引用本文： 楊貴芳, 柴湘平, 彭文, 周陽, 盛麗娟. PKD1 基因對主動脈平滑肌細胞自噬的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2020, 27(5): 569-573. doi: 10.7507/1007-4848.201904029 復制
主動脈夾層（aortic dissection，AD）作為一種急性大血管病變其病情兇險，病死率高，但發病機制目前暫不明。有研究發現在 AD 病變血管中可觀察到自噬減弱。自噬廣泛存在于真核細胞內，自噬缺乏或功能障礙，變性蛋白不能被降解，在細胞內大量蓄積，從而對細胞產生毒性作用，引起細胞腫脹，最終導致細胞死亡[1]。多囊腎病關鍵致病基因為多囊腎病基因1（polycystic kidney disease-1，PKD1），其發病可能與 PKD1 表達下調引起腎小管上皮細胞自噬減弱有關。研究[2]發現 PKD1 基因也廣泛高表達于心血管系統中，對維持血管壁結構的完整性和穩定性非常重要。在 PKD1 基因敲除小鼠模型中可觀察到血管壁出現不同程度的血腫，甚至可見小的夾層[3-4]。因此，我們推測 AD 的發病可能與 PKD1 基因表達下調引起主動脈血管平滑肌細胞自噬減弱有關。本研究初步探討了 PKD1 基因對主動脈血管平滑肌細胞自噬的影響。
1 材料與方法
1.1 主要材料和試劑
小鼠主動脈平滑肌細胞（MOVAS）、293T 細胞（ATCC 公司），PKD1 基因干擾及過表達序列送上海捷瑞公司合成。其他主要試劑有 T4 磷酸化酶（M0201s，NEB），T4 連接酶（M02012L，NEB），LB 培養基（B5859，生工生物），Tran5α 感受態細胞（CD201，Transgene），DMEM 高糖培養基（C11995500BT，GIBCO），PBS pH7.4 basic（C10010500BT，GIBCO），0.25% Trypsin-EDTA（25200-072，GIBCO），胎牛血清（16000-044，GIBCO）。
1.2 實驗方法
1.2.1 主動脈平滑肌細胞培養
將購買的 MOVAS 細胞加入含 20% 胎牛血清的完全培養基，置于 37℃ 5% CO2 培養箱培養，每隔 2～3 d 換液。待細胞鋪滿培養皿底部后消化傳代。免疫熒光法鑒定其純度，取第 3～8 代細胞進行實驗。
1.2.2 慢病毒干擾及表達質粒的構建
干擾片段的選擇：運用 Promega，Invitrogen 和 Dharmaco 公司提供的 RNA 干擾設計工具，并結合 RNA 干擾設計的原則，尋找 19 個堿基的靶序列。將編碼 siRNA 的 DNA 片段設計成發夾結構，包括正義序列（19 nt）-中間環（9 nt）-反義序列（19 nt）。發夾結構的兩端含限制性內切酶位點 HpaI 和 XhoI。過表達目的基因 ETS-1：在 NCBI 上搜索到目的基因，找到該基因的 mRNA，確定 CDS 長度及序列，然后進行引物設計；通過 PCR 擴增目的片段，將含有酶切位點的目的基因片段克隆到慢病毒載體及連接產物，最后取部分菌液送中美泰和公司測序。
1.2.3 慢病毒轉染
293T 細胞鋪板（96 孔板），每個孔加 4×104 個細胞，體積為 100 μL。根據病毒的預期滴度，準備 7～10 個無菌的 EP 管。在每個管中加入 90 μL 無血清培養基。取待測定的病毒原液 10 μL 加入到第一個管中，記為 1E+10 μL；混勻后，取 10 μL 加入到第二個管中，記為 2E+10 μL，以此類推，繼續相同的操作直到最后一管。選取所需的細胞孔，吸去 90 μL 培養基，丟棄，同時加入 90 μL 稀釋好的病毒溶液，放入培養箱培養。24 h 后，加入完全培養基 100 μL。小心操作，不要吹起細胞。4 d 后，觀察熒光表達情況。
1.2.4 慢病毒轉染后穩定細胞株的篩選
