引用本文： 陳宏, 陳蘇偉, 王盛宇, 李巖, 孟旭. N-甲基-D-天冬氨酸受體介導的脊髓缺血-再灌注保護作用的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2020, 27(12): 1460-1465. doi: 10.7507/1007-4848.202002084 復制
脊髓缺血導致的不同程度的癱瘓是胸主動脈瘤手術的嚴重并發癥[1]。雖然截癱的發生率為 2.5%～8%，但脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）仍然是主動脈瘤術后的嚴重并發癥[2]。最近研究[3-6]表明，興奮性氨基酸（excitatory amino acid，EAA）的離子型受體在 EAA 所致的神經毒性作用中有極其重要的意義，尤其是 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體與脊髓缺血-再灌注損傷關系密切。谷氨酸在脊髓中被認為是興奮性神經遞質，它通過過度激活 NMDA 受體，誘導大量 Ca2+內流損傷神經細胞，導致神經細胞死亡[7]。
動物實驗不斷發現一些藥物可以阻斷腦脊髓缺血缺氧后的損傷級聯反應，減輕腦損傷。然而目前尚未找到一種經臨床證明安全、有效的神經保護劑。K-1024 作為 EAA-NMDA 受體拮抗劑，是目前醫學研究的熱點，但其用于缺血-再灌注脊髓保護治療的報道較少。本實驗擬通過構建大鼠脊髓缺血-再灌注模型，探討 K-1024 對缺血-再灌注大鼠行為學、組織病理學的保護作用，及對谷氨酸、一氧化氮合酶（NOS）表達的影響，評價其對缺血-再灌注脊髓的保護作用并探討其機制。
1 材料與方法
1.1 動物分組與脊髓缺血-再灌注模型的建立
實驗分組：健康成年 SD 大鼠 42 只，由北京安貞醫院實驗動物中心提供，體重 350～375 g，雌雄不拘，隨機分為 4 組。非阻斷組（n=6）：球囊導管置入胸主動脈，但不充填球囊；生理鹽水組（n=12）：生理鹽水 2 mL 在降主動脈阻斷前 30 min 腹腔注射；K-1024 保護組（n=12）：K-1024（25 mg/kg，上海第一制藥廠）在降主動脈阻斷前 30 min 腹腔注射；尼莫地平組（n=12）：尼莫地平（0.5 mg/kg，德國 Bayer 公司）在降主動脈阻斷前 30 min 腹腔注射。
誘導脊髓缺血：10% 水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，聚乙烯導管（PE-50）插入尾動脈監測動脈血壓，注射肝素。分離左股動脈，2-F# Fogarty（Terumo 2.5/3.0）導管放入胸降主動脈，導管頂端到左鎖骨下動脈水平（距導管插入點 10.5～11 cm）。聚乙烯導管（PE-50）插入左頸動脈 1 cm，外接儲血袋（37.5℃），用 4 U/mL 的肝素生理鹽水充填。調整環路儲血器高度以控制近端主動脈壓力（proximal artery blood pressure，PAP），主動脈阻斷期間，阻斷點近端的血壓控制在 40 mm Hg。插管放置完成，尾動脈注射肝素 200 U。球囊導管用 0.05 mL 生理鹽水充入，血液引流入外接儲血袋。被阻斷的主動脈下方搏動消失、壓力降低證明阻斷完全。缺血后，球囊導管排氣并拔除，血液 60 s 回灌，硫酸魚精蛋白（4 mg）皮下注射。灌流完成后，拔除所有插管，縫合切口，復蘇動物。
1.2 行為學評價
