鈣化性主動脈瓣疾病是歐美國家最常見的心臟瓣膜疾病，在我國的發病率也逐年升高。主動脈瓣鈣化是多種分子和機制共同參與的復雜病理過程。炎癥不僅與多種疾病相關，也是參與主動脈瓣鈣化發生發展的機制之一，它能調控成骨細胞分化相關因子的表達而促進鈣化損害的進展，因而在瓣膜鈣化中扮演著重要角色。心血管事件的危險因素脂質代謝異常也與主動脈瓣鈣化有關，它能誘發或增強瓣膜局部炎癥反應而促進鈣化進展。對惡性腫瘤進展具有調控作用的非編碼 RNA 亦可從多方面調控主動脈瓣鈣化的相關通路。miRNA 和 lncRNA 等非編碼 RNA 可調控炎癥及成骨細胞分化相關基因的表達而調節瓣膜鈣化的進程。
引用本文： 賀鈺斌, 朱丹. 鈣化性主動脈瓣疾病發病機制的研究進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(2): 171-176. doi: 10.7507/1007-4848.201704033 復制
鈣化性主動脈瓣疾病（calcific aortic valve disease，CAVD）是主動脈瓣的進行性病變，主要表現為瓣葉纖維增生與鈣化導致瓣膜僵硬，嚴重者可發生鈣化性主動脈瓣狹窄（calcific aortic valve stenosis, CAVS），引起左室流出道梗阻。CAVS 是最常見的心臟瓣膜疾病，2006 年美國瓣膜病的指南將其定義為：超聲顯示瓣膜回聲增強、瓣膜增厚，瓣口面積<3.0 cm2、跨瓣血流速率>2.5 m/s[1]。在發達國家，CAVS 在 65 歲以上人群的發病率約為 2%，85 歲以上人群的發病率約為 4%[2]。CAVD 的發病風險隨年齡增長而增加，因此眾多學者一度認為它是主動脈瓣的退行性病變。但近年的研究發現 CAVD 與動脈粥樣硬化具有相似的病理過程，包括脂質沉積、炎癥反應、新血管形成、內皮功能障礙及瓣膜間質細胞（valvular interstitial cell，VIC）向成骨細胞分化[3-4]最終形成鈣化損害。目前尚缺乏治療 CAVD 的有效藥物，盡管有學者認為他汀類藥物能發揮抗炎作用從而延緩 CAVD 進展，在相關臨床研究中卻發現試驗組與對照組主動脈瓣鈣化的進展程度并無明顯差異[5]。外科主動脈瓣置換術是治療 CAVD 唯一有效的方法，能明顯改善患者癥狀、提高生存質量[6]。因此闡明 CAVD 的發病機制、尋找可能的藥物靶點對于延緩和預防主動脈瓣鈣化具有重要意義。
1 脂質代謝異常誘發炎癥反應促進主動脈瓣鈣化進展
血脂異常是主動脈瓣鈣化的重要危險因素之一。家族性高脂血癥是低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）基因突變所致的遺傳性疾病。臨床研究發現家族性高脂血癥患者發生主動脈瓣狹窄的風險明顯升高，且 LDLR 陰性突變的患者更易發生主動脈瓣鈣化。大量臨床研究表明血脂異常的患者主動脈瓣狹窄的發病風險明顯升高，而在動物實驗中發現給予高脂血癥所致主動脈瓣鈣化的家兔他汀類藥物治療后，其瓣膜鈣化程度有所減輕[7-8]。組織病理學研究也發現主動脈瓣鈣化區域周圍有脂質浸潤，如低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、載脂蛋白 B（apolipoproteinB，ApoB）和脂蛋白（lipoprotein，Lp），這些脂質很可能來源于血漿。血漿高水平的脂質在主動脈瓣上皮損傷處沉積形成原始損害并誘發氧化應激可能是其促進主動脈瓣狹窄進展的重要機制。
LDL 是富含膽固醇的脂蛋白，在炎癥環境下，LDL 可被氧化修飾生成氧化型 LDL（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），后者可通過 Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）誘發炎癥反應并形成抗原表位激活特異性免疫系統[9]。單核-巨噬細胞是參與主動脈瓣鈣化的重要細胞成分之一，活化的巨噬細胞能分泌多種促炎性細胞因子，ox-LDL 能激活單核-巨噬細胞從而促進主動脈瓣鈣化的進展[10]。氧化型磷脂（oxidized phospholipids，oxPL）能促進炎癥反應并具有促動脈粥樣硬化的作用[11]。Ox-LDL 富含 oxPL，其與主動脈瓣鈣化的進展直接相關[12]。最新研究發現狹窄瓣膜中脂蛋白相關性磷脂酶 A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，LP-PLA2）表達水平升高，它能將 oxPL 分解為游離脂肪酸和溶血卵磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）[13]。