引用本文： 程弦, 白樹堂. CYP2C9 及 APOE 基因多態性與華法林穩態劑量和模型預測劑量的相關性研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2019, 26(6): 543-547. doi: 10.7507/1007-4848.201810012 復制
臨床上，華法林可預防血栓的形成及發生，其口服需要依據國際標準化比值（INR）[1-2]。有研究表明，華法林使用劑量與個體間細胞色素 P450（cytochrome P450，CYP450）2C9（CYP2C9）和載脂蛋白（apolipoprotein E，APOE）基因多態性有關，即使在 INR 限值內口服，仍可能發生相關并發癥[3-5]。目前，心臟瓣膜置換術后臨床上常采用華法林進行抗凝治療。本文以 368 例心臟瓣膜置換術患者作為研究對象，探討中國海南地區人群 CYP2C9 和 APOE 對華法林穩態劑量的影響，現報道如下。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取我院心胸外二科 2016 年 8 月至 2018 年 7 月收治的 368 例行心臟瓣膜置換術患者。入選標準：所有研究對象均符合歐洲心臟病學會（ESC）及我國以往超聲診斷心力衰竭標準對臨床慢性心力衰竭的診斷；男女不限，戶籍為海南省的 18 周歲以上患者；患者與患者間無血緣關系及異族通婚史；肝腎功能、血小板計數正常；因風濕性心臟病進行了人工心臟機械瓣膜置換術；飲食均衡穩定；已達到華法林穩態劑量。術后采用口服華法林抗凝治療；INR=2～3；所有患者及其家屬簽署知情同意。排除標準：長期抽煙或飲酒；合并腫瘤；卒中史；合并高血壓、糖尿病、心力衰竭、心肌病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、甲狀腺功能亢進癥等疾病；同時服用阿司匹林、胺碘酮、甲狀腺素、增加 INR 藥物、降低 INR 藥物、他汀類藥物；同時服用中草藥；術前或術后有嚴重出血或栓塞史；孕婦或哺乳期患者。華法林穩態劑量即：采用華法林治療 7 d 以上時，至少連續 2 次（間隔至少 1～2 周）的 INR 處于 2～3 范圍。華法林的平均日劑量值=周劑量/7 d。本研究已獲得我院倫理委員會的批準［2016-（倫審）-84］。
1.2 試劑與儀器
試劑包括：2 × Taq Master Mixture（北京全式金生物科技有限公司，中國），DNA 分子質量 Marker（大連 TaKaRa 生物科技有限公司，中國），Tiagen 膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司，德國），Quick Start DNA 測序試劑盒（ABI 公司，美國），全血 DNA 提取試劑盒（Qiagen 生物科技有限公司，德國），去磷酸酶 CIAP（生工生物公司，中國）和核酸外切酶 ExoⅠ（Promega 公司，美國）。PCR 擴增引物均在上海生工生物公司合成。儀器包括：電泳儀及水平電泳槽（六一儀器公司，中國），UV200 紫外分光光度儀（島津公司，日本），普通 PCR 儀（Eppendorf 公司，美國），凝膠成像系統（Thermo Fisher 生物科技有限公司，美國）和 CEQTM 8000 測序儀（Beckman Coulter 公司，美國）。
1.3 全血樣本收集
所有患者均采靜脈血 3 ml，離心、儲存、備用。同時記錄患者的一般臨床資料，如 INR 值、計算機模型預測劑量、華法林穩態劑量等。
1.4 DNA 提取
