引用本文： 陳鈾, 羅豫川, 王開杰, 曹輝, 呂建宏, 鄭劍, 徐亞青. 新型冠狀病毒肺炎重癥患者的細胞免疫功能特征及其預后評估價值的隊列研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2020, 27(6): 603-608. doi: 10.7507/1007-4848.202003133 復制
2019 新型冠狀病毒疫情蔓延，現已成為全球大流行。2020 年 1 月，新疆首批重癥醫療隊作為首支援助醫療隊參與 2019 新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）定點醫院武漢大學人民醫院東院區救治工作，疆鄂聯隊一起對疾病診療，積累經驗，不斷加深對 COVID-19 的認識。既往研究[1-3]顯示，細胞免疫功能在各種類型、各年齡段肺炎中均發揮重要作用，針對重癥急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）研究[4]中，同樣發現患者免疫力低下和系統性炎癥的表現。本研究收集確診患者的臨床資料，結合細胞免疫進行匯總分析，對 COVID-19 的臨床及預后價值進行評估。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選擇 2020 年 1 月 30 日至 2 月 18 日在武漢大學人民醫院東院區確診為 COVID-19 重癥患者 119 例，隨訪 30 d，即研究時間段為 2020 年 1 月 30 日至 3 月 19 日。收集患者臨床資料，包括年齡、性別、生命體征、體重指數（BMI）、臨床癥狀、吸煙史；記錄患者臨床指標，定義為入院后首次實驗室相關檢查，包括血常規、血生化、炎癥因子、纖溶指標、細胞免疫功能等檢查。
納入標準：符合《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》確診標準的重癥患者。排除標準：（1）既往接受免疫支持或抑制治療；（2）妊娠期婦女；（3）<18 歲青少年；（4）近 3 個月內接受過手術；（5）合并其它感染性疾病或血液病；（6）未在入院后當日或次日及時完善細胞免疫功能檢測。
1.2 檢測方法
采用 CytoFLEX 流式細胞儀（Beckman Coulter，美國）檢測細胞免疫功能。具體包括 CD3+百分比、CD3+計數、CD4+百分比、CD4+計數、CD8+百分比、CD8+計數、CD4+/CD8+、CD19+百分比、CD19+計數、CD16++CD56+百分比、CD16++CD56+計數。
1.3 隨訪
本研究主要通過住院期間對患者進行隨訪，以入院日期為隨訪起點，以出院前患者發生院內死亡為主要終點，以入院期間 30 d 內疾病轉歸評估分型（普通型、重型/危重型）為隨訪的次要終點。
1.4 統計學分析
使用 SPSS 22.0 軟件建立數據庫并進行統計分析。符合正態分布的連續性變量資料采用均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。不符合正態分布的連續性變量資料采用中位數（四分位數間距）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料采用頻數和百分比表示，組間比較采用卡方檢驗。通過受試者工作特征（ROC）曲線評估 CD 值對 COVID-19 臨床及預后評估價值。P<0.05 為差異有統計學意義。
1.5 倫理審查與臨床試驗注冊
此研究嚴格遵守武漢大學人民醫院倫理委員會批準的方案執行（批準號 WDRY2020-K131），并在中國臨床試驗注冊中心注冊，注冊號為 CHiCTR2000030494。研究內容通過武漢大學人民醫院科教處審核。
2 結果
2.1 一般基線資料
