引用本文： 郭海嬌, 康凱, 劉煥欣, 劉思雨, 啜俊波, 蔡俊, 吳華, 李建中, 蔣樹林, 王宜淳. 紫紺及非紫紺型先心病患者來源的人骨髓間充質干細胞抗凋亡能力的比較. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(12): 1172-1176. doi: 10.7507/1007-4848.20160275 復制
工程化心肌補片由于理論上具有生物活性，可伴隨人體的生長而生長，一直被視為解決嬰幼兒心臟畸形糾治后再狹窄的最理想修補材料[1]。但是，就臨床應用而言，目前仍有一系列困難有待克服。其中，如何減少種子細胞移植后因乏氧導致的細胞凋亡就是難題之一[2]。此外，雖然自體來源細胞，如人骨髓間充質干細胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs），作為種子細胞存在諸多優勢[3-4]，如取材擴增方便，沒有免疫原性，不涉及倫理問題等，但對紫紺型先心病（cyanotic congenital heart disease，C-CHD）患者而言，因其心臟畸形所造成的乏氧狀態，其自體來源的hMSCs能否承擔種子細胞的職能，目前國際上尚無人證實。在本研究中，課題組將采集紫紺及非紫紺型先心病（acyanotic congenital heart disease，A-CHD）患者來源的hMSCs，并體外對比其抗凋亡能力。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 入選標準
本實驗實施前已通過哈爾濱醫科大學附屬二院倫理委員會批準（倫理號：2014-研-010）。hMSCs均來源于術前經超聲心動圖診斷、術中經手術證實的紫紺（C-CHD，C組）和非紫紺型（A-CHD，A組） 先心病患兒，年齡0～5歲，性別不限。取材前均取得患兒監護人的知情同意書。
1.1.2 hMSCs的獲取、培養和種植
為模擬細胞體內移植后的生存環境，體外細胞培養均在37℃的乏氧培養箱中（1% O2，5% CO2，94% N2） 進行，兩組細胞擴增后均種植于經碳化二亞胺法處理過的膠原補片上。細胞獲取、培養及擴增方法參見參考文獻[5-6]，每組各選取5名不同個體的細胞（n=5）。
1.2 檢測方法
1.2.1 Annexin
Ⅴ/PI雙染結合流式細胞技術取已鋪滿盤的兩組hMSCs（P3代），棄去原培養液，磷酸鹽緩沖液洗盤2次后，加入無糖無血清培養液，于厭氧環境下（100% N2，37℃）培養4 h以誘導凋亡，然后按照Annexin Ⅴ/PI雙染試劑盒的操作流程進行染色，上流式細胞儀檢測對比其凋亡情況。
1.2.2 Western
blot法對比兩組hMSCs中B細胞淋巴瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），Bcl-2相關X蛋白（Bax）以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的蛋白表達水平。將上述兩組細胞于乏氧環境下培養，取第三代細胞，消化、重懸、打碎、提取蛋白，按照各自試劑盒說明書檢測蛋白含量。
1.3 統計學分析
統計軟件采用Graphpad 5.0。所有計量資料以均值±標準差（X±s）表示。兩組均數間的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 Annexin Ⅴ/PI雙染結合流式細胞技術結果
兩組細胞在上述乏氧環境下發生的凋亡均以早期凋亡為主（Q4象限）。A組細胞的早期凋亡率明顯高于C組細胞（P=0.008）；此外，就總體凋亡率而言（Q2+Q4象限），A組細胞也明顯高于C組細胞（P=0.018），見圖 1。
圖1
紫紺組（C組）和非紫紺組（A組）先心病患者來源的hMSCs對抗缺氧誘導的細胞凋亡能力的比較（n=5）
注：A為兩組Annexin Ⅴ/PI雙染結合流式細胞技術檢測結果象限分布；B為兩組總體凋亡率的比較，*與C組相比，