首先，對每個受試者采取外周靜脈血 2.0 ml 于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，置于–80℃ 冰箱內保存備用。其次，采用 Qiagen 基因組 DNA 提取試劑盒，提取患者血樣 DNA，冰箱保存、備用。單核苷酸多態性（SNP）位點選擇：CYP2C9*3 （等位基因突變位點：1075A>C，基因在染色體位置：10q24.1，SNP 檢索序列號：rs1057910）；APOE 基因位于第 19 號染色體長臂 13 區 2 帶（19p13.2），共有 3 種主要的亞型 E2、E3、E4，其相應的編碼基因分別為 e2、e3、e4，根據患者基因型將其分為三組，依次是 E2 組（E2/E2，E2/E3），E3 組（E3/E3）和 E4 組（E4/E4，E3/E4）。
1.5 PCR 擴增目的片段
采用 20 μl PCR 反應體系，主要組分如下：2×Taq Master Mixture（其中含有 2.5 mM dNTP，PCR 反應緩沖液以及高保真的 DNA 聚合酶）10 μl，加入的基因組 DNA 含量為 50～100 ng，并加入終濃度為 0.2 μmol/L 上下游引物，最后用 ddH2O 將反應體系補加至 20 μl，混勻之后放入 PCR 儀器進行反應。PCR 擴增反應的條件設置如下：預變性：94℃ 2 min；擴增（35 個循環）：94℃ 變性 25 s，58℃ 退火 30 s，70℃ 延伸 30 s；再延伸：70℃ 延伸 5 min。通過以上 PCR 擴增反應，將從基因組 DNA 中特異性擴增 257 bp 包含有 APOE 基因第 112、158 位密碼子的 DNA 片段，和 383 bp 包含有 CYP2C9 基因第 7 外顯子的 DNA 片段，并對擴增產物用 1%～2% 瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定，PCR 擴增引物見表 1。
表1
相關引物信息
1.6 DNA 產物的測序分析
PCR 擴增完成鑒定正確后，從中取出 5 μl PCR 產物進行核酸消化和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）去磷酸化處理，采用 10 μl 反應體系，加入 4 U 堿性磷酸酶 CIAP，1.5 U 核酸外切酶 ExoⅠ混合均勻，37℃ 孵育 30 min 進行反應，之后采用 85℃ 加熱 10 min 對酶蛋白進行失活處理；從 10 μl 反應體系中，回收去磷酸化的核苷產物，利用美國 Beckman Coulter 公司的 CEQ8000 自動序列測序儀對 PCR 產物進行核苷酸序列的測定，測序結果可經 lasergen 7 和 Chromas 軟件進行查看和分析。
1.7 統計學分析
計量資料采用均數±標準差（
）表示，而計數資料則用例數和百分比表示，所有數據用 SPSS21.0 統計軟件進行統計學分析。計量資料在進行分析前，先行正態性分布的檢驗，如若數據不服從正態分布，則對數據進行適當的變化，比如自然對數轉換，對轉換后的資料再進行正態性檢驗，如若仍不符合正態分布，則對該資料采用非參數的分析檢驗。SNP 的基因型以及等位基因的頻率直接采用計數法進行統計分析，資料比較采用 χ2 檢驗，以確定其基因分布是否符合 Hardy-Weinberg 遺傳定律。以華法林穩態劑量為因變量，對自變量進行逐步多元回歸，嘗試建立不同個體間關于華法林穩態劑量預測模型。
2 結果
2.1 患者基礎資料分析
本研究對象的基礎資料見表 2，通過對研究人群中 CYP2C9 基因和 APOE 基因的基因型頻率進行 χ2 檢驗，發現其分布符合 Hardy-Weillberg 遺傳平衡定律。其中，在本研究 368 例海南患者中，其華法林穩態劑量范圍在 0. 86～9. 47 mg/d 之間，平均劑量則為（3.45±0.87）mg/d。
表2
患者一般資料［
/例（%）］
2.2 不同基因型患者華法林穩態劑量比較