LPC 具有促炎作用，在體外培養的 VIC 中，LPC 能促進堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、核苷酸內焦磷酸酶/磷酸二酯酶 1（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1）和鈉磷共轉運體 Pit1 基因表達上調，而 ALP、ENPP1 和 Pit1 均能促進主動脈瓣鈣化[14]。此外，ENPP1 家族成員 autotaxin 亦可通過調控炎癥誘導的 BMP 表達而促進鈣化[15]。因此 ox-LDL 亦可通過 LP-PLA2 對 oxPL 的分解作用產生 LPC、誘發后續的連鎖反應從而促進 VIC 鈣化。最新研究發現，給心肌鈣化的小鼠注射 ENPP1 小分子抑制劑 SYL-001 和 ARL67156 后，小鼠心肌鈣鹽沉積與對照組相比分別減少 35% 和 79%[16]。鈣化瓣膜中 ENPP1 水平亦有升高，因此我們推測 ENPP1 小分子抑制劑對延緩主動脈瓣鈣化的進展也有類似作用，仍需進一步研究以確保此類藥物的安全性和有效性。
ApoB 是低密度脂蛋白膽固醇的主要成分，它是一種大分子蛋白并作為大分子骨架包裹于 Lp 表面以保證其結構完整性[17]。脂蛋白 a［lipoproteina，Lp（a）］水平升高也是主動脈瓣鈣化的重要危險因素。大量流行病學研究表明：Lp（a）水平達到 30 mg/dl（75 nmol/L）時主動脈瓣狹窄的發病風險開始增加，當其水平>60 mg/dl（150 nmol/L）時則主動脈瓣鈣狹窄的發病風險明顯增加[18]。血清 Lp（a）的水平是由其編碼基因 LPA 決定的，其中 Kringle-Ⅳ區 2 型（KⅣ-2）重復序列長度多態性決定了載脂蛋白 A 的表達程度，它與 Lp（a）水平呈負相關，而 LPA 基因 rs10455872 和 rs3798220 位點的單核苷酸多態性（single-nucleotide polymorphism，SNP）與 Lp（a）水平升高有關[19-20]。對鈣化瓣膜標本進行全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）后發現僅有 LPA 基因 rs10455872 位點的 SNP 與主動脈瓣鈣化有關[21]。
因此，脂質代謝異常可通過活化單核-巨噬細胞系統、激活特異性免疫而誘發炎癥反應，最終促進主動脈瓣鈣化進展。基因變異所致的脂質代謝異常亦與 CAVD 發病有關，但能否將 Lp（a）作為預測 CAVD 的生物標記物需要進行大規模臨床研究。血脂異常作為瓣膜鈣化的重要危險因素之一，目前主要以預防為主，脂蛋白 SNP 的發現可能從基因層面為 CAVD 的治療提供新思路。
2 炎癥反應活化鈣化相關因子促進主動脈瓣鈣化進展
炎癥是最常見的病理過程，已經證實在動脈粥樣硬化中常有炎癥細胞浸潤，CAVD 的組織學研究中也觀察到此現象[4]，因此 CAVD 的進展涉及炎癥反應。在炎癥反應中，非特異性免疫產生的細胞因子、特異性免疫細胞的激活均與 CAVD 進展有關。
腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是由巨噬細胞、單核細胞、T 細胞和平滑肌細胞等多種細胞分泌的細胞因子，它在急性炎癥反應中具有保護作用，而在慢性炎癥中則與多種病理過程有關[22]。VIC 是主動脈瓣中重要的細胞成分之一，它有兩種類型，分別為：α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）陽性的 VIC 和 α-SMA 陰性的 VIC，其中前者表現出活化的成肌細胞表型而后者表現出靜止的成纖維細胞表型[23]。鈣化瓣膜中的巨噬細胞能表達 TNF-α，從而促進主動脈瓣成肌細胞增殖和基質金屬蛋白酶 1（matrix metalloproteinase1，MMP1）表達，在鈣化培養基培養的主動脈瓣成肌細胞受到 TNF-α 刺激后細胞內鈣化結節增多、成骨細胞標記物水平升高[24]。此外，TNF-α 一方面可激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路調節促炎性細胞因子白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）表達上調，另一方面可通過該通路誘導自身表達水平上調[25]。IL-6 能通過骨成型蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）信號通路促進 VIC 向成骨細胞分化，白細胞介素-1（interluekin-1，IL-1）家族成員 IL-18 能通過 NF-κB 信號通路促進 VIC 向成肌細胞分化同時上調成骨細胞標記物 mRNA 的表達水平并誘導 TNF-α 和 IL-6 表達上調[26-28]，這些炎癥因子相互作用形成正反饋環路使炎癥因子生成增加、加重瓣膜內炎癥反應，最終促進主動脈瓣鈣化進展。新發現的細胞因子 IL-1 家族成員白細胞介素-37（interleukin-37，IL-37）則是一種抗炎性細胞因子，其在體內和體外均有抗炎作用[29]。最新研究表明 IL-37 具有抑制瓣膜鈣化的作用，它能抑制瓣膜鈣化相關的 NF-κB 和 BMP2 信號通路及成骨細胞標記物堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表達，進而減少 VIC 內鈣鹽沉積[30]。
轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和 BMP2 均參與血管與瓣膜鈣化中的促成骨活動，Smad 信號是介導二者促成骨作用的重要信號分子[31-32]。Smad1 和 Smad3 與 TGF-β 和 BMP2 介導的成骨細胞標記物 Runx2 及 ALP 水平升高有關，而 Smurf2 則是該作用的負向調控因子[33-34]。在正常情況下，機體可通過 TGF-β/BMP2-Smad1/Smad3-Runx2/ALP-Smurf2 的負反饋環路抑制 TGF-β 和 BMP2 誘導的 Smad1 和 Smad3 信號，使瓣膜內鈣化相關因子處于正常水平，防止鈣化的發生。在病理狀態下，該環路受到破壞，導致鈣化相關因子生成增多而促進主動脈瓣鈣化的進展。
最近的研究發現在鈣化主動脈瓣中有 T 細胞克隆性增殖以及 CD4+和 CD8+T 細胞浸潤[9]。CAVD 患者 CD3+T 細胞表達人類白細胞 DR 抗原（human leukocyte antige，HLA-DR）水平升高，CD8+和 CD57+T 細胞亞群表達 HLA-DR 比例增加，這充分說明在主動脈瓣鈣化中有特異性免疫的參與[35]。有學者認為抗原表位的氧化性修飾能激活 T 細胞[9]，該觀點仍有待證實。
目前已明確非特異性免疫在 CAVD 中具有重要作用，但對特異性免疫研究較少。鈣化瓣膜中大量促炎性細胞因子表達上調、相關信號通路的激活，而抗炎性細胞因子表達則受到抑制。我們推測兩類細胞因子在主動脈瓣中失衡是炎癥促進 CAVD 進展的重要因素之一。IL-37 的抗炎作用能抑制鈣化相關信號通路的活性，因此該細胞因子有望成為延緩 CAVD 進展的治療靶點。
3 非編碼 RNA 對炎癥及促鈣化因子的調控促進主動脈瓣鈣化進展
3.1 miRNA 對炎癥及促鈣化因子的調控
炎癥反應和脂質代謝是 CAVD 進展的經典機制，但兩種機制涉及的信號通路和分子還受到基因水平的調控。非編碼 RNA 是調控編碼蛋白質基因的重要分子，且與多種疾病的發生發展有關。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類由內源性基因編碼、長度約為 20～24 個核苷酸、高度保守的非編碼 RNA，它在基因表達的轉錄后修飾中具有重要作用并且與多種疾病發生發展有關。最近有大量研究發現正常瓣膜與鈣化瓣膜的多種 miRNA 呈差異性表達且與主動脈瓣鈣化的進展密切相關。目前已發現二葉式主動脈瓣（bicuspid aortic valve，BAV）的狹窄瓣膜中 miR-26a、miR-30b 和 miR-195 表達下調，鈣化瓣膜中 miR-374b、miR-602 和 miR-939 表達下調而 miR-125b 水平上調[36-37]。此外，巨噬細胞對主動脈瓣鈣化的促進作用也與 miRNA 有關。
miR-26a 對促鈣化因子如 BMP2、Runx2、SMAD1 和 SMAD5 具有抑制作用，同時能增強鈣化抑制基因如 Smad7 和 JAG2 的表達，miR-30b 亦可增強 Smad7 和 JAG2 的表達而表現出抑制鈣化的效應，miR-195 則能活化促鈣化基因[37]。其中 JAG2 是 Notch 信號通路的配體，它可能通過對 NOTCH1 的作用抑制主動脈瓣鈣化的進展[38]。MiR-939 對內皮一氧化氮合成酶（endothelialnitric oxide synthase，eNOS）具有調節作用，eNOS 能降低 α-SMA 水平、抑制 MMP9 活性和 TGF-β 的下游分子 Smad2 磷酸化等機制防止瓣膜纖維化、抑制 VIC 的促纖維化因子活性，而 eNOS-/-基因敲除的小鼠易發生主動脈瓣鈣化[36, 39]。鈣化瓣膜中 MiR-939 表達下調可能導致 eNOS 合成減少并促進主動脈瓣鈣化的進展。此外，在 TGF-β/BMP2-Smad1/Smad3-Runx2/ALP-Smurf2 負反饋環路中，TGF-β 和 BMP2 通過上調 VIC 中 miR-486、下調 miR-204 水平增強促成骨活動，miR-486 通過抑制 Smurf2 表達使 miR-204 水平下調，最終加快瓣膜鈣化的進展[32]。miR-374b 是 CCTTA 增強子結合蛋白-β（C/EBP-β）的調節因子且與巨噬細胞極化有關[40]。靜止的巨噬細胞可促進 VIC 向成骨細胞分化，巨噬細胞極化能影響促炎性細胞因子的釋放及其對 VIC 的作用并調節 VIC 向成骨細胞分化，而極化的 M1 型巨噬細胞可能分泌 TNF-α 和 IL-6 形成促炎環境而進一步促進 VIC 鈣化[41]。miR-125b 能調節炎癥因子的基因表達及血管鈣化，具有炎癥調節作用的趨化因子 CCL4 是 miR-125b 的作用靶點，最近研究已證實鈣化瓣膜中二者水平均上調能促進 CAVD 的進展[36]。