按實驗需要將細胞鋪板，細胞數以第 2 d 密度約 50% 為宜。37℃ 培養過夜。感染前，從冰箱取出并在 37℃ 水浴中快速融化病毒，用新鮮完全培養基稀釋成所需濃度。注意輕輕混勻，不要使用振蕩器。吸去細胞原有培養基，將稀釋好的病毒液加入細胞中。加入聚凝胺（終濃度 8 μg/mL），輕輕搖勻，37℃ 培養過夜。感染后第 2 d，吸去含病毒的培養液，換上新鮮的完全培養液，繼續 37℃ 培養。感染后第 3 d，換上含適當濃度嘌呤霉素的培養液，篩選穩定轉染的細胞株。10～12 d 后可獲得穩定表達目的蛋白的細胞克隆。熒光顯微鏡下觀察 GFP 陽性率，當 GFP 陽性率>95% 時，收集樣本并通過 qPCR 實驗驗證轉染效率。
1.2.5 qPCR 檢測目的基因 mRNA 水平
目的基因的相對表達量計算公式為：2?△△Ct=2?［（△Ct）Test-（△Ct）Control］。CtTest 為目的基因 Ct 值，CtControl 為管家基因 Ct 值。△Ct=CtTest?CtControl，表示各樣本目的基因相對管家基因的相對 Ct 值，△△Ct 表示處理組相對對照組進行歸一化的 Ct 值，2?△△Ct 表示處理組相對對照組的相對表達量，即目的基因的相對表達倍數。
1.2.6 Western blotting 檢測自噬相關蛋白的表達
提取細胞經蛋白定量后，采用 8% 濃度的聚丙烯酰胺凝膠檢測目的蛋白 Atg5，Beclin1及LC3。經 SDS-PAGE 電泳后將蛋白轉至 PVDF 膜上，5% 脫脂牛奶封閉后，加入相應的一抗 Atg5（133158，Santa，1∶200），Beclin1（48341，Santa，1∶200），LC3（376404，Santa，1∶200），4℃ 孵育過夜后，用 TBST 緩沖液洗膜兩次，每次 7 min；用稀釋好的相應二抗（HRP 標記二抗，Forevergen，1∶3 000）室溫下孵育 1～2 h，然后用 TBST 緩沖液洗膜三次，每次 7 min；最后進行化學發光顯影（ECL，Forevergen）。用 Image J 分析目標條帶的光密度值。以 GAPDH（HC301，1∶5 000）作為內參，比較不同處理后上述蛋白表達的差異。
1.3 統計學分析
采用 GraphPad Prism 統計學軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，兩兩比較采用 t 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 熒光檢測 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒轉染效率
將構建的 shPKD1 和 ETS-1 重組慢病毒載體轉染 MOVAS 細胞，10～12 d 后可獲得穩定表達目的蛋白的細胞克隆，熒光顯微鏡下觀察 GFP 陽性率>95%，轉染后的細胞形態正常，生長狀態良好，獲得了穩定的基因干預效果；見圖 1。
圖1
PKD1 慢病毒載體轉染 MOVAS 細胞 72 h 后光鏡和熒光顯微鏡下觀察轉染效果
a～b：空白慢病毒載體轉染 MOVAS 細胞；c～d：shPKD1 慢病毒載體轉染 MOVAS 細胞；e～f：ETS-1 慢病毒載體轉染 MOVAS 細胞。熒光顯微鏡下觀察 GFP 陽性率>95%，轉染效率高。a/c/e：明視野；b/d/f：熒光視野；放大倍數：200 ×
2.2 轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中 PKD1 和 ETS-1 mRNA 水平的影響
設置正常對照（NC）組、shPKD1 組及 ETS-1 組，以 β-actin 為內參，采用公式 2?△△Ct計算目的基因 PKD1 及 ETS-1 的 mRNA 相對表達量。與對照組相比，shPKD1 組 PKD1 mRNA 水平明顯下降（P<0.05），ETS-1 組 ETS-1 和 PKD1 mRNA 水平明顯升高（P<0.05）；見圖 2。
圖2
轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中 PKD1 和 ETS-1 mRNA 水平的影響