2.2 凋亡相關蛋白含量的比較
Western blot檢測結果顯示：相較于A組細胞，C組細胞內與抗凋亡能力呈正相關的Bcl-2的含量明顯高于前者（P=0.026），而與抗凋亡能力呈負相關的Bax（P=0.043）以及caspase-3（P=0.045）的含量則明顯低于前者，見圖 2。
圖2
紫紺組（C組）和非紫紺組（A組）凋亡相關蛋白含量的比較（n=5）
注：A為兩組Bcl-2蛋白表達的比較，*與A組相比，
3 討論
目前，細胞移植術后誘導的炎性反應、免疫排斥反應以及移植細胞身處乏氧環境所造成的細胞凋亡依舊是限制心肌細胞移植進入臨床的瓶頸問題[7-8]。由于可有效規避包括排斥反應在內的多重障礙，自體來源的hMSCs一直是組織工程學界青睞的種子細胞來源之一[3-4, 9]。但對C-CHD這一特殊人群而言，因其自體來源的hMSCs長期處于慢性乏氧狀態，它能否承擔種子細胞的職責，目前學界尚無人證實。
既往的科研實踐已告訴我們：對正常細胞采用移植前的“乏氧預適應”可明顯改善細胞移植后的存活效率[10-11]。其機理在于：（1）乏氧可誘導干細胞體內一系列凋亡相關因子的變化（如Bcl-2上調、caspase-3下調），可減少細胞移植后的程序性死亡[12-13]；（2）乏氧可誘導hMSCs體內產生缺氧誘導因子，進而加速細胞體內血管內皮生長因子的合成[14]。因此，課題組推測：由于C-CHD患者來源的hMSCs在體內已經過天然的“乏氧預適應”，作為種子細胞可更好地耐受移植后的缺血缺氧及其所誘導的細胞凋亡； 在乏氧應激時可產生并分泌更多的血管內皮生長因子，可更好的促進周圍組織的再血管化進程并產生更好的細胞治療效果，因而可能具有更好的抗凋亡能力。隨后的Annexin Ⅴ/PI雙染結合流式細胞技術進一步印證了課題組的上述猜想。研究結果顯示：由于存活環境的巨大變化，細胞移植后的早期凋亡是造成種子細胞流失的主要原因。但C組細胞抗早期凋亡能力明顯優于A組細胞，其最終的總體凋亡率也低于A組。為了探索造成上述現象的分子機制，課題組選取了三個經典的凋亡相關蛋白，對比其在兩組細胞體內的表達。
Bcl-2被稱為凋亡抑制基因，是目前最受重視的細胞凋亡調控基因，其蛋白產物與細胞凋亡呈明顯的負相關。而Bax則為促凋亡因子，它通過與Bcl-2形成異源二聚體而調控Bcl-2的抗凋亡能力。既往的研究已明確證明，低氧環境可明顯誘導hMSCs內Bcl-2的生成，增強其抗凋亡和抗心臟重構的能力[13]，進而改善細胞移植后的心臟功能[12]。caspase家族在介導細胞凋亡的過程中同樣起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。正常情況下，caspase-3以酶原（35KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活、活化，起到促進細胞凋亡的作用，被認為是啟動早期凋亡的關鍵因子[15-16]。
在本研究中，我們在C-CHD來源的hMSCs內檢測到了更高含量的Bcl-2，更低含量的Bax及caspase-3因子，在體外構建的缺血缺氧模型中進一步證實了其具有更強的抗凋亡能力。這充分說明了C-CHD來源的hMSCs是一種具有更好抗凋亡能力的種子細胞。
至于本實驗為何采用乏氧環境對比兩組細胞功能，我們是基于如下考慮：（1）細胞移植后的乏氧環境是導致細胞壞死和凋亡的主要因素，而體外模擬逼真的體內環境對移植細胞進行“乏氧預適應”已被證實是改善細胞存活效率的有效手段；（2） 其次，在生理狀態下，人體骨髓即處于相對乏氧狀態（氧濃度約1%～6%）[17-18]，故采用乏氧環境培養更接近骨髓來源的hMSCs（BM-hMSCs）的生存環境并保持其生物活性。Estrada等[19-20]證實：在普通的常氧培養環境下（氧濃度約20%）培養，由于體外相對高氧（相對于骨髓環境）所造成的氧化應激損傷，BM-hMSCs的生物活性會受到明顯影響。
