引用本文： 朱放, 溫臣, 施國丞, 張茜, 穆宏偉, 劉剛, 師博文, 燕怡辰, 祝忠群, 陳會文. 肺靜脈狹窄豬模型的建立. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2019, 26(10): 1008-1013. doi: 10.7507/1007-4848.201812074 復制
肺靜脈狹窄是完全性肺靜脈異位引流（TAPVC）手術后的常見并發癥，發生率約為 10%～20%，嚴重影響患兒術后的遠期生存率[1-5]。其特征是肺靜脈系統出現進行性和彌漫性狹窄，進而導致肺動脈高壓、右心衰竭和死亡。盡管臨床上采用介入和外科手術進行干預，預后依然很差[6-8]。
我們通過外科手術環縮肺靜脈，創建一種接近臨床病理的肺靜脈狹窄幼豬動物模型[9-10]，對其遠端肺靜脈進行病理形態學觀察，并與 TAPVC 手術后并發肺靜脈狹窄的患者手術標本進行對比，為臨床治療提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
主要儀器和試劑包括電刀（HEAL FORCE EB03）、呼吸機（Dr?ger Fabius）、監護儀（PHILIPS Agilent）、低壓吸引器（上海唯心 JE-DY-I）、超聲診斷儀（PHILIPS XMATRIX）、蘇木素染液（貝索生物 BA-4041）、醇溶性伊紅（國藥 7104460）、CD31（abcam ab28364）、α-SMA（博士德 BM0002）、Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit lgG（Life technologies A21207）、Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse lgG（Life technologies A21202）。
1.2 實驗動物
選用 6 周齡的健康實驗幼豬 10 頭，雄性，體重（9.0±0.7）kg，購自啟東市隆宇科技農業發展有限公司，生產許可證為 SCXK（蘇）2018-0004。動物的飼養及實驗操作在銀蛇醫療科技有限公司進行，實驗動物使用許可證為 SYXK（滬）2017-0001。將幼豬隨機分為 2 組：假手術組 5 頭，肺靜脈環縮組 5 頭。豬單籠飼養，自由進食和飲水。實驗經上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心倫理委員會批準后實施。
1.3 麻醉和術前準備
幼豬術前禁食 12 h。經臀部肌肉注射 3% 戊巴比妥鈉 30 mg/kg、氯胺酮 5 mg/kg、阿托品 0.5 mg 進行基礎麻醉。當麻醉起效后將幼豬固定于手術臺上，連接監護儀檢測心電圖和血氧飽和度。置入 3.0F 單腔氣管導管，插管成功后連接呼吸機，潮氣量 8～10 mL/kg，呼吸頻率控制在 12～16 次/min，使用 1%～2% 異氟烷、N2O 和 O2 維持全身麻醉。靜脈注射 0.1 mL/kg 羅庫溴銨。胸部區域剃毛后用安爾碘清潔手術區域。手術期間密切注意幼豬呼吸節律，保證輔助呼吸的通暢性。
1.4 手術過程
