由于高分辨率胸部 CT 和肺癌早期篩查的普及，同期多原發肺癌（或稱同時性多原發肺癌，synchronous multiple primary lung cancer，sMPLC）的檢出率逐步提高。sMPLC 與肺癌肺內轉移的鑒別診斷成為尤其重要的臨床問題。借助高通量測序技術刻畫 sMPLC 的分子遺傳學特征是目前研究的熱點，既能闡釋 sMPLC 的發生發展規律，也可作為臨床病理診斷標準的補充和完善。本文對 sMPLC 診斷標準的更新進行總結，并以克隆性分析領域為例，綜述 sMPLC 分子遺傳學特征的研究進展。
引用本文： 宋洋, 楊笑盈, 賈梓淇, 邴鐘興, 曹磊, 曹智理, 郭超, 梁乃新, 李單青. 同期多原發肺癌診斷標準更新與分子遺傳學特征研究進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2021, 28(3): 358-362. doi: 10.7507/1007-4848.202004014 復制
GLOBOCAN 2018 統計顯示，在全球范圍內肺癌是發病率最高的惡性腫瘤，同時也是癌癥相關死亡最主要的原因[1]。2018 年中國新增肺癌病例 774 323 例，新增肺癌死亡病例 690 567 例[1]。目前，中國肺癌患者的 5 年生存率為 19.7%[2-3]。
1924 年，Beyreuther 首次報道了同時有兩個彼此獨立的原發腫瘤灶的肺癌病例，對于肺部多發惡性腫瘤的研究就此拉開序幕。而根據研究[4]，約有 15% 的肺癌患者經手術明確同時存在≥ 2 個肺內惡性病灶。而一項通過回顧分析 SEER 數據庫的研究[5]報道，對于首診原發性肺癌的患者，即便在接受根治性治療后，仍有每人每年 1%～2% 的風險發生第二原發性肺癌（second primary lung cancer，SPLC）。由此，同一患者肺內發生2個或2個以上的原發性惡性腫瘤，即多原發肺癌（multiple primary lung cancer，MPLC）的研究價值，再次得到了強調。
MPLC 據診斷時間間隔 4 年[6-7]，可進一步區分為同期多原發肺癌（或稱同時性多原發肺癌，sMPLC）與異時性多原發肺癌（metachronous MPLC，mMPLC）。據多個臨床序列提供的數據顯示，sMPLC 的估算發病率在 0.2%～8%[8]。近年來，隨著早診檢查手段的普及（如 CT、PET），以及對肺癌綜合治療的深入探索，sMPLC 患者有了更高的檢出率、更長的生存期[9]。然而，sMPLC 與肺癌肺內轉移（intrapulmonary metastases）的鑒別診斷是一個長久存在的臨床難題。由于二者預后、相應治療方案的顯著區別，建立臨床工作中可遵循的診斷標準，并進一步探索二者預后差別背后的病理學、分子生物學機制，無疑是一個極具重要性的研究課題。
本文對 sMPLC 的診斷標準更新及相關理論的研究進展，包括臨床病理診斷證據、分子遺傳學特征及二者的比較、匹配，進行綜述，以期為完善 sMPLC 的診治策略帶來啟發。
1 sMPLC 診斷標準的更新及局限
1.1 sMPLC 概念及診斷標準的發展史
1975 年，Martini 和 Melamed [10]提出了MPLC的首個臨床病理診斷標準。據 Martini-Melamed 診斷標準，對于解剖上分隔開的多個腫瘤病灶，若符合下列標準之一，則可被診斷為 MPLC：（1）病理組織類型不同；（2）多個病灶病理組織類型相同，但符合下列條件：① 病灶起源于原位癌（carcinoma in situ，CIS）；② 病灶發生于不同肺段、不同肺葉或不同側肺；③ 無共同引流的淋巴系統或肺外轉移。如診斷為 MPLC 的病灶間的診斷間隔≤2 年，則劃分為 sMPLC。
