引用本文： 張耀超, 張晗, 柳立軍, 宋永彬, 張桂彬, 崔紅賞. 兔連枷胸模型建立的研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2018, 25(2): 159-163. doi: 10.7507/1007-4848.201611007 復制
肋骨骨折在胸部創傷中較為多見。多根多處肋骨骨折所致的浮動胸壁稱為連枷胸。連枷胸所致的反常呼吸運動導致縱隔擺動，是影響呼吸、循環功能的重要因素之一，嚴重時可導致呼吸窘迫綜合征。動物模型為研究連枷胸的病理生理變化、診斷、治療提供實驗材料，因此制備適宜的連枷胸動物模型是必要的[1-4]。本實驗旨在建立連枷胸兔模型，為進一步研究連枷胸的病理生理變化、發展過程及治療方法奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
健康雄性 6 月齡新西蘭大白兔 12 只，購于河北醫科大學實驗動物中心（實驗動物許可證號：SCXK（冀）2013-1-003），體重 2.5～3.0 kg。標準飼料，單籠飼養，明暗周期 12 h 交替，自由取食和飲水，房間溫度保持在（25±1）℃，濕度在 50%～60%。
1.1.2 主要試劑、藥品與器材
試劑、藥品包括戊巴比妥鈉（北京索來寶科技有限公司）、利多卡因、生理鹽水、碘伏、醫用酒精。主要器材包括 MD3000 生物信號采集系統（淮北正華）、肌張力換能器 ZH（淮北正華）2 個、血氣分析儀（Cobasb123，Roche 公司，瑞士）、心電監護儀、小兒氣管插管 3-0、電子纖維支氣管鏡，電子天平、動物體重秤、兔解剖臺、注射器及針頭、血氣針、留置針、小夾子、無菌手術包、縫合線、自制胸腔引流管、簡易呼吸裝置（皮球）。
1.2 實驗方法
1.2.1 兔連枷胸模型建立的手術方法
耳緣靜脈放置留置針。1% 戊巴比妥鈉按 30 mg/kg 耳緣靜脈注射麻醉動物[5]。麻醉后平臥于實驗臺上綁定，經口電子纖維支氣管鏡輔助行氣管插管，插管深度 12 cm。插管成功后取左側臥位綁定。行左側胸壁第 5 肋順肋骨方向手術切口，切口長約 5 cm。依次切開皮膚、皮下組織及肌肉各層，給予銳性+鈍性分離充分暴露第 5、6、7 肋。分別結扎第 5、6、7 肋的兩端擬切斷處。剪斷第 5、6、7 肋各 2 處，使之形成 3 根長約 3 cm 游離肋骨段，形成連枷。充分止血后胸腔內預留自制胸腔引流管，逐層縫合肌肉皮膚，形成連枷胸（圖 1）。動物于麻醉清醒后拔出氣管插管。
圖1
連枷胸模型
1.2.2 指標觀察
一般情況：手術時間、手術死亡率、氣管插管時間。生命體征：于術前，術后 1 h、3 h、12 h、1 d、3 d、7 d 用心電監護儀檢測心率、呼吸頻率。
胸壁反常呼吸運動：在連枷區域皮膚及正常胸壁區域皮膚分別縫針掛線。兩根線分別與兩個肌張力換能器相連：A 張力換能器連接 a 點（正常胸壁處）接通道 1，B 張力換能器連接 b 點（手術胸壁處）接通道 2。MD3000 生物信號采集系統收集信號（圖 2）。
圖2
MD3000 生物信號采集系統連接圖
血氣分析：于術前，術后 1 h、3 h、12 h、1 d、3 d、7 d 采耳中動脈血標本 1.5 ml 在血氣分析儀上測定動脈 pH 值、二氧化碳分壓（PaCO2）、血氧分壓（PaO2）、動脈血氧飽和度（SaO2）和剩余堿（BE）。
病理組織學檢查：實驗終點（術后 1 周）耳緣靜脈空氣栓塞處死動物并立即取患側肺組織進行病理學檢查。
1.3 統計學分析
運用 SPSS21.0 軟件進行統計分析。計量數據采用均數±標準差（