肺靜脈環縮部位見圖 1a 所示。在左側第 5 肋間隙切開皮膚，由肋間進入，鈍性分離皮下組織和肌肉、小心探查并分離胸膜。游離左上葉肺靜脈、左舌葉肺靜脈、左下葉肺靜脈。將 Gore-tex 管道剪成 3 mm 寬的長條，環繞肺靜脈，Gore-tex 長度為肺靜脈周長的 1.3 倍，用 5-0 Proplene 將 Gore-tex 管道固定（圖 1b）。假手術組進行上述過程，但不使用 Gore-Tex 環縮。術中注意減少出血，關閉胸腔前插入胸腔引流管，隨后逐層縫合。關閉切口后，停用異氟烷，待豬清醒以后，拔出氣管插管。將豬轉移到籠中，觀察生命體征。術中、術后給予頭孢呋辛鈉預防感染。術后 3 d 拔出胸腔引流管。第一次術后 1 周從右側第 4 肋間隙進行胸廓切開術，環縮右上葉肺靜脈。麻醉、開胸方式、游離右上肺靜脈、使用 Gore-Tex 環縮、關胸的步驟同前。
圖1
肺靜脈環縮手術示意圖
1.5 組織病理檢查
左側環縮術后 6 周收集病理標本。麻醉方法同前，正中胸骨切開，暴露心臟。結扎上、下腔靜脈，血管鉗夾閉肺動脈干，然后在左心耳切開一小口，使用 100 IU/kg 肝素生理鹽水經肺動脈灌注肺循環。當左心耳流出液變清時，將心臟和肺迅速取出，放置于冰床上解剖，取得環縮部位上游肺靜脈。為了避免環縮部位纖維化影響結果，故從距離環縮部位上游 1 cm 取材，浸泡于 10%福爾馬林固定，使用石蠟包埋，行蘇木素-伊紅染色（HE ）、免疫熒光染色。使用 ImageJ（NIH）測量熒光面積、內皮長度。
1.6 人肺靜脈狹窄標本
選取 2018 年于我院就診的 TAPVC 術后吻合口梗阻的患者共 3 例。患兒 1：TAPVC（心下型）術后 7 個月，患兒重癥肺炎入院，入院期間心臟超聲檢查發現肺靜脈吻合口流速 2.2 m/s，遂行肺靜脈狹窄糾治術，取術中廢棄梗阻組織。患兒 2：TAPVC（心上型）術后 8 年，心臟超聲發現肺靜脈吻合口流速 2.82 m/s，行肺靜脈狹窄糾治術，獲取術中廢棄梗阻組織。患兒 3：術后心臟超聲發現肺靜脈結構異常，2 個月后行 TAPVC（心上型）糾治術。術后 10 個月行心臟超聲發現肺靜脈狹窄，左側肺靜脈入口流速 1.63 m/s，血流頻譜呈連續性，遂行肺靜脈狹窄糾治術，吻合口切開，取牛心包補片擴大，獲得術中廢棄梗阻部位組織。梗阻部位組織使用 10%福爾馬林固定，進行 HE 染色和免疫熒光染色。患者廢棄標本的使用獲得上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心倫理委員會的批準。
1.7 統計學分析
采用 SPSS 20.0 統計軟件對實驗數據進行分析。計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，兩組數據間比較若方差齊使用t檢驗，方差不齊用t′檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 豬肺靜脈環縮手術結果
假手術組和環縮組手術后動物均存活，但環縮組出現明顯的肺靜脈狹窄的臨床表現：食量變小、運動減少、口鼻紫紺、呼吸困難。在收集標本前，對每頭實驗豬進行超聲和 CT 檢查。超聲檢查發現，環縮組左上、左下、右上、右下肺靜脈的流速較對照組均有增快。對照組的流速約為 0.86 m/s（圖 2a），而環縮組最高流速達到 2.00 m/s（圖 2b）。通過統計各靜脈的流速，環縮組與假手術組存在顯著差異（圖 2c）。解剖后標本顯示假手術組肺部顏色形態正常（圖 3a），實驗組則出現多個肺段甚至整個肺葉的淤血（圖 3b）。分離肺靜脈后，假手術組肺靜脈形態正常（圖 3c），環縮組肺靜脈管徑受限（圖 3d）。
圖2
兩組肺靜脈流速比較