1995 年及 2003 年，Antakli等[11]及 Colice等[12] 對 Martini-Melamed 診斷標準進行了修訂，符合下列標準之一的病灶可被診斷為 MPLC：（1）病理組織類型不同；（2）多個病灶病理組織類型相同，但下列條件符合至少兩個：① 解剖上獨立；② 屬癌前病變；③ 無全身轉移；④ 無縱隔受累；⑤ DNA 倍體分析結果不同。區分 sMPLC 與 mMPLC 的診斷間隔標準變更為 4 年，癌灶的分子遺傳學特征首次加入了診斷標準。
2007 年，美國胸科醫師學會（ACCP）提出了 sMPLC 的診斷標準[6]，并在 2013 年作出了修訂[7]，符合下列標準之一的病灶可被診斷為 MPLC：（1）病理組織類型不同；（2）多個病灶病理組織類型相同，但符合下列條件之一：① 分屬不同肺葉，且無 N2、N3 受累、無全身轉移；② 由解剖上分離的癌前病變發展而來；③ 有不同的分子遺傳學特征。至此，sMPLC 分子遺傳學特征的診斷價值得到了再一次提高，但 ACCP 的指南中仍未明確“分子遺傳學特征”的具體內容及標準（圖1）。
圖1
sMPLC 臨床診斷標準更新及理念進化
1995～2003 年，Antakli-Colice 首次將癌灶的分子遺傳學特征加入診斷標準；2007～2013 年，ACCP 不斷提高分子遺傳學特征的診斷價值，但具體內容及標準尚待明確；未來，對 sMPLC 分子遺傳學特征的探究將有更加廣闊的前景
2016 年，國際肺癌研究協會（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）提出現行 TNM 分期對于評價 sMPLC 有其局限性，建議在第 8 版 TNM 分期中對其進行特殊分期：T 分期為各單個病灶中最高的 T 分期，在其后標注病灶個數，N 分期和 M 分期則根據所有結節的總體淋巴結及全身轉移情況制定，如“T2（3）N0M0”[13]。此后，尚無被廣泛接受的 sMPLC 診斷標準在指南中被提出。
1.2 臨床病理診斷的局限性
經過長時間的臨床實踐檢驗，單獨的臨床病理診斷呈現出了其局限性。即便是根據最為廣泛應用的 Martini-Melamed 診斷標準，不同課題組據該標準區分出的 sMPLC 患者群體的生存率數據呈現出顯著偏倚[14]。2010 年 Girard等[15]報道，同一組患者分別通過 Martini-Melamed 及 ACCP 標準進行 sMPLC 與肺癌肺內轉移的鑒別診斷，結果也有較大偏差。ACCP 指南（2013 年版）中評論，臨床病理診斷中觀察到的這些偏倚，不僅由于部分診斷標準有賴于臨床醫生無法完全量化的主觀判斷，沒有將 sMPLC 具體的分子遺傳學特征納入診斷標準也是因素之一[7]。第 8 版 TNM 分期的補充意見中也同樣強調了分子遺傳學特征對于 sMPLC 的診斷價值[13]。sMPLC 分子遺傳學特征的診斷價值逐漸成為研究熱點。
2 sMPLC 分子遺傳學特征的診斷價值
2011 年 Hanahan等[16]報道了惡性腫瘤的十大特征，并認為其中最根本的特征是“基因組的不穩定性和突變”，此特征賦予了惡性腫瘤細胞克隆性增殖的能力。因而，克隆性分析是對 sMPLC 分子遺傳學特征分析的一個重要切入點。
經典的克隆性分析包括原癌基因或抑癌基因的體細胞突變（somatic mutations in oncogenes or tumor suppressor genes）分析、X-染色體的失活（X-chromosome inactivation）分析及雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）分析等分析手段[14, 17]。下文將從上述三方面對 sMPLC 的分子遺傳學特征及其診斷價值進行綜述。
2.1 原癌基因或抑癌基因的體細胞突變分析
