引用本文： 李斌, 朱多杰, 何雯婷, 劉濤, 王成, 宋鐵牛, 楊建寶, 郭權威, 蔣鵬, 魏小平, 孟于琪. 靶向沉默 DDX46 基因對食管鱗癌 TE-1 細胞增殖及凋亡的影響. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2017, 24(6): 463-468. doi: 10.7507/1007-4848.201608084 復制
食管癌居全球惡性腫瘤死亡率第 6 位[1]。中國是食管癌發病率和死亡率最高的國家，全球近 70% 的食管癌發生在中國，死亡率居我國所有惡性腫瘤第 4 位，嚴重威脅國人健康[2]。我國食管癌的病理學類型 90% 以上為食管鱗癌，目前遠期療效很不理想，基因事件在食管鱗癌發生發展中的機制仍不清楚[3]。近年來 RNA 在生命系統中的重要作用備受關注，而 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶參與了 RNA 代謝的全過程[4]。DDX 解旋酶可通過改變癌基因表達水平、基因突變，或者參與腫瘤啟動和進展相關信號通路、調控腫瘤耐藥基因的表達，參與腫瘤的發生發展[5]。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成員[5]，我們前期研究報道了 DDX46 蛋白表達主要定位于細胞核，食管鱗癌組織中 DDX46 蛋白和 mRNA 的表達均明顯高于相對應食管正常組織[6]。本實驗通過 shRNA 干擾技術，探討靶向沉默 DDX46 基因對食管鱗癌 TE-1 細胞增殖及凋亡的影響，并闡述可能的作用機制，以期為揭示食管鱗癌新型生物學標記、探索新的個體化治療策略提供實驗依據。
1 資料與方法
1.1 細胞系來源
本實驗所用人食管鱗癌細胞 TE-1 購于上海生命科學研究院細胞資源中心，人永生化食管鱗狀上皮細胞 Het-1A 購于上海拜力生物科技有限公司。
1.2 主要試劑和儀器
本實驗使用的主要試劑包括 RNAlater（Qiagen）、Trizol 試劑（Invitrogen）、胎牛血清（Ausbian）、胰蛋白酶（上海生工）、M-MLV 逆轉錄酶（Promega）、Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer Set（廣州銳博）、SYBR premix ex taq（TaKaRa）、PCR 擴增試劑盒（TaKaRa）、dNTPs（Promega）、EDTA（上海生工）、Primer（廣州銳博）、Rnase Inhibitor（Promega）、RPMI-1640 細胞培養基（Lonza）、BulletKit 內皮細胞培養基（Lonza）、Anti-DDX46（Sigma-Aldrich）、D-Hanks 液（Sigma-Aldrich）、Lipofectamine 2000 轉染試劑（Invitrogen）、Giemsa（上海鼎國）、Annexin V-APC single-staining 凋亡試劑盒（eBioscience）、PathScan? Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit（CST）。
本實驗所用主要儀器與設備包括二氧化碳細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific）、隔水式恒溫培養箱（上海一恒）、Nanodrop 分光光度計（Thermo Fisher Scientific）、PCR 儀（Applied Biosystems）、Cellomics 高內涵篩選成像系統（Thermo Fisher Scientific）、熒光顯微鏡（Olympus）、倒置相差顯微鏡（Olympus）、流式細胞儀（Millipore）、高速冷凍臺式離心機（Thermo Fisher Scientific）、超速離心機（Thermo Fisher Scientific）、精密天平（浙江力辰）。
1.3 方法