a：shPKD1 組與對照組 PKD1 mRNA 表達比較；b：ETS-1 組與對照組 ETS-1 mRNA 表達比較；c：ETS-1 組與對照組 PKD1 mRNA 表達比較；*
2.3 轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中自噬相關基因 Atg5 和 Beclin1 mRNA 水平的影響
利用 RNA 干擾技術下調 MOVAS 細胞 PKD1 基因的表達，或利用 PKD1 基因促進劑 ETS-1 促進 PKD1 基因的表達，以空載組為對照，比較各組之間自噬相關基因 Atg5 和 Beclin1 mRNA 的表達。結果顯示，與對照組相比，shPKD1 組 Atg5（P<0.05）和 Beclin1（P<0.01）mRNA 表達水平明顯降低，ETS-1 組 Atg5 和 Beclin1 mRNA 表達水平明顯升高（P<0.001）；見圖 3。
圖3
轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中自噬相關基因 Atg5 和 Beclin1 mRNA 水平的影響
a：shPKD1 組與對照組 Atg5 mRNA 表達比較；b：shPKD1 組與對照組 Beclin1 mRNA 表達比較；c：ETS-1 組與對照組 Atg5 mRNA 表達比較；d：ETS-1 組與對照組 Beclin1 mRNA 表達比較；*
2.4 轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中自噬相關蛋白 Atg5、Beclin1 及 LC3 表達的影響
運用 Western blotting 對各組細胞中自噬相關蛋白 Atg5、Beclin1 及 LC3 的表達水平進行檢測。結果顯示，與對照組相比，shPKD1 組 Atg5（P<0.05）、Beclin1（P<0.05）和 LC3（P<0.01）蛋白表達水平均降低，ETS-1 組 Atg5（P<0.001）、Beclin1（P<0.05）和 LC3（P<0.05）蛋白表達水平均升高（P<0.05）；見圖 4。
圖4
轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中自噬相關基因 Atg5、Beclin1 及 LC3 蛋白表達的影響
a：shPKD1 組與對照組 Atg5、Beclin1 和 LC3 Western blotting 蛋白條帶圖；b～d：shPKD1 組與對照組 Atg5、Beclin1 和 LC3 蛋白的表達比較；e：ETS-1 組與對照組 Atg5、Beclin1 和 LC3 Western blotting 蛋白條帶圖；f～h：ETS-1 組與對照組 Atg5、Beclin1 和 LC3 蛋白的表達比較；*
3 討論
AD 是一種嚴重的大血管病變，臨床表現多樣，早期誤診率較高，夾層破裂是其主要死亡原因。由于 AD 的發病機制不清，導致 AD 的臨床預測及診治面臨著嚴峻的挑戰[5]。因此，研究 AD 的發病機制，為 AD 的防治提供新的靶點和理論基礎，具有十分重要的意義。
PKD1 基因是常染色體顯性遺傳疾病多囊腎病的關鍵致病基因，其編碼的蛋白產物 PC-1 是一種整合蛋白及糖基化蛋白，對維持正常細胞和組織結構起重要作用，廣泛參與細胞的收縮、增殖和凋亡過程[6]。許多研究表明 PKD1 突變引起 PC-1 的不正常表達導致腎臟及某些腎外組織如主動脈中膜出現廣泛的多囊病變。有研究[7]表明 PKD1 基因參與了 AD 發生的病理過程，但其具體機制不詳。近年越來越多的研究表明，主動脈平滑肌退化及細胞死亡或數量的減少與 AD 的形成密切相關，但平滑肌細胞死亡的機制目前尚不明確。研究發現自噬與細胞死亡高度相關[8-9]。自噬作為一種溶酶體降解途徑是細胞或組織生存、分化、發育及維持內環境穩定必不可少的一個因素，被認為是細胞對某些持續性內外刺激的一種非損傷性應答，其廣泛存在于真核細胞內。