“標記基因（genetic markers，或稱 clonal markers）”是在惡性腫瘤的癌變過程中，早期發生、高頻發生突變的基因，且該突變隨惡性腫瘤細胞的復制能夠穩定傳遞給子代細胞。位于 17 號染色體上的 p53 是一個抑癌基因，兼具作為標記基因的上述特征，且 p53 在小細胞肺癌及非小細胞肺癌中的突變發生率分別高達 70% 與 50%[18-19]。據報道，在 MPLC 中，p53 的突變可發生在該基因 DNA 結合區（5～8 外顯子）的多個位點，且均為點突變[20]。因此，在多種多樣的 p53 突變中，兩個獨立的癌灶有相同的 p53 突變的概率極低，這是通過原癌基因或抑癌基因的體細胞突變模式鑒別腫瘤來源的理論基礎。早在 1993 年，此理論就已在鑒別診斷多原發頭頸部腫瘤中得到了驗證[21]。在診斷 MPLC 的研究中，p53 體細胞突變的診斷可靠性大概為 35%～66%[22]。不只是 p53，EGFR 與 KRAS 突變在非典型性腺瘤樣增生（atypical adenomatous hyperplasia，AAH）的病例中多有報道，傾向于被認為是肺癌發生過程中的早期事件[23]。同樣，EGFR 及 KRAS 突變是隨機發生的，且有極高的突變不一致性：如將 EGFR 與 KRAS 的突變狀態組合分析，71%～83% 的 MPLC 患者表現出克隆性（clonality status）的不一致[23-24]，因此 EGFR/KRAS 也是被用于克隆性分析的標記基因[23-26]。有研究人員發現，27.9% 的多原發肺癌患者不同腫瘤灶中程序性死亡配體-1（PD-L1）表達水平存在差異，該比例遠高于肺內轉移患者（6.3%）[27]。
“分子標簽”也可以是一組肺癌的相關熱點突變。已有一項研究提出可通過結合病理診斷及 22 個肺癌熱點基因的突變形式對肺癌肺內轉移及 sMPLC 作出鑒別診斷。文中認為有不同驅動基因突變（包括 BRAF、EGFR、KRAS、NRAS、ERBB2、MET）的同期多灶肺癌可診斷為 sMPLC；在有相同突變的情況下，（1）如相同突變是肺癌的高頻突變（包括 EGFR del 19、EGFR L858R、KRAS G12X），則根據病理劃分肺內轉移或 sMPLC；（2）如相同突變是罕見突變（包括 p53），則認為是肺內轉移。本研究提出的診斷標準尚需大規模的前瞻性臨床試驗進行進一步驗證[28]。
在臨床應用中，對于根據病理組織類型證據就可診斷為 sMPLC 的病例，體細胞突變分析可驗證其病理組織診斷，一致性高達 78%[29-30]；當癌灶病理組織類型相同、臨床診斷存在難度時，分子遺傳學特征可作為獨立于臨床證據的補充證據[31]。
需要特別指出的是，對于影像學表現為純磨玻璃影的多個早期癌變，研究者常常排除淋巴或血性轉移的可能，診斷為 sMPLC[13]，但近期有研究通過體細胞突變分析的手段，從分子遺傳學特征的角度證明了氣腔播散轉移（spread through air spaces，STAS[32]）在此類多發磨玻璃影的“早期癌變”中存在的可能[33]。此發現也從另一角度提示，分子遺傳學特征可用于研究肺癌發生發展的規律。
2.2 X-染色體的失活分析
在女性胚胎發育過程中，每個體細胞的兩條 X 染色體中都有一條會隨機失活，正常的女性組織中父本 X 染色體失活的細胞與母本 X 染色體失活的細胞隨機分布，相互鑲嵌，呈“馬賽克”樣。而在細胞克隆性增殖過程中，失活的 X 染色體會穩定傳遞到子代細胞中，因此同樣可以作為一個克隆性標志。2009 年，Wang等[34]首次將 X-染色體失活分析法運用于一個 MPLC 臨床序列，臨床診斷為 sMPLC 或 mMPLC 的入組患者中，78% 的患者呈現出了一致的 X 染色體失活模式，因此該組患者中很大可能有誤診為 MPLC 的肺內轉移患者，X 染色體的失活分析揭示了臨床病理學診斷的局限性。
但 X-染色體失活分析的主要局限性在于：（1）僅可運用于女性患者中；（2）即便是克隆性不一致的兩個癌灶，也有 50% 的可能，因為 X 染色體失活的隨機性，呈現出同樣的 X 染色體失活模式[35]。
