引用本文： 畢紅親, 李妙玲, 周偉, 李光, 董亞輝, 黃濤, 于風旭. 竇性心律與心房顫動患者心房成纖維細胞大電導鈣激活鉀通道表達差異研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2017, 24(12): 937-942. doi: 10.7507/1007-4848.201707042 復制
心房顫動（atrial fibrillation，AF）是臨床最為常見的心律失常，住院率和死亡率較高[1]。研究發現心肌纖維化導致的結構重構是永久性 AF 發生和持續的底物[2]，同時也是 AF 發生電重構和收縮重構的底物[3-6]，臨床也發現心房纖維化是 AF 發生結構重構的重要特點[7]。
大電導鈣激活鉀通道（BKCa）廣泛分布在各種組織細胞內，參與多種細胞生理功能的調節。在血管中分布密度較大，被證實該類通道結構變化及功能狀態對血管平滑肌細胞的舒張和收縮起到重要作用，與高血壓疾病的發生發展密切相關[8]。2006 年 Wang 等[9]首次報道人心肌來源成纖維細胞上存在功能性的 BKCa，但其確切的生理功能并不知曉。2013 年 Sheng 等[10]首次在人心房成纖維細胞上發現存在 BKCa 通道。Cruse 等[11]研究發現鈣激活鉀通道與纖維化的形成密切相關。
因此本研究擬對照分析竇性心律（sinus rhythm，SR）與 AF 患者心房成纖維細胞 BKCa 通道表達差異，探索心肌纖維化產生的機制，為治療和逆轉 AF 結構重構提供新的治療策略。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
選擇西南醫科大學附屬醫院心胸外科 2015 年 6 月至 2016 年 12 月收治確診為風濕性心臟病且行體外循環瓣膜置換術的 10 例患者，均未服用抗心律失常藥物。本試驗經西南醫科大學附屬醫院倫理委員會同意，且患者及家屬均簽署知情同意書。按照心臟彩超診斷為風濕性心臟瓣膜病且 24 h 動態心電圖證實為 SR 或者 AF ，將患者分為 SR 組 [5 例，男 2 例、女 3 例，年齡（49.1±8.3）歲]及 AF 組 [5 例，男 3 例、女 2 例，年齡（50.3±5.8）歲]。
入選標準及診斷方法：（1）由 GE 公司生產的 VividE9 型心臟多普勒彩超儀（探頭頻率 3.0 Hz）診斷為風濕性心臟瓣膜病；（2）24 h 動態心電圖證實為 SR 或 AF；（3）檢測患者類風濕性因子；（4）患者心尖區聞及舒張期隆隆樣雜音或第一心音增強；（5）具有外科手術指征，且與患者及家屬溝通后同意手術治療。
排除標準：排除感染性心內膜炎、心肌梗死引起的瓣膜病變以及合并糖尿病、高血壓及其他自身免疫性疾病、血液系統疾病及惡性腫瘤患者。
1.2 成纖維細胞培養鑒定
1.2.1 細胞培養
右心耳組織塊經 75% 的酒精浸泡消毒后剪成約 1 mm3 大小均勻小塊。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗后移入盛有 1 ml DMEM 培養基的 EP 管中，繼續用眼科剪盡量剪碎，然后用移液管將組織碎塊吸入到無菌玻璃瓶中，加入 0.01% Ⅱ型膠原酶液 5 ml ，37℃ 水浴箱中消化 10 min 后離心，去上清液。加入 10 ml 20% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 高糖培養基，吹打混勻后，將懸浮液吸入到 10 cm 培養皿中，放置于 37℃、5% CO2 培養箱中孵育。每天觀察培養液顏色，及時更換培養液。
1.2.2 細胞鑒定