在 PAP 40 mm Hg 條件下，將實驗動物分為 4 組，每組 6 只。先阻斷 10 min，再恢復灌注。分別于再灌注 1、2、4、8 h，通過評價下肢行走及步態來量化運動功能的恢復程度。具體的評價方法如下：下肢行走按下列分級：0=正常；1=扁平足，共濟失調；2=使用關節行走；3=下肢有活動，但不能通過關節行走；4=無運動，拖動下肢。抬放反射評價通過外展后爪背側誘發相應的上舉和回放反應，分級為 0=正常，1=弱，2=無。記錄每一組的運動缺失，最后記錄下肢行走+抬放反射的總分，最高得分為 6 分。
1.3 組織病理學評價
大鼠背部正中切口，快速打開椎管，剖取 L3～L5 段脊髓，迅速放入 250 mL 4% 多聚甲醛（含 0.1% DEPC）固定液中，固定 6 h，入 25% 庶糖（含 0.1% DEPC）使組織塊下沉，然后包埋于石蠟中。每只動物 L3、L4、L5 節段取得 5 張典型性切片，切片厚度 3 μm，行蘇木精-伊紅（HE）染色。灰質損害程度（壞死或暗神經元）分別從三個區判斷：一區，損害涉及Ⅰ～Ⅵ層面；二區，損害涉及Ⅶ和Ⅹ層面；三區，損害涉及Ⅷ和Ⅸ層面。
1.4 脊髓組織中谷氨酸含量測定
高效液相色譜法：用 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.8）在冰上制備脊髓組織勻漿，取上清液 20 μL 加 0.4 mol/L 過氯酸（PCA）180 μL，混勻，37℃，12 000 r/min 離心 45 min。取上清液 10 μL 加內標物（30 pmol/L 高絲氨酸）10 μL，再加鄰苯二甲醛（OPA）100 μL，2 min 后即進樣 10 μL 按色譜條件進行梯度洗脫。
1.5 神經元型 NOS（nNOS）檢測
免疫組織化學染色（ABC 法）：1∶50 正常羊血清在室溫下孵育 30 min，滴加兔抗 nNOS 抗體（工作濃度為 1∶80，Sigma 公司），4℃，孵育 72 h；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分沖洗（3 min×3）后，加羊抗兔抗體（工作濃度為 1∶100，博士德公司），在 37℃ 下溫育 30 min；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分沖洗（3 min×3）后，滴加 ABC 復合物（工作濃度為 1∶100，博士德公司），37℃ 溫育 30 min；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分沖洗（3 min×3）后，DAB-H2O2 呈色，室溫，5～10 min，常規脫水，透明，中性樹膠封片。以 PBS 代替一抗作為空白對照。結果以普通光學顯微鏡檢查。
1.6 圖像分析
用顯微圖像分析儀（TJTY-400 真彩色細胞圖像分析儀）對切片進行圖像分析，所有切片均在同一放大倍數（×10）及同一光強度下分析，每例動物測 3 張切片，取平均值。采集陽性反應細胞數，視場范圍 261 632.00 μm2。
1.7 統計學分析
所有實驗數據用 SPSS 25.0 軟件進行分析處理，結果以均數±標準差（
±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統計學意義。
1.8 倫理審查
本研究已通過北京安貞醫院醫學倫理委員會審批，批準號：2016044X。
2 結果
2.1 行為學評價
非阻斷組：再灌注 8 h 后，所有大鼠未發現神經功能不全表現。
生理鹽水組：5 只大鼠出現急性硬癱，再灌注 8 h 后無任何改變。1 只大鼠再灌注 2 h 后運動功能有一個級別的恢復，但是再灌注 8 h 行為學評分又增加到 6 分。
K-1024 組：4 只大鼠再灌注 1 h 評分為 4 分。另外 2 只大鼠再灌注 1 h 評分為 2 分，再灌注 2 h 后仍為 2 分。但所有 6 只大鼠再灌注 8 h 后輕微肌無力，運動損傷評分保持在 2 分。且均能行走和抬步，行為學評分與對照組最接近。