miRNA 是腫瘤學領域的研究熱點，但關于 CAVD 的 miRNA 研究較少。近年的研究表明 miRNA 與 CAVD 的易感性與進展密切相關。miRNA 亦參與了炎癥因子、纖維化和鈣化相關因子表達的調控以及炎癥細胞功能的調節，這表明其與瓣膜內炎癥反應有關。目前正在研究 miRNA 作為急性心肌梗死和心力衰竭的生物標記物的可行性[42]，但在 CAVD 中尚缺乏可能作為生物標記物的 miRNA。因此，對 miRNA 與其它機制之間的相互作用進行深入研究、尋找可能作為 CAVD 標記物的 miRNA 分子對于闡明 CAVD 的發病機制、早期發現并干預 CAVD 的進展有重要意義。
3.2 lncRNA 對鈣化相關因子的調控
長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，越來越多的證據表明 lncRNA 是調節基因表達和細胞分化的關鍵因子，它能與蛋白質相互作用、干擾 miRNA、修飾表觀基因組并被基因啟動子募集而干預基因表達[43-44]。
Hox 轉錄反義基因間 RNA（hox transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）是一種lncRNA，長度為 2 200 個核苷酸，能使多個轉移抑制基因沉默促進惡性腫瘤轉移。BAV 由于長期承受較正常瓣膜更大的機械剪切力而更易發生鈣化。有研究發現 BAV 的 VIC 中 HOTAIR 水平較三葉式主動脈瓣（tricuspid aortic valve，TAV）的 VIC 水平低，同時伴有鈣化相關基因肝/骨/腎型堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，liver/bone/kidney，ALPL）和 BMP2 表達水平增高，這些改變與瓣膜長期承受機械張力所致 Wnt/β-Catenin 信號通路的激活有關[45]。這表明 HOTAIR 能抑制鈣化相關基因的表達，而且 HOTAIR 基因位點的 SNP 可能與主動脈瓣鈣化有關。
lncRNA H19 為一種印記基因，H19-胰島素樣生長因子 2（insulin-like growth factor，H19-IGF2）的基因位點包含了差異性甲基化區域（differentially methylated region，DMR）[46]。對鈣化瓣膜的標本進行檢測后發現 H19 的啟動子區域低甲基化并導致其過表達，H19 過表達可誘導鈣化相關基因 Runx2 表達上調、抑制 NOTCH1 基因表達、激活 Wnt 信號通路從而促進 VIC 獲得成骨細胞表型[47-49]。NOTCH1 對促鈣化因子 Runx2 和 BMP2 具有負向調控作用，轉錄因子 P53 是 NOTCH1 的重要調節因子且能負向調控成骨細胞分化，H19 對 NOTCH1 基因表達的抑制作用可能與其抑制 P53 在 NOTCH1 啟動子區域的募集有關[49-50]。因此，H19 能在轉錄水平調控 NOTCH1 表達從而促進主動脈瓣鈣化的進展。
lncRNA 是遺傳學和腫瘤學領域的研究熱點，并有大量研究表明 lncRNA 參與了腫瘤的發生發展和轉移以及退行性神經疾病的進展，但心血管領域的此類研究較少。lncRNA 所調控的 NOTCH1 基因和 BMP2 亦受到炎癥因子的調控。lncRNA 對成骨相關基因和信號通路的調控是否有炎癥的參與還不清楚，因此我們需要對 lncRNA 與炎癥在主動脈瓣鈣化中有無相互作用進行綜合考慮。對 lncRNA 在 CAVD 中作用的深入研究能為闡明其發病機制提供新視角，并在分子生物學水平上為該疾病的藥物治療提供新靶點。
4 總結
CAVD 并非單純的瓣膜退行性病變，炎癥反應、脂質代謝異常以及非編碼 RNA 的調控均參與其中，共同促進主動脈瓣鈣化的進展。一方面，瓣膜局部炎癥反應和脂質代謝異常的經典機制與 CAVD 的發生發展明確相關，脂質代謝異常可誘發或加重瓣膜局部的炎癥反應促進 CAVD 進展。另一方面，分子生物學研究表明 Lp（a）編碼基因 SNP 所致的脂質代謝異常、miRNA 與 lncRNA 對鈣化相關基因的調控亦與 CAVD 的進展有關，miRNA 和 lncRNA 上調具有促鈣化作用的炎癥因子而抑制抗鈣化因子的活性最終加快瓣膜鈣化的進展。現已證實抗 IL-1β 單抗對減輕血管鈣化有一定作用，對老年患者實行藥物治療后再給予必要的手術治療亦有助于降低術后死亡風險。盡管對主動脈瓣鈣化的發病機制在炎癥、脂質代謝和基因水平上做了大量研究，但瓣膜局部有多種細胞成分，多種細胞間有相互作用，因此還原體內環境、探討細胞間通訊對主動脈瓣鈣化的作用，對于明確 CAVD 的發病機制、尋找合適的治療靶點具有重要意義。