1.3.1 細胞培養及傳代 目的細胞 TE-1 培養于 RPMI-1640 培養液中，Het-1A 培養于 BulletKit 內皮細胞培養基中，均置于 37℃、5% CO 2 培養箱內。每 3 d 換液 1 次。支原體檢測均為陰性。至細胞 80% 融合且狀態良好時，棄舊培養液，加入適量磷酸鹽緩沖液（PBS）輕柔清洗1遍，再加入適量 0.25% 胰蛋白酶消化約 2～5 min，置于顯微鏡下觀察，細胞回縮變圓后棄去胰酶消化液，并立即加入細胞培養液終止消化。吸管吸取培養瓶內培養液反復吹打瓶壁上的細胞，使貼壁細胞脫落制成單細胞懸液。將上述單細胞懸液移至 10 ml 離心管，1 000 rpm 離心 5 min，棄上清液，加入 2 ml 培養液重懸混勻細胞后，將細胞重新接種于新的培養瓶中（細胞數≥1×104 個），置于 37℃、5% CO 2 培養箱內繼續培養。取對數生長期細胞用于實驗。
1.3.2 目的細胞 DDX46 基因 qRT-PCR 檢測 收集目的細胞，用 2 000 rpm 離心 5 min 后，棄上清液，沉淀的細胞中加入 Trizol 裂解液 1 ml，充分混勻后靜置于室溫下 5 min，然后轉移至 1.5 ml EP 管中，完成細胞樣本 Trizol 裂解。依據 Invitrogen 公司 Trizol 操作說明書完成總 RNA 抽提。依據 Promega 公司 M-MLV 操作說明書逆轉錄 RNA 獲得 cDNA。以 GAPDH 基因為內參，兩步法進行 qRT-PCR，2–??Ct法計算 DDX46 基因 mRNA 的相對表達量（?Ct=目的基因 Ct 值–內參基因 Ct 值；??Ct=樣品 ?Ct 值–對照組 ?Ct 平均值）。實驗重復 3 次。
1.3.3 DDX46 基因 RNAi 慢病毒制備和包裝 DDX46基因 RNAi 靶點序列和 RNAi 慢病毒（DDX46-shRNA-LV）制備和包裝由上海吉凱基因化學技術有限公司設計完成，DDX46 基因 shRNA 序列：5′-AGAAATCACCAGGCTCATA-3′，陰性對照序列應用公認序列：5′-TTCTCCGAACGTGT CACGT-3′[7]。
1.3.4 慢病毒感染 TE-1 細胞 胰蛋白酶消化對數生長期的 TE-1 細胞，然后 RPMI-1640 完全培養基重懸制成 3×104～5×104 個細胞/ml 的懸液，均勻接種至 6 孔板中繼續培養；鋪板量達到 30% 左右時，更換感染培養基，加入最適病毒量進行感染（感染復數為 5），實驗組（DDX46 基因 RNAi 靶點序列慢病毒感染，DDX46-shRNA-LV 組）病毒滴度 2×108 TU/ml、病毒感染用量 5 μl，對照組（陰性對照序列慢病毒感染，Control-LV 組）病毒滴度 4×108 TU/ml、病毒感染用量 2.5 μl；感染后 12 h，更換為常規培養基繼續培養；觀察細胞狀態良好，未出現大量死亡現象，實驗組與對照組細胞狀態相當；感染后 72 h，熒光顯微鏡觀察報告基因綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，熒光率即為陽性感染率。
1.3.5 qRT-PCR 檢測 DDX46 基因的敲減效率 實驗方法同 1.3.2。
1.3.6 細胞計數檢測 將處于對數生長期的各組細胞胰蛋白酶消化，完全培養基重懸細胞成懸液并計數；以每孔 2 000 細胞接種于 96 孔板，每組 3 復孔，培養體系為每孔 100 μl，鋪板過程中每孔加入細胞數一致，37℃、5%CO 2 培養箱培養；鋪板后第 2 d 開始，每天 Cellomics 高內涵篩選成像系統（HCS）檢測讀板 1 次，連續 5 d；計算出每次 HCS 檢測掃描孔板中帶綠色熒光的細胞數量，繪出 5 d 的細胞增殖曲線圖：根據細胞計數值和時間點，繪制基于細胞計數值的細胞生長曲線；計算各組細胞各時間點細胞計數值與該組第 1 d 的細胞計數值的比值，獲得該組細胞各時間點的增殖倍數，根據該增殖倍數和時間點，繪制基于細胞增殖倍數的細胞生長曲線。
1.3.7 克隆形成實驗 將處于對數生長期的各組細胞胰蛋白酶消化，完全培養基重懸細胞成懸液并計數；以每孔 600 細胞接種于 6 孔板培養板中，每組設 3 復孔，培養體系為每孔 2 ml；將接種好的細胞 37℃、5%CO 2 培養箱中持續培養 15 d，中途每 5 d 進行換液并觀察細胞狀態；實驗終止前熒光顯微鏡下對細胞克隆進行拍照，PBS 液洗滌細胞 1 次；每孔加入 4% 多聚甲醛 1 ml，固定細胞 30～60 min，PBS 液洗滌細胞 1 次；每孔加入 Giemsa 染液 500 μl，染色細胞 10～20 min；ddH 2O 洗滌細胞數次，晾干后拍照，克隆計數（含有 50 個以上細胞的克隆計為 1 個細胞克隆）。