將細胞懸液種到 3 cm 培養皿的載玻片上，加入培養液培養 1～2 d 取出玻片，PBS 清洗 3 次后加入 1 ml 固定液固定，PBS 清洗后加入 1 ml 封閉液（0.5% Triton×100）室溫封閉 30 min。PBS 清洗后加入 1 ml 1% 牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉 1 h。取 1∶300 的稀釋一抗（兔抗人波形蛋白）1 ml 滴加到載玻片上 4℃ 作用過夜。次日用 PBS 清洗后加入 1 ml 按 1∶100 稀釋的二抗（兔抗）室溫避光孵育 1 h，加入 500 μl 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）液，室溫避光孵育 5 min，PBS 洗滌 3 次。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的載玻片，使細胞接觸封片液，便可于熒光顯微鏡下觀察。
1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）及 western blotting 檢測
按照 Trizon Reagen 說明書提取總 RNA，使用 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Code No. FSQ-201）試劑盒行 qRT-PCR 檢測，逆轉錄程序：37℃×15 min，50℃×5 min，98℃×5 min；擴增程序：95℃×2 min，95℃×15 s，57℃×30 s，循環數為 40 個；添加溶解曲線：95℃×15 s，60℃×15 s，95℃×15 s。反應結束后采用 2–△△CT值方法分析目的基因的表達水平。
PCR 相關引物序列：
BKCa α F：5'-TCTCCAGTGCCTTCGTG-3'
R：5'-GGTGTTGGGTGAGTTCC-3'
BkCa β1F：5'-TTGAGACCAACATCAGGGA-3'
R：5'-GGTGTTGGGTGAGTTCC-3'
western blotting 檢測：常規方法提取蛋白，測定濃度后采用 SDS-PAGE 檢測蛋白表達。
1.4 統計學分析
采用 SPSS17.0 軟件進行統計分析，計量資料以均數+標準差（
）表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗和單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 兩組患者的一般資料
比較 AF 組及 SR 組患者的一般情況，兩組患者年齡（P=0.67）、性別（P=0.75）差異無統計學意義。心臟彩色超聲多普勒儀檢查證實兩組患者均為風濕性二尖瓣狹窄伴關閉不全，反流病變程度均在中度以下。兩組患者左房內徑和右房內徑差異有統計學意義（t=19.45，P=0.01；t=23.52，P=0.06），見表 1。
表1
AF 組與 SR 組患者一般情況（
/例）
2.2 人心房成纖維細胞培養及鑒定
采用組織塊貼壁法培養心房成纖維細胞，進行原代培養時，可見顯微鏡下黑色組織塊，即為貼壁的心房組織，約 4～5 d 后，可見細胞從組織塊邊緣長出，隨著培養時間的延長，細胞形態逐漸變為星狀或放射狀，不規則排列，細胞核呈橢圓形，核仁較大，常含 2～3 個核。待細胞生長至培養皿的 90% 左右，即可行傳代培養。傳代細胞排列緊密，慢慢融合，形態呈長梭形，無自發性搏動，見圖 1。使用波形蛋白鑒定成纖維細胞，可見成纖維細胞波形蛋白表達陽性，胞核周圍可觀察到紅色細胞漿呈絲狀改變，見圖 2。為排除心肌細胞的干擾，本試驗用肌鈣蛋白抗體鑒定所培養細胞的純度，結果顯示肌鈣蛋白表達陰性，僅見藍色細胞核，證實所培養的為成纖維細胞，且純度高，無心肌細胞干擾，故鏡下未成像，見圖 3。
圖1
不同倍數下的成纖維細胞 a. 原代細胞（20×）； b. 傳代細胞（10×）； c. 傳代細胞（20×）； d. 傳代細胞（40×）
圖2
波形蛋白鑒定成纖維細胞 a. 成纖維細胞漿呈紅色絲狀改變； b. 成纖維細胞Dapi染色細胞核；c. a、b合成圖