尼莫地平組：所有 6 只大鼠在再灌注 2 h 后顯示重度的運動損害硬癱，其中 2 只大鼠再灌注 4 h 后行為學評分恢復到 5 分（不能使用關節行走）。再灌注 8 h 后，6 只大鼠中，2 只大鼠無任何變化，2 只大鼠行為學評分恢復到 5 分，2 只大鼠恢復到中等程度的運動損害（共濟失調但使用關節行走）；見圖 1。
圖1
不同藥物對缺血-再灌注大鼠脊髓行為學的影響
2.2 組織病理學改變
非阻斷組：運動和感覺功能完全恢復，L2～L5 脊髓節段切片無組織病理學改變。小的和中等大小的聯絡神經元、大的 α 運動神經元均無壞死表現，神經纖維也無病理改變。
生理鹽水組：全部動物硬癱，組織病理學改變在脊髓 L2～L5 節段Ⅲ～Ⅶ層面灰質出現特征性的廣泛壞死和不規則空洞。但是，位于灰質周邊部位的層面，如Ⅰ～Ⅱ層、Ⅹ層、Ⅷ～Ⅸ層顯示接近正常結構。與硬癱的出現相符合，α 運動神經元及核結構正常。
尼莫地平組：與生理鹽水組基本相似。
K-1024 組：在神經功能恢復的動物中，偶然發現神經元“變暗”或“皺縮”的降解表現，這些神經元典型地分部在中內區（第Ⅶ層）的中部和后角的中后部。但是，大多數聯絡神經元和 α 運動神經元未發現改變；見圖 2。
圖2
不同組別大鼠脊髓 HE 染色（×10）
a：非阻斷組，完整脊髓結構；b：生理鹽水組，常溫缺血 10 min，黑色箭頭顯示脊髓灰質Ⅲ～Ⅶ層壞死，紅色箭頭顯示 α 運動神經元正常；c：尼莫地平組，黑色箭頭顯示神經元“皺縮”，紅色箭頭顯示灰質空泡形成；d：K-1024 組，脊髓結構基本完整
2.3 脊髓組織中谷氨酸含量
缺血 10 min，生理鹽水組、尼莫地平組和 K-1024 組之間谷氨酸含量差異無統計學意義（F=0.324，P=0.731），且生理鹽水組的神經遞質谷氨酸水平較非阻斷組高出 3 倍。進一步多重比較發現，K-1024 組谷氨酸含量與生理鹽水組比較差異無統計學意義（P=0.801）；尼莫地平組谷氨酸含量略低于生理鹽水組，但差異無統計學意義（P=0.450）；K-1024 組與尼莫地平組差異也無統計學意義（P=0.609）。
再灌注 8 h 后，三組之間差異無統計學意義（F=1.095，P=0.375）。進一步多重比較發現，各組谷氨酸含量與非阻斷組處于相似的水平。K-1024 組谷氨酸含量雖略低于與生理鹽水組，但差異無統計學意義（P=0.789）；尼莫地平組與生理鹽水組的谷氨酸水平差異無統計學意義（P=0.196）；K-1024 組與尼莫地平組差異也無統計學意義（P=0.291）；見表 1。
表1
藥物對缺血-再灌注大鼠脊髓谷氨酸含量的影響（μmol/L，
）
2.4 脊髓組織內 nNOS 表達
缺血 10 min，三組 nNOS 表達差異有統計學意義（F=40.597，P<0.01）。進一步多重比較發現，K-1024 組和尼莫地平組 nNOS 陽性反應細胞數與生理鹽水組比較均明顯下調（P<0.01）；K-1024 組與尼莫地平組差異無統計學意義（P=0.283）。
再灌注 8 h，三組 nNOS 表達差異有統計學意義（F=3.409，P=0.046）。進一步多重比較發現，K-1024 組 nNOS 陽性反應細胞數與生理鹽水組比較明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05），尼莫地平組與生理鹽水組差異無統計學意義（P=0.096），K-1024 組與尼莫地平組之間差異也無統計學意義（P=0.441）；見表 2、圖 3。
表2
藥物對缺血-再灌注大鼠脊髓 nNOS 陽性反應細胞數的影響（個/261 632.00 μm2，
）
圖3
不同組別大鼠 nNOS 免疫組織化學染色（×10）