1.3.8 細胞凋亡實驗 待各組 6 孔板細胞生長至覆蓋率約為 80% 時胰酶消化，完全培養基重懸細胞成懸液，與孔板上清細胞收集于同一 5 ml 離心管中（細胞數≥5×105 個），每組設 3 個孔；1 300 rmp 離心 5 min，棄上清液，4℃ 預冷的 D-Hanks 液（pH 值 7.2～7.4）洗滌細胞沉淀 1 次；Binding Buffer 洗滌細胞沉淀 1 次，1 300 rmp 離心 3 min 收集細胞；200 μl Binding Buffer 重懸細胞沉淀；加入 10 μl Annexin V-APC 染色，室溫避光 10～15 min，上流式細胞儀檢測。
1.3.9 PathScan? Antibody Array 檢測 目的細胞 Trizol 裂解方法同 1.3.2。依據 CST 公司 Signaling Antibody Array Kit 操作說明書完成抗體芯片檢測。
1.4 統計學分析
應用 SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（ ）表示。計量資料比較采用 t 檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗，率的比較采用 χ2 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 目的細胞 DDX46 基因 mRNA 的表達
與人正常食管上皮細胞 Het-1A 相比，DDX46 基因 mRNA 的表達在人食管鱗癌 TE-1 細胞中顯著上調（P<0.001）；見圖 1 。
圖1
TE-1 細胞 DDX46 基因 mRNA 的表達較 Het-1A 顯 著上調（***P<0.001）
2.2 shRNA 慢病毒介導的 RNAi 有效抑制 DDX46 基因的表達
慢病毒目的細胞感染率達到 80% 以上。qRT-PCR 結果顯示，經 DDX46-shRNA-LV 慢病毒感染后，TE-1 細胞 DDX46 基因 mRNA 的表達明顯受到抑制（P<0.01），敲減效率達到 86.6%；見圖 2。
圖2
慢病毒目的細胞感染率達到 80% 以上，RNAi 有效抑制 DDX46 基因的表達（**P<0.01）
2.3 靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 細胞生長
慢病毒感染目的細胞 3 d 后，HCS 儀連續檢測 5 d，記錄各時間點的細胞數目，繪制出細胞生長曲線圖，結果如圖 3 所示，與對照組相比，實驗組 TE-1 細胞生長被顯著抑制。
圖3
靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 細胞生長 a. HCS 連續讀取熒光信號； b. 增殖倍數細胞生長曲線； c. 計數值細胞生長曲線，**與對照組比較P<0.01，***與對照組比較P<0.001
2.4 靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 細胞克隆形成
相對于對照組，RNAi 沉默 DDX46 基因后，TE-1 細胞克隆形成數顯著減少（P<0.001），細胞克隆形成能力被抑制；見圖4。
圖4
靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 細胞克隆形成，***P<0.001
2.5 靶向沉默 DDX46 基因誘導 TE-1 細胞凋亡
相對于對照組，RNAi 沉默 DDX46 基因后，TE-1 細胞凋亡率顯著升高（P<0.001）；見圖 5。
圖5
靶向沉默 DDX46 基因誘導 TE-1 細胞凋亡，***P<0.001
2.6 PathScan? Antibody Array 檢測結果
靶向沉默 DDX46 基因后，檢測 Stress and Apoptosis 細胞信號通路中關鍵信號分子的變化，4 號目標點 Akt（Ser473，Phosphorylation）和 14 號目標點 IκBα（total，N/A）表達水平顯著下調（P<0.01），12 號目標點 Caspase-3（Asp175，cleaved）蛋白表達水平上調（P<0.05），提示靶向沉默 DDX46 基因可能通過下調 Akt/NF-κB 信號通路，進而抑制 TE-1 細胞增殖并誘導細胞凋亡；見圖 6。
圖6
Antibody Array 檢測結果
3 討論
