μs 的電脈沖，其發揮作用主要受電脈沖的個數及電場強度的影響[21]，我們參考其它研究將電脈沖個數固定為 50 個，通過改變電場強度觀察其效果。結果顯示當電場強度為 500 V/cm 時，單純的 IRE 并無明顯的殺傷作用，因為當電場強度較小時，雖然也能在細胞膜上產生小孔，但這個過程是可逆的，當去除電場作用后，這些小孔就會慢慢閉合，對細胞影響較小[22]。而隨著電場強度的不斷加大，細胞膜上的小孔變為不可逆的，IRE 對食管癌細胞的殺傷作用也越來越強，當達到 2 000 V/cm 時，其作用基本最大化，也以此作為后續研究的參數。我們檢測了凋亡相關蛋白如 cleaved caspase-3 的表達，也顯示 IRE 處理后是增加的，表明 IRE 能夠促進食管癌細胞的凋亡。接著我們檢測 IRE 對在體食管腫瘤的作用，應用食管癌細胞 EC109 建立裸鼠皮下移植瘤模型，利用平板電極行 IRE 處理，觀察其對腫瘤生長的作用。與體外實驗相一致，IRE 能夠減小瘤體體積，減輕瘤體重量，抑制腫瘤的生長。食管是一種空腔臟器，治療處理不當容易引起食管瘺等并發癥，因此我們應用平板電極對正常新西蘭大白兔食管進行 IRE 處理，觀察其效果。結果顯示 IRE 處理后并無食管瘺等不良反應的發生，且能夠對食管組織的實質細胞產生殺傷作用，而對纖維等結締組織的影響較小，這也有利于治療后消融區組織的修復。Neven等[23]研究也顯示對正常豬食管進行 IRE 處理后，無不良反應發生，且間質組織不受損害。
綜上，IRE 消融對食管癌細胞具有殺傷作用，能夠減緩食管腫瘤的生長，且在食管組織中應用是安全的，為進一步的臨床應用奠定理論及實驗基礎。
利益沖突：無。
作者貢獻：夏彥民負責實驗設計及完成，論文撰寫；朱建飛負責部分裸鼠實驗；王文辰負責細胞及分子生物學檢測；姜濤負責實驗設計和論文審校。
食管癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，全世界每年因其死亡人數高達 30 萬[1]。目前，手術依然是其治療的主要方式。對于不可切除食管癌患者的治療方法是以放療和化療為主的綜合治療，但總體效果不滿意。其它局部治療多采取消融技術來緩解癥狀，或減小腫瘤以達到可再次手術的目的，如射頻消融、冷凍消融及微波消融[2-4]。然而，這些方法主要是以熱效應發揮作用，對組織缺乏選擇性。不可逆電穿孔（irreversible electroporation，IRE）技術又稱納米刀，是一種能有效消融腫瘤的新技術。IRE 主要是通過釋放高壓直流電，利用電極傳遞電脈沖，產生強力的電場，改變細胞跨膜電位，使磷脂雙分子層重排，從而在細胞膜上產生永久性的納米孔，影響細胞穩態，導致細胞凋亡[5]。與常見的消融術相比，IRE 依賴瞬間的高壓電場而不是熱效應來發揮作用，因此其不受大血管血流的熱沉作用影響，且組織選擇性較好，能保存被消融區的重要結構，如神經、大血管等[6]。IRE 在實質性腫瘤如肝癌、胰腺癌、腎腫瘤及前列腺癌等治療應用中已經有了廣泛研究[7-10]，而對食管癌這種空腔臟器方面研究較少。本研究擬應用電穿孔杯和平板電極分別對食管癌細胞、裸鼠皮下移植瘤及兔正常食管施行 IRE 處理，探索 IRE 對食管癌消融的有效性和安全性。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 主要實驗儀器和試劑
此研究涉及的儀器包括ECM830 細胞電穿孔儀、4 mm 電穿孔杯、平板電極（美國 BTX 公司），TP3090 高壓電脈沖發生器（大連泰思曼科技有限公司），數字示波器（北京普源精電科技有限公司），全自動酶標儀（Cole Parmer 公司），蛋白電泳轉膜儀、紫外成像分析儀（Bio-Rad 公司）。本研究所使用的主要試劑包括RPMI-1640 培養基、胰蛋白酶（Gibco 公司），胎牛血清（Ausbian 公司），噻唑藍 MTT（Sigma 公司），RIPA 裂解液、BCA 試劑盒（碧云天公司），caspase-3 抗體、cleaved caspase-3 抗體（Santa Cruz 公司），GAPDH 抗體（Abcam 公司），山羊抗兔二抗（Sigma 公司），ECL 顯色液（美國 GE 公司），戊巴比妥鈉（Sigma 公司），蘇木素、伊紅、中性樹脂（西安晶彩生物科技有限公司）。