本研究共納入 119 例 COVID-19 重癥患者，其中男 60 例（50.4%）、女 59 例（49.6%），平均年齡（60.9±14.2）歲。其中首發癥狀表現為發熱 71 例（59.7%），咳嗽 23 例（19.3%），乏力 13 例（10.9%），其它癥狀如納差、腹瀉、肌肉酸痛等 12 例（10.1%）。
2.2 臨床及預后隨訪結果
在隨訪期間內，生存組與死亡組主要終點事件臨床指標包括中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、C 反應蛋白、超敏 C 反應蛋白、天冬氨酸轉氨酶（AST）、尿素、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、D-二聚體的差異有統計學意義（均P<0.05）。普通組與重/危重組次要終點事件臨床指標（白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、C 反應蛋白、超敏 C 反應蛋白、AST、白蛋白、總膽紅素、直接膽紅素、尿素、HDL-C、D-二聚體）差異有統計學意義（均P<0.05）；見表 1。
表1
臨床及預后基線資料比較［
/例（%）］
2.3 細胞免疫功能差異分析
根據流式細胞儀檢測結果分析，將所有患者細胞免疫功能淋巴細胞亞組百分比和計數，即 CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++CD56+進行分析，主要終點事件中 CD3+計數、CD4+計數、CD8+計數、CD19+計數生存組與死亡組的差異有統計學意義（均P<0.05）。次要終點事件中 CD3+計數、CD4+計數、CD8+計數、CD19+計數普通組和重/危重癥組的差異有統計學意義（均P<0.05）；見表 2。
表2
119 例患者的細胞免疫功能差異分析（
）
2.4 ROC 曲線分析
對死亡患者 CD 計數值進行 ROC 曲線分析，CD3+、CD4+、CD8+、CD19+的曲線下面積（AUC）依次為 0.199、0.200、0.196、0.313（均P<0.05）。其值越低發生死亡的風險越高，對生存患者的預測價值可達 0.801、0.800、0.804、0.687；對重癥患者 CD 計數值進行 ROC 曲線分析，CD3+、CD4+、CD8+、CD19+的AUC 依次為 0.096、0.100、0.124、0.310（均P<0.05）。其值越低發生重/危重型的風險越高，對普通型患者的預測價值可達 0.904、0.900、0.876、0.690。由此可見入院后首次細胞免疫分析對 COVID-19 重癥患者院內死亡和重/危重癥轉歸評估具有預測價值；見表 3、表 4。
表3
死亡患者細胞免疫功能 ROC 曲線分析
表4
重/危重癥患者細胞免疫功能 ROC 曲線分析
3 討論
病毒是一種個體微小、結構簡單、依賴宿主活細胞寄生并增殖的非細胞生命形態，人體免疫系統的特異性免疫和非特異性免疫在清除病毒過程中發揮至關重要的作用[5]。免疫系統作為人體抵抗病原微生物的重要防線，其強弱在一定程度上決定了人體的患病狀況和預后情況[6]。抗病毒免疫包括細胞免疫、體液免疫等機體免疫模式，其中細胞免疫是清除細胞內寄生微生物最為有效的防御反應。廣義的細胞免疫包括 T 細胞、B 細胞和 NK 細胞介導的免疫應答。
《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[7]、《新型冠狀病毒肺炎重型、危重型病例診療方案（試行第三版）》[8]對于重型、危重型臨床預警指標均涉及外周血淋巴細胞進行性下降。淋巴細胞可分為 T 細胞、B 細胞和 NK 細胞，淋巴細胞亞群失衡是反映機體免疫應答的重要指標[9]。呼吸道傳播病毒入侵氣道上皮細胞，經抗原識別呈遞加工激活 T 細胞，產生抗病毒因子，如白細胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、趨化因子（包括體內平衡趨化因子和促炎趨化因子）和細胞毒性分子（穿孔素和顆粒酶 B）廣泛參與機體免疫反應。B 細胞作為專職抗原呈遞細胞，分布在淋巴結和脾臟，調節 T 細胞亞群及樹突狀細胞功能，在抗原刺激下可分化為漿細胞，執行機體體液免疫。NK 細胞不同于前兩者，無需預先致敏，非特異性殺傷病毒感染細胞。武漢大學人民醫院東院已將流式細胞儀淋巴細胞亞型分析作為常規檢查項目。除 CD3+、CD4+、CD8+ T 細胞外，還包括參與 B 細胞活化增殖的 CD19+細胞和反映 NK 細胞功能的 CD16+、CD56+細胞，這些細胞免疫指標是本研究的循證基礎。