）表示，以 α=0.05 為檢驗水準，采用重復測量方差分析。首先進行正態性檢驗，然后進行球對稱檢驗，若滿足球對稱檢驗采用 Sphericity Assumed 檢驗；若不滿足球對稱檢驗采用 Greenhouse-Geisser 檢驗。
2 結果
2.1 手術情況
手術時間（41.42±7.08）min。無死亡。氣管插管時間（79.33±12.21） min。
2.2 生命體征
重復測量方差分析顯示各時間點心率差異有統計學意義（P<0.01）。不同時間點成對比較：術前與術后 1 h 差異有統計學意義，術前與術后 3 h、12 h、1 d、3 d、7 d 差異均無統計學意義；見表 1。
重復測量方差分析顯示各時間點呼吸頻率差異有統計學意義（P<0.01）。不同時間點成對比較：術前與術后 1 h、3 h、12 h、1 d、3 d、7 d 差異均有統計學意義。
表1
心電監護指標（
）
2.3 胸壁反常呼吸運動情況
MD3000 生物信號采集系統收集信號（圖 3），呼吸時在相同時相胸壁 A 點和 B 點運動方向相反，并且肉眼觀察也同時可見，說明出現了明顯胸壁反常呼吸運動，連枷胸造模成功。
圖3
通道曲線結果圖
a：通道 1 曲線結果圖；b：通道 2 曲線結果圖
2.4 血氣分析
重復測量方差分析顯示各時間點之間的 pH 值、PaCO2、PaO2、SaO2、BE 差異有統計學意義（P<0.01）；術后 1 h、12 h、1 d、3 d 和 7 d 的 pH 值與術前差異均有統計學意義；術后 1 h、3 h、1 d、3 d 和 7 d 的 PaCO2 與術前差異均有統計學意義；術后各時間點的 PaO2 和 BE 與術前相比差異均有統計學意義；術后 1 h、1 d、3 d 和 7 d 的 SaO2 與術前差異均有統計學意義；見表 2。
表2
血氣分析結果（
）
2.5 病理形態學檢查
2.5.1 肉眼觀察大體標本
肉眼觀察大體標本可見肺葉不張、粘連。肺充血、肺出血為斑點狀，有明顯水腫，肺損傷明顯（圖 4）。
圖4
術后肺組織大體標本
2.5.2 光鏡觀察肺組織病理切片
光鏡觀察見肺泡和毛細血管損傷；肺組織內紅細胞增多、炎癥細胞增多，可見大量中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞。肺泡內水腫、出血、肺泡結構破壞；肺泡間質增厚，肺水腫嚴重（圖 5、圖 6）。
圖5
術后肺組織水腫嚴重（HE×10）
圖6
術后肺組織炎癥細胞增多（HE×100）
3 討論
正常人在吸氣時胸廓抬起，呼氣時胸壁下降。胸壁反常呼吸運動是一種病理的呼吸運動，是胸部外傷后致連枷胸，胸廓的完整性遭到破壞，使胸壁失去完整肋骨支撐而軟化所致，導致胸部傷處軟組織失去胸廓的支撐，出現反常呼吸，即隨呼氣外凸，吸氣時凹陷[6-7]。
本研究生命體征、血氣分析結果顯示說明實驗動物術后呼吸費力，出現了淺快呼吸，實驗動物術后 1 h、3 h 受麻醉影響，術后 1 d、3 d、7 d 趨于穩定，處于呼吸性酸增高，代謝性堿增高，考慮為呼酸后代償性的堿升高，最終導致 pH 值增高的狀態（可能為堿代償占了主要趨勢或者因為呼吸頻率快，過多的二氧化碳呼出導致）。動物長期處于低氧狀態，影響氧飽和度。說明連枷胸導致胸壁反常運動，影響縱隔擺動，最后影響呼吸功能[8-9]。病理形態學檢查說明連枷胸長期作用的結果導致實驗動物器質性改變。導致通氣和換氣功能障礙，使肺動脈壓和肺循環阻力增高，影響呼吸功能。所以，連枷胸需要進行必要的干預措施[10-11]。
3.1 實驗動物選擇