自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬 3 類。自噬體由雙層膜結構的囊泡包裹已經變性的蛋白質以及某些受損無功能的細胞器形成，在溶酶體存在的條件下與之結合形成自噬溶酶體。研究發現哺乳類動物自噬溶酶體膜上主要表達 Atg5、Beclin1 和 LC3，其中 LC3 分為 LC3Ⅰ和 LC3Ⅱ。LC3Ⅰ具有可溶性而 LC3Ⅱ特異表達于自噬溶酶體膜上，因此 LC3Ⅱ更常用于細胞自噬功能的檢測。自噬缺乏或功能障礙，變性蛋白不能被降解，在細胞內大量蓄積，從而對細胞產生毒性作用，引起細胞腫脹，最終導致細胞死亡。因此，自噬可清除細胞內有害代謝產物，對維持細胞的正常功能起著重要作用[10-11]。文獻[12]報道在某些退化的血管中，自噬被抑制，變性蛋白不能降解，大量活性氧化物及其它有害代謝產物不能及時清除，血管平滑肌細胞結構受損及適應力下降，最終引起細胞死亡。為探討 PKD1 對血管平滑肌細胞自噬的影響，我們采取人為干預血管平滑肌細胞中 PKD1 表達的方法觀察 PKD1 水平對自噬的影響。
shRNA，又稱小發卡 RNA 或短發卡 RNA，是一種人工合成的類似于發卡結構的小分子 RNA 片段，其通過 RNA 干擾沉默靶基因的表達。目前為使細胞穩定表達 shRNA，一般借助于質粒、細菌或病毒載體攜帶并轉染 shRNA。當這些小分子片段與 mRNA 中的同源序列互補結合后，會引起某些特定 mRNA 失去功能，也就是使基因“沉默”，即不能翻譯產生蛋白質。使用慢病毒作為載體攜帶 shRNA，不僅能在細胞傳代中穩定表達而不衰減，而且能夠維持 shRNA 結構穩定[13-14]。本研究根據 PKD1 基因的靶序列成功設計出了針對 PKD1 基因的 shRNA，成功構建了 shPKD1 慢病毒載體。將構建的 shPKD1 慢病毒載體轉染小鼠主動脈平滑肌細胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白 GFP 陽性率>95%，轉染效率高，轉染后的細胞形態正常，生長狀態良好。同時，通過 qPCR 檢測 PKD1 mRNA 水平發現與對照組相比 shPKD1 組 PKD1 mRNA 表達水平明顯降低。ETS 家族是由一類高度保守序列特異性 DNA 結合蛋白組成的轉錄因子，主要表達于內皮細胞等，在人體內目前共發現 28 個 ETS 基因，同時在小鼠體內發現 27 個 ETS 基因。ETS-1 作為其家族中的一員能與 DNA 結合形成單體結構。Puri 等[15]發現 PKD1 基因的啟動子區域是 ETS-1 轉錄因子的受體，本研究通過把 ETS-1 與載體共轉錄進靶細胞發現與對照組相比 PKD1 基因表達明顯上調；同時 Lantinga-van Leeuwen 等[16]也證實 ETS-1 能夠調控 PKD1 基因的表達，ETS-1 能夠作用于 PKD1 基因的啟動子區域，促進 PKD1 基因的表達。本實驗成功構建了 ETS-1 過表達慢病毒載體，將構建的 ETS-1 過表達慢病毒載體轉染小鼠主動脈平滑肌細胞，熒光顯微鏡下觀察 GFP 陽性率>95%，轉染效率高，轉染后的細胞形態正常，生長狀態良好。同時，通過 qPCR 檢測 ETS-1 和 PKD1 mRNA 水平發現與對照組相比 ETS-1 組 ETS-1 及 PKD1 mRNA 表達水平明顯升高。
本實驗成功構建了 PKD1 干擾及過表達的小鼠主動脈平滑肌細胞穩定細胞系，獲得了穩定的基因干預效果。在干擾 PKD1 表達后，血管平滑肌細胞自噬水平明顯受到抑制；而過表達 PKD1 則促進了血管平滑肌細胞自噬。上述結果提示，PKD1 基因參與了血管平滑肌細胞自噬過程。
基于我們的認識，本研究首次提出 PKD1 參與血管平滑肌細胞自噬過程，其具體機制有待進一步研究。本研究豐富了對 PKD1 的功能認識，同時也為更廣泛、深入地研究其在血管平滑肌細胞中的作用提供了理論依據。
綜上所述，PKD1 基因參與小鼠主動脈平滑肌細胞自噬過程，下調 PKD1 基因表達可導致血管平滑肌細胞自噬減弱，而過表達 PKD1 基因能夠促進小鼠主動脈平滑肌細胞自噬。