a：假手術組肺靜脈流速；b：環縮組肺靜脈流速；c：假手術組與環縮組術后 6 周的肺靜脈流速差異有統計學意義
圖3
術后肺靜脈形態大體觀
a：假手術組肺組織顏色紅潤；b：環縮組肺組織出現典型肺淤血癥狀，累及多個肺段甚至肺葉；c：肺靜脈形態正常；d：肺靜脈管徑受限
2.2 豬肺靜脈 HE 及免疫熒光結果
HE 染色發現，假手術組肺靜脈形狀較規則，內膜結構正常，內彈性膜完整（圖 4a）。環縮組肺靜脈形狀不規則，內膜增生，內彈性膜斷裂（圖 4b）。免疫熒光染色發現，環縮組與假手術組相比，內皮細胞標志物 CD31（紅色）表達下降，間充質標志物 α-SMA（綠色）表達面積增大，但新生內膜的熒光強度較血管中膜低，且內皮細胞標記物 CD31（紅色）和間充質標記物 α-SMA（綠色）共定位，表現出肌成纖維細胞表型（圖 5）。
圖4
三組肺靜脈形狀比較 HE 染色（×200）
a：假手術組肺靜脈形狀規則，內膜結構正常，內彈性膜完整；b：環縮組肺靜脈形狀不規則，內膜增生向管腔內突出，內彈性膜斷裂；c：人標本組內膜增生，散亂排列著細長核細胞，細胞外大量基質
圖5
環縮組與假手術組相比，內皮細胞標記物 CD31（紅色）表達降低和間充質標記物 α-SMA（綠色）表達增加，但新生內膜的平均熒光強度較低 免疫熒光染色（×200）
2.3 人肺靜脈狹窄標本結果
豬肺靜脈狹窄模型的病理結果與患者組織的病理結果一致。患者組織標本 HE 染色顯示肺靜脈內膜增生，增生內膜中隨意排列著細長核細胞，細胞外基質豐富松散（圖 4c）。免疫熒光染色顯示內皮細胞標記物 CD31（紅色）和間充質標記物 α-SMA（綠色）共定位，表現出肌成纖維細胞表型（圖 5）。以上結果表明豬肺靜脈狹窄模型構建成功。
3 討論
幼豬肺靜脈環縮術后管徑減小，其上游血管的病理表現為內膜增生，并出現肌成纖維細胞。該病理結果與 TAPVC 術后肺靜脈狹窄患者相似，說明模型建立成功。國內尚缺乏肺靜脈狹窄的動物模型，此模型可以用于肺靜脈狹窄的研究。
動物實驗用豬與人類相似性較高，所以選用豬建立該模型。我們的動物模型具有以下優點：① Gore-tex 材料的套扎是非限制性的，隨著幼豬生長，肺靜脈逐漸受限產生狹窄，這一過程較為緩慢，與實際臨床中的狹窄類似；② 采用的是分期環縮，并且由肋間切口進胸，有效減少了手術的創傷，有利于提高幼豬的存活；③ 環縮處位于肺靜脈與左心房連接處，與臨床上 TAPVC 術后吻合口梗阻的部位大致相同。
幼豬肺靜脈環縮部位局部的炎癥可能在肺靜脈狹窄中造成干擾，我們在環縮部位上游 1 cm 以上取材來避免這種情況對結果的影響。另外我們在術中發現手術器械和 Gore-Tex 管道的接觸會使肺靜脈發生暫時性的痙攣，所以需要在血管恢復后再進行后續步驟。當麻醉蘇醒后，全身血流量增加，Gore-Tex 管道可能變成非限制性的，對幼豬心肺功能限制[9]。
該模型存在一定的局限性。首先，臨床上肺靜脈狹窄是自發產生的，而模型中的狹窄是人為造成的，所以該模型不能用于研究肺靜脈狹窄的起源，但是對狹窄上游血管的病理生理學研究依然具有重要意義。其次我們并沒有對肌成纖維細胞的來源以及其發生的機制做進一步闡述。國外有研究表明其與 TGF-β 介導的內皮間質轉化、酪氨酸激酶途徑、血管緊張素Ⅱ途徑有關[10-12]，并且受到生物力學因素和細胞外基質調控[13-15]。