建立可重復、穩定、成功率高的動物模型是開展連枷胸臨床治療的基礎。目前用于開展胸部創傷連枷胸、肺挫傷的動物主要有兔[12-13]、狗[14-15]、豬[16-17]、鼠[18-19]和羊[20-21]。連枷胸動物模型要求盡量來源廣、價格適中，能夠成功構建所要模擬研究的肋骨、肌肉、肺、神經等對象及內環境的改變。狗性格兇猛、價格較高，需要一些特殊麻醉[22]；羊來源廣泛，是較好的動物來源，但價格較高；豬肋骨與人體接近，價格較高，應用少。鼠肋骨較短且細，胸腔小，手術操作困難，術后死亡率較高，一般不作為連枷胸動物模型。兔胸廓體積合適，性格溫順，來源廣泛，其經濟成本較低[23]，但是尚未見有連枷胸兔模型的文獻報道。本研究中作者選擇兔作為實驗對象，主要用于研究連枷胸兔模型可否出現明顯胸壁反常運動，模擬人體連枷胸后一系列生理功能如呼吸功能的影響，為研究不同治療方法奠定基礎。具有操作簡便、可重復性高、安全性好的優勢。
3.2 造模方式選擇
目前實驗研究中制作連枷胸/肺挫傷動物模型的方式有：（1）胸部撞擊器法[12, 15, 19, 24]；（2）手術咬剪肋骨法。第一種方法具有更接近現實情況的優點，但同時也有不利于單獨研究肺挫傷或連枷胸的缺點，有發生復合傷（損傷心臟、食管等）的可能，所以導致損傷部位不完全可控，常導致連枷胸/肺挫傷等復合傷，不能單獨評價連枷胸或肺挫傷對疾病的影響；第二種方法又分為截取肋骨法[9]和直接咬剪法等不同方式。其中截取肋骨法制作連枷胸模型優點是容易形成浮動胸壁，使反常呼吸趨勢明顯，但缺點是截取的肋骨長度不易控制，脫離疾病發生、愈合的自然轉歸狀態，容易發生骨折不易愈合可能。本實驗中我們采用的直接咬剪法手術方法制作連枷胸動物模型可控性強，可以避免復合傷的影響，更接近于連枷胸發生時的真實狀態。
我們認為該種連枷胸兔模型可以模擬人類連枷胸患者，并且可以單獨研究連枷胸避免復合傷的影響，動物來源廣泛、整體模型穩定性高、可重復性好、操作簡便、安全性高，是研究連枷胸疾病過程、恢復過程、干預方案效果的基礎。
肋骨骨折在胸部創傷中較為多見。多根多處肋骨骨折所致的浮動胸壁稱為連枷胸。連枷胸所致的反常呼吸運動導致縱隔擺動，是影響呼吸、循環功能的重要因素之一，嚴重時可導致呼吸窘迫綜合征。動物模型為研究連枷胸的病理生理變化、診斷、治療提供實驗材料，因此制備適宜的連枷胸動物模型是必要的[1-4]。本實驗旨在建立連枷胸兔模型，為進一步研究連枷胸的病理生理變化、發展過程及治療方法奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
健康雄性 6 月齡新西蘭大白兔 12 只，購于河北醫科大學實驗動物中心（實驗動物許可證號：SCXK（冀）2013-1-003），體重 2.5～3.0 kg。標準飼料，單籠飼養，明暗周期 12 h 交替，自由取食和飲水，房間溫度保持在（25±1）℃，濕度在 50%～60%。
1.1.2 主要試劑、藥品與器材
試劑、藥品包括戊巴比妥鈉（北京索來寶科技有限公司）、利多卡因、生理鹽水、碘伏、醫用酒精。主要器材包括 MD3000 生物信號采集系統（淮北正華）、肌張力換能器 ZH（淮北正華）2 個、血氣分析儀（Cobasb123，Roche 公司，瑞士）、心電監護儀、小兒氣管插管 3-0、電子纖維支氣管鏡，電子天平、動物體重秤、兔解剖臺、注射器及針頭、血氣針、留置針、小夾子、無菌手術包、縫合線、自制胸腔引流管、簡易呼吸裝置（皮球）。
1.2 實驗方法
1.2.1 兔連枷胸模型建立的手術方法