在 368 例海南患者中，CYP2C9*1*1 基因型患者 301 例，華法林平均穩態劑量為（3.47±0.94）mg/d；CYP2C9*1*3 基因型患者 67 例，華法林平均穩態劑量為（2.12±0.78）mg/d，顯著低于 CYP2C9*1*1 基因型患者，差異有統計學意義（P<0.05）；APOE E2 基因型患者 93 例，華法林平均穩態劑量為（3.21±0.83）mg/d；APOE E3 基因型患者 221 例，華法林平均穩態劑量為（4.04±1.25）mg/d，相比于 APOE E2 基因型患者，顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）；APOE E4 基因型患者 54 例，華法林平均穩態劑量為（4.59±1.43）mg/d，相比于 APOE E2 基因型患者，其華法林穩態劑量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）；見表 3。
表3
不同基因型患者的華法林模型預測劑量及穩態劑量（例/
）
2.3 華法林穩態劑量的影響因素分析
以患者的性別、年齡、身高、體重、有無吸煙史、有無飲酒史、CYP2C9 和 APOE 基因型為自變量，以華法林穩態劑量為因變量 Y，進行多元線性逐步回歸分析，結果顯示華法林劑量與患者的年齡、體重及 CYP2C9 與 APOE 基因型有關，回歸方程為：ln（Y）=1.430?0.047×年齡+0.213×體重－0.348×CYP2C9（*1*3）+0.816×APOE（E3）+0.943×APOE（E4），患者的體重、APOE 多態性與華法林穩態劑量正相關，而患者的年齡以及 CYP2C9*1*3 基因型則與華法林穩態劑量負相關；方程的調整 R2 為 0.572，表明該模型可解釋約 57.2% 接受華法林治療的心房顫動（房顫）患者中劑量的個體化差異；見表 4。
表4
患者華法林穩態劑量的影響因素分析
3 討論
臨床常用華法林抗凝治療瓣膜病合并房顫、瓣膜置換術后房顫等[6]。但其劑量在不同種族間及個體間存在較大差異[7-8]。另外，遺傳因素可解釋約 40%～80% 的個體劑量差異[9]。
CYP2C9 是 CYP2 家族中的一種同功酶，其基因多態性會影響代謝酶活性[10]。Higashi 等[11]發現華法林治療攜帶 CYP2C9*3 等位基因型的患者，其更易發生出血并發癥。APOE 基因是血漿的中的載脂蛋白之一，其通過維生素 K 的循環途徑來影響華法林抗凝劑量[12]。Kohnke 等[13]發現華法林治療攜帶一個 e4 等位基因的患者所需的治療劑量為 34.3 mg/d；而治療不攜帶 e4 等位基因者所需治療劑量則略低。Kimmel 等[14]發現華法林治療攜有 e4 等位基因患者所需劑量增加了 28.6%。黃盛文等[15]發現 APOE 基因型患者華法林劑量差異無統計學意義（P>0.05）。
本研究中 CYP2C9*1*1 基因型患者 301 例，占比 81.8%，*1*3 型患者 67 例，占比 18.2%，不同 CYP2C9 基因型患者，華法林穩態劑量差異有統計學意義（P<0.05）；APOE E2 基因型患者 93 例，占比 25.3%，E3 基因型患者 221 例，占比 60.1%，E4 基因型患者 54 例，占比 14.7%，不同 APOE 基因型患者，華法林穩態劑量差異有統計學意義（P<0.05），表明在海南地區人群中，存在 CYP2C9 和 APOE 基因多態性。多因素逐步回歸分析發現 CYP2C9*1*3 基因型患者相比 CYP2C9*1*1 基因型患者華法林需求量較低；而 APOE E3、E4 基因型患者對華法林的需求量相比于 AOPE E2 基因型患者較高。
本研究發現，華法林劑量與患者的年齡、身高、體重及不同的基因型均有關，我們采用的預測模型中納入了遺傳因素以及臨床因素，能夠一定程度上估計華法林的準確用量。本研究回歸分析表明，該預測模型的調整 R2為 0.572。表明該模型可預測海南地區人群華法林劑量，減少華法林治療過程中過量的風險，并可使華法林達到穩定治療的時間縮短。