鈣化性主動脈瓣疾病（calcific aortic valve disease，CAVD）是主動脈瓣的進行性病變，主要表現為瓣葉纖維增生與鈣化導致瓣膜僵硬，嚴重者可發生鈣化性主動脈瓣狹窄（calcific aortic valve stenosis, CAVS），引起左室流出道梗阻。CAVS 是最常見的心臟瓣膜疾病，2006 年美國瓣膜病的指南將其定義為：超聲顯示瓣膜回聲增強、瓣膜增厚，瓣口面積<3.0 cm2、跨瓣血流速率>2.5 m/s[1]。在發達國家，CAVS 在 65 歲以上人群的發病率約為 2%，85 歲以上人群的發病率約為 4%[2]。CAVD 的發病風險隨年齡增長而增加，因此眾多學者一度認為它是主動脈瓣的退行性病變。但近年的研究發現 CAVD 與動脈粥樣硬化具有相似的病理過程，包括脂質沉積、炎癥反應、新血管形成、內皮功能障礙及瓣膜間質細胞（valvular interstitial cell，VIC）向成骨細胞分化[3-4]最終形成鈣化損害。目前尚缺乏治療 CAVD 的有效藥物，盡管有學者認為他汀類藥物能發揮抗炎作用從而延緩 CAVD 進展，在相關臨床研究中卻發現試驗組與對照組主動脈瓣鈣化的進展程度并無明顯差異[5]。外科主動脈瓣置換術是治療 CAVD 唯一有效的方法，能明顯改善患者癥狀、提高生存質量[6]。因此闡明 CAVD 的發病機制、尋找可能的藥物靶點對于延緩和預防主動脈瓣鈣化具有重要意義。
1 脂質代謝異常誘發炎癥反應促進主動脈瓣鈣化進展
血脂異常是主動脈瓣鈣化的重要危險因素之一。家族性高脂血癥是低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）基因突變所致的遺傳性疾病。臨床研究發現家族性高脂血癥患者發生主動脈瓣狹窄的風險明顯升高，且 LDLR 陰性突變的患者更易發生主動脈瓣鈣化。大量臨床研究表明血脂異常的患者主動脈瓣狹窄的發病風險明顯升高，而在動物實驗中發現給予高脂血癥所致主動脈瓣鈣化的家兔他汀類藥物治療后，其瓣膜鈣化程度有所減輕[7-8]。組織病理學研究也發現主動脈瓣鈣化區域周圍有脂質浸潤，如低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、載脂蛋白 B（apolipoproteinB，ApoB）和脂蛋白（lipoprotein，Lp），這些脂質很可能來源于血漿。血漿高水平的脂質在主動脈瓣上皮損傷處沉積形成原始損害并誘發氧化應激可能是其促進主動脈瓣狹窄進展的重要機制。
LDL 是富含膽固醇的脂蛋白，在炎癥環境下，LDL 可被氧化修飾生成氧化型 LDL（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL），后者可通過 Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）誘發炎癥反應并形成抗原表位激活特異性免疫系統[9]。單核-巨噬細胞是參與主動脈瓣鈣化的重要細胞成分之一，活化的巨噬細胞能分泌多種促炎性細胞因子，ox-LDL 能激活單核-巨噬細胞從而促進主動脈瓣鈣化的進展[10]。氧化型磷脂（oxidized phospholipids，oxPL）能促進炎癥反應并具有促動脈粥樣硬化的作用[11]。Ox-LDL 富含 oxPL，其與主動脈瓣鈣化的進展直接相關[12]。最新研究發現狹窄瓣膜中脂蛋白相關性磷脂酶 A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，LP-PLA2）表達水平升高，它能將 oxPL 分解為游離脂肪酸和溶血卵磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）[13]。LPC 具有促炎作用，在體外培養的 VIC 中，LPC 能促進堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、核苷酸內焦磷酸酶/磷酸二酯酶 1（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1）和鈉磷共轉運體 Pit1 基因表達上調，而 ALP、ENPP1 和 Pit1 均能促進主動脈瓣鈣化[14]。此外，ENPP1 家族成員 autotaxin 亦可通過調控炎癥誘導的 BMP 表達而促進鈣化[15]。因此 ox-LDL 亦可通過 LP-PLA2 對 oxPL 的分解作用產生 LPC、誘發后續的連鎖反應從而促進 VIC 鈣化。最新研究發現，給心肌鈣化的小鼠注射 ENPP1 小分子抑制劑 SYL-001 和 ARL67156 后，小鼠心肌鈣鹽沉積與對照組相比分別減少 35% 和 79%[16]。鈣化瓣膜中 ENPP1 水平亦有升高，因此我們推測 ENPP1 小分子抑制劑對延緩主動脈瓣鈣化的進展也有類似作用，仍需進一步研究以確保此類藥物的安全性和有效性。