HIV 感染患者常出現 CD4+ T 細胞和 CD4+/CD8+比值下降[10]。SARS 患者急性期外周血 CD3+、CD4+和 CD8+ T 細胞絕對數顯著下降[11]。有學者推測 COVID-19 導致患者外周血 CD4+ T 細胞下降的具體機制可能有：（1）病毒直接損傷，但不侵入細胞；（2）病毒直接侵入細胞，并將其當作宿主細胞；（3）啟動炎性反應，分泌大量細胞因子，導致細胞消耗過多或抑制細胞分化和生成[12]。住院患者潛伏期過后出現首發癥狀持續時間多在 1～2 周，此時顯示病毒已經導致患者外周血細胞免疫檢測出現異常。
通過對 119 例重癥患者的分析，結果顯示死亡患者和重/危重患者的細胞免疫指標顯著低于生存患者和普通型患者。這與近期其他團隊外周血淋巴細胞亞型分析相關研究結果一致[13-15]。通過單細胞 RNA 序列結合 TCR 測序對 COVID-19 患者支氣管肺泡灌洗液免疫微環境分析，重癥患者 CD8+細胞克隆數目顯著下降，輕癥患者 CD8+細胞高度擴增[16]。在對 1 例 COVID-19 進行病理解剖中發現[17]，外周血 CD4+及 CD8+ T 細胞數量雖然大幅降低，但狀態卻被顯著激活。CD4+ T 細胞中具有高促炎效應的 Th17 細胞數量增加，CD8+ T 細胞則呈現高顆粒酶細胞毒性。如何通過淋巴細胞亞型分析進行風險預測，阻止細胞因子風暴發生，改善患者預后至關重要。本研究 ROC 曲線顯示入院后首次細胞免疫分析即 CD+細胞計數（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+）對 COVID-19 患者院內死亡和重/危重癥評估具有顯著預測價值。
當前，重癥患者權威診療方案[7-8]推薦中藥、胸腺肽 α1、人免疫球蛋白、康復血漿等免疫支持治療。對于已發生細胞因子風暴危重癥患者采用托珠單抗和血液凈化治療。臨床顯示治療過程可以提升細胞免疫指標，故本研究入選人群為入院當日或次日行此項檢測患者。COVID-19 危重型病死率接近 50%[18]。此時患者免疫系統已經完全紊亂，體內會因 IL-6、IL-10、巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等為主的炎性因子大量產生而出現細胞因子風暴，從而導致全身性炎癥反應，致多器官衰竭甚至死亡[19]。細胞因子風暴發生迅速，這也是重型患者極易在極短時間內發展成為危重型患者的原因。在 COVID-19 重型患者的治療中，增加細胞因子這一免疫學特征的檢測，根據檢測結果使用相應的免疫治療策略來阻止細胞因子風暴的發生，很可能會有效改善患者的疾病狀況。此外，疫苗研制的原理也正是保留病原微生物的特性，在不引起人體患病的情況下激活機體的免疫系統，產生特異性抗體和效應 T 細胞，并產生記憶 B 細胞和記憶 T 細胞來建立免疫保護[20]。
本研究是一個單中心研究，納入患者數量相對較少，混雜因素控制相對困難，結果需要多中心大樣本研究進一步驗證。其次，本研究隨訪時間相對較短，無法評估患者遠期預后。
綜上所述，本研究通過對 119 例 COVID-19 重癥患者的隨訪，以在院死亡為隨訪的主要終點，入院后 30 d 內疾病轉歸評估分型為隨訪的次要終點，發現細胞免疫功能對 COVID-19 具有良好的臨床及預后評估價值，在疫情全球化蔓延的當今值得在臨床上引起重視。