2.3 雜合性缺失分析
據二次打擊假說（Knudson's two hit hypothesis），細胞中攜帶一個等位基因上的生殖細胞系突變（germ-line heterozygosity）是發生癌變的基礎，若第二個等位基因上發生二次突變，細胞成為體細胞突變純合子（somatic homozygosity），導致抑癌基因徹底失活，細胞則發生癌變[36]，上述過程稱為雜合性缺失。LOH 分析中，正常組織因為父本與母本來源的基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）或微衛星（microsatellite）位點多態性的不一致呈現出雜合性，而同一克隆來源的癌灶則會表現出相同的 LOH 模式[37]。已有報道通過 LOH 分析可成功區別病理組織類型相同的 sMPLC 與肺內轉移灶[38-39]，通過與 p53 突變模式結合，此種分子遺傳學診斷方法的特異性及敏感性可得到進一步提高[17]。
3 分子遺傳性特征分析的潛在問題
無論是通過何種分子生物學技術對癌灶進行分子遺傳學特征的探究，一個始終需要回答的問題是腫瘤的異質性（intratumoral heterogeneity）。2012 年，《新英格蘭醫學雜志》刊發了腎癌相關研究中腫瘤內部的異質性，及隨腫瘤發展進化出現的異質性[40]。通過 DNA 測序分析，多個肺癌相關基因，包括 EGFR、KRAS、ERBB2，均呈現出了腫瘤異質性，并主要見于肺腺癌標本[41-43]。這種異質性或許能夠部分解釋部分肺癌患者對于治療反應的差異，但同時也提示，sMPLC 分子遺傳學特征的臨床應用仍需要更多深入的研究[44-45]。
4 小結與展望
經過 30 余年的探索，sMPLC 的診斷標準多次更新，僅依照腫瘤的組織病理學特征無法明確區分 sMPLC 與肺內轉移瘤，分子遺傳學特征的診斷價值逐漸得到重視和強調。以克隆性分析領域取得的進展為例，對 sMPLC 的分子遺傳學特征進行描述和機制探索，不僅可以補充完善臨床病理診斷標準，在揭示 sMPLC 的發生發展規律方面也有廣闊的前景，有望輔助定義 sMPLC 的疾病性質。
利益沖突：無。
作者貢獻：宋洋設計論文、檢索文獻、撰寫初稿；梁乃新、李單青設計論文、修改論文終稿；楊笑盈、賈梓淇檢索及分析文獻； 邴鐘興、曹磊、曹智理和郭超對論文進行了審閱與修改。
GLOBOCAN 2018 統計顯示，在全球范圍內肺癌是發病率最高的惡性腫瘤，同時也是癌癥相關死亡最主要的原因[1]。2018 年中國新增肺癌病例 774 323 例，新增肺癌死亡病例 690 567 例[1]。目前，中國肺癌患者的 5 年生存率為 19.7%[2-3]。
1924 年，Beyreuther 首次報道了同時有兩個彼此獨立的原發腫瘤灶的肺癌病例，對于肺部多發惡性腫瘤的研究就此拉開序幕。而根據研究[4]，約有 15% 的肺癌患者經手術明確同時存在≥ 2 個肺內惡性病灶。而一項通過回顧分析 SEER 數據庫的研究[5]報道，對于首診原發性肺癌的患者，即便在接受根治性治療后，仍有每人每年 1%～2% 的風險發生第二原發性肺癌（second primary lung cancer，SPLC）。由此，同一患者肺內發生2個或2個以上的原發性惡性腫瘤，即多原發肺癌（multiple primary lung cancer，MPLC）的研究價值，再次得到了強調。