1.1.2 細胞培養
人食管鱗癌細胞 EC109、KYSE30 由空軍軍醫大學唐都醫院胸外科實驗室提供，用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培養基進行培養，靜置于 37℃，5% CO2 培養箱中。取對數生長期的細胞進行后續實驗。
1.1.3 實驗動物
所需實驗動物由空軍軍醫大學實驗動物中心提供。5 周齡健康雌性 BALB/c 裸鼠 8 只，均在 SPF 級環境下飼養；雌性新西蘭大白兔 10 只，體重 2.5 ～ 3.5 kg，在清潔實驗條件下飼養。實驗前飼養1周以熟悉環境。
1.2 實驗方法
1.2.1 MTT 細胞存活率檢測
EC109、KYSE30 細胞生長到對數期時，用胰蛋白酶消化，800 g 離心 5 min，用 PBS 重懸，將細胞濃度調整為 1×106個/mL。然后將 600 μL 細胞重懸液加到 4 mm 電穿孔杯中，用 ECM830 電穿孔儀進行 IRE 處理，施加直流方波脈沖 50 個，脈沖長度 100 μs，脈沖間隔 1 s，按電壓不同，分為對照、500 V/cm、1000 V/cm、1500 V/cm、2 000 V/cm 5組。IRE 處理后細胞分別接種到 96 孔板中，24 h 后每孔中加入 20 μL MTT 溶液，孵育 4 h，吸棄上清液，每孔再加入 150 μL DMSO，振蕩 10 min 后在全自動酶標儀上檢測各孔的吸光度值。
1.2.2 Western blotting 檢測
分別收集正常及 IRE 處理的 EC109、KYSE30 細胞，提取蛋白并用 BCA 法測定各樣品的蛋白濃度，按 1∶4 加入蛋白上樣緩沖液，煮沸、離心。進行 SDS-PAGE 電泳，每孔上樣量 20 μg，再轉移至硝酸纖維素（PVDF）膜上，BSA 室溫封閉 1.5 ～ 2 h，TBST 洗膜后加入稀釋好的 caspase-3（1∶1000）、cleaved caspase-3（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）抗體，4℃ 過夜；次日用 TBST 洗膜，再加入稀釋好的山羊抗兔二抗，室溫 1 ～ 1.5 h，TBST 洗膜后加入 ECL 顯色液，顯影照相。
1.2.3 裸鼠皮下移植瘤的建立
用胰蛋白酶消化處于對數生長期的 EC109 細胞，PBS 清洗兩次，PBS 重懸細胞并調整濃度為 2.5×107個/mL。8 只 6 周齡雌性 BALB/c 裸鼠平均分為兩組（對照組、IRE 組），取 200 μL EC109 細胞懸液注入裸鼠右側背部皮下，每隔一天檢測腫瘤生長情況。
1.2.4 IRE 處理裸鼠腫瘤
當裸鼠腫瘤生長至 6 ～ 8 mm 時，腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉進行麻醉，固定于操作臺上，調整平板電極間距并加持腫瘤，行 IRE 處理，設備輸出參數：50 個脈沖，場強 2 000 V/cm（電壓/電極間距），波長 100 μs，間隔 1 s，頻率為 1 Hz。IRE 處理 14 d 后，處死裸鼠，剝離取出瘤體，稱量瘤體重量，并用游標卡尺測量瘤體的大小，根據公式（體積=長徑×短徑2×0.5）計算瘤體體積。
1.2.5 IRE 處理兔食管
將 10 只新西蘭大白兔平均分成兩組（對照組、IRE 組），禁食水 24 h 后，按 30 mg/kg 經耳緣靜脈注入 3% 戊巴比妥鈉麻醉，然后仰臥位固定于操作臺上，沿腹正中切口暴露腹腔，找到腹段食管。IRE 組將平板電極間距加持食管，并輸出脈沖：50 個脈沖，場強 2 000 V/cm，波長 100 μs，間隔 1 s；對照組操作同 IRE 組，但不輸出脈沖。術后縫合切口，并連續 3 d 給予肌肉注射 40 萬單位青霉素抗感染治療。7 d 后，將實驗兔安樂死，取腹段食管組織，進行組織病理檢測。
1.2.6 HE 染色