利益沖突：無。
作者貢獻：陳鈾負責論文設計；陳鈾、羅豫川、王開杰、曹輝、呂建宏、鄭劍負責實施研究；陳鈾、王開杰、鄭劍負責數據整理與分析；陳鈾負責論文初稿撰寫；鄭劍、徐亞青負責論文審閱與修改。
2019 新型冠狀病毒疫情蔓延，現已成為全球大流行。2020 年 1 月，新疆首批重癥醫療隊作為首支援助醫療隊參與 2019 新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）定點醫院武漢大學人民醫院東院區救治工作，疆鄂聯隊一起對疾病診療，積累經驗，不斷加深對 COVID-19 的認識。既往研究[1-3]顯示，細胞免疫功能在各種類型、各年齡段肺炎中均發揮重要作用，針對重癥急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）研究[4]中，同樣發現患者免疫力低下和系統性炎癥的表現。本研究收集確診患者的臨床資料，結合細胞免疫進行匯總分析，對 COVID-19 的臨床及預后價值進行評估。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選擇 2020 年 1 月 30 日至 2 月 18 日在武漢大學人民醫院東院區確診為 COVID-19 重癥患者 119 例，隨訪 30 d，即研究時間段為 2020 年 1 月 30 日至 3 月 19 日。收集患者臨床資料，包括年齡、性別、生命體征、體重指數（BMI）、臨床癥狀、吸煙史；記錄患者臨床指標，定義為入院后首次實驗室相關檢查，包括血常規、血生化、炎癥因子、纖溶指標、細胞免疫功能等檢查。
納入標準：符合《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》確診標準的重癥患者。排除標準：（1）既往接受免疫支持或抑制治療；（2）妊娠期婦女；（3）<18 歲青少年；（4）近 3 個月內接受過手術；（5）合并其它感染性疾病或血液病；（6）未在入院后當日或次日及時完善細胞免疫功能檢測。
1.2 檢測方法
采用 CytoFLEX 流式細胞儀（Beckman Coulter，美國）檢測細胞免疫功能。具體包括 CD3+百分比、CD3+計數、CD4+百分比、CD4+計數、CD8+百分比、CD8+計數、CD4+/CD8+、CD19+百分比、CD19+計數、CD16++CD56+百分比、CD16++CD56+計數。
1.3 隨訪
本研究主要通過住院期間對患者進行隨訪，以入院日期為隨訪起點，以出院前患者發生院內死亡為主要終點，以入院期間 30 d 內疾病轉歸評估分型（普通型、重型/危重型）為隨訪的次要終點。
1.4 統計學分析
使用 SPSS 22.0 軟件建立數據庫并進行統計分析。符合正態分布的連續性變量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。不符合正態分布的連續性變量資料采用中位數（四分位數間距）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料采用頻數和百分比表示，組間比較采用卡方檢驗。通過受試者工作特征（ROC）曲線評估 CD 值對 COVID-19 臨床及預后評估價值。P<0.05 為差異有統計學意義。
1.5 倫理審查與臨床試驗注冊
此研究嚴格遵守武漢大學人民醫院倫理委員會批準的方案執行（批準號 WDRY2020-K131），并在中國臨床試驗注冊中心注冊，注冊號為 CHiCTR2000030494。研究內容通過武漢大學人民醫院科教處審核。
2 結果
2.1 一般基線資料
本研究共納入 119 例 COVID-19 重癥患者，其中男 60 例（50.4%）、女 59 例（49.6%），平均年齡（60.9±14.2）歲。其中首發癥狀表現為發熱 71 例（59.7%），咳嗽 23 例（19.3%），乏力 13 例（10.9%），其它癥狀如納差、腹瀉、肌肉酸痛等 12 例（10.1%）。