食管鱗癌是我國惡性腫瘤相關死亡的主要原因之一，雖有手術、化療、放療以及其他輔助療法，但其遠期療效令人沮喪，并且部分病人首診時已是局部晚期或轉移性疾病，失去了根治性手術的機會，導致平均 5 年生存率僅為 10%[3]，遠遠不能令人滿意。食管鱗癌缺乏特異性的早期腫瘤標記物，靶向治療的相關研究尚處于萌芽階段，目前許多靶向藥物的相關研究多針對胃-食管交界部腺癌開展，這些研究結果對于食管鱗癌是否適合尚未證實，對食管鱗癌基因事件的認識還遠未達到精準醫療所需要的程度。
蛋白質是生命活動的物質基礎，但 DNA 不能直接制造蛋白質。RNA 將 DNA 與蛋白質聯絡起來，完成生物體的各種生理活動。涉及 RNA 的細胞生物進程需要 RNA 解旋酶，RNA 解旋酶利用 ATP 水解產生的能量實現 RNA 解旋或核糖核蛋白結構重組[8]，幾乎參與了 RNA 代謝的所有環節，包括基因的轉錄、RNA 的剪接、轉運、貯存、降解、核糖體合成、翻譯及細胞器基因表達等[9-11]。DDX 蛋白家族是一類重要的 RNA 解旋酶，幾乎存在于所有真核生物中[4]，因其基序Ⅱ中含有一段保守的氨基酸片段：天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（Asp-Glu-Ala-Asp，D-E-A-D），故將其命名為 DEAD-box 蛋白家族，即 DDX 蛋白家族[12]。雖然一些 DDX 基因在人類腫瘤中的表達失調已被報道，但仍有許多 DDX 解旋酶家族成員在人類腫瘤中的表達情況，以及與人類腫瘤的關系未被闡述[5, 13]。
DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成員[5]，研究表明 DDX46 在 mRNA 前體剪接和核糖體組裝中發揮核心作用[14-16]。人類 DDX46 基因位于染色體 5q31.1，有 26 個外顯子，編碼的 DDX46 蛋白分子量為 131 kDa[17]，在腫瘤中的表達及與腫瘤的相關性罕見報道[18]。我們先前首次報道了 DDX46 在食管鱗癌中的表達情況[6]。基因表達水平可以揭示某一信號通路是否參與腫瘤細胞的增殖和分化，本研究應用 qRT-PCR 檢測 DDX46 基因 mRNA 在人食管鱗癌細胞 TE-1 及人正常食管上皮細胞 Het-1A 中的表達，發現與 Het-1A 相比，TE-1 中 DDX46 基因 mRNA 的表達均顯著上調。隨后應用 DDX46-shRNA-LV 靶向沉默 DDX46 基因，檢測 DDX46 基因沉默后 TE-1 細胞生物功能學變化，結果顯示靶向沉默 DDX46 基因可顯著抑制 TE-1 細胞增殖，并誘導細胞凋亡，說明 DDX46 基因與食管鱗癌細胞的增殖和凋亡密切相關。
為闡明其可能的作用機制，本實驗應用 PathScan? Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit 檢測比較 DDX46 基因敲減前后 TE-1 細胞信號通路關鍵信號分子的變化，結果表明 Akt 和 IκBα 表達水平明顯下調，Caspase-3 表達水平上調，Akt/NF-κB 信號通路被抑制。Akt（蛋白激酶 B）是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以磷酸化百余種不同底物，是調節細胞增殖、凋亡和自噬等上游信號通路的匯合點，在腫瘤的發生中起到了關鍵作用[19]。NF-κB 是真核細胞的快反應核轉錄因子，幾乎存在于所有的細胞中，是 Akt 信號通路下游的重要效應分子。食管鱗癌細胞中存在有活化的 NF-κB 信號通路[20]。NF-κB 與抑制性蛋白 IκBα 結合形成無活性的復合物駐于胞漿內，若抑制性蛋白 IκBα 磷酸化而被降解，則 NF-κB 從無活性的復合物脫落釋放而得以激活，并從細胞質中轉位進入細胞核，激活其下游靶基因，發揮促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用[20-22]。Caspase-3 是參與細胞凋亡的關鍵執行分子，在凋亡信號轉導的許多途徑中發揮功能，正常以無活性的酶原形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡[23]。因此我們推測靶向沉默 DDX46 基因可能通過抑制 Akt 磷酸化，進而抑制 IκBα 磷酸化，使 NF-κB 不能從無活性的復合物脫落釋放，進而發揮抑制 TE-1 細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用。