a：非阻斷組；b：生理鹽水組缺血 10 min；c：生理鹽水組缺血-再灌注 8 h；d：K-1024 組缺血 10 min；e：K-1024 組缺血-再灌注 8 h；f：尼莫地平組缺血 10 min；g：尼莫地平組缺血-再灌注 8 h
3 討論
隨著 NMDA 受體介導的興奮性毒性在神經元損傷中的作用逐漸被認識，NMDA 受體拮抗劑為缺血性腦、脊髓損傷的預防和治療帶來新的希望[8-9]。在動物實驗中不斷發現 NMDA 受體拮抗劑可以阻斷腦、脊髓缺血缺氧后的損傷級聯反應，減輕腦、脊髓損傷。Li 等[10]發現 NMDA 受體拮抗劑人參皂甙具有抗神經元損傷的作用；de Miranda 等[11]證實全身予以 NMDA 受體拮抗劑 MK-801 能縮小脊髓梗塞區，減少神經元損傷，有明顯的保護作用。目前，K-1024 是非競爭性 NMDA 受體拮抗劑，已用于臨床靜脈麻醉，并在腦缺血保護中已有報道，但在主動脈手術圍術期脊髓缺血中的保護作用報道較少[12-14]。
本研究應用球囊導管阻斷的方式構建大鼠脊髓缺血模型，模擬胸腹主動脈瘤切除的圍術期條件，以 K-1024 作為實驗組，同時與尼莫地平相比較，探討脊髓缺血和再灌注損傷的機制，并論證 K-1024 作為非競爭性 NMDA 受體拮抗劑在主動脈手術圍術期脊髓保護中的作用。本實驗發現，缺血-再灌注脊髓的神經功能損傷與組織病理學改變相關，主動脈阻斷 10 min 后，生理鹽水組和尼莫地平組中的急性期大鼠均出現硬癱，在 8 h 恢復期，仍不能使用關節行走，或出現嚴重共濟失調。K-1024 組在急性期表現為肌無力，8 h 恢復期所有動物都能行走和抬步。尼莫地平組和生理鹽水組組織病理學結果相似，在脊髓 L2～L5 節段Ⅲ～Ⅶ層面灰質出現特征性的廣泛壞死和不規則空洞。但是，灰質周邊部位的層面（Ⅰ～Ⅱ層、Ⅹ層、Ⅷ～Ⅸ層）顯示接近正常結構，α 運動神經元及核也顯示正常結構，與硬癱的出現相符合。而 K-1024 組雖偶有神經元“變暗”或“皺縮”的降解表現，但大多數聯絡神經元和 α 運動神經元未見改變。這提示 K-1024 對缺血脊髓功能的恢復和脊髓組織結構具有保護作用。
谷氨酸在脊髓中被認為是最主要的興奮性氨基酸，其在脊髓缺血時的神經毒性作用已引起人們的廣泛注意。Coyle 等[15]提出的谷氨酸-鈣超載學說是腦、脊髓缺血損傷的重要病理機制之一。在生理和病理情況下，谷氨酸將通過以下幾種方式釋放：Ca2+依賴性的釋放、水腫引起的釋放、谷氨酸轉運系統調節的重吸收及釋放[16]。而目前認為谷氨酸轉運體的表達和功能變化是脊髓缺血時興奮性谷氨酸異常釋放的主要機制[17]。本研究發現缺血 10 min 時神經遞質谷氨酸水平較基礎值高出 3 倍，再灌注 8 h 回到基礎水平，但各組間谷氨酸含量無顯著性差異，這一結果也說明谷氨酸的釋放途徑復雜[18]。而 NMDA 受體途徑并不是通過改變谷氨酸釋放水平而達到脊髓保護的作用。
脊髓缺血誘發的神經毒性作用與 NMDA 受體有極大的關系。本實驗中 K-1024 和尼莫地平都能降低缺血 10 min 時 nNOS 的表達。但再灌注 8 h 后，只有 K-1024 維持了更好的脊髓生物學活性。這可能是由于二者雖能阻斷 Ca2+內流，但其作用途徑不同。尼莫地平通過阻斷 L-型 Ca2+通道阻斷 Ca2+內流，但不能抑制 NMDA 受體介導的 Ca2+內流，缺乏特異性，同時對全身影響大。而 K-1024 阻斷 NMDA 受體過度激活導致的 Ca2+內流避免細胞內 Ca2+超載，從而減少 nNOS 的激活和 NO 的生成，以及 O2－、ONOO－、OH－等氧自由基的產生，進而減少線粒體的損傷[19-20]。
綜上所述，K-1024 對脊髓缺血-再灌注損傷具有一定的保護作用。本研究為臨床應用 K-1024 治療主動脈圍術期缺血性脊髓損傷提供了理論依據。以期未來 K-1024 可用于臨床主動脈手術圍術期的脊髓保護。