2.2 臨床及預后隨訪結果
在隨訪期間內，生存組與死亡組主要終點事件臨床指標包括中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、C 反應蛋白、超敏 C 反應蛋白、天冬氨酸轉氨酶（AST）、尿素、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、D-二聚體的差異有統計學意義（均P<0.05）。普通組與重/危重組次要終點事件臨床指標（白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、C 反應蛋白、超敏 C 反應蛋白、AST、白蛋白、總膽紅素、直接膽紅素、尿素、HDL-C、D-二聚體）差異有統計學意義（均P<0.05）；見表 1。
表1
臨床及預后基線資料比較［/例（%）］
2.3 細胞免疫功能差異分析
根據流式細胞儀檢測結果分析，將所有患者細胞免疫功能淋巴細胞亞組百分比和計數，即 CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++CD56+進行分析，主要終點事件中 CD3+計數、CD4+計數、CD8+計數、CD19+計數生存組與死亡組的差異有統計學意義（均P<0.05）。次要終點事件中 CD3+計數、CD4+計數、CD8+計數、CD19+計數普通組和重/危重癥組的差異有統計學意義（均P<0.05）；見表 2。
表2
119 例患者的細胞免疫功能差異分析（）
2.4 ROC 曲線分析
對死亡患者 CD 計數值進行 ROC 曲線分析，CD3+、CD4+、CD8+、CD19+的曲線下面積（AUC）依次為 0.199、0.200、0.196、0.313（均P<0.05）。其值越低發生死亡的風險越高，對生存患者的預測價值可達 0.801、0.800、0.804、0.687；對重癥患者 CD 計數值進行 ROC 曲線分析，CD3+、CD4+、CD8+、CD19+的AUC 依次為 0.096、0.100、0.124、0.310（均P<0.05）。其值越低發生重/危重型的風險越高，對普通型患者的預測價值可達 0.904、0.900、0.876、0.690。由此可見入院后首次細胞免疫分析對 COVID-19 重癥患者院內死亡和重/危重癥轉歸評估具有預測價值；見表 3、表 4。
表3
死亡患者細胞免疫功能 ROC 曲線分析
表4
重/危重癥患者細胞免疫功能 ROC 曲線分析
3 討論
病毒是一種個體微小、結構簡單、依賴宿主活細胞寄生并增殖的非細胞生命形態，人體免疫系統的特異性免疫和非特異性免疫在清除病毒過程中發揮至關重要的作用[5]。免疫系統作為人體抵抗病原微生物的重要防線，其強弱在一定程度上決定了人體的患病狀況和預后情況[6]。抗病毒免疫包括細胞免疫、體液免疫等機體免疫模式，其中細胞免疫是清除細胞內寄生微生物最為有效的防御反應。廣義的細胞免疫包括 T 細胞、B 細胞和 NK 細胞介導的免疫應答。
《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[7]、《新型冠狀病毒肺炎重型、危重型病例診療方案（試行第三版）》[8]對于重型、危重型臨床預警指標均涉及外周血淋巴細胞進行性下降。淋巴細胞可分為 T 細胞、B 細胞和 NK 細胞，淋巴細胞亞群失衡是反映機體免疫應答的重要指標[9]。呼吸道傳播病毒入侵氣道上皮細胞，經抗原識別呈遞加工激活 T 細胞，產生抗病毒因子，如白細胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、趨化因子（包括體內平衡趨化因子和促炎趨化因子）和細胞毒性分子（穿孔素和顆粒酶 B）廣泛參與機體免疫反應。B 細胞作為專職抗原呈遞細胞，分布在淋巴結和脾臟，調節 T 細胞亞群及樹突狀細胞功能，在抗原刺激下可分化為漿細胞，執行機體體液免疫。NK 細胞不同于前兩者，無需預先致敏，非特異性殺傷病毒感染細胞。武漢大學人民醫院東院已將流式細胞儀淋巴細胞亞型分析作為常規檢查項目。除 CD3+、CD4+、CD8+ T 細胞外，還包括參與 B 細胞活化增殖的 CD19+細胞和反映 NK 細胞功能的 CD16+、CD56+細胞，這些細胞免疫指標是本研究的循證基礎。