MPLC 據診斷時間間隔 4 年[6-7]，可進一步區分為同期多原發肺癌（或稱同時性多原發肺癌，sMPLC）與異時性多原發肺癌（metachronous MPLC，mMPLC）。據多個臨床序列提供的數據顯示，sMPLC 的估算發病率在 0.2%～8%[8]。近年來，隨著早診檢查手段的普及（如 CT、PET），以及對肺癌綜合治療的深入探索，sMPLC 患者有了更高的檢出率、更長的生存期[9]。然而，sMPLC 與肺癌肺內轉移（intrapulmonary metastases）的鑒別診斷是一個長久存在的臨床難題。由于二者預后、相應治療方案的顯著區別，建立臨床工作中可遵循的診斷標準，并進一步探索二者預后差別背后的病理學、分子生物學機制，無疑是一個極具重要性的研究課題。
本文對 sMPLC 的診斷標準更新及相關理論的研究進展，包括臨床病理診斷證據、分子遺傳學特征及二者的比較、匹配，進行綜述，以期為完善 sMPLC 的診治策略帶來啟發。
1 sMPLC 診斷標準的更新及局限
1.1 sMPLC 概念及診斷標準的發展史
1975 年，Martini 和 Melamed [10]提出了MPLC的首個臨床病理診斷標準。據 Martini-Melamed 診斷標準，對于解剖上分隔開的多個腫瘤病灶，若符合下列標準之一，則可被診斷為 MPLC：（1）病理組織類型不同；（2）多個病灶病理組織類型相同，但符合下列條件：① 病灶起源于原位癌（carcinoma in situ，CIS）；② 病灶發生于不同肺段、不同肺葉或不同側肺；③ 無共同引流的淋巴系統或肺外轉移。如診斷為 MPLC 的病灶間的診斷間隔≤2 年，則劃分為 sMPLC。
1995 年及 2003 年，Antakli等[11]及 Colice等[12] 對 Martini-Melamed 診斷標準進行了修訂，符合下列標準之一的病灶可被診斷為 MPLC：（1）病理組織類型不同；（2）多個病灶病理組織類型相同，但下列條件符合至少兩個：① 解剖上獨立；② 屬癌前病變；③ 無全身轉移；④ 無縱隔受累；⑤ DNA 倍體分析結果不同。區分 sMPLC 與 mMPLC 的診斷間隔標準變更為 4 年，癌灶的分子遺傳學特征首次加入了診斷標準。
2007 年，美國胸科醫師學會（ACCP）提出了 sMPLC 的診斷標準[6]，并在 2013 年作出了修訂[7]，符合下列標準之一的病灶可被診斷為 MPLC：（1）病理組織類型不同；（2）多個病灶病理組織類型相同，但符合下列條件之一：① 分屬不同肺葉，且無 N2、N3 受累、無全身轉移；② 由解剖上分離的癌前病變發展而來；③ 有不同的分子遺傳學特征。至此，sMPLC 分子遺傳學特征的診斷價值得到了再一次提高，但 ACCP 的指南中仍未明確“分子遺傳學特征”的具體內容及標準（圖1）。
圖1
sMPLC 臨床診斷標準更新及理念進化
1995～2003 年，Antakli-Colice 首次將癌灶的分子遺傳學特征加入診斷標準；2007～2013 年，ACCP 不斷提高分子遺傳學特征的診斷價值，但具體內容及標準尚待明確；未來，對 sMPLC 分子遺傳學特征的探究將有更加廣闊的前景
2016 年，國際肺癌研究協會（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）提出現行 TNM 分期對于評價 sMPLC 有其局限性，建議在第 8 版 TNM 分期中對其進行特殊分期：T 分期為各單個病灶中最高的 T 分期，在其后標注病灶個數，N 分期和 M 分期則根據所有結節的總體淋巴結及全身轉移情況制定，如“T2（3）N0M0”[13]。此后，尚無被廣泛接受的 sMPLC 診斷標準在指南中被提出。
1.2 臨床病理診斷的局限性
經過長時間的臨床實踐檢驗，單獨的臨床病理診斷呈現出了其局限性。即便是根據最為廣泛應用的 Martini-Melamed 診斷標準，不同課題組據該標準區分出的 sMPLC 患者群體的生存率數據呈現出顯著偏倚[14]。2010 年 Girard等[15]報道，同一組患者分別通過 Martini-Melamed 及 ACCP 標準進行 sMPLC 與肺癌肺內轉移的鑒別診斷，結果也有較大偏差。ACCP 指南（2013 年版）中評論，臨床病理診斷中觀察到的這些偏倚，不僅由于部分診斷標準有賴于臨床醫生無法完全量化的主觀判斷，沒有將 sMPLC 具體的分子遺傳學特征納入診斷標準也是因素之一[7]。第 8 版 TNM 分期的補充意見中也同樣強調了分子遺傳學特征對于 sMPLC 的診斷價值[13]。sMPLC 分子遺傳學特征的診斷價值逐漸成為研究熱點。