利益沖突：無。
作者貢獻：陳宏負責論文設計、數據整理與分析、論文初稿撰寫；陳蘇偉負責數據整理與分析；王盛宇、李巖負責數據整理；孟旭負責論文審閱與修改。
脊髓缺血導致的不同程度的癱瘓是胸主動脈瘤手術的嚴重并發癥[1]。雖然截癱的發生率為 2.5%～8%，但脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）仍然是主動脈瘤術后的嚴重并發癥[2]。最近研究[3-6]表明，興奮性氨基酸（excitatory amino acid，EAA）的離子型受體在 EAA 所致的神經毒性作用中有極其重要的意義，尤其是 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體與脊髓缺血-再灌注損傷關系密切。谷氨酸在脊髓中被認為是興奮性神經遞質，它通過過度激活 NMDA 受體，誘導大量 Ca2+內流損傷神經細胞，導致神經細胞死亡[7]。
動物實驗不斷發現一些藥物可以阻斷腦脊髓缺血缺氧后的損傷級聯反應，減輕腦損傷。然而目前尚未找到一種經臨床證明安全、有效的神經保護劑。K-1024 作為 EAA-NMDA 受體拮抗劑，是目前醫學研究的熱點，但其用于缺血-再灌注脊髓保護治療的報道較少。本實驗擬通過構建大鼠脊髓缺血-再灌注模型，探討 K-1024 對缺血-再灌注大鼠行為學、組織病理學的保護作用，及對谷氨酸、一氧化氮合酶（NOS）表達的影響，評價其對缺血-再灌注脊髓的保護作用并探討其機制。
1 材料與方法
1.1 動物分組與脊髓缺血-再灌注模型的建立
實驗分組：健康成年 SD 大鼠 42 只，由北京安貞醫院實驗動物中心提供，體重 350～375 g，雌雄不拘，隨機分為 4 組。非阻斷組（n=6）：球囊導管置入胸主動脈，但不充填球囊；生理鹽水組（n=12）：生理鹽水 2 mL 在降主動脈阻斷前 30 min 腹腔注射；K-1024 保護組（n=12）：K-1024（25 mg/kg，上海第一制藥廠）在降主動脈阻斷前 30 min 腹腔注射；尼莫地平組（n=12）：尼莫地平（0.5 mg/kg，德國 Bayer 公司）在降主動脈阻斷前 30 min 腹腔注射。
誘導脊髓缺血：10% 水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，聚乙烯導管（PE-50）插入尾動脈監測動脈血壓，注射肝素。分離左股動脈，2-F# Fogarty（Terumo 2.5/3.0）導管放入胸降主動脈，導管頂端到左鎖骨下動脈水平（距導管插入點 10.5～11 cm）。聚乙烯導管（PE-50）插入左頸動脈 1 cm，外接儲血袋（37.5℃），用 4 U/mL 的肝素生理鹽水充填。調整環路儲血器高度以控制近端主動脈壓力（proximal artery blood pressure，PAP），主動脈阻斷期間，阻斷點近端的血壓控制在 40 mm Hg。插管放置完成，尾動脈注射肝素 200 U。球囊導管用 0.05 mL 生理鹽水充入，血液引流入外接儲血袋。被阻斷的主動脈下方搏動消失、壓力降低證明阻斷完全。缺血后，球囊導管排氣并拔除，血液 60 s 回灌，硫酸魚精蛋白（4 mg）皮下注射。灌流完成后，拔除所有插管，縫合切口，復蘇動物。
1.2 行為學評價
在 PAP 40 mm Hg 條件下，將實驗動物分為 4 組，每組 6 只。先阻斷 10 min，再恢復灌注。分別于再灌注 1、2、4、8 h，通過評價下肢行走及步態來量化運動功能的恢復程度。具體的評價方法如下：下肢行走按下列分級：0=正常；1=扁平足，共濟失調；2=使用關節行走；3=下肢有活動，但不能通過關節行走；4=無運動，拖動下肢。抬放反射評價通過外展后爪背側誘發相應的上舉和回放反應，分級為 0=正常，1=弱，2=無。記錄每一組的運動缺失，最后記錄下肢行走+抬放反射的總分，最高得分為 6 分。