綜上所述，本實驗通過分期雙側肺靜脈環縮建立幼豬肺靜脈狹窄模型。該方法創傷小，動物術后存活率高，動物表現與臨床表現相似，模型效果可靠，具有可重復性，可以極好地模擬肺靜脈狹窄的臨床和病理特點，滿足相關研究的需要。本模型的建立可以為肺靜脈狹窄相關分子機制、藥理和臨床轉化奠定良好的基礎。
利益沖突：無。
肺靜脈狹窄是完全性肺靜脈異位引流（TAPVC）手術后的常見并發癥，發生率約為 10%～20%，嚴重影響患兒術后的遠期生存率[1-5]。其特征是肺靜脈系統出現進行性和彌漫性狹窄，進而導致肺動脈高壓、右心衰竭和死亡。盡管臨床上采用介入和外科手術進行干預，預后依然很差[6-8]。
我們通過外科手術環縮肺靜脈，創建一種接近臨床病理的肺靜脈狹窄幼豬動物模型[9-10]，對其遠端肺靜脈進行病理形態學觀察，并與 TAPVC 手術后并發肺靜脈狹窄的患者手術標本進行對比，為臨床治療提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
主要儀器和試劑包括電刀（HEAL FORCE EB03）、呼吸機（Dr?ger Fabius）、監護儀（PHILIPS Agilent）、低壓吸引器（上海唯心 JE-DY-I）、超聲診斷儀（PHILIPS XMATRIX）、蘇木素染液（貝索生物 BA-4041）、醇溶性伊紅（國藥 7104460）、CD31（abcam ab28364）、α-SMA（博士德 BM0002）、Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit lgG（Life technologies A21207）、Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse lgG（Life technologies A21202）。
1.2 實驗動物
選用 6 周齡的健康實驗幼豬 10 頭，雄性，體重（9.0±0.7）kg，購自啟東市隆宇科技農業發展有限公司，生產許可證為 SCXK（蘇）2018-0004。動物的飼養及實驗操作在銀蛇醫療科技有限公司進行，實驗動物使用許可證為 SYXK（滬）2017-0001。將幼豬隨機分為 2 組：假手術組 5 頭，肺靜脈環縮組 5 頭。豬單籠飼養，自由進食和飲水。實驗經上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心倫理委員會批準后實施。
1.3 麻醉和術前準備
幼豬術前禁食 12 h。經臀部肌肉注射 3% 戊巴比妥鈉 30 mg/kg、氯胺酮 5 mg/kg、阿托品 0.5 mg 進行基礎麻醉。當麻醉起效后將幼豬固定于手術臺上，連接監護儀檢測心電圖和血氧飽和度。置入 3.0F 單腔氣管導管，插管成功后連接呼吸機，潮氣量 8～10 mL/kg，呼吸頻率控制在 12～16 次/min，使用 1%～2% 異氟烷、N2O 和 O2 維持全身麻醉。靜脈注射 0.1 mL/kg 羅庫溴銨。胸部區域剃毛后用安爾碘清潔手術區域。手術期間密切注意幼豬呼吸節律，保證輔助呼吸的通暢性。
1.4 手術過程
肺靜脈環縮部位見圖 1a 所示。在左側第 5 肋間隙切開皮膚，由肋間進入，鈍性分離皮下組織和肌肉、小心探查并分離胸膜。游離左上葉肺靜脈、左舌葉肺靜脈、左下葉肺靜脈。將 Gore-tex 管道剪成 3 mm 寬的長條，環繞肺靜脈，Gore-tex 長度為肺靜脈周長的 1.3 倍，用 5-0 Proplene 將 Gore-tex 管道固定（圖 1b）。假手術組進行上述過程，但不使用 Gore-Tex 環縮。術中注意減少出血，關閉胸腔前插入胸腔引流管，隨后逐層縫合。關閉切口后，停用異氟烷，待豬清醒以后，拔出氣管插管。將豬轉移到籠中，觀察生命體征。術中、術后給予頭孢呋辛鈉預防感染。術后 3 d 拔出胸腔引流管。第一次術后 1 周從右側第 4 肋間隙進行胸廓切開術，環縮右上葉肺靜脈。麻醉、開胸方式、游離右上肺靜脈、使用 Gore-Tex 環縮、關胸的步驟同前。