耳緣靜脈放置留置針。1% 戊巴比妥鈉按 30 mg/kg 耳緣靜脈注射麻醉動物[5]。麻醉后平臥于實驗臺上綁定，經口電子纖維支氣管鏡輔助行氣管插管，插管深度 12 cm。插管成功后取左側臥位綁定。行左側胸壁第 5 肋順肋骨方向手術切口，切口長約 5 cm。依次切開皮膚、皮下組織及肌肉各層，給予銳性+鈍性分離充分暴露第 5、6、7 肋。分別結扎第 5、6、7 肋的兩端擬切斷處。剪斷第 5、6、7 肋各 2 處，使之形成 3 根長約 3 cm 游離肋骨段，形成連枷。充分止血后胸腔內預留自制胸腔引流管，逐層縫合肌肉皮膚，形成連枷胸（圖 1）。動物于麻醉清醒后拔出氣管插管。
圖1
連枷胸模型
1.2.2 指標觀察
一般情況：手術時間、手術死亡率、氣管插管時間。生命體征：于術前，術后 1 h、3 h、12 h、1 d、3 d、7 d 用心電監護儀檢測心率、呼吸頻率。
胸壁反常呼吸運動：在連枷區域皮膚及正常胸壁區域皮膚分別縫針掛線。兩根線分別與兩個肌張力換能器相連：A 張力換能器連接 a 點（正常胸壁處）接通道 1，B 張力換能器連接 b 點（手術胸壁處）接通道 2。MD3000 生物信號采集系統收集信號（圖 2）。
圖2
MD3000 生物信號采集系統連接圖
血氣分析：于術前，術后 1 h、3 h、12 h、1 d、3 d、7 d 采耳中動脈血標本 1.5 ml 在血氣分析儀上測定動脈 pH 值、二氧化碳分壓（PaCO2）、血氧分壓（PaO2）、動脈血氧飽和度（SaO2）和剩余堿（BE）。
病理組織學檢查：實驗終點（術后 1 周）耳緣靜脈空氣栓塞處死動物并立即取患側肺組織進行病理學檢查。
1.3 統計學分析
運用 SPSS21.0 軟件進行統計分析。計量數據采用均數±標準差（
）表示，以 α=0.05 為檢驗水準，采用重復測量方差分析。首先進行正態性檢驗，然后進行球對稱檢驗，若滿足球對稱檢驗采用 Sphericity Assumed 檢驗；若不滿足球對稱檢驗采用 Greenhouse-Geisser 檢驗。
2 結果
2.1 手術情況
手術時間（41.42±7.08）min。無死亡。氣管插管時間（79.33±12.21） min。
2.2 生命體征
重復測量方差分析顯示各時間點心率差異有統計學意義（P<0.01）。不同時間點成對比較：術前與術后 1 h 差異有統計學意義，術前與術后 3 h、12 h、1 d、3 d、7 d 差異均無統計學意義；見表 1。
重復測量方差分析顯示各時間點呼吸頻率差異有統計學意義（P<0.01）。不同時間點成對比較：術前與術后 1 h、3 h、12 h、1 d、3 d、7 d 差異均有統計學意義。
表1
心電監護指標（
）
2.3 胸壁反常呼吸運動情況
MD3000 生物信號采集系統收集信號（圖 3），呼吸時在相同時相胸壁 A 點和 B 點運動方向相反，并且肉眼觀察也同時可見，說明出現了明顯胸壁反常呼吸運動，連枷胸造模成功。
圖3
通道曲線結果圖
a：通道 1 曲線結果圖；b：通道 2 曲線結果圖
2.4 血氣分析
重復測量方差分析顯示各時間點之間的 pH 值、PaCO2、PaO2、SaO2、BE 差異有統計學意義（P<0.01）；術后 1 h、12 h、1 d、3 d 和 7 d 的 pH 值與術前差異均有統計學意義；術后 1 h、3 h、1 d、3 d 和 7 d 的 PaCO2 與術前差異均有統計學意義；術后各時間點的 PaO2 和 BE 與術前相比差異均有統計學意義；術后 1 h、1 d、3 d 和 7 d 的 SaO2 與術前差異均有統計學意義；見表 2。
表2
血氣分析結果（
）
2.5 病理形態學檢查
2.5.1 肉眼觀察大體標本
肉眼觀察大體標本可見肺葉不張、粘連。肺充血、肺出血為斑點狀，有明顯水腫，肺損傷明顯（圖 4）。