1.3 組織病理學評價
大鼠背部正中切口，快速打開椎管，剖取 L3～L5 段脊髓，迅速放入 250 mL 4% 多聚甲醛（含 0.1% DEPC）固定液中，固定 6 h，入 25% 庶糖（含 0.1% DEPC）使組織塊下沉，然后包埋于石蠟中。每只動物 L3、L4、L5 節段取得 5 張典型性切片，切片厚度 3 μm，行蘇木精-伊紅（HE）染色。灰質損害程度（壞死或暗神經元）分別從三個區判斷：一區，損害涉及Ⅰ～Ⅵ層面；二區，損害涉及Ⅶ和Ⅹ層面；三區，損害涉及Ⅷ和Ⅸ層面。
1.4 脊髓組織中谷氨酸含量測定
高效液相色譜法：用 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.8）在冰上制備脊髓組織勻漿，取上清液 20 μL 加 0.4 mol/L 過氯酸（PCA）180 μL，混勻，37℃，12 000 r/min 離心 45 min。取上清液 10 μL 加內標物（30 pmol/L 高絲氨酸）10 μL，再加鄰苯二甲醛（OPA）100 μL，2 min 后即進樣 10 μL 按色譜條件進行梯度洗脫。
1.5 神經元型 NOS（nNOS）檢測
免疫組織化學染色（ABC 法）：1∶50 正常羊血清在室溫下孵育 30 min，滴加兔抗 nNOS 抗體（工作濃度為 1∶80，Sigma 公司），4℃，孵育 72 h；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分沖洗（3 min×3）后，加羊抗兔抗體（工作濃度為 1∶100，博士德公司），在 37℃ 下溫育 30 min；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分沖洗（3 min×3）后，滴加 ABC 復合物（工作濃度為 1∶100，博士德公司），37℃ 溫育 30 min；0.01 mol/L PBS（pH 7.4）充分沖洗（3 min×3）后，DAB-H2O2 呈色，室溫，5～10 min，常規脫水，透明，中性樹膠封片。以 PBS 代替一抗作為空白對照。結果以普通光學顯微鏡檢查。
1.6 圖像分析
用顯微圖像分析儀（TJTY-400 真彩色細胞圖像分析儀）對切片進行圖像分析，所有切片均在同一放大倍數（×10）及同一光強度下分析，每例動物測 3 張切片，取平均值。采集陽性反應細胞數，視場范圍 261 632.00 μm2。
1.7 統計學分析
所有實驗數據用 SPSS 25.0 軟件進行分析處理，結果以均數±標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統計學意義。
1.8 倫理審查
本研究已通過北京安貞醫院醫學倫理委員會審批，批準號：2016044X。
2 結果
2.1 行為學評價
非阻斷組：再灌注 8 h 后，所有大鼠未發現神經功能不全表現。
生理鹽水組：5 只大鼠出現急性硬癱，再灌注 8 h 后無任何改變。1 只大鼠再灌注 2 h 后運動功能有一個級別的恢復，但是再灌注 8 h 行為學評分又增加到 6 分。
K-1024 組：4 只大鼠再灌注 1 h 評分為 4 分。另外 2 只大鼠再灌注 1 h 評分為 2 分，再灌注 2 h 后仍為 2 分。但所有 6 只大鼠再灌注 8 h 后輕微肌無力，運動損傷評分保持在 2 分。且均能行走和抬步，行為學評分與對照組最接近。