圖3
肌鈣蛋白鑒定培養細胞 a. 培養細胞中無心肌細胞，表明培養細胞純度高，鏡下未顯像； b. Dapi染色可見成纖維細胞核； c. a、b合成圖
2.3 BKCa mRNA 表達水平比較
應用 qRT-PCR 方法檢測兩組 BKCa mRNA 表達水平，結果提示，兩組的 BKCa α 和 BKCa β1 的表達差異均無統計學意義（P=0.79，P=0.69），見圖 4。
圖4
SR 與 AF 患者成纖維細胞上 BKCa mRNA 表達水平比較
2.4 BKCa 蛋白表達水平比較
應用 western blotting 方法檢測 BKCa 蛋白表達水平，結果提示，兩組的 BKCa α 和 BKCa β1 的表達差異均無統計學意義（P=0.31，P=0.46），見圖 5。
圖5
SR 與 AF 患者成纖維細胞上 BKCa 蛋白表達水平比較
3 討論
近年來，大量研究證實，人心房成纖維細胞上存在多種鉀離子通道表達，其中 BKCa 通道是表達最多的一類，其功能與成纖維細胞增殖分化相關[9-10]。然而，BKCa 通道是否參與 AF 的形成及維持目前尚不清楚。
BKCa 通道由 4 個 α 亞基單獨或與 β 亞基配對組成，兩者比例為 1∶1，α 亞基是由 Sloα（KCNMA1）單基因編碼的 7 次跨膜結構（S0～S6），其中 S0 跨膜片段是 BKCa 通道的功能區域，S1～S4 片段為電壓敏感區，S5 與 S6 間形成一個片段稱 H5 區或 P 環，4 個 α 亞基在此對稱排列構成通道的親水性孔道。β1 亞基由 191 個氨基酸殘基組成的兩個跨膜片段，主要參與調節通道的 Ca2+ 的敏感性[12]。因此，本研究為明確 SR 患者和 AF 患者人心房成纖維細胞上 BKCa 通道表達的差異性，采用 qRT-PCR 和 western blotting 技術分別檢測 BKCa 通道 α 和 β1的 mRNA 及蛋白表達水平。
為獲取足量的成纖維細胞，本研究采用優化組織塊貼壁法，即使用 0.01% Ⅱ型膠原酶消化結締組織中的膠原，將消化下來的膠原蛋白及結締組織去除，更利于組織塊貼壁，同時提高培養基中血清比例（20%），結果發現成纖維細胞生長快，細胞密度高，形態上呈有突起的梭形或多角形細胞，與張建成等[13]培養的人心房成纖維細胞形態相似。波形蛋白是鑒定成纖維細胞的特異性標志[14-15]，本研究對所培養的細胞行免疫熒光染色顯示波形蛋白強陽性，且純度大于 95%，證實所培養的為成纖維細胞。
我們的結果顯示 SR 組與 AF 組中人心房成纖維細胞上 BKCa 通道 α 和 β1 的 mRNA 與蛋白表達水平均無明顯差異。其表達無差異可能跟以下原因有關：（1）由于受到倫理因素的影響，無法在左心房取材做檢測，但 AF 的發生與左心房的結構改變也有密切的關系，右心耳的檢測結果不一定能代表左心房的檢測結果，這也是該試驗的局限性；（2）由于本次研究檢測的例數較少，這也可能影響數據的統計分析結果，這將在以后的試驗中繼續驗證；（3）有報道表明下調 BKCa 的表達可抑制人心房成纖維細胞的增殖，從而參與調控心肌纖維化進程[10]。Balderas 等[16]報道，在心肌細胞細胞膜上并未發現 BKCa，僅在線粒體內膜上存在。眾所周知，心肌細胞上離子通道表達異常與心律失常發生關系密切。因此我們推論，BKCa 通道可能僅參與心肌纖維化的形成，而在心肌纖維化導致 AF 的進程中無明顯作用。此外，值得注意的是，多數研究證實成纖維細胞在體外培養后而發生表型變化。例如，成纖維細胞在體外培養 24～48 h 后會分化成肌成纖維細胞，并表達 α-SMA[17-19]。上述報道說明，無論是 SR 組或 AF 組細胞經體外培養后均可能發生表型的改變，使得兩組細胞的生理特性趨于一致，從而使得細胞上的離子通道表達及其功能表現出無差異性。