ApoB 是低密度脂蛋白膽固醇的主要成分，它是一種大分子蛋白并作為大分子骨架包裹于 Lp 表面以保證其結構完整性[17]。脂蛋白 a［lipoproteina，Lp（a）］水平升高也是主動脈瓣鈣化的重要危險因素。大量流行病學研究表明：Lp（a）水平達到 30 mg/dl（75 nmol/L）時主動脈瓣狹窄的發病風險開始增加，當其水平>60 mg/dl（150 nmol/L）時則主動脈瓣鈣狹窄的發病風險明顯增加[18]。血清 Lp（a）的水平是由其編碼基因 LPA 決定的，其中 Kringle-Ⅳ區 2 型（KⅣ-2）重復序列長度多態性決定了載脂蛋白 A 的表達程度，它與 Lp（a）水平呈負相關，而 LPA 基因 rs10455872 和 rs3798220 位點的單核苷酸多態性（single-nucleotide polymorphism，SNP）與 Lp（a）水平升高有關[19-20]。對鈣化瓣膜標本進行全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）后發現僅有 LPA 基因 rs10455872 位點的 SNP 與主動脈瓣鈣化有關[21]。
因此，脂質代謝異常可通過活化單核-巨噬細胞系統、激活特異性免疫而誘發炎癥反應，最終促進主動脈瓣鈣化進展。基因變異所致的脂質代謝異常亦與 CAVD 發病有關，但能否將 Lp（a）作為預測 CAVD 的生物標記物需要進行大規模臨床研究。血脂異常作為瓣膜鈣化的重要危險因素之一，目前主要以預防為主，脂蛋白 SNP 的發現可能從基因層面為 CAVD 的治療提供新思路。
2 炎癥反應活化鈣化相關因子促進主動脈瓣鈣化進展
炎癥是最常見的病理過程，已經證實在動脈粥樣硬化中常有炎癥細胞浸潤，CAVD 的組織學研究中也觀察到此現象[4]，因此 CAVD 的進展涉及炎癥反應。在炎癥反應中，非特異性免疫產生的細胞因子、特異性免疫細胞的激活均與 CAVD 進展有關。
腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是由巨噬細胞、單核細胞、T 細胞和平滑肌細胞等多種細胞分泌的細胞因子，它在急性炎癥反應中具有保護作用，而在慢性炎癥中則與多種病理過程有關[22]。VIC 是主動脈瓣中重要的細胞成分之一，它有兩種類型，分別為：α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）陽性的 VIC 和 α-SMA 陰性的 VIC，其中前者表現出活化的成肌細胞表型而后者表現出靜止的成纖維細胞表型[23]。鈣化瓣膜中的巨噬細胞能表達 TNF-α，從而促進主動脈瓣成肌細胞增殖和基質金屬蛋白酶 1（matrix metalloproteinase1，MMP1）表達，在鈣化培養基培養的主動脈瓣成肌細胞受到 TNF-α 刺激后細胞內鈣化結節增多、成骨細胞標記物水平升高[24]。此外，TNF-α 一方面可激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路調節促炎性細胞因子白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）表達上調，另一方面可通過該通路誘導自身表達水平上調[25]。IL-6 能通過骨成型蛋白 2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）信號通路促進 VIC 向成骨細胞分化，白細胞介素-1（interluekin-1，IL-1）家族成員 IL-18 能通過 NF-κB 信號通路促進 VIC 向成肌細胞分化同時上調成骨細胞標記物 mRNA 的表達水平并誘導 TNF-α 和 IL-6 表達上調[26-28]，這些炎癥因子相互作用形成正反饋環路使炎癥因子生成增加、加重瓣膜內炎癥反應，最終促進主動脈瓣鈣化進展。新發現的細胞因子 IL-1 家族成員白細胞介素-37（interleukin-37，IL-37）則是一種抗炎性細胞因子，其在體內和體外均有抗炎作用[29]。最新研究表明 IL-37 具有抑制瓣膜鈣化的作用，它能抑制瓣膜鈣化相關的 NF-κB 和 BMP2 信號通路及成骨細胞標記物堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表達，進而減少 VIC 內鈣鹽沉積[30]。
轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和 BMP2 均參與血管與瓣膜鈣化中的促成骨活動，Smad 信號是介導二者促成骨作用的重要信號分子[31-32]。Smad1 和 Smad3 與 TGF-β 和 BMP2 介導的成骨細胞標記物 Runx2 及 ALP 水平升高有關，而 Smurf2 則是該作用的負向調控因子[33-34]。在正常情況下，機體可通過 TGF-β/BMP2-Smad1/Smad3-Runx2/ALP-Smurf2 的負反饋環路抑制 TGF-β 和 BMP2 誘導的 Smad1 和 Smad3 信號，使瓣膜內鈣化相關因子處于正常水平，防止鈣化的發生。在病理狀態下，該環路受到破壞，導致鈣化相關因子生成增多而促進主動脈瓣鈣化的進展。
最近的研究發現在鈣化主動脈瓣中有 T 細胞克隆性增殖以及 CD4+和 CD8+T 細胞浸潤[9]。CAVD 患者 CD3+T 細胞表達人類白細胞 DR 抗原（human leukocyte antige，HLA-DR）水平升高，CD8+和 CD57+T 細胞亞群表達 HLA-DR 比例增加，這充分說明在主動脈瓣鈣化中有特異性免疫的參與[35]。有學者認為抗原表位的氧化性修飾能激活 T 細胞[9]，該觀點仍有待證實。
目前已明確非特異性免疫在 CAVD 中具有重要作用，但對特異性免疫研究較少。鈣化瓣膜中大量促炎性細胞因子表達上調、相關信號通路的激活，而抗炎性細胞因子表達則受到抑制。我們推測兩類細胞因子在主動脈瓣中失衡是炎癥促進 CAVD 進展的重要因素之一。IL-37 的抗炎作用能抑制鈣化相關信號通路的活性，因此該細胞因子有望成為延緩 CAVD 進展的治療靶點。
3 非編碼 RNA 對炎癥及促鈣化因子的調控促進主動脈瓣鈣化進展
3.1 miRNA 對炎癥及促鈣化因子的調控
炎癥反應和脂質代謝是 CAVD 進展的經典機制，但兩種機制涉及的信號通路和分子還受到基因水平的調控。非編碼 RNA 是調控編碼蛋白質基因的重要分子，且與多種疾病的發生發展有關。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類由內源性基因編碼、長度約為 20～24 個核苷酸、高度保守的非編碼 RNA，它在基因表達的轉錄后修飾中具有重要作用并且與多種疾病發生發展有關。最近有大量研究發現正常瓣膜與鈣化瓣膜的多種 miRNA 呈差異性表達且與主動脈瓣鈣化的進展密切相關。目前已發現二葉式主動脈瓣（bicuspid aortic valve，BAV）的狹窄瓣膜中 miR-26a、miR-30b 和 miR-195 表達下調，鈣化瓣膜中 miR-374b、miR-602 和 miR-939 表達下調而 miR-125b 水平上調[36-37]。此外，巨噬細胞對主動脈瓣鈣化的促進作用也與 miRNA 有關。
miR-26a 對促鈣化因子如 BMP2、Runx2、SMAD1 和 SMAD5 具有抑制作用，同時能增強鈣化抑制基因如 Smad7 和 JAG2 的表達，miR-30b 亦可增強 Smad7 和 JAG2 的表達而表現出抑制鈣化的效應，miR-195 則能活化促鈣化基因[37]。其中 JAG2 是 Notch 信號通路的配體，它可能通過對 NOTCH1 的作用抑制主動脈瓣鈣化的進展[38]。MiR-939 對內皮一氧化氮合成酶（endothelialnitric oxide synthase，eNOS）具有調節作用，eNOS 能降低 α-SMA 水平、抑制 MMP9 活性和 TGF-β 的下游分子 Smad2 磷酸化等機制防止瓣膜纖維化、抑制 VIC 的促纖維化因子活性，而 eNOS-/-基因敲除的小鼠易發生主動脈瓣鈣化[36, 39]。鈣化瓣膜中 MiR-939 表達下調可能導致 eNOS 合成減少并促進主動脈瓣鈣化的進展。此外，在 TGF-β/BMP2-Smad1/Smad3-Runx2/ALP-Smurf2 負反饋環路中，TGF-β 和 BMP2 通過上調 VIC 中 miR-486、下調 miR-204 水平增強促成骨活動，miR-486 通過抑制 Smurf2 表達使 miR-204 水平下調，最終加快瓣膜鈣化的進展[32]。miR-374b 是 CCTTA 增強子結合蛋白-β（C/EBP-β）的調節因子且與巨噬細胞極化有關[40]。靜止的巨噬細胞可促進 VIC 向成骨細胞分化，巨噬細胞極化能影響促炎性細胞因子的釋放及其對 VIC 的作用并調節 VIC 向成骨細胞分化，而極化的 M1 型巨噬細胞可能分泌 TNF-α 和 IL-6 形成促炎環境而進一步促進 VIC 鈣化[41]。miR-125b 能調節炎癥因子的基因表達及血管鈣化，具有炎癥調節作用的趨化因子 CCL4 是 miR-125b 的作用靶點，最近研究已證實鈣化瓣膜中二者水平均上調能促進 CAVD 的進展[36]。