尼莫地平組：所有 6 只大鼠在再灌注 2 h 后顯示重度的運動損害硬癱，其中 2 只大鼠再灌注 4 h 后行為學評分恢復到 5 分（不能使用關節行走）。再灌注 8 h 后，6 只大鼠中，2 只大鼠無任何變化，2 只大鼠行為學評分恢復到 5 分，2 只大鼠恢復到中等程度的運動損害（共濟失調但使用關節行走）；見圖 1。
圖1
不同藥物對缺血-再灌注大鼠脊髓行為學的影響
2.2 組織病理學改變
非阻斷組：運動和感覺功能完全恢復，L2～L5 脊髓節段切片無組織病理學改變。小的和中等大小的聯絡神經元、大的 α 運動神經元均無壞死表現，神經纖維也無病理改變。
生理鹽水組：全部動物硬癱，組織病理學改變在脊髓 L2～L5 節段Ⅲ～Ⅶ層面灰質出現特征性的廣泛壞死和不規則空洞。但是，位于灰質周邊部位的層面，如Ⅰ～Ⅱ層、Ⅹ層、Ⅷ～Ⅸ層顯示接近正常結構。與硬癱的出現相符合，α 運動神經元及核結構正常。
尼莫地平組：與生理鹽水組基本相似。
K-1024 組：在神經功能恢復的動物中，偶然發現神經元“變暗”或“皺縮”的降解表現，這些神經元典型地分部在中內區（第Ⅶ層）的中部和后角的中后部。但是，大多數聯絡神經元和 α 運動神經元未發現改變；見圖 2。
圖2
不同組別大鼠脊髓 HE 染色（×10）
a：非阻斷組，完整脊髓結構；b：生理鹽水組，常溫缺血 10 min，黑色箭頭顯示脊髓灰質Ⅲ～Ⅶ層壞死，紅色箭頭顯示 α 運動神經元正常；c：尼莫地平組，黑色箭頭顯示神經元“皺縮”，紅色箭頭顯示灰質空泡形成；d：K-1024 組，脊髓結構基本完整
2.3 脊髓組織中谷氨酸含量
缺血 10 min，生理鹽水組、尼莫地平組和 K-1024 組之間谷氨酸含量差異無統計學意義（F=0.324，P=0.731），且生理鹽水組的神經遞質谷氨酸水平較非阻斷組高出 3 倍。進一步多重比較發現，K-1024 組谷氨酸含量與生理鹽水組比較差異無統計學意義（P=0.801）；尼莫地平組谷氨酸含量略低于生理鹽水組，但差異無統計學意義（P=0.450）；K-1024 組與尼莫地平組差異也無統計學意義（P=0.609）。
再灌注 8 h 后，三組之間差異無統計學意義（F=1.095，P=0.375）。進一步多重比較發現，各組谷氨酸含量與非阻斷組處于相似的水平。K-1024 組谷氨酸含量雖略低于與生理鹽水組，但差異無統計學意義（P=0.789）；尼莫地平組與生理鹽水組的谷氨酸水平差異無統計學意義（P=0.196）；K-1024 組與尼莫地平組差異也無統計學意義（P=0.291）；見表 1。
表1
藥物對缺血-再灌注大鼠脊髓谷氨酸含量的影響（μmol/L，）
2.4 脊髓組織內 nNOS 表達
缺血 10 min，三組 nNOS 表達差異有統計學意義（F=40.597，P<0.01）。進一步多重比較發現，K-1024 組和尼莫地平組 nNOS 陽性反應細胞數與生理鹽水組比較均明顯下調（P<0.01）；K-1024 組與尼莫地平組差異無統計學意義（P=0.283）。
再灌注 8 h，三組 nNOS 表達差異有統計學意義（F=3.409，P=0.046）。進一步多重比較發現，K-1024 組 nNOS 陽性反應細胞數與生理鹽水組比較明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05），尼莫地平組與生理鹽水組差異無統計學意義（P=0.096），K-1024 組與尼莫地平組之間差異也無統計學意義（P=0.441）；見表 2、圖 3。
表2
藥物對缺血-再灌注大鼠脊髓 nNOS 陽性反應細胞數的影響（個/261 632.00 μm2，）
圖3
不同組別大鼠 nNOS 免疫組織化學染色（×10）
a：非阻斷組；b：生理鹽水組缺血 10 min；c：生理鹽水組缺血-再灌注 8 h；d：K-1024 組缺血 10 min；e：K-1024 組缺血-再灌注 8 h；f：尼莫地平組缺血 10 min；g：尼莫地平組缺血-再灌注 8 h
3 討論