利益沖突：無。
作者貢獻：楊貴芳、柴湘平、彭文負責論文設計；周陽負責實施研究；楊貴芳、盛麗娟負責數據整理與分析及論文初稿撰寫；柴湘平負責論文審閱與修改。
主動脈夾層（aortic dissection，AD）作為一種急性大血管病變其病情兇險，病死率高，但發病機制目前暫不明。有研究發現在 AD 病變血管中可觀察到自噬減弱。自噬廣泛存在于真核細胞內，自噬缺乏或功能障礙，變性蛋白不能被降解，在細胞內大量蓄積，從而對細胞產生毒性作用，引起細胞腫脹，最終導致細胞死亡[1]。多囊腎病關鍵致病基因為多囊腎病基因1（polycystic kidney disease-1，PKD1），其發病可能與 PKD1 表達下調引起腎小管上皮細胞自噬減弱有關。研究[2]發現 PKD1 基因也廣泛高表達于心血管系統中，對維持血管壁結構的完整性和穩定性非常重要。在 PKD1 基因敲除小鼠模型中可觀察到血管壁出現不同程度的血腫，甚至可見小的夾層[3-4]。因此，我們推測 AD 的發病可能與 PKD1 基因表達下調引起主動脈血管平滑肌細胞自噬減弱有關。本研究初步探討了 PKD1 基因對主動脈血管平滑肌細胞自噬的影響。
1 材料與方法
1.1 主要材料和試劑
小鼠主動脈平滑肌細胞（MOVAS）、293T 細胞（ATCC 公司），PKD1 基因干擾及過表達序列送上海捷瑞公司合成。其他主要試劑有 T4 磷酸化酶（M0201s，NEB），T4 連接酶（M02012L，NEB），LB 培養基（B5859，生工生物），Tran5α 感受態細胞（CD201，Transgene），DMEM 高糖培養基（C11995500BT，GIBCO），PBS pH7.4 basic（C10010500BT，GIBCO），0.25% Trypsin-EDTA（25200-072，GIBCO），胎牛血清（16000-044，GIBCO）。
1.2 實驗方法
1.2.1 主動脈平滑肌細胞培養
將購買的 MOVAS 細胞加入含 20% 胎牛血清的完全培養基，置于 37℃ 5% CO2 培養箱培養，每隔 2～3 d 換液。待細胞鋪滿培養皿底部后消化傳代。免疫熒光法鑒定其純度，取第 3～8 代細胞進行實驗。
1.2.2 慢病毒干擾及表達質粒的構建
干擾片段的選擇：運用 Promega，Invitrogen 和 Dharmaco 公司提供的 RNA 干擾設計工具，并結合 RNA 干擾設計的原則，尋找 19 個堿基的靶序列。將編碼 siRNA 的 DNA 片段設計成發夾結構，包括正義序列（19 nt）-中間環（9 nt）-反義序列（19 nt）。發夾結構的兩端含限制性內切酶位點 HpaI 和 XhoI。過表達目的基因 ETS-1：在 NCBI 上搜索到目的基因，找到該基因的 mRNA，確定 CDS 長度及序列，然后進行引物設計；通過 PCR 擴增目的片段，將含有酶切位點的目的基因片段克隆到慢病毒載體及連接產物，最后取部分菌液送中美泰和公司測序。
1.2.3 慢病毒轉染
293T 細胞鋪板（96 孔板），每個孔加 4×104 個細胞，體積為 100 μL。根據病毒的預期滴度，準備 7～10 個無菌的 EP 管。在每個管中加入 90 μL 無血清培養基。取待測定的病毒原液 10 μL 加入到第一個管中，記為 1E+10 μL；混勻后，取 10 μL 加入到第二個管中，記為 2E+10 μL，以此類推，繼續相同的操作直到最后一管。選取所需的細胞孔，吸去 90 μL 培養基，丟棄，同時加入 90 μL 稀釋好的病毒溶液，放入培養箱培養。24 h 后，加入完全培養基 100 μL。小心操作，不要吹起細胞。4 d 后，觀察熒光表達情況。
1.2.4 慢病毒轉染后穩定細胞株的篩選