綜上所述，雖然本研究結果表明 BKCa 通道可能不參與 AF 的發生及維持，但 BKCa 通道在成纖維細胞上的功能以及在心肌纖維化進程中的作用值得進一步研究。BKCa 通道可能不參與 AF 的發生及維持，其在心肌纖維化進程中的可能發揮著作用。
心房顫動（atrial fibrillation，AF）是臨床最為常見的心律失常，住院率和死亡率較高[1]。研究發現心肌纖維化導致的結構重構是永久性 AF 發生和持續的底物[2]，同時也是 AF 發生電重構和收縮重構的底物[3-6]，臨床也發現心房纖維化是 AF 發生結構重構的重要特點[7]。
大電導鈣激活鉀通道（BKCa）廣泛分布在各種組織細胞內，參與多種細胞生理功能的調節。在血管中分布密度較大，被證實該類通道結構變化及功能狀態對血管平滑肌細胞的舒張和收縮起到重要作用，與高血壓疾病的發生發展密切相關[8]。2006 年 Wang 等[9]首次報道人心肌來源成纖維細胞上存在功能性的 BKCa，但其確切的生理功能并不知曉。2013 年 Sheng 等[10]首次在人心房成纖維細胞上發現存在 BKCa 通道。Cruse 等[11]研究發現鈣激活鉀通道與纖維化的形成密切相關。
因此本研究擬對照分析竇性心律（sinus rhythm，SR）與 AF 患者心房成纖維細胞 BKCa 通道表達差異，探索心肌纖維化產生的機制，為治療和逆轉 AF 結構重構提供新的治療策略。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
選擇西南醫科大學附屬醫院心胸外科 2015 年 6 月至 2016 年 12 月收治確診為風濕性心臟病且行體外循環瓣膜置換術的 10 例患者，均未服用抗心律失常藥物。本試驗經西南醫科大學附屬醫院倫理委員會同意，且患者及家屬均簽署知情同意書。按照心臟彩超診斷為風濕性心臟瓣膜病且 24 h 動態心電圖證實為 SR 或者 AF ，將患者分為 SR 組 [5 例，男 2 例、女 3 例，年齡（49.1±8.3）歲]及 AF 組 [5 例，男 3 例、女 2 例，年齡（50.3±5.8）歲]。
入選標準及診斷方法：（1）由 GE 公司生產的 VividE9 型心臟多普勒彩超儀（探頭頻率 3.0 Hz）診斷為風濕性心臟瓣膜病；（2）24 h 動態心電圖證實為 SR 或 AF；（3）檢測患者類風濕性因子；（4）患者心尖區聞及舒張期隆隆樣雜音或第一心音增強；（5）具有外科手術指征，且與患者及家屬溝通后同意手術治療。
排除標準：排除感染性心內膜炎、心肌梗死引起的瓣膜病變以及合并糖尿病、高血壓及其他自身免疫性疾病、血液系統疾病及惡性腫瘤患者。
1.2 成纖維細胞培養鑒定
1.2.1 細胞培養
右心耳組織塊經 75% 的酒精浸泡消毒后剪成約 1 mm3 大小均勻小塊。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗后移入盛有 1 ml DMEM 培養基的 EP 管中，繼續用眼科剪盡量剪碎，然后用移液管將組織碎塊吸入到無菌玻璃瓶中，加入 0.01% Ⅱ型膠原酶液 5 ml ，37℃ 水浴箱中消化 10 min 后離心，去上清液。加入 10 ml 20% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 高糖培養基，吹打混勻后，將懸浮液吸入到 10 cm 培養皿中，放置于 37℃、5% CO2 培養箱中孵育。每天觀察培養液顏色，及時更換培養液。
1.2.2 細胞鑒定