圖1
肺靜脈環縮手術示意圖
1.5 組織病理檢查
左側環縮術后 6 周收集病理標本。麻醉方法同前，正中胸骨切開，暴露心臟。結扎上、下腔靜脈，血管鉗夾閉肺動脈干，然后在左心耳切開一小口，使用 100 IU/kg 肝素生理鹽水經肺動脈灌注肺循環。當左心耳流出液變清時，將心臟和肺迅速取出，放置于冰床上解剖，取得環縮部位上游肺靜脈。為了避免環縮部位纖維化影響結果，故從距離環縮部位上游 1 cm 取材，浸泡于 10%福爾馬林固定，使用石蠟包埋，行蘇木素-伊紅染色（HE ）、免疫熒光染色。使用 ImageJ（NIH）測量熒光面積、內皮長度。
1.6 人肺靜脈狹窄標本
選取 2018 年于我院就診的 TAPVC 術后吻合口梗阻的患者共 3 例。患兒 1：TAPVC（心下型）術后 7 個月，患兒重癥肺炎入院，入院期間心臟超聲檢查發現肺靜脈吻合口流速 2.2 m/s，遂行肺靜脈狹窄糾治術，取術中廢棄梗阻組織。患兒 2：TAPVC（心上型）術后 8 年，心臟超聲發現肺靜脈吻合口流速 2.82 m/s，行肺靜脈狹窄糾治術，獲取術中廢棄梗阻組織。患兒 3：術后心臟超聲發現肺靜脈結構異常，2 個月后行 TAPVC（心上型）糾治術。術后 10 個月行心臟超聲發現肺靜脈狹窄，左側肺靜脈入口流速 1.63 m/s，血流頻譜呈連續性，遂行肺靜脈狹窄糾治術，吻合口切開，取牛心包補片擴大，獲得術中廢棄梗阻部位組織。梗阻部位組織使用 10%福爾馬林固定，進行 HE 染色和免疫熒光染色。患者廢棄標本的使用獲得上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心倫理委員會的批準。
1.7 統計學分析
采用 SPSS 20.0 統計軟件對實驗數據進行分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組數據間比較若方差齊使用t檢驗，方差不齊用t′檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 豬肺靜脈環縮手術結果
假手術組和環縮組手術后動物均存活，但環縮組出現明顯的肺靜脈狹窄的臨床表現：食量變小、運動減少、口鼻紫紺、呼吸困難。在收集標本前，對每頭實驗豬進行超聲和 CT 檢查。超聲檢查發現，環縮組左上、左下、右上、右下肺靜脈的流速較對照組均有增快。對照組的流速約為 0.86 m/s（圖 2a），而環縮組最高流速達到 2.00 m/s（圖 2b）。通過統計各靜脈的流速，環縮組與假手術組存在顯著差異（圖 2c）。解剖后標本顯示假手術組肺部顏色形態正常（圖 3a），實驗組則出現多個肺段甚至整個肺葉的淤血（圖 3b）。分離肺靜脈后，假手術組肺靜脈形態正常（圖 3c），環縮組肺靜脈管徑受限（圖 3d）。
圖2
兩組肺靜脈流速比較
a：假手術組肺靜脈流速；b：環縮組肺靜脈流速；c：假手術組與環縮組術后 6 周的肺靜脈流速差異有統計學意義
圖3
術后肺靜脈形態大體觀