我們充分論證了C-CHD來源的hMSCs作為種子細胞的卓越抗凋亡能力，結合其作為自體來源細胞的諸多優勢，它極可能成為C-CHD患者工程化心肌補片最有前途的種子細胞來源。此外，本研究給我們的另一個重要啟示：對于某些處于病理狀態下的自體來源細胞，因經過天然的“預適應”，可能反倒是組織工程研究更有利的種子細胞。
工程化心肌補片由于理論上具有生物活性，可伴隨人體的生長而生長，一直被視為解決嬰幼兒心臟畸形糾治后再狹窄的最理想修補材料[1]。但是，就臨床應用而言，目前仍有一系列困難有待克服。其中，如何減少種子細胞移植后因乏氧導致的細胞凋亡就是難題之一[2]。此外，雖然自體來源細胞，如人骨髓間充質干細胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs），作為種子細胞存在諸多優勢[3-4]，如取材擴增方便，沒有免疫原性，不涉及倫理問題等，但對紫紺型先心病（cyanotic congenital heart disease，C-CHD）患者而言，因其心臟畸形所造成的乏氧狀態，其自體來源的hMSCs能否承擔種子細胞的職能，目前國際上尚無人證實。在本研究中，課題組將采集紫紺及非紫紺型先心病（acyanotic congenital heart disease，A-CHD）患者來源的hMSCs，并體外對比其抗凋亡能力。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 入選標準
本實驗實施前已通過哈爾濱醫科大學附屬二院倫理委員會批準（倫理號：2014-研-010）。hMSCs均來源于術前經超聲心動圖診斷、術中經手術證實的紫紺（C-CHD，C組）和非紫紺型（A-CHD，A組） 先心病患兒，年齡0～5歲，性別不限。取材前均取得患兒監護人的知情同意書。
1.1.2 hMSCs的獲取、培養和種植
為模擬細胞體內移植后的生存環境，體外細胞培養均在37℃的乏氧培養箱中（1% O2，5% CO2，94% N2） 進行，兩組細胞擴增后均種植于經碳化二亞胺法處理過的膠原補片上。細胞獲取、培養及擴增方法參見參考文獻[5-6]，每組各選取5名不同個體的細胞（n=5）。
1.2 檢測方法
1.2.1 Annexin
Ⅴ/PI雙染結合流式細胞技術取已鋪滿盤的兩組hMSCs（P3代），棄去原培養液，磷酸鹽緩沖液洗盤2次后，加入無糖無血清培養液，于厭氧環境下（100% N2，37℃）培養4 h以誘導凋亡，然后按照Annexin Ⅴ/PI雙染試劑盒的操作流程進行染色，上流式細胞儀檢測對比其凋亡情況。
1.2.2 Western
blot法對比兩組hMSCs中B細胞淋巴瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2），Bcl-2相關X蛋白（Bax）以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的蛋白表達水平。將上述兩組細胞于乏氧環境下培養，取第三代細胞，消化、重懸、打碎、提取蛋白，按照各自試劑盒說明書檢測蛋白含量。
1.3 統計學分析
統計軟件采用Graphpad 5.0。所有計量資料以均值±標準差（X±s）表示。兩組均數間的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 Annexin Ⅴ/PI雙染結合流式細胞技術結果
兩組細胞在上述乏氧環境下發生的凋亡均以早期凋亡為主（Q4象限）。A組細胞的早期凋亡率明顯高于C組細胞（P=0.008）；此外，就總體凋亡率而言（Q2+Q4象限），A組細胞也明顯高于C組細胞（P=0.018），見圖 1。
圖1
紫紺組（C組）和非紫紺組（A組）先心病患者來源的hMSCs對抗缺氧誘導的細胞凋亡能力的比較（n=5）
注：A為兩組Annexin Ⅴ/PI雙染結合流式細胞技術檢測結果象限分布；B為兩組總體凋亡率的比較，*與C組相比，
2.2 凋亡相關蛋白含量的比較
Western blot檢測結果顯示：相較于A組細胞，C組細胞內與抗凋亡能力呈正相關的Bcl-2的含量明顯高于前者（P=0.026），而與抗凋亡能力呈負相關的Bax（P=0.043）以及caspase-3（P=0.045）的含量則明顯低于前者，見圖 2。