綜上所述，DDX46 在食管鱗癌 TE-1 細胞中高表達，靶向沉默 DDX46 基因可抑制細胞增殖，并誘導細胞凋亡；靶向沉默 DDX46 基因可能是通過下調 Akt/NF-κB 信號通路，進而發揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用。DDX46 與食管鱗癌的相關性還需要其他食管鱗癌細胞株功能實驗和體內裸鼠成瘤實驗進一步驗證。
食管癌居全球惡性腫瘤死亡率第 6 位[1]。中國是食管癌發病率和死亡率最高的國家，全球近 70% 的食管癌發生在中國，死亡率居我國所有惡性腫瘤第 4 位，嚴重威脅國人健康[2]。我國食管癌的病理學類型 90% 以上為食管鱗癌，目前遠期療效很不理想，基因事件在食管鱗癌發生發展中的機制仍不清楚[3]。近年來 RNA 在生命系統中的重要作用備受關注，而 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶參與了 RNA 代謝的全過程[4]。DDX 解旋酶可通過改變癌基因表達水平、基因突變，或者參與腫瘤啟動和進展相關信號通路、調控腫瘤耐藥基因的表達，參與腫瘤的發生發展[5]。DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成員[5]，我們前期研究報道了 DDX46 蛋白表達主要定位于細胞核，食管鱗癌組織中 DDX46 蛋白和 mRNA 的表達均明顯高于相對應食管正常組織[6]。本實驗通過 shRNA 干擾技術，探討靶向沉默 DDX46 基因對食管鱗癌 TE-1 細胞增殖及凋亡的影響，并闡述可能的作用機制，以期為揭示食管鱗癌新型生物學標記、探索新的個體化治療策略提供實驗依據。
1 資料與方法
1.1 細胞系來源
本實驗所用人食管鱗癌細胞 TE-1 購于上海生命科學研究院細胞資源中心，人永生化食管鱗狀上皮細胞 Het-1A 購于上海拜力生物科技有限公司。
1.2 主要試劑和儀器
本實驗使用的主要試劑包括 RNAlater（Qiagen）、Trizol 試劑（Invitrogen）、胎牛血清（Ausbian）、胰蛋白酶（上海生工）、M-MLV 逆轉錄酶（Promega）、Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer Set（廣州銳博）、SYBR premix ex taq（TaKaRa）、PCR 擴增試劑盒（TaKaRa）、dNTPs（Promega）、EDTA（上海生工）、Primer（廣州銳博）、Rnase Inhibitor（Promega）、RPMI-1640 細胞培養基（Lonza）、BulletKit 內皮細胞培養基（Lonza）、Anti-DDX46（Sigma-Aldrich）、D-Hanks 液（Sigma-Aldrich）、Lipofectamine 2000 轉染試劑（Invitrogen）、Giemsa（上海鼎國）、Annexin V-APC single-staining 凋亡試劑盒（eBioscience）、PathScan? Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit（CST）。
本實驗所用主要儀器與設備包括二氧化碳細胞培養箱（Thermo Fisher Scientific）、隔水式恒溫培養箱（上海一恒）、Nanodrop 分光光度計（Thermo Fisher Scientific）、PCR 儀（Applied Biosystems）、Cellomics 高內涵篩選成像系統（Thermo Fisher Scientific）、熒光顯微鏡（Olympus）、倒置相差顯微鏡（Olympus）、流式細胞儀（Millipore）、高速冷凍臺式離心機（Thermo Fisher Scientific）、超速離心機（Thermo Fisher Scientific）、精密天平（浙江力辰）。
1.3 方法
1.3.1 細胞培養及傳代 目的細胞 TE-1 培養于 RPMI-1640 培養液中，Het-1A 培養于 BulletKit 內皮細胞培養基中，均置于 37℃、5% CO 2 培養箱內。每 3 d 換液 1 次。支原體檢測均為陰性。至細胞 80% 融合且狀態良好時，棄舊培養液，加入適量磷酸鹽緩沖液（PBS）輕柔清洗1遍，再加入適量 0.25% 胰蛋白酶消化約 2～5 min，置于顯微鏡下觀察，細胞回縮變圓后棄去胰酶消化液，并立即加入細胞培養液終止消化。吸管吸取培養瓶內培養液反復吹打瓶壁上的細胞，使貼壁細胞脫落制成單細胞懸液。將上述單細胞懸液移至 10 ml 離心管，1 000 rpm 離心 5 min，棄上清液，加入 2 ml 培養液重懸混勻細胞后，將細胞重新接種于新的培養瓶中（細胞數≥1×104 個），置于 37℃、5% CO 2 培養箱內繼續培養。取對數生長期細胞用于實驗。