綜上所述，在我國海南地區人群不同基因型患者華法林穩態劑量存在一定差異。通過 CYP2C9、APOE 基因以及患者年齡、體重構建華法林穩態劑量預測模型，可以一定程度上解釋不同患者之間華法林用藥的差異。
臨床上，華法林可預防血栓的形成及發生，其口服需要依據國際標準化比值（INR）[1-2]。有研究表明，華法林使用劑量與個體間細胞色素 P450（cytochrome P450，CYP450）2C9（CYP2C9）和載脂蛋白（apolipoprotein E，APOE）基因多態性有關，即使在 INR 限值內口服，仍可能發生相關并發癥[3-5]。目前，心臟瓣膜置換術后臨床上常采用華法林進行抗凝治療。本文以 368 例心臟瓣膜置換術患者作為研究對象，探討中國海南地區人群 CYP2C9 和 APOE 對華法林穩態劑量的影響，現報道如下。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取我院心胸外二科 2016 年 8 月至 2018 年 7 月收治的 368 例行心臟瓣膜置換術患者。入選標準：所有研究對象均符合歐洲心臟病學會（ESC）及我國以往超聲診斷心力衰竭標準對臨床慢性心力衰竭的診斷；男女不限，戶籍為海南省的 18 周歲以上患者；患者與患者間無血緣關系及異族通婚史；肝腎功能、血小板計數正常；因風濕性心臟病進行了人工心臟機械瓣膜置換術；飲食均衡穩定；已達到華法林穩態劑量。術后采用口服華法林抗凝治療；INR=2～3；所有患者及其家屬簽署知情同意。排除標準：長期抽煙或飲酒；合并腫瘤；卒中史；合并高血壓、糖尿病、心力衰竭、心肌病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、甲狀腺功能亢進癥等疾病；同時服用阿司匹林、胺碘酮、甲狀腺素、增加 INR 藥物、降低 INR 藥物、他汀類藥物；同時服用中草藥；術前或術后有嚴重出血或栓塞史；孕婦或哺乳期患者。華法林穩態劑量即：采用華法林治療 7 d 以上時，至少連續 2 次（間隔至少 1～2 周）的 INR 處于 2～3 范圍。華法林的平均日劑量值=周劑量/7 d。本研究已獲得我院倫理委員會的批準［2016-（倫審）-84］。
1.2 試劑與儀器
試劑包括：2 × Taq Master Mixture（北京全式金生物科技有限公司，中國），DNA 分子質量 Marker（大連 TaKaRa 生物科技有限公司，中國），Tiagen 膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司，德國），Quick Start DNA 測序試劑盒（ABI 公司，美國），全血 DNA 提取試劑盒（Qiagen 生物科技有限公司，德國），去磷酸酶 CIAP（生工生物公司，中國）和核酸外切酶 ExoⅠ（Promega 公司，美國）。PCR 擴增引物均在上海生工生物公司合成。儀器包括：電泳儀及水平電泳槽（六一儀器公司，中國），UV200 紫外分光光度儀（島津公司，日本），普通 PCR 儀（Eppendorf 公司，美國），凝膠成像系統（Thermo Fisher 生物科技有限公司，美國）和 CEQTM 8000 測序儀（Beckman Coulter 公司，美國）。
1.3 全血樣本收集
所有患者均采靜脈血 3 ml，離心、儲存、備用。同時記錄患者的一般臨床資料，如 INR 值、計算機模型預測劑量、華法林穩態劑量等。
1.4 DNA 提取
首先，對每個受試者采取外周靜脈血 2.0 ml 于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，置于–80℃ 冰箱內保存備用。其次，采用 Qiagen 基因組 DNA 提取試劑盒，提取患者血樣 DNA，冰箱保存、備用。單核苷酸多態性（SNP）位點選擇：CYP2C9*3 （等位基因突變位點：1075A>C，基因在染色體位置：10q24.1，SNP 檢索序列號：rs1057910）；APOE 基因位于第 19 號染色體長臂 13 區 2 帶（19p13.2），共有 3 種主要的亞型 E2、E3、E4，其相應的編碼基因分別為 e2、e3、e4，根據患者基因型將其分為三組，依次是 E2 組（E2/E2，E2/E3），E3 組（E3/E3）和 E4 組（E4/E4，E3/E4）。