圖2
紫紺組（C組）和非紫紺組（A組）凋亡相關蛋白含量的比較（n=5）
注：A為兩組Bcl-2蛋白表達的比較，*與A組相比，
3 討論
目前，細胞移植術后誘導的炎性反應、免疫排斥反應以及移植細胞身處乏氧環境所造成的細胞凋亡依舊是限制心肌細胞移植進入臨床的瓶頸問題[7-8]。由于可有效規避包括排斥反應在內的多重障礙，自體來源的hMSCs一直是組織工程學界青睞的種子細胞來源之一[3-4, 9]。但對C-CHD這一特殊人群而言，因其自體來源的hMSCs長期處于慢性乏氧狀態，它能否承擔種子細胞的職責，目前學界尚無人證實。
既往的科研實踐已告訴我們：對正常細胞采用移植前的“乏氧預適應”可明顯改善細胞移植后的存活效率[10-11]。其機理在于：（1）乏氧可誘導干細胞體內一系列凋亡相關因子的變化（如Bcl-2上調、caspase-3下調），可減少細胞移植后的程序性死亡[12-13]；（2）乏氧可誘導hMSCs體內產生缺氧誘導因子，進而加速細胞體內血管內皮生長因子的合成[14]。因此，課題組推測：由于C-CHD患者來源的hMSCs在體內已經過天然的“乏氧預適應”，作為種子細胞可更好地耐受移植后的缺血缺氧及其所誘導的細胞凋亡； 在乏氧應激時可產生并分泌更多的血管內皮生長因子，可更好的促進周圍組織的再血管化進程并產生更好的細胞治療效果，因而可能具有更好的抗凋亡能力。隨后的Annexin Ⅴ/PI雙染結合流式細胞技術進一步印證了課題組的上述猜想。研究結果顯示：由于存活環境的巨大變化，細胞移植后的早期凋亡是造成種子細胞流失的主要原因。但C組細胞抗早期凋亡能力明顯優于A組細胞，其最終的總體凋亡率也低于A組。為了探索造成上述現象的分子機制，課題組選取了三個經典的凋亡相關蛋白，對比其在兩組細胞體內的表達。
Bcl-2被稱為凋亡抑制基因，是目前最受重視的細胞凋亡調控基因，其蛋白產物與細胞凋亡呈明顯的負相關。而Bax則為促凋亡因子，它通過與Bcl-2形成異源二聚體而調控Bcl-2的抗凋亡能力。既往的研究已明確證明，低氧環境可明顯誘導hMSCs內Bcl-2的生成，增強其抗凋亡和抗心臟重構的能力[13]，進而改善細胞移植后的心臟功能[12]。caspase家族在介導細胞凋亡的過程中同樣起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。正常情況下，caspase-3以酶原（35KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活、活化，起到促進細胞凋亡的作用，被認為是啟動早期凋亡的關鍵因子[15-16]。
在本研究中，我們在C-CHD來源的hMSCs內檢測到了更高含量的Bcl-2，更低含量的Bax及caspase-3因子，在體外構建的缺血缺氧模型中進一步證實了其具有更強的抗凋亡能力。這充分說明了C-CHD來源的hMSCs是一種具有更好抗凋亡能力的種子細胞。
至于本實驗為何采用乏氧環境對比兩組細胞功能，我們是基于如下考慮：（1）細胞移植后的乏氧環境是導致細胞壞死和凋亡的主要因素，而體外模擬逼真的體內環境對移植細胞進行“乏氧預適應”已被證實是改善細胞存活效率的有效手段；（2） 其次，在生理狀態下，人體骨髓即處于相對乏氧狀態（氧濃度約1%～6%）[17-18]，故采用乏氧環境培養更接近骨髓來源的hMSCs（BM-hMSCs）的生存環境并保持其生物活性。Estrada等[19-20]證實：在普通的常氧培養環境下（氧濃度約20%）培養，由于體外相對高氧（相對于骨髓環境）所造成的氧化應激損傷，BM-hMSCs的生物活性會受到明顯影響。
我們充分論證了C-CHD來源的hMSCs作為種子細胞的卓越抗凋亡能力，結合其作為自體來源細胞的諸多優勢，它極可能成為C-CHD患者工程化心肌補片最有前途的種子細胞來源。此外，本研究給我們的另一個重要啟示：對于某些處于病理狀態下的自體來源細胞，因經過天然的“預適應”，可能反倒是組織工程研究更有利的種子細胞。