1.3.2 目的細胞 DDX46 基因 qRT-PCR 檢測 收集目的細胞，用 2 000 rpm 離心 5 min 后，棄上清液，沉淀的細胞中加入 Trizol 裂解液 1 ml，充分混勻后靜置于室溫下 5 min，然后轉移至 1.5 ml EP 管中，完成細胞樣本 Trizol 裂解。依據 Invitrogen 公司 Trizol 操作說明書完成總 RNA 抽提。依據 Promega 公司 M-MLV 操作說明書逆轉錄 RNA 獲得 cDNA。以 GAPDH 基因為內參，兩步法進行 qRT-PCR，2–??Ct法計算 DDX46 基因 mRNA 的相對表達量（?Ct=目的基因 Ct 值–內參基因 Ct 值；??Ct=樣品 ?Ct 值–對照組 ?Ct 平均值）。實驗重復 3 次。
1.3.3 DDX46 基因 RNAi 慢病毒制備和包裝 DDX46基因 RNAi 靶點序列和 RNAi 慢病毒（DDX46-shRNA-LV）制備和包裝由上海吉凱基因化學技術有限公司設計完成，DDX46 基因 shRNA 序列：5′-AGAAATCACCAGGCTCATA-3′，陰性對照序列應用公認序列：5′-TTCTCCGAACGTGT CACGT-3′[7]。
1.3.4 慢病毒感染 TE-1 細胞 胰蛋白酶消化對數生長期的 TE-1 細胞，然后 RPMI-1640 完全培養基重懸制成 3×104～5×104 個細胞/ml 的懸液，均勻接種至 6 孔板中繼續培養；鋪板量達到 30% 左右時，更換感染培養基，加入最適病毒量進行感染（感染復數為 5），實驗組（DDX46 基因 RNAi 靶點序列慢病毒感染，DDX46-shRNA-LV 組）病毒滴度 2×108 TU/ml、病毒感染用量 5 μl，對照組（陰性對照序列慢病毒感染，Control-LV 組）病毒滴度 4×108 TU/ml、病毒感染用量 2.5 μl；感染后 12 h，更換為常規培養基繼續培養；觀察細胞狀態良好，未出現大量死亡現象，實驗組與對照組細胞狀態相當；感染后 72 h，熒光顯微鏡觀察報告基因綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，熒光率即為陽性感染率。
1.3.5 qRT-PCR 檢測 DDX46 基因的敲減效率 實驗方法同 1.3.2。
1.3.6 細胞計數檢測 將處于對數生長期的各組細胞胰蛋白酶消化，完全培養基重懸細胞成懸液并計數；以每孔 2 000 細胞接種于 96 孔板，每組 3 復孔，培養體系為每孔 100 μl，鋪板過程中每孔加入細胞數一致，37℃、5%CO 2 培養箱培養；鋪板后第 2 d 開始，每天 Cellomics 高內涵篩選成像系統（HCS）檢測讀板 1 次，連續 5 d；計算出每次 HCS 檢測掃描孔板中帶綠色熒光的細胞數量，繪出 5 d 的細胞增殖曲線圖：根據細胞計數值和時間點，繪制基于細胞計數值的細胞生長曲線；計算各組細胞各時間點細胞計數值與該組第 1 d 的細胞計數值的比值，獲得該組細胞各時間點的增殖倍數，根據該增殖倍數和時間點，繪制基于細胞增殖倍數的細胞生長曲線。
1.3.7 克隆形成實驗 將處于對數生長期的各組細胞胰蛋白酶消化，完全培養基重懸細胞成懸液并計數；以每孔 600 細胞接種于 6 孔板培養板中，每組設 3 復孔，培養體系為每孔 2 ml；將接種好的細胞 37℃、5%CO 2 培養箱中持續培養 15 d，中途每 5 d 進行換液并觀察細胞狀態；實驗終止前熒光顯微鏡下對細胞克隆進行拍照，PBS 液洗滌細胞 1 次；每孔加入 4% 多聚甲醛 1 ml，固定細胞 30～60 min，PBS 液洗滌細胞 1 次；每孔加入 Giemsa 染液 500 μl，染色細胞 10～20 min；ddH 2O 洗滌細胞數次，晾干后拍照，克隆計數（含有 50 個以上細胞的克隆計為 1 個細胞克隆）。
1.3.8 細胞凋亡實驗 待各組 6 孔板細胞生長至覆蓋率約為 80% 時胰酶消化，完全培養基重懸細胞成懸液，與孔板上清細胞收集于同一 5 ml 離心管中（細胞數≥5×105 個），每組設 3 個孔；1 300 rmp 離心 5 min，棄上清液，4℃ 預冷的 D-Hanks 液（pH 值 7.2～7.4）洗滌細胞沉淀 1 次；Binding Buffer 洗滌細胞沉淀 1 次，1 300 rmp 離心 3 min 收集細胞；200 μl Binding Buffer 重懸細胞沉淀；加入 10 μl Annexin V-APC 染色，室溫避光 10～15 min，上流式細胞儀檢測。