1.5 PCR 擴增目的片段
采用 20 μl PCR 反應體系，主要組分如下：2×Taq Master Mixture（其中含有 2.5 mM dNTP，PCR 反應緩沖液以及高保真的 DNA 聚合酶）10 μl，加入的基因組 DNA 含量為 50～100 ng，并加入終濃度為 0.2 μmol/L 上下游引物，最后用 ddH2O 將反應體系補加至 20 μl，混勻之后放入 PCR 儀器進行反應。PCR 擴增反應的條件設置如下：預變性：94℃ 2 min；擴增（35 個循環）：94℃ 變性 25 s，58℃ 退火 30 s，70℃ 延伸 30 s；再延伸：70℃ 延伸 5 min。通過以上 PCR 擴增反應，將從基因組 DNA 中特異性擴增 257 bp 包含有 APOE 基因第 112、158 位密碼子的 DNA 片段，和 383 bp 包含有 CYP2C9 基因第 7 外顯子的 DNA 片段，并對擴增產物用 1%～2% 瓊脂糖凝膠電泳進行初步鑒定，PCR 擴增引物見表 1。
表1
相關引物信息
1.6 DNA 產物的測序分析
PCR 擴增完成鑒定正確后，從中取出 5 μl PCR 產物進行核酸消化和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）去磷酸化處理，采用 10 μl 反應體系，加入 4 U 堿性磷酸酶 CIAP，1.5 U 核酸外切酶 ExoⅠ混合均勻，37℃ 孵育 30 min 進行反應，之后采用 85℃ 加熱 10 min 對酶蛋白進行失活處理；從 10 μl 反應體系中，回收去磷酸化的核苷產物，利用美國 Beckman Coulter 公司的 CEQ8000 自動序列測序儀對 PCR 產物進行核苷酸序列的測定，測序結果可經 lasergen 7 和 Chromas 軟件進行查看和分析。
1.7 統計學分析
計量資料采用均數±標準差（）表示，而計數資料則用例數和百分比表示，所有數據用 SPSS21.0 統計軟件進行統計學分析。計量資料在進行分析前，先行正態性分布的檢驗，如若數據不服從正態分布，則對數據進行適當的變化，比如自然對數轉換，對轉換后的資料再進行正態性檢驗，如若仍不符合正態分布，則對該資料采用非參數的分析檢驗。SNP 的基因型以及等位基因的頻率直接采用計數法進行統計分析，資料比較采用 χ2 檢驗，以確定其基因分布是否符合 Hardy-Weinberg 遺傳定律。以華法林穩態劑量為因變量，對自變量進行逐步多元回歸，嘗試建立不同個體間關于華法林穩態劑量預測模型。
2 結果
2.1 患者基礎資料分析
本研究對象的基礎資料見表 2，通過對研究人群中 CYP2C9 基因和 APOE 基因的基因型頻率進行 χ2 檢驗，發現其分布符合 Hardy-Weillberg 遺傳平衡定律。其中，在本研究 368 例海南患者中，其華法林穩態劑量范圍在 0. 86～9. 47 mg/d 之間，平均劑量則為（3.45±0.87）mg/d。
表2
患者一般資料［/例（%）］
2.2 不同基因型患者華法林穩態劑量比較