按實驗需要將細胞鋪板，細胞數以第 2 d 密度約 50% 為宜。37℃ 培養過夜。感染前，從冰箱取出并在 37℃ 水浴中快速融化病毒，用新鮮完全培養基稀釋成所需濃度。注意輕輕混勻，不要使用振蕩器。吸去細胞原有培養基，將稀釋好的病毒液加入細胞中。加入聚凝胺（終濃度 8 μg/mL），輕輕搖勻，37℃ 培養過夜。感染后第 2 d，吸去含病毒的培養液，換上新鮮的完全培養液，繼續 37℃ 培養。感染后第 3 d，換上含適當濃度嘌呤霉素的培養液，篩選穩定轉染的細胞株。10～12 d 后可獲得穩定表達目的蛋白的細胞克隆。熒光顯微鏡下觀察 GFP 陽性率，當 GFP 陽性率>95% 時，收集樣本并通過 qPCR 實驗驗證轉染效率。
1.2.5 qPCR 檢測目的基因 mRNA 水平
目的基因的相對表達量計算公式為：2?△△Ct=2?［（△Ct）Test-（△Ct）Control］。CtTest 為目的基因 Ct 值，CtControl 為管家基因 Ct 值。△Ct=CtTest?CtControl，表示各樣本目的基因相對管家基因的相對 Ct 值，△△Ct 表示處理組相對對照組進行歸一化的 Ct 值，2?△△Ct 表示處理組相對對照組的相對表達量，即目的基因的相對表達倍數。
1.2.6 Western blotting 檢測自噬相關蛋白的表達
提取細胞經蛋白定量后，采用 8% 濃度的聚丙烯酰胺凝膠檢測目的蛋白 Atg5，Beclin1及LC3。經 SDS-PAGE 電泳后將蛋白轉至 PVDF 膜上，5% 脫脂牛奶封閉后，加入相應的一抗 Atg5（133158，Santa，1∶200），Beclin1（48341，Santa，1∶200），LC3（376404，Santa，1∶200），4℃ 孵育過夜后，用 TBST 緩沖液洗膜兩次，每次 7 min；用稀釋好的相應二抗（HRP 標記二抗，Forevergen，1∶3 000）室溫下孵育 1～2 h，然后用 TBST 緩沖液洗膜三次，每次 7 min；最后進行化學發光顯影（ECL，Forevergen）。用 Image J 分析目標條帶的光密度值。以 GAPDH（HC301，1∶5 000）作為內參，比較不同處理后上述蛋白表達的差異。
1.3 統計學分析
采用 GraphPad Prism 統計學軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩兩比較采用 t 檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 熒光檢測 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒轉染效率
將構建的 shPKD1 和 ETS-1 重組慢病毒載體轉染 MOVAS 細胞，10～12 d 后可獲得穩定表達目的蛋白的細胞克隆，熒光顯微鏡下觀察 GFP 陽性率>95%，轉染后的細胞形態正常，生長狀態良好，獲得了穩定的基因干預效果；見圖 1。
圖1
PKD1 慢病毒載體轉染 MOVAS 細胞 72 h 后光鏡和熒光顯微鏡下觀察轉染效果
a～b：空白慢病毒載體轉染 MOVAS 細胞；c～d：shPKD1 慢病毒載體轉染 MOVAS 細胞；e～f：ETS-1 慢病毒載體轉染 MOVAS 細胞。熒光顯微鏡下觀察 GFP 陽性率>95%，轉染效率高。a/c/e：明視野；b/d/f：熒光視野；放大倍數：200 ×
2.2 轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中 PKD1 和 ETS-1 mRNA 水平的影響
設置正常對照（NC）組、shPKD1 組及 ETS-1 組，以 β-actin 為內參，采用公式 2?△△Ct計算目的基因 PKD1 及 ETS-1 的 mRNA 相對表達量。與對照組相比，shPKD1 組 PKD1 mRNA 水平明顯下降（P<0.05），ETS-1 組 ETS-1 和 PKD1 mRNA 水平明顯升高（P<0.05）；見圖 2。
圖2
轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中 PKD1 和 ETS-1 mRNA 水平的影響
a：shPKD1 組與對照組 PKD1 mRNA 表達比較；b：ETS-1 組與對照組 ETS-1 mRNA 表達比較；c：ETS-1 組與對照組 PKD1 mRNA 表達比較；*