miRNA 是腫瘤學領域的研究熱點，但關于 CAVD 的 miRNA 研究較少。近年的研究表明 miRNA 與 CAVD 的易感性與進展密切相關。miRNA 亦參與了炎癥因子、纖維化和鈣化相關因子表達的調控以及炎癥細胞功能的調節，這表明其與瓣膜內炎癥反應有關。目前正在研究 miRNA 作為急性心肌梗死和心力衰竭的生物標記物的可行性[42]，但在 CAVD 中尚缺乏可能作為生物標記物的 miRNA。因此，對 miRNA 與其它機制之間的相互作用進行深入研究、尋找可能作為 CAVD 標記物的 miRNA 分子對于闡明 CAVD 的發病機制、早期發現并干預 CAVD 的進展有重要意義。
3.2 lncRNA 對鈣化相關因子的調控
長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 RNA，越來越多的證據表明 lncRNA 是調節基因表達和細胞分化的關鍵因子，它能與蛋白質相互作用、干擾 miRNA、修飾表觀基因組并被基因啟動子募集而干預基因表達[43-44]。
Hox 轉錄反義基因間 RNA（hox transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）是一種lncRNA，長度為 2 200 個核苷酸，能使多個轉移抑制基因沉默促進惡性腫瘤轉移。BAV 由于長期承受較正常瓣膜更大的機械剪切力而更易發生鈣化。有研究發現 BAV 的 VIC 中 HOTAIR 水平較三葉式主動脈瓣（tricuspid aortic valve，TAV）的 VIC 水平低，同時伴有鈣化相關基因肝/骨/腎型堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，liver/bone/kidney，ALPL）和 BMP2 表達水平增高，這些改變與瓣膜長期承受機械張力所致 Wnt/β-Catenin 信號通路的激活有關[45]。這表明 HOTAIR 能抑制鈣化相關基因的表達，而且 HOTAIR 基因位點的 SNP 可能與主動脈瓣鈣化有關。
lncRNA H19 為一種印記基因，H19-胰島素樣生長因子 2（insulin-like growth factor，H19-IGF2）的基因位點包含了差異性甲基化區域（differentially methylated region，DMR）[46]。對鈣化瓣膜的標本進行檢測后發現 H19 的啟動子區域低甲基化并導致其過表達，H19 過表達可誘導鈣化相關基因 Runx2 表達上調、抑制 NOTCH1 基因表達、激活 Wnt 信號通路從而促進 VIC 獲得成骨細胞表型[47-49]。NOTCH1 對促鈣化因子 Runx2 和 BMP2 具有負向調控作用，轉錄因子 P53 是 NOTCH1 的重要調節因子且能負向調控成骨細胞分化，H19 對 NOTCH1 基因表達的抑制作用可能與其抑制 P53 在 NOTCH1 啟動子區域的募集有關[49-50]。因此，H19 能在轉錄水平調控 NOTCH1 表達從而促進主動脈瓣鈣化的進展。
lncRNA 是遺傳學和腫瘤學領域的研究熱點，并有大量研究表明 lncRNA 參與了腫瘤的發生發展和轉移以及退行性神經疾病的進展，但心血管領域的此類研究較少。lncRNA 所調控的 NOTCH1 基因和 BMP2 亦受到炎癥因子的調控。lncRNA 對成骨相關基因和信號通路的調控是否有炎癥的參與還不清楚，因此我們需要對 lncRNA 與炎癥在主動脈瓣鈣化中有無相互作用進行綜合考慮。對 lncRNA 在 CAVD 中作用的深入研究能為闡明其發病機制提供新視角，并在分子生物學水平上為該疾病的藥物治療提供新靶點。
4 總結
CAVD 并非單純的瓣膜退行性病變，炎癥反應、脂質代謝異常以及非編碼 RNA 的調控均參與其中，共同促進主動脈瓣鈣化的進展。一方面，瓣膜局部炎癥反應和脂質代謝異常的經典機制與 CAVD 的發生發展明確相關，脂質代謝異常可誘發或加重瓣膜局部的炎癥反應促進 CAVD 進展。另一方面，分子生物學研究表明 Lp（a）編碼基因 SNP 所致的脂質代謝異常、miRNA 與 lncRNA 對鈣化相關基因的調控亦與 CAVD 的進展有關，miRNA 和 lncRNA 上調具有促鈣化作用的炎癥因子而抑制抗鈣化因子的活性最終加快瓣膜鈣化的進展。現已證實抗 IL-1β 單抗對減輕血管鈣化有一定作用，對老年患者實行藥物治療后再給予必要的手術治療亦有助于降低術后死亡風險。盡管對主動脈瓣鈣化的發病機制在炎癥、脂質代謝和基因水平上做了大量研究，但瓣膜局部有多種細胞成分，多種細胞間有相互作用，因此還原體內環境、探討細胞間通訊對主動脈瓣鈣化的作用，對于明確 CAVD 的發病機制、尋找合適的治療靶點具有重要意義。