在 368 例海南患者中，CYP2C9*1*1 基因型患者 301 例，華法林平均穩態劑量為（3.47±0.94）mg/d；CYP2C9*1*3 基因型患者 67 例，華法林平均穩態劑量為（2.12±0.78）mg/d，顯著低于 CYP2C9*1*1 基因型患者，差異有統計學意義（P<0.05）；APOE E2 基因型患者 93 例，華法林平均穩態劑量為（3.21±0.83）mg/d；APOE E3 基因型患者 221 例，華法林平均穩態劑量為（4.04±1.25）mg/d，相比于 APOE E2 基因型患者，顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）；APOE E4 基因型患者 54 例，華法林平均穩態劑量為（4.59±1.43）mg/d，相比于 APOE E2 基因型患者，其華法林穩態劑量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）；見表 3。
表3
不同基因型患者的華法林模型預測劑量及穩態劑量（例/）
2.3 華法林穩態劑量的影響因素分析
以患者的性別、年齡、身高、體重、有無吸煙史、有無飲酒史、CYP2C9 和 APOE 基因型為自變量，以華法林穩態劑量為因變量 Y，進行多元線性逐步回歸分析，結果顯示華法林劑量與患者的年齡、體重及 CYP2C9 與 APOE 基因型有關，回歸方程為：ln（Y）=1.430?0.047×年齡+0.213×體重－0.348×CYP2C9（*1*3）+0.816×APOE（E3）+0.943×APOE（E4），患者的體重、APOE 多態性與華法林穩態劑量正相關，而患者的年齡以及 CYP2C9*1*3 基因型則與華法林穩態劑量負相關；方程的調整 R2 為 0.572，表明該模型可解釋約 57.2% 接受華法林治療的心房顫動（房顫）患者中劑量的個體化差異；見表 4。
表4
患者華法林穩態劑量的影響因素分析
3 討論
臨床常用華法林抗凝治療瓣膜病合并房顫、瓣膜置換術后房顫等[6]。但其劑量在不同種族間及個體間存在較大差異[7-8]。另外，遺傳因素可解釋約 40%～80% 的個體劑量差異[9]。
CYP2C9 是 CYP2 家族中的一種同功酶，其基因多態性會影響代謝酶活性[10]。Higashi 等[11]發現華法林治療攜帶 CYP2C9*3 等位基因型的患者，其更易發生出血并發癥。APOE 基因是血漿的中的載脂蛋白之一，其通過維生素 K 的循環途徑來影響華法林抗凝劑量[12]。Kohnke 等[13]發現華法林治療攜帶一個 e4 等位基因的患者所需的治療劑量為 34.3 mg/d；而治療不攜帶 e4 等位基因者所需治療劑量則略低。Kimmel 等[14]發現華法林治療攜有 e4 等位基因患者所需劑量增加了 28.6%。黃盛文等[15]發現 APOE 基因型患者華法林劑量差異無統計學意義（P>0.05）。
本研究中 CYP2C9*1*1 基因型患者 301 例，占比 81.8%，*1*3 型患者 67 例，占比 18.2%，不同 CYP2C9 基因型患者，華法林穩態劑量差異有統計學意義（P<0.05）；APOE E2 基因型患者 93 例，占比 25.3%，E3 基因型患者 221 例，占比 60.1%，E4 基因型患者 54 例，占比 14.7%，不同 APOE 基因型患者，華法林穩態劑量差異有統計學意義（P<0.05），表明在海南地區人群中，存在 CYP2C9 和 APOE 基因多態性。多因素逐步回歸分析發現 CYP2C9*1*3 基因型患者相比 CYP2C9*1*1 基因型患者華法林需求量較低；而 APOE E3、E4 基因型患者對華法林的需求量相比于 AOPE E2 基因型患者較高。
本研究發現，華法林劑量與患者的年齡、身高、體重及不同的基因型均有關，我們采用的預測模型中納入了遺傳因素以及臨床因素，能夠一定程度上估計華法林的準確用量。本研究回歸分析表明，該預測模型的調整 R2為 0.572。表明該模型可預測海南地區人群華法林劑量，減少華法林治療過程中過量的風險，并可使華法林達到穩定治療的時間縮短。
綜上所述，在我國海南地區人群不同基因型患者華法林穩態劑量存在一定差異。通過 CYP2C9、APOE 基因以及患者年齡、體重構建華法林穩態劑量預測模型，可以一定程度上解釋不同患者之間華法林用藥的差異。