2.3 轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中自噬相關基因 Atg5 和 Beclin1 mRNA 水平的影響
利用 RNA 干擾技術下調 MOVAS 細胞 PKD1 基因的表達，或利用 PKD1 基因促進劑 ETS-1 促進 PKD1 基因的表達，以空載組為對照，比較各組之間自噬相關基因 Atg5 和 Beclin1 mRNA 的表達。結果顯示，與對照組相比，shPKD1 組 Atg5（P<0.05）和 Beclin1（P<0.01）mRNA 表達水平明顯降低，ETS-1 組 Atg5 和 Beclin1 mRNA 表達水平明顯升高（P<0.001）；見圖 3。
圖3
轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中自噬相關基因 Atg5 和 Beclin1 mRNA 水平的影響
a：shPKD1 組與對照組 Atg5 mRNA 表達比較；b：shPKD1 組與對照組 Beclin1 mRNA 表達比較；c：ETS-1 組與對照組 Atg5 mRNA 表達比較；d：ETS-1 組與對照組 Beclin1 mRNA 表達比較；*
2.4 轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中自噬相關蛋白 Atg5、Beclin1 及 LC3 表達的影響
運用 Western blotting 對各組細胞中自噬相關蛋白 Atg5、Beclin1 及 LC3 的表達水平進行檢測。結果顯示，與對照組相比，shPKD1 組 Atg5（P<0.05）、Beclin1（P<0.05）和 LC3（P<0.01）蛋白表達水平均降低，ETS-1 組 Atg5（P<0.001）、Beclin1（P<0.05）和 LC3（P<0.05）蛋白表達水平均升高（P<0.05）；見圖 4。
圖4
轉染 shPKD1 和 ETS-1 慢病毒對 MOVAS 細胞中自噬相關基因 Atg5、Beclin1 及 LC3 蛋白表達的影響
a：shPKD1 組與對照組 Atg5、Beclin1 和 LC3 Western blotting 蛋白條帶圖；b～d：shPKD1 組與對照組 Atg5、Beclin1 和 LC3 蛋白的表達比較；e：ETS-1 組與對照組 Atg5、Beclin1 和 LC3 Western blotting 蛋白條帶圖；f～h：ETS-1 組與對照組 Atg5、Beclin1 和 LC3 蛋白的表達比較；*
3 討論
AD 是一種嚴重的大血管病變，臨床表現多樣，早期誤診率較高，夾層破裂是其主要死亡原因。由于 AD 的發病機制不清，導致 AD 的臨床預測及診治面臨著嚴峻的挑戰[5]。因此，研究 AD 的發病機制，為 AD 的防治提供新的靶點和理論基礎，具有十分重要的意義。
PKD1 基因是常染色體顯性遺傳疾病多囊腎病的關鍵致病基因，其編碼的蛋白產物 PC-1 是一種整合蛋白及糖基化蛋白，對維持正常細胞和組織結構起重要作用，廣泛參與細胞的收縮、增殖和凋亡過程[6]。許多研究表明 PKD1 突變引起 PC-1 的不正常表達導致腎臟及某些腎外組織如主動脈中膜出現廣泛的多囊病變。有研究[7]表明 PKD1 基因參與了 AD 發生的病理過程，但其具體機制不詳。近年越來越多的研究表明，主動脈平滑肌退化及細胞死亡或數量的減少與 AD 的形成密切相關，但平滑肌細胞死亡的機制目前尚不明確。研究發現自噬與細胞死亡高度相關[8-9]。自噬作為一種溶酶體降解途徑是細胞或組織生存、分化、發育及維持內環境穩定必不可少的一個因素，被認為是細胞對某些持續性內外刺激的一種非損傷性應答，其廣泛存在于真核細胞內。自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬 3 類。自噬體由雙層膜結構的囊泡包裹已經變性的蛋白質以及某些受損無功能的細胞器形成，在溶酶體存在的條件下與之結合形成自噬溶酶體。