將細胞懸液種到 3 cm 培養皿的載玻片上，加入培養液培養 1～2 d 取出玻片，PBS 清洗 3 次后加入 1 ml 固定液固定，PBS 清洗后加入 1 ml 封閉液（0.5% Triton×100）室溫封閉 30 min。PBS 清洗后加入 1 ml 1% 牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉 1 h。取 1∶300 的稀釋一抗（兔抗人波形蛋白）1 ml 滴加到載玻片上 4℃ 作用過夜。次日用 PBS 清洗后加入 1 ml 按 1∶100 稀釋的二抗（兔抗）室溫避光孵育 1 h，加入 500 μl 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）液，室溫避光孵育 5 min，PBS 洗滌 3 次。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的載玻片，使細胞接觸封片液，便可于熒光顯微鏡下觀察。
1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）及 western blotting 檢測
按照 Trizon Reagen 說明書提取總 RNA，使用 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（Code No. FSQ-201）試劑盒行 qRT-PCR 檢測，逆轉錄程序：37℃×15 min，50℃×5 min，98℃×5 min；擴增程序：95℃×2 min，95℃×15 s，57℃×30 s，循環數為 40 個；添加溶解曲線：95℃×15 s，60℃×15 s，95℃×15 s。反應結束后采用 2–△△CT值方法分析目的基因的表達水平。
PCR 相關引物序列：
BKCa α F：5'-TCTCCAGTGCCTTCGTG-3'
R：5'-GGTGTTGGGTGAGTTCC-3'
BkCa β1F：5'-TTGAGACCAACATCAGGGA-3'
R：5'-GGTGTTGGGTGAGTTCC-3'
western blotting 檢測：常規方法提取蛋白，測定濃度后采用 SDS-PAGE 檢測蛋白表達。
1.4 統計學分析
采用 SPSS17.0 軟件進行統計分析，計量資料以均數+標準差（
）表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗和單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 兩組患者的一般資料
比較 AF 組及 SR 組患者的一般情況，兩組患者年齡（P=0.67）、性別（P=0.75）差異無統計學意義。心臟彩色超聲多普勒儀檢查證實兩組患者均為風濕性二尖瓣狹窄伴關閉不全，反流病變程度均在中度以下。兩組患者左房內徑和右房內徑差異有統計學意義（t=19.45，P=0.01；t=23.52，P=0.06），見表 1。
表1
AF 組與 SR 組患者一般情況（
/例）
2.2 人心房成纖維細胞培養及鑒定
采用組織塊貼壁法培養心房成纖維細胞，進行原代培養時，可見顯微鏡下黑色組織塊，即為貼壁的心房組織，約 4～5 d 后，可見細胞從組織塊邊緣長出，隨著培養時間的延長，細胞形態逐漸變為星狀或放射狀，不規則排列，細胞核呈橢圓形，核仁較大，常含 2～3 個核。待細胞生長至培養皿的 90% 左右，即可行傳代培養。傳代細胞排列緊密，慢慢融合，形態呈長梭形，無自發性搏動，見圖 1。使用波形蛋白鑒定成纖維細胞，可見成纖維細胞波形蛋白表達陽性，胞核周圍可觀察到紅色細胞漿呈絲狀改變，見圖 2。為排除心肌細胞的干擾，本試驗用肌鈣蛋白抗體鑒定所培養細胞的純度，結果顯示肌鈣蛋白表達陰性，僅見藍色細胞核，證實所培養的為成纖維細胞，且純度高，無心肌細胞干擾，故鏡下未成像，見圖 3。
圖1
不同倍數下的成纖維細胞 a. 原代細胞（20×）； b. 傳代細胞（10×）； c. 傳代細胞（20×）； d. 傳代細胞（40×）
圖2
波形蛋白鑒定成纖維細胞 a. 成纖維細胞漿呈紅色絲狀改變； b. 成纖維細胞Dapi染色細胞核；c. a、b合成圖
圖3
肌鈣蛋白鑒定培養細胞 a. 培養細胞中無心肌細胞，表明培養細胞純度高，鏡下未顯像； b. Dapi染色可見成纖維細胞核； c. a、b合成圖