2 sMPLC 分子遺傳學特征的診斷價值
2011 年 Hanahan等[16]報道了惡性腫瘤的十大特征，并認為其中最根本的特征是“基因組的不穩定性和突變”，此特征賦予了惡性腫瘤細胞克隆性增殖的能力。因而，克隆性分析是對 sMPLC 分子遺傳學特征分析的一個重要切入點。
經典的克隆性分析包括原癌基因或抑癌基因的體細胞突變（somatic mutations in oncogenes or tumor suppressor genes）分析、X-染色體的失活（X-chromosome inactivation）分析及雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）分析等分析手段[14, 17]。下文將從上述三方面對 sMPLC 的分子遺傳學特征及其診斷價值進行綜述。
2.1 原癌基因或抑癌基因的體細胞突變分析
“標記基因（genetic markers，或稱 clonal markers）”是在惡性腫瘤的癌變過程中，早期發生、高頻發生突變的基因，且該突變隨惡性腫瘤細胞的復制能夠穩定傳遞給子代細胞。位于 17 號染色體上的 p53 是一個抑癌基因，兼具作為標記基因的上述特征，且 p53 在小細胞肺癌及非小細胞肺癌中的突變發生率分別高達 70% 與 50%[18-19]。據報道，在 MPLC 中，p53 的突變可發生在該基因 DNA 結合區（5～8 外顯子）的多個位點，且均為點突變[20]。因此，在多種多樣的 p53 突變中，兩個獨立的癌灶有相同的 p53 突變的概率極低，這是通過原癌基因或抑癌基因的體細胞突變模式鑒別腫瘤來源的理論基礎。早在 1993 年，此理論就已在鑒別診斷多原發頭頸部腫瘤中得到了驗證[21]。在診斷 MPLC 的研究中，p53 體細胞突變的診斷可靠性大概為 35%～66%[22]。不只是 p53，EGFR 與 KRAS 突變在非典型性腺瘤樣增生（atypical adenomatous hyperplasia，AAH）的病例中多有報道，傾向于被認為是肺癌發生過程中的早期事件[23]。同樣，EGFR 及 KRAS 突變是隨機發生的，且有極高的突變不一致性：如將 EGFR 與 KRAS 的突變狀態組合分析，71%～83% 的 MPLC 患者表現出克隆性（clonality status）的不一致[23-24]，因此 EGFR/KRAS 也是被用于克隆性分析的標記基因[23-26]。有研究人員發現，27.9% 的多原發肺癌患者不同腫瘤灶中程序性死亡配體-1（PD-L1）表達水平存在差異，該比例遠高于肺內轉移患者（6.3%）[27]。
“分子標簽”也可以是一組肺癌的相關熱點突變。已有一項研究提出可通過結合病理診斷及 22 個肺癌熱點基因的突變形式對肺癌肺內轉移及 sMPLC 作出鑒別診斷。文中認為有不同驅動基因突變（包括 BRAF、EGFR、KRAS、NRAS、ERBB2、MET）的同期多灶肺癌可診斷為 sMPLC；在有相同突變的情況下，（1）如相同突變是肺癌的高頻突變（包括 EGFR del 19、EGFR L858R、KRAS G12X），則根據病理劃分肺內轉移或 sMPLC；（2）如相同突變是罕見突變（包括 p53），則認為是肺內轉移。本研究提出的診斷標準尚需大規模的前瞻性臨床試驗進行進一步驗證[28]。
在臨床應用中，對于根據病理組織類型證據就可診斷為 sMPLC 的病例，體細胞突變分析可驗證其病理組織診斷，一致性高達 78%[29-30]；當癌灶病理組織類型相同、臨床診斷存在難度時，分子遺傳學特征可作為獨立于臨床證據的補充證據[31]。