研究發現哺乳類動物自噬溶酶體膜上主要表達 Atg5、Beclin1 和 LC3，其中 LC3 分為 LC3Ⅰ和 LC3Ⅱ。LC3Ⅰ具有可溶性而 LC3Ⅱ特異表達于自噬溶酶體膜上，因此 LC3Ⅱ更常用于細胞自噬功能的檢測。自噬缺乏或功能障礙，變性蛋白不能被降解，在細胞內大量蓄積，從而對細胞產生毒性作用，引起細胞腫脹，最終導致細胞死亡。因此，自噬可清除細胞內有害代謝產物，對維持細胞的正常功能起著重要作用[10-11]。文獻[12]報道在某些退化的血管中，自噬被抑制，變性蛋白不能降解，大量活性氧化物及其它有害代謝產物不能及時清除，血管平滑肌細胞結構受損及適應力下降，最終引起細胞死亡。為探討 PKD1 對血管平滑肌細胞自噬的影響，我們采取人為干預血管平滑肌細胞中 PKD1 表達的方法觀察 PKD1 水平對自噬的影響。
shRNA，又稱小發卡 RNA 或短發卡 RNA，是一種人工合成的類似于發卡結構的小分子 RNA 片段，其通過 RNA 干擾沉默靶基因的表達。目前為使細胞穩定表達 shRNA，一般借助于質粒、細菌或病毒載體攜帶并轉染 shRNA。當這些小分子片段與 mRNA 中的同源序列互補結合后，會引起某些特定 mRNA 失去功能，也就是使基因“沉默”，即不能翻譯產生蛋白質。使用慢病毒作為載體攜帶 shRNA，不僅能在細胞傳代中穩定表達而不衰減，而且能夠維持 shRNA 結構穩定[13-14]。本研究根據 PKD1 基因的靶序列成功設計出了針對 PKD1 基因的 shRNA，成功構建了 shPKD1 慢病毒載體。將構建的 shPKD1 慢病毒載體轉染小鼠主動脈平滑肌細胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白 GFP 陽性率>95%，轉染效率高，轉染后的細胞形態正常，生長狀態良好。同時，通過 qPCR 檢測 PKD1 mRNA 水平發現與對照組相比 shPKD1 組 PKD1 mRNA 表達水平明顯降低。ETS 家族是由一類高度保守序列特異性 DNA 結合蛋白組成的轉錄因子，主要表達于內皮細胞等，在人體內目前共發現 28 個 ETS 基因，同時在小鼠體內發現 27 個 ETS 基因。ETS-1 作為其家族中的一員能與 DNA 結合形成單體結構。Puri 等[15]發現 PKD1 基因的啟動子區域是 ETS-1 轉錄因子的受體，本研究通過把 ETS-1 與載體共轉錄進靶細胞發現與對照組相比 PKD1 基因表達明顯上調；同時 Lantinga-van Leeuwen 等[16]也證實 ETS-1 能夠調控 PKD1 基因的表達，ETS-1 能夠作用于 PKD1 基因的啟動子區域，促進 PKD1 基因的表達。本實驗成功構建了 ETS-1 過表達慢病毒載體，將構建的 ETS-1 過表達慢病毒載體轉染小鼠主動脈平滑肌細胞，熒光顯微鏡下觀察 GFP 陽性率>95%，轉染效率高，轉染后的細胞形態正常，生長狀態良好。同時，通過 qPCR 檢測 ETS-1 和 PKD1 mRNA 水平發現與對照組相比 ETS-1 組 ETS-1 及 PKD1 mRNA 表達水平明顯升高。
本實驗成功構建了 PKD1 干擾及過表達的小鼠主動脈平滑肌細胞穩定細胞系，獲得了穩定的基因干預效果。在干擾 PKD1 表達后，血管平滑肌細胞自噬水平明顯受到抑制；而過表達 PKD1 則促進了血管平滑肌細胞自噬。上述結果提示，PKD1 基因參與了血管平滑肌細胞自噬過程。
基于我們的認識，本研究首次提出 PKD1 參與血管平滑肌細胞自噬過程，其具體機制有待進一步研究。本研究豐富了對 PKD1 的功能認識，同時也為更廣泛、深入地研究其在血管平滑肌細胞中的作用提供了理論依據。
綜上所述，PKD1 基因參與小鼠主動脈平滑肌細胞自噬過程，下調 PKD1 基因表達可導致血管平滑肌細胞自噬減弱，而過表達 PKD1 基因能夠促進小鼠主動脈平滑肌細胞自噬。
利益沖突：無。
作者貢獻：楊貴芳、柴湘平、彭文負責論文設計；周陽負責實施研究；楊貴芳、盛麗娟負責數據整理與分析及論文初稿撰寫；柴湘平負責論文審閱與修改。