將獲得的食管組織置于多聚甲醛中，脫水后進行石蠟包埋，將切片機調成 5 μm 厚度進行切片，經二甲苯、梯度酒精脫蠟，蘇木精溶液浸泡 2 min 染色，弱堿液中反藍，再用自來水沖洗干凈，脫水，中性樹脂封片，顯微鏡觀察。
1.2.7 Masson 染色
將食管組織石蠟切片進行脫蠟，蘇木精溶液浸泡 10 min 染色，水洗后用 1% 的鹽酸-乙醇分化 1 ～ 3 s，水洗后放入促藍液中，再水洗后用立春紅酸性復紅液浸泡 10 min 染色，2% 冰醋酸溶液水洗后用 1% 磷鉬酸溶液分化 3 ～ 5 min，再用苯胺藍染色 5 min，0.2% 冰醋酸溶液水洗，脫水，中性樹脂封片，顯微鏡觀察。
1.3 統計學分析
采用 SPSS 19.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P≤0.05 表示差異有統計學意義。
1.4 倫理審查
本研究已通過空軍軍醫大學實驗動物倫理委員會審批，批準號：20191106。
2 結果
2.1 IRE 促進食管癌細胞的凋亡
為了檢測不同電場強度對食管癌細胞的滅活作用，用 MTT 法檢測 IRE 處理后食管癌細胞 EC109、KYSE30 的增殖情況，結果顯示當電場強度較小時（500 V/cm），IRE 處理后食管癌細胞的增殖與對照組無差異，而隨著電場強度的增加，IRE 對食管癌細胞增殖的影響逐漸加重，當達到 2 000 V/cm 時，IRE 處理后基本上無增殖（P<0.001，圖 1）。用 Western blotting 方法檢測 IRE 處理后，食管癌細胞 EC109、KYSE30 凋亡相關蛋白 caspase-3、cleaved caspase-3 的表達，以 caspase-3/GAPDH 及 cleaved caspase-3/GAPDH 相對灰度度值為結果計算相對表達量，結果顯示 IRE 處理能夠增加 EC109、KYSE30 凋亡相關蛋白 cleaved caspase-3 的表達，提示 IRE 可以促進食管癌細胞的凋亡（圖 2）。
圖1
不同電場強度 IRE 對食管癌細胞 EC109（a）、KYSE30（b）的作用
NS：與對照組比較，差異無統計學意義；**：與對照組比較，
圖2
Western blotting 檢測凋亡蛋白的表達
a：Western blotting 檢測 IRE 處理后食管癌細胞 caspase-3、cleaved caspase-3 表達情況的代表性圖像；b：Caspase-3 表達的半定量分析；c：Cleaved caspase-3 表達的半定量分析；NS：與對照組比較，差異無統計學意義；**：與對照組比較，
2.2 IRE 能夠抑制食管腫瘤的生長
采用 TP3090 高壓脈沖發生器（圖 3a）產生穩定的電脈沖，用示波器（圖 3b）顯示脈沖的波形以保證各項參數的準確性，用平板電極（圖 3c）輸出電脈沖以發揮作用；建立裸鼠皮下 EC109 食管癌移植瘤，用平板電極行 IRE 處理（圖 4a），到達時間節點后處死裸鼠，剝離瘤體（圖 4b），測量其體積及重量，結果顯示，IRE 處理后裸鼠移植瘤體積減小、重量減輕（P<0.05，圖 4c、d），表明 IRE 能夠抑制食管腫瘤的生長。
圖3
進行動物 IRE 實驗相關儀器
a：TP3090 高壓脈沖發生器；b：示波器；c：平板電極
圖4
IRE 對裸鼠皮下移植瘤的作用
a：用平板電極對裸鼠進行 IRE 處理；b：裸鼠皮下移植瘤剝離后大體觀；c：瘤體體積統計圖；d：瘤體重量統計圖；*：與對照組比較，
2.3 IRE 處理對實驗兔食管是安全的
用平板電極對實驗兔食管行 IRE 處理（圖 5a），與對照組相比，IRE 組實驗兔1 d后開始進食進水，觀察 1 周，實驗兔體重未發生明顯變化，沒有發生食管瘺的情況；病理學檢測可見，食管組織中，食管內膜細胞及肌細胞等發生凋亡，而間質組織受到破壞較小，對后期食管組織的恢復有著重大作用（圖 5b、c、d、e）；而 Masson 染色顯示，正常食管組織與 IRE 治療后的食管組織的纖維分布較一致，IRE 對纖維組織沒有影響，保持了組織的框架結構，有利于 IRE 治療后正常組織的恢復（圖 6）；表明 IRE 處理應用到食管組織也是安全有效的。
圖5
實驗兔食管組織 HE 染色