HIV 感染患者常出現 CD4+ T 細胞和 CD4+/CD8+比值下降[10]。SARS 患者急性期外周血 CD3+、CD4+和 CD8+ T 細胞絕對數顯著下降[11]。有學者推測 COVID-19 導致患者外周血 CD4+ T 細胞下降的具體機制可能有：（1）病毒直接損傷，但不侵入細胞；（2）病毒直接侵入細胞，并將其當作宿主細胞；（3）啟動炎性反應，分泌大量細胞因子，導致細胞消耗過多或抑制細胞分化和生成[12]。住院患者潛伏期過后出現首發癥狀持續時間多在 1～2 周，此時顯示病毒已經導致患者外周血細胞免疫檢測出現異常。
通過對 119 例重癥患者的分析，結果顯示死亡患者和重/危重患者的細胞免疫指標顯著低于生存患者和普通型患者。這與近期其他團隊外周血淋巴細胞亞型分析相關研究結果一致[13-15]。通過單細胞 RNA 序列結合 TCR 測序對 COVID-19 患者支氣管肺泡灌洗液免疫微環境分析，重癥患者 CD8+細胞克隆數目顯著下降，輕癥患者 CD8+細胞高度擴增[16]。在對 1 例 COVID-19 進行病理解剖中發現[17]，外周血 CD4+及 CD8+ T 細胞數量雖然大幅降低，但狀態卻被顯著激活。CD4+ T 細胞中具有高促炎效應的 Th17 細胞數量增加，CD8+ T 細胞則呈現高顆粒酶細胞毒性。如何通過淋巴細胞亞型分析進行風險預測，阻止細胞因子風暴發生，改善患者預后至關重要。本研究 ROC 曲線顯示入院后首次細胞免疫分析即 CD+細胞計數（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+）對 COVID-19 患者院內死亡和重/危重癥評估具有顯著預測價值。
當前，重癥患者權威診療方案[7-8]推薦中藥、胸腺肽 α1、人免疫球蛋白、康復血漿等免疫支持治療。對于已發生細胞因子風暴危重癥患者采用托珠單抗和血液凈化治療。臨床顯示治療過程可以提升細胞免疫指標，故本研究入選人群為入院當日或次日行此項檢測患者。COVID-19 危重型病死率接近 50%[18]。此時患者免疫系統已經完全紊亂，體內會因 IL-6、IL-10、巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等為主的炎性因子大量產生而出現細胞因子風暴，從而導致全身性炎癥反應，致多器官衰竭甚至死亡[19]。細胞因子風暴發生迅速，這也是重型患者極易在極短時間內發展成為危重型患者的原因。在 COVID-19 重型患者的治療中，增加細胞因子這一免疫學特征的檢測，根據檢測結果使用相應的免疫治療策略來阻止細胞因子風暴的發生，很可能會有效改善患者的疾病狀況。此外，疫苗研制的原理也正是保留病原微生物的特性，在不引起人體患病的情況下激活機體的免疫系統，產生特異性抗體和效應 T 細胞，并產生記憶 B 細胞和記憶 T 細胞來建立免疫保護[20]。
本研究是一個單中心研究，納入患者數量相對較少，混雜因素控制相對困難，結果需要多中心大樣本研究進一步驗證。其次，本研究隨訪時間相對較短，無法評估患者遠期預后。
綜上所述，本研究通過對 119 例 COVID-19 重癥患者的隨訪，以在院死亡為隨訪的主要終點，入院后 30 d 內疾病轉歸評估分型為隨訪的次要終點，發現細胞免疫功能對 COVID-19 具有良好的臨床及預后評估價值，在疫情全球化蔓延的當今值得在臨床上引起重視。
利益沖突：無。
作者貢獻：陳鈾負責論文設計；陳鈾、羅豫川、王開杰、曹輝、呂建宏、鄭劍負責實施研究；陳鈾、王開杰、鄭劍負責數據整理與分析；陳鈾負責論文初稿撰寫；鄭劍、徐亞青負責論文審閱與修改。