a：假手術組肺組織顏色紅潤；b：環縮組肺組織出現典型肺淤血癥狀，累及多個肺段甚至肺葉；c：肺靜脈形態正常；d：肺靜脈管徑受限
2.2 豬肺靜脈 HE 及免疫熒光結果
HE 染色發現，假手術組肺靜脈形狀較規則，內膜結構正常，內彈性膜完整（圖 4a）。環縮組肺靜脈形狀不規則，內膜增生，內彈性膜斷裂（圖 4b）。免疫熒光染色發現，環縮組與假手術組相比，內皮細胞標志物 CD31（紅色）表達下降，間充質標志物 α-SMA（綠色）表達面積增大，但新生內膜的熒光強度較血管中膜低，且內皮細胞標記物 CD31（紅色）和間充質標記物 α-SMA（綠色）共定位，表現出肌成纖維細胞表型（圖 5）。
圖4
三組肺靜脈形狀比較 HE 染色（×200）
a：假手術組肺靜脈形狀規則，內膜結構正常，內彈性膜完整；b：環縮組肺靜脈形狀不規則，內膜增生向管腔內突出，內彈性膜斷裂；c：人標本組內膜增生，散亂排列著細長核細胞，細胞外大量基質
圖5
環縮組與假手術組相比，內皮細胞標記物 CD31（紅色）表達降低和間充質標記物 α-SMA（綠色）表達增加，但新生內膜的平均熒光強度較低 免疫熒光染色（×200）
2.3 人肺靜脈狹窄標本結果
豬肺靜脈狹窄模型的病理結果與患者組織的病理結果一致。患者組織標本 HE 染色顯示肺靜脈內膜增生，增生內膜中隨意排列著細長核細胞，細胞外基質豐富松散（圖 4c）。免疫熒光染色顯示內皮細胞標記物 CD31（紅色）和間充質標記物 α-SMA（綠色）共定位，表現出肌成纖維細胞表型（圖 5）。以上結果表明豬肺靜脈狹窄模型構建成功。
3 討論
幼豬肺靜脈環縮術后管徑減小，其上游血管的病理表現為內膜增生，并出現肌成纖維細胞。該病理結果與 TAPVC 術后肺靜脈狹窄患者相似，說明模型建立成功。國內尚缺乏肺靜脈狹窄的動物模型，此模型可以用于肺靜脈狹窄的研究。
動物實驗用豬與人類相似性較高，所以選用豬建立該模型。我們的動物模型具有以下優點：① Gore-tex 材料的套扎是非限制性的，隨著幼豬生長，肺靜脈逐漸受限產生狹窄，這一過程較為緩慢，與實際臨床中的狹窄類似；② 采用的是分期環縮，并且由肋間切口進胸，有效減少了手術的創傷，有利于提高幼豬的存活；③ 環縮處位于肺靜脈與左心房連接處，與臨床上 TAPVC 術后吻合口梗阻的部位大致相同。
幼豬肺靜脈環縮部位局部的炎癥可能在肺靜脈狹窄中造成干擾，我們在環縮部位上游 1 cm 以上取材來避免這種情況對結果的影響。另外我們在術中發現手術器械和 Gore-Tex 管道的接觸會使肺靜脈發生暫時性的痙攣，所以需要在血管恢復后再進行后續步驟。當麻醉蘇醒后，全身血流量增加，Gore-Tex 管道可能變成非限制性的，對幼豬心肺功能限制[9]。
該模型存在一定的局限性。首先，臨床上肺靜脈狹窄是自發產生的，而模型中的狹窄是人為造成的，所以該模型不能用于研究肺靜脈狹窄的起源，但是對狹窄上游血管的病理生理學研究依然具有重要意義。其次我們并沒有對肌成纖維細胞的來源以及其發生的機制做進一步闡述。國外有研究表明其與 TGF-β 介導的內皮間質轉化、酪氨酸激酶途徑、血管緊張素Ⅱ途徑有關[10-12]，并且受到生物力學因素和細胞外基質調控[13-15]。
綜上所述，本實驗通過分期雙側肺靜脈環縮建立幼豬肺靜脈狹窄模型。該方法創傷小，動物術后存活率高，動物表現與臨床表現相似，模型效果可靠，具有可重復性，可以極好地模擬肺靜脈狹窄的臨床和病理特點，滿足相關研究的需要。本模型的建立可以為肺靜脈狹窄相關分子機制、藥理和臨床轉化奠定良好的基礎。
利益沖突：無。