隨著 NMDA 受體介導的興奮性毒性在神經元損傷中的作用逐漸被認識，NMDA 受體拮抗劑為缺血性腦、脊髓損傷的預防和治療帶來新的希望[8-9]。在動物實驗中不斷發現 NMDA 受體拮抗劑可以阻斷腦、脊髓缺血缺氧后的損傷級聯反應，減輕腦、脊髓損傷。Li 等[10]發現 NMDA 受體拮抗劑人參皂甙具有抗神經元損傷的作用；de Miranda 等[11]證實全身予以 NMDA 受體拮抗劑 MK-801 能縮小脊髓梗塞區，減少神經元損傷，有明顯的保護作用。目前，K-1024 是非競爭性 NMDA 受體拮抗劑，已用于臨床靜脈麻醉，并在腦缺血保護中已有報道，但在主動脈手術圍術期脊髓缺血中的保護作用報道較少[12-14]。
本研究應用球囊導管阻斷的方式構建大鼠脊髓缺血模型，模擬胸腹主動脈瘤切除的圍術期條件，以 K-1024 作為實驗組，同時與尼莫地平相比較，探討脊髓缺血和再灌注損傷的機制，并論證 K-1024 作為非競爭性 NMDA 受體拮抗劑在主動脈手術圍術期脊髓保護中的作用。本實驗發現，缺血-再灌注脊髓的神經功能損傷與組織病理學改變相關，主動脈阻斷 10 min 后，生理鹽水組和尼莫地平組中的急性期大鼠均出現硬癱，在 8 h 恢復期，仍不能使用關節行走，或出現嚴重共濟失調。K-1024 組在急性期表現為肌無力，8 h 恢復期所有動物都能行走和抬步。尼莫地平組和生理鹽水組組織病理學結果相似，在脊髓 L2～L5 節段Ⅲ～Ⅶ層面灰質出現特征性的廣泛壞死和不規則空洞。但是，灰質周邊部位的層面（Ⅰ～Ⅱ層、Ⅹ層、Ⅷ～Ⅸ層）顯示接近正常結構，α 運動神經元及核也顯示正常結構，與硬癱的出現相符合。而 K-1024 組雖偶有神經元“變暗”或“皺縮”的降解表現，但大多數聯絡神經元和 α 運動神經元未見改變。這提示 K-1024 對缺血脊髓功能的恢復和脊髓組織結構具有保護作用。
谷氨酸在脊髓中被認為是最主要的興奮性氨基酸，其在脊髓缺血時的神經毒性作用已引起人們的廣泛注意。Coyle 等[15]提出的谷氨酸-鈣超載學說是腦、脊髓缺血損傷的重要病理機制之一。在生理和病理情況下，谷氨酸將通過以下幾種方式釋放：Ca2+依賴性的釋放、水腫引起的釋放、谷氨酸轉運系統調節的重吸收及釋放[16]。而目前認為谷氨酸轉運體的表達和功能變化是脊髓缺血時興奮性谷氨酸異常釋放的主要機制[17]。本研究發現缺血 10 min 時神經遞質谷氨酸水平較基礎值高出 3 倍，再灌注 8 h 回到基礎水平，但各組間谷氨酸含量無顯著性差異，這一結果也說明谷氨酸的釋放途徑復雜[18]。而 NMDA 受體途徑并不是通過改變谷氨酸釋放水平而達到脊髓保護的作用。
脊髓缺血誘發的神經毒性作用與 NMDA 受體有極大的關系。本實驗中 K-1024 和尼莫地平都能降低缺血 10 min 時 nNOS 的表達。但再灌注 8 h 后，只有 K-1024 維持了更好的脊髓生物學活性。這可能是由于二者雖能阻斷 Ca2+內流，但其作用途徑不同。尼莫地平通過阻斷 L-型 Ca2+通道阻斷 Ca2+內流，但不能抑制 NMDA 受體介導的 Ca2+內流，缺乏特異性，同時對全身影響大。而 K-1024 阻斷 NMDA 受體過度激活導致的 Ca2+內流避免細胞內 Ca2+超載，從而減少 nNOS 的激活和 NO 的生成，以及 O2－、ONOO－、OH－等氧自由基的產生，進而減少線粒體的損傷[19-20]。
綜上所述，K-1024 對脊髓缺血-再灌注損傷具有一定的保護作用。本研究為臨床應用 K-1024 治療主動脈圍術期缺血性脊髓損傷提供了理論依據。以期未來 K-1024 可用于臨床主動脈手術圍術期的脊髓保護。
利益沖突：無。
作者貢獻：陳宏負責論文設計、數據整理與分析、論文初稿撰寫；陳蘇偉負責數據整理與分析；王盛宇、李巖負責數據整理；孟旭負責論文審閱與修改。