1.3.9 PathScan? Antibody Array 檢測 目的細胞 Trizol 裂解方法同 1.3.2。依據 CST 公司 Signaling Antibody Array Kit 操作說明書完成抗體芯片檢測。
1.4 統計學分析
應用 SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（ ）表示。計量資料比較采用 t 檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗，率的比較采用 χ2 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 目的細胞 DDX46 基因 mRNA 的表達
與人正常食管上皮細胞 Het-1A 相比，DDX46 基因 mRNA 的表達在人食管鱗癌 TE-1 細胞中顯著上調（P<0.001）；見圖 1 。
圖1
TE-1 細胞 DDX46 基因 mRNA 的表達較 Het-1A 顯 著上調（***P<0.001）
2.2 shRNA 慢病毒介導的 RNAi 有效抑制 DDX46 基因的表達
慢病毒目的細胞感染率達到 80% 以上。qRT-PCR 結果顯示，經 DDX46-shRNA-LV 慢病毒感染后，TE-1 細胞 DDX46 基因 mRNA 的表達明顯受到抑制（P<0.01），敲減效率達到 86.6%；見圖 2。
圖2
慢病毒目的細胞感染率達到 80% 以上，RNAi 有效抑制 DDX46 基因的表達（**P<0.01）
2.3 靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 細胞生長
慢病毒感染目的細胞 3 d 后，HCS 儀連續檢測 5 d，記錄各時間點的細胞數目，繪制出細胞生長曲線圖，結果如圖 3 所示，與對照組相比，實驗組 TE-1 細胞生長被顯著抑制。
圖3
靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 細胞生長 a. HCS 連續讀取熒光信號； b. 增殖倍數細胞生長曲線； c. 計數值細胞生長曲線，**與對照組比較P<0.01，***與對照組比較P<0.001
2.4 靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 細胞克隆形成
相對于對照組，RNAi 沉默 DDX46 基因后，TE-1 細胞克隆形成數顯著減少（P<0.001），細胞克隆形成能力被抑制；見圖4。
圖4
靶向沉默 DDX46 基因抑制 TE-1 細胞克隆形成，***P<0.001
2.5 靶向沉默 DDX46 基因誘導 TE-1 細胞凋亡
相對于對照組，RNAi 沉默 DDX46 基因后，TE-1 細胞凋亡率顯著升高（P<0.001）；見圖 5。
圖5
靶向沉默 DDX46 基因誘導 TE-1 細胞凋亡，***P<0.001
2.6 PathScan? Antibody Array 檢測結果
靶向沉默 DDX46 基因后，檢測 Stress and Apoptosis 細胞信號通路中關鍵信號分子的變化，4 號目標點 Akt（Ser473，Phosphorylation）和 14 號目標點 IκBα（total，N/A）表達水平顯著下調（P<0.01），12 號目標點 Caspase-3（Asp175，cleaved）蛋白表達水平上調（P<0.05），提示靶向沉默 DDX46 基因可能通過下調 Akt/NF-κB 信號通路，進而抑制 TE-1 細胞增殖并誘導細胞凋亡；見圖 6。
圖6
Antibody Array 檢測結果
3 討論
食管鱗癌是我國惡性腫瘤相關死亡的主要原因之一，雖有手術、化療、放療以及其他輔助療法，但其遠期療效令人沮喪，并且部分病人首診時已是局部晚期或轉移性疾病，失去了根治性手術的機會，導致平均 5 年生存率僅為 10%[3]，遠遠不能令人滿意。食管鱗癌缺乏特異性的早期腫瘤標記物，靶向治療的相關研究尚處于萌芽階段，目前許多靶向藥物的相關研究多針對胃-食管交界部腺癌開展，這些研究結果對于食管鱗癌是否適合尚未證實，對食管鱗癌基因事件的認識還遠未達到精準醫療所需要的程度。