需要特別指出的是，對于影像學表現為純磨玻璃影的多個早期癌變，研究者常常排除淋巴或血性轉移的可能，診斷為 sMPLC[13]，但近期有研究通過體細胞突變分析的手段，從分子遺傳學特征的角度證明了氣腔播散轉移（spread through air spaces，STAS[32]）在此類多發磨玻璃影的“早期癌變”中存在的可能[33]。此發現也從另一角度提示，分子遺傳學特征可用于研究肺癌發生發展的規律。
2.2 X-染色體的失活分析
在女性胚胎發育過程中，每個體細胞的兩條 X 染色體中都有一條會隨機失活，正常的女性組織中父本 X 染色體失活的細胞與母本 X 染色體失活的細胞隨機分布，相互鑲嵌，呈“馬賽克”樣。而在細胞克隆性增殖過程中，失活的 X 染色體會穩定傳遞到子代細胞中，因此同樣可以作為一個克隆性標志。2009 年，Wang等[34]首次將 X-染色體失活分析法運用于一個 MPLC 臨床序列，臨床診斷為 sMPLC 或 mMPLC 的入組患者中，78% 的患者呈現出了一致的 X 染色體失活模式，因此該組患者中很大可能有誤診為 MPLC 的肺內轉移患者，X 染色體的失活分析揭示了臨床病理學診斷的局限性。
但 X-染色體失活分析的主要局限性在于：（1）僅可運用于女性患者中；（2）即便是克隆性不一致的兩個癌灶，也有 50% 的可能，因為 X 染色體失活的隨機性，呈現出同樣的 X 染色體失活模式[35]。
2.3 雜合性缺失分析
據二次打擊假說（Knudson's two hit hypothesis），細胞中攜帶一個等位基因上的生殖細胞系突變（germ-line heterozygosity）是發生癌變的基礎，若第二個等位基因上發生二次突變，細胞成為體細胞突變純合子（somatic homozygosity），導致抑癌基因徹底失活，細胞則發生癌變[36]，上述過程稱為雜合性缺失。LOH 分析中，正常組織因為父本與母本來源的基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）或微衛星（microsatellite）位點多態性的不一致呈現出雜合性，而同一克隆來源的癌灶則會表現出相同的 LOH 模式[37]。已有報道通過 LOH 分析可成功區別病理組織類型相同的 sMPLC 與肺內轉移灶[38-39]，通過與 p53 突變模式結合，此種分子遺傳學診斷方法的特異性及敏感性可得到進一步提高[17]。
3 分子遺傳性特征分析的潛在問題
無論是通過何種分子生物學技術對癌灶進行分子遺傳學特征的探究，一個始終需要回答的問題是腫瘤的異質性（intratumoral heterogeneity）。2012 年，《新英格蘭醫學雜志》刊發了腎癌相關研究中腫瘤內部的異質性，及隨腫瘤發展進化出現的異質性[40]。通過 DNA 測序分析，多個肺癌相關基因，包括 EGFR、KRAS、ERBB2，均呈現出了腫瘤異質性，并主要見于肺腺癌標本[41-43]。這種異質性或許能夠部分解釋部分肺癌患者對于治療反應的差異，但同時也提示，sMPLC 分子遺傳學特征的臨床應用仍需要更多深入的研究[44-45]。
4 小結與展望
經過 30 余年的探索，sMPLC 的診斷標準多次更新，僅依照腫瘤的組織病理學特征無法明確區分 sMPLC 與肺內轉移瘤，分子遺傳學特征的診斷價值逐漸得到重視和強調。以克隆性分析領域取得的進展為例，對 sMPLC 的分子遺傳學特征進行描述和機制探索，不僅可以補充完善臨床病理診斷標準，在揭示 sMPLC 的發生發展規律方面也有廣闊的前景，有望輔助定義 sMPLC 的疾病性質。
利益沖突：無。
作者貢獻：宋洋設計論文、檢索文獻、撰寫初稿；梁乃新、李單青設計論文、修改論文終稿；楊笑盈、賈梓淇檢索及分析文獻； 邴鐘興、曹磊、曹智理和郭超對論文進行了審閱與修改。