圖4
術后肺組織大體標本
2.5.2 光鏡觀察肺組織病理切片
光鏡觀察見肺泡和毛細血管損傷；肺組織內紅細胞增多、炎癥細胞增多，可見大量中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞。肺泡內水腫、出血、肺泡結構破壞；肺泡間質增厚，肺水腫嚴重（圖 5、圖 6）。
圖5
術后肺組織水腫嚴重（HE×10）
圖6
術后肺組織炎癥細胞增多（HE×100）
3 討論
正常人在吸氣時胸廓抬起，呼氣時胸壁下降。胸壁反常呼吸運動是一種病理的呼吸運動，是胸部外傷后致連枷胸，胸廓的完整性遭到破壞，使胸壁失去完整肋骨支撐而軟化所致，導致胸部傷處軟組織失去胸廓的支撐，出現反常呼吸，即隨呼氣外凸，吸氣時凹陷[6-7]。
本研究生命體征、血氣分析結果顯示說明實驗動物術后呼吸費力，出現了淺快呼吸，實驗動物術后 1 h、3 h 受麻醉影響，術后 1 d、3 d、7 d 趨于穩定，處于呼吸性酸增高，代謝性堿增高，考慮為呼酸后代償性的堿升高，最終導致 pH 值增高的狀態（可能為堿代償占了主要趨勢或者因為呼吸頻率快，過多的二氧化碳呼出導致）。動物長期處于低氧狀態，影響氧飽和度。說明連枷胸導致胸壁反常運動，影響縱隔擺動，最后影響呼吸功能[8-9]。病理形態學檢查說明連枷胸長期作用的結果導致實驗動物器質性改變。導致通氣和換氣功能障礙，使肺動脈壓和肺循環阻力增高，影響呼吸功能。所以，連枷胸需要進行必要的干預措施[10-11]。
3.1 實驗動物選擇
建立可重復、穩定、成功率高的動物模型是開展連枷胸臨床治療的基礎。目前用于開展胸部創傷連枷胸、肺挫傷的動物主要有兔[12-13]、狗[14-15]、豬[16-17]、鼠[18-19]和羊[20-21]。連枷胸動物模型要求盡量來源廣、價格適中，能夠成功構建所要模擬研究的肋骨、肌肉、肺、神經等對象及內環境的改變。狗性格兇猛、價格較高，需要一些特殊麻醉[22]；羊來源廣泛，是較好的動物來源，但價格較高；豬肋骨與人體接近，價格較高，應用少。鼠肋骨較短且細，胸腔小，手術操作困難，術后死亡率較高，一般不作為連枷胸動物模型。兔胸廓體積合適，性格溫順，來源廣泛，其經濟成本較低[23]，但是尚未見有連枷胸兔模型的文獻報道。本研究中作者選擇兔作為實驗對象，主要用于研究連枷胸兔模型可否出現明顯胸壁反常運動，模擬人體連枷胸后一系列生理功能如呼吸功能的影響，為研究不同治療方法奠定基礎。具有操作簡便、可重復性高、安全性好的優勢。
3.2 造模方式選擇
目前實驗研究中制作連枷胸/肺挫傷動物模型的方式有：（1）胸部撞擊器法[12, 15, 19, 24]；（2）手術咬剪肋骨法。第一種方法具有更接近現實情況的優點，但同時也有不利于單獨研究肺挫傷或連枷胸的缺點，有發生復合傷（損傷心臟、食管等）的可能，所以導致損傷部位不完全可控，常導致連枷胸/肺挫傷等復合傷，不能單獨評價連枷胸或肺挫傷對疾病的影響；第二種方法又分為截取肋骨法[9]和直接咬剪法等不同方式。其中截取肋骨法制作連枷胸模型優點是容易形成浮動胸壁，使反常呼吸趨勢明顯，但缺點是截取的肋骨長度不易控制，脫離疾病發生、愈合的自然轉歸狀態，容易發生骨折不易愈合可能。本實驗中我們采用的直接咬剪法手術方法制作連枷胸動物模型可控性強，可以避免復合傷的影響，更接近于連枷胸發生時的真實狀態。
我們認為該種連枷胸兔模型可以模擬人類連枷胸患者，并且可以單獨研究連枷胸避免復合傷的影響，動物來源廣泛、整體模型穩定性高、可重復性好、操作簡便、安全性高，是研究連枷胸疾病過程、恢復過程、干預方案效果的基礎。