蛋白質是生命活動的物質基礎，但 DNA 不能直接制造蛋白質。RNA 將 DNA 與蛋白質聯絡起來，完成生物體的各種生理活動。涉及 RNA 的細胞生物進程需要 RNA 解旋酶，RNA 解旋酶利用 ATP 水解產生的能量實現 RNA 解旋或核糖核蛋白結構重組[8]，幾乎參與了 RNA 代謝的所有環節，包括基因的轉錄、RNA 的剪接、轉運、貯存、降解、核糖體合成、翻譯及細胞器基因表達等[9-11]。DDX 蛋白家族是一類重要的 RNA 解旋酶，幾乎存在于所有真核生物中[4]，因其基序Ⅱ中含有一段保守的氨基酸片段：天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（Asp-Glu-Ala-Asp，D-E-A-D），故將其命名為 DEAD-box 蛋白家族，即 DDX 蛋白家族[12]。雖然一些 DDX 基因在人類腫瘤中的表達失調已被報道，但仍有許多 DDX 解旋酶家族成員在人類腫瘤中的表達情況，以及與人類腫瘤的關系未被闡述[5, 13]。
DDX46 是 DDX 蛋白家族 RNA 解旋酶成員[5]，研究表明 DDX46 在 mRNA 前體剪接和核糖體組裝中發揮核心作用[14-16]。人類 DDX46 基因位于染色體 5q31.1，有 26 個外顯子，編碼的 DDX46 蛋白分子量為 131 kDa[17]，在腫瘤中的表達及與腫瘤的相關性罕見報道[18]。我們先前首次報道了 DDX46 在食管鱗癌中的表達情況[6]。基因表達水平可以揭示某一信號通路是否參與腫瘤細胞的增殖和分化，本研究應用 qRT-PCR 檢測 DDX46 基因 mRNA 在人食管鱗癌細胞 TE-1 及人正常食管上皮細胞 Het-1A 中的表達，發現與 Het-1A 相比，TE-1 中 DDX46 基因 mRNA 的表達均顯著上調。隨后應用 DDX46-shRNA-LV 靶向沉默 DDX46 基因，檢測 DDX46 基因沉默后 TE-1 細胞生物功能學變化，結果顯示靶向沉默 DDX46 基因可顯著抑制 TE-1 細胞增殖，并誘導細胞凋亡，說明 DDX46 基因與食管鱗癌細胞的增殖和凋亡密切相關。
為闡明其可能的作用機制，本實驗應用 PathScan? Stress and Apoptosis Signaling Antibody Array Kit 檢測比較 DDX46 基因敲減前后 TE-1 細胞信號通路關鍵信號分子的變化，結果表明 Akt 和 IκBα 表達水平明顯下調，Caspase-3 表達水平上調，Akt/NF-κB 信號通路被抑制。Akt（蛋白激酶 B）是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以磷酸化百余種不同底物，是調節細胞增殖、凋亡和自噬等上游信號通路的匯合點，在腫瘤的發生中起到了關鍵作用[19]。NF-κB 是真核細胞的快反應核轉錄因子，幾乎存在于所有的細胞中，是 Akt 信號通路下游的重要效應分子。食管鱗癌細胞中存在有活化的 NF-κB 信號通路[20]。NF-κB 與抑制性蛋白 IκBα 結合形成無活性的復合物駐于胞漿內，若抑制性蛋白 IκBα 磷酸化而被降解，則 NF-κB 從無活性的復合物脫落釋放而得以激活，并從細胞質中轉位進入細胞核，激活其下游靶基因，發揮促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用[20-22]。Caspase-3 是參與細胞凋亡的關鍵執行分子，在凋亡信號轉導的許多途徑中發揮功能，正常以無活性的酶原形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡[23]。因此我們推測靶向沉默 DDX46 基因可能通過抑制 Akt 磷酸化，進而抑制 IκBα 磷酸化，使 NF-κB 不能從無活性的復合物脫落釋放，進而發揮抑制 TE-1 細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用。
綜上所述，DDX46 在食管鱗癌 TE-1 細胞中高表達，靶向沉默 DDX46 基因可抑制細胞增殖，并誘導細胞凋亡；靶向沉默 DDX46 基因可能是通過下調 Akt/NF-κB 信號通路，進而發揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用。DDX46 與食管鱗癌的相關性還需要其他食管鱗癌細胞株功能實驗和體內裸鼠成瘤實驗進一步驗證。