2.3 BKCa mRNA 表達水平比較
應用 qRT-PCR 方法檢測兩組 BKCa mRNA 表達水平，結果提示，兩組的 BKCa α 和 BKCa β1 的表達差異均無統計學意義（P=0.79，P=0.69），見圖 4。
圖4
SR 與 AF 患者成纖維細胞上 BKCa mRNA 表達水平比較
2.4 BKCa 蛋白表達水平比較
應用 western blotting 方法檢測 BKCa 蛋白表達水平，結果提示，兩組的 BKCa α 和 BKCa β1 的表達差異均無統計學意義（P=0.31，P=0.46），見圖 5。
圖5
SR 與 AF 患者成纖維細胞上 BKCa 蛋白表達水平比較
3 討論
近年來，大量研究證實，人心房成纖維細胞上存在多種鉀離子通道表達，其中 BKCa 通道是表達最多的一類，其功能與成纖維細胞增殖分化相關[9-10]。然而，BKCa 通道是否參與 AF 的形成及維持目前尚不清楚。
BKCa 通道由 4 個 α 亞基單獨或與 β 亞基配對組成，兩者比例為 1∶1，α 亞基是由 Sloα（KCNMA1）單基因編碼的 7 次跨膜結構（S0～S6），其中 S0 跨膜片段是 BKCa 通道的功能區域，S1～S4 片段為電壓敏感區，S5 與 S6 間形成一個片段稱 H5 區或 P 環，4 個 α 亞基在此對稱排列構成通道的親水性孔道。β1 亞基由 191 個氨基酸殘基組成的兩個跨膜片段，主要參與調節通道的 Ca2+ 的敏感性[12]。因此，本研究為明確 SR 患者和 AF 患者人心房成纖維細胞上 BKCa 通道表達的差異性，采用 qRT-PCR 和 western blotting 技術分別檢測 BKCa 通道 α 和 β1的 mRNA 及蛋白表達水平。
為獲取足量的成纖維細胞，本研究采用優化組織塊貼壁法，即使用 0.01% Ⅱ型膠原酶消化結締組織中的膠原，將消化下來的膠原蛋白及結締組織去除，更利于組織塊貼壁，同時提高培養基中血清比例（20%），結果發現成纖維細胞生長快，細胞密度高，形態上呈有突起的梭形或多角形細胞，與張建成等[13]培養的人心房成纖維細胞形態相似。波形蛋白是鑒定成纖維細胞的特異性標志[14-15]，本研究對所培養的細胞行免疫熒光染色顯示波形蛋白強陽性，且純度大于 95%，證實所培養的為成纖維細胞。
我們的結果顯示 SR 組與 AF 組中人心房成纖維細胞上 BKCa 通道 α 和 β1 的 mRNA 與蛋白表達水平均無明顯差異。其表達無差異可能跟以下原因有關：（1）由于受到倫理因素的影響，無法在左心房取材做檢測，但 AF 的發生與左心房的結構改變也有密切的關系，右心耳的檢測結果不一定能代表左心房的檢測結果，這也是該試驗的局限性；（2）由于本次研究檢測的例數較少，這也可能影響數據的統計分析結果，這將在以后的試驗中繼續驗證；（3）有報道表明下調 BKCa 的表達可抑制人心房成纖維細胞的增殖，從而參與調控心肌纖維化進程[10]。Balderas 等[16]報道，在心肌細胞細胞膜上并未發現 BKCa，僅在線粒體內膜上存在。眾所周知，心肌細胞上離子通道表達異常與心律失常發生關系密切。因此我們推論，BKCa 通道可能僅參與心肌纖維化的形成，而在心肌纖維化導致 AF 的進程中無明顯作用。此外，值得注意的是，多數研究證實成纖維細胞在體外培養后而發生表型變化。例如，成纖維細胞在體外培養 24～48 h 后會分化成肌成纖維細胞，并表達 α-SMA[17-19]。上述報道說明，無論是 SR 組或 AF 組細胞經體外培養后均可能發生表型的改變，使得兩組細胞的生理特性趨于一致，從而使得細胞上的離子通道表達及其功能表現出無差異性。
綜上所述，雖然本研究結果表明 BKCa 通道可能不參與 AF 的發生及維持，但 BKCa 通道在成纖維細胞上的功能以及在心肌纖維化進程中的作用值得進一步研究。BKCa 通道可能不參與 AF 的發生及維持，其在心肌纖維化進程中的可能發揮著作用。