a：用平板電極對兔食管進行 IRE 處理；b、c：分別為對照組 HE 染色（100×）、（200×）；d、e：分別為IRE 處理后 HE 染色（100×）、（200×）
圖6
實驗兔食管組織 Masson 染色
用平板電極對兔食管進行 IRE 處理；a、b：分別為對照組 Masson 染色（100×）、（200×）；c、d：分別為IRE 處理后 Masson 染色（100×）、（200×）
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食管癌是常見的惡性腫瘤之一，其發病率及死亡率均居惡性腫瘤前列。在我國，食管癌在男性新發惡性腫瘤中排第3位，在女性新發惡性腫瘤中排第5位[1,11]。手術是食管癌治療的主要方式，但由于早期診斷困難，多數患者就診時已屬中晚期，失去手術切除機會。對無法手術的患者，臨床大多采用姑息性放療、化療等綜合治療，總體效果不滿意[12]。除此之外，局部微創消融治療也可減輕腫瘤負荷，緩解癥狀，甚至通過減小腫瘤以達到再次手術目的。然而，像射頻、冷凍和微波消融等局部消融方法，發揮作用的機理都是通過熱效應來實現，對組織選擇性差，在殺死腫瘤細胞的同時，對間質組織也會產生巨大的破壞，不利于治療后組織的恢復[13]。另外能量多少不易控制，在消融區易發生粘連甚至食管瘺[14]。
IRE 作為一種新的軟組織消融技術，其主要是通過高壓直流電在消融區內的細胞膜上不可逆地產生多個納米級小孔，從而導致細胞死亡。由于其發揮作用依賴的是微秒級的超短電脈沖，因此在消融過程中幾乎不產熱[15-16]。與傳統的局部消融手段相比，其主要有以下特點：因不依賴于熱效應，所以不受大血管的冷熱消除效應的影響；消融過程中對膠原等纖維結締組織無影響，不易損傷大血管、神經等重要組織結構；消融邊界清晰，易于對消融效果做出準確判斷；消融區炎癥反應輕微；治療時間短，可多次消融[17-19]。目前，IRE 已被用于多種實質性腫瘤的研究應用當中，如胰腺癌、肝癌、前列腺癌等[7-10]，甚至因毗鄰重要結構無法用傳統消融方法治療的腫瘤類型，如肝門腫瘤，且顯示出良好的作用[20]。然而 IRE 在食管癌方面的研究較少。
本研究旨在探討 IRE 在食管癌方面的治療效果及安全性。首先，利用相關細胞實驗，檢測 IRE 的作用并篩選出合適的參數。IRE 大多采用脈寬為 100 μs 的電脈沖，其發揮作用主要受電脈沖的個數及電場強度的影響[21]，我們參考其它研究將電脈沖個數固定為 50 個，通過改變電場強度觀察其效果。結果顯示當電場強度為 500 V/cm 時，單純的 IRE 并無明顯的殺傷作用，因為當電場強度較小時，雖然也能在細胞膜上產生小孔，但這個過程是可逆的，當去除電場作用后，這些小孔就會慢慢閉合，對細胞影響較小[22]。而隨著電場強度的不斷加大，細胞膜上的小孔變為不可逆的，IRE 對食管癌細胞的殺傷作用也越來越強，當達到 2 000 V/cm 時，其作用基本最大化，也以此作為后續研究的參數。我們檢測了凋亡相關蛋白如 cleaved caspase-3 的表達，也顯示 IRE 處理后是增加的，表明 IRE 能夠促進食管癌細胞的凋亡。接著我們檢測 IRE 對在體食管腫瘤的作用，應用食管癌細胞 EC109 建立裸鼠皮下移植瘤模型，利用平板電極行 IRE 處理，觀察其對腫瘤生長的作用。與體外實驗相一致，IRE 能夠減小瘤體體積，減輕瘤體重量，抑制腫瘤的生長。食管是一種空腔臟器，治療處理不當容易引起食管瘺等并發癥，因此我們應用平板電極對正常新西蘭大白兔食管進行 IRE 處理，觀察其效果。結果顯示 IRE 處理后并無食管瘺等不良反應的發生，且能夠對食管組織的實質細胞產生殺傷作用，而對纖維等結締組織的影響較小，這也有利于治療后消融區組織的修復。Neven等[23]研究也顯示對正常豬食管進行 IRE 處理后，無不良反應發生，且間質組織不受損害。
綜上，IRE 消融對食管癌細胞具有殺傷作用，能夠減緩食管腫瘤的生長，且在食管組織中應用是安全的，為進一步的臨床應用奠定理論及實驗基礎。
利益沖突：無。
作者貢獻：夏彥民負責實驗設計及完成，論文撰寫；朱建飛負責部分裸鼠實驗；王文辰負責細胞及分子生物學檢測；姜濤負責實驗設計和論文審校。
