充血性心力衰竭（congestive heart failure，CHF）是心肌梗死的并發癥，嚴重影響人類的健康，盡管目前藥物治療CHF的效果已經有很大提高，但如何徹底使由心肌梗死所導致的損傷心肌復原仍然是個世界性問題。骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植已被證實能夠修復梗死的心肌，大量證據表明MSCs可以在人和動物體內產生新的心肌細胞。本篇綜述將探討MSCs移植治療CHF這一問題。
引用本文： 劉圣辰, 王強, 盧子潤, 王東進. 骨髓間充質干細胞治療充血性心力衰竭的研究現狀. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(11): 1108-1111. doi: 10.7507/1007-4848.20160259 復制
隨著心肌梗死治療技術的進步以及對心肌缺血早期診斷的增加，心肌缺血性疾病的院內死亡率已經顯著下降，這也間接導致缺血后患有充血性心力衰竭（congestive heart failure, CHF）的患者數量明顯增加[1-2]。常規藥物治療不能使受損的心肌復原，因此并不能使CHF得到顯著改善[3]。骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有很高的分化潛能，已被證實可以用于治療CHF[4-5]。用MSCs治療CHF主要涉及到心肌缺血后局部細胞因子的表達變化、細胞因子干細胞的趨化歸巢作用以及干細胞歸巢后的治療作用。有研究表明，MSCs移植療法能增加有功能的心肌細胞數目，修復受損的心肌細胞，繼而使心肌梗死灶面積減小，左心室射血分數增加，顯著改善心臟功能[6-9]。因此，MSCs可能是治療CHF最有效的方法之一。本文主要對現有的間充質干細胞治療心肌梗死的現狀、原理及前景做較全面的論述，以期為將來的臨床治療提供更好的理論指導。
1 骨髓間充質干細胞的分化潛能
目前用于嘗試治療CHF的干細胞主要是MSCs，因為其特有的優勢：（1）MSCs是造血組織的前體細胞，它可以相對較容易地從自身骨髓中獲得；（2）通過體外擴增，這些MSCs依然具有多向分化的潛能，表現出較低的免疫原性，并且容易冷凍；（3）MSCs可以在具有血管內皮生長因子的培養條件下分化成血管內皮細胞，而且可以在刺激下分化成心肌細胞[10-11]；（4）其分化來的心肌細胞能與周圍宿主心肌細胞形成有效的電-機械耦聯。因此，MSCs更適用于臨床。
通過修復和再生受損的心肌是對傳統的治療機制的挑戰。內源性修復方式是將MSCs移植到受損的心肌區域，使之增殖分化，形成新的血管和心肌組織，從而修補損傷的心肌細胞，恢復心肌的功能[12-14]。已有的研究表明，心肌梗死后將MSCs移植入損傷的心臟之后，可以分化成心肌細胞和血管內皮細胞[15-17]。Fukuda [18]證明在體外實驗中，MSCs在5氮胞苷的作用下可以自發轉化為心肌肌管樣組織。Supokawej等[19]發現經過5氮胞苷處理過的間充質干細胞可以表達包括心房肽、腦鈉素、心肌細胞特異性轉錄因子及Nkx2.5/Csx在內的心肌細胞基因。此外，這些細胞還顯示出了心肌細胞連接所特有的閏盤結構，形成肌絲并且自發的產生收縮。Wang等報道MSCs注射進入心肌組織之后，甚至不需要5氮胞苷處理就可以分化并表現出心肌細胞的特性，而且注射的間充質干細胞在正常心肌中較疤痕組織中更易分化為心肌細胞。Madonna等[20]證明移植MSCs可以使受損的心室中形成新的心肌組織。標記的移植干細胞可以表達心肌細胞增強因子，心肌特異性轉錄因子-4和連接蛋白-43。在體內實驗的嚙齒類和大型動物實驗模型以及Meta分析的結果均顯示干細胞處理組可以顯著改善左心室射血分數，減少梗死瘢痕的面積，并降低左心室收縮期末容積，還可以進一步減少心肌梗死、死亡，心衰再入院以及重復的血運重建的發生[21-23]。
2 心肌細胞再生的機制
圍繞受損心肌的修復和再生問題，學者們做了許多工作，探討心肌細胞再生的可能性和了解心肌細胞再生的機制，以發現有效修復受損心肌細胞及功能的方法。目前對心肌細胞再生的機制有如下3種假設。
2.1 轉分化理論
此理論是在間充質干細胞與乳鼠心肌細胞共培養之后，發現可以表達連接蛋白-43、心房肽以及肌鈣蛋白-I，而第一次被提出的。這些有意義的結果和轉分化理論的提出是有爭議的，在2004年Murry等[24]用基因失蹤技術來研究注射入心肌梗死之后的小鼠心臟中的干細胞，結果他們未發現任何的轉分化證據。一系列的研究表明移植以后的干細胞保存在體內的機率很低，因此轉分化理論可能并不是干細胞分化的機制。
2.2 心肌融合理論
Rose等[25]將用綠色熒光蛋白標記的MSCs注入急性缺血的心肌組織中，接著他們發現綠色熒光蛋白陽性的細胞可以表現出心肌細胞特異的標記和形態。他們用轉基因技術標記的基因證明了這些細胞是已經融合的結果而不是轉分化的結果。然而，相關研究也表明這種融合機率非常低。盡管細胞融合看起來是存在的，但是這并不是細胞心肌化的最主要機制。
2.3 干細胞調節的旁分泌作用
目前，這種假說理論已經被廣泛接受。這種理論的支持者認為干細胞釋放的炎癥趨化因子和炎性分子的作用上調宿主細胞的再生過程。梗死的心肌組織中植入干細胞以后，組織中的血管內皮生長因子，成纖維細胞生長因子（bFGF）以及胰島素樣生長因子-1的表達量都出現上調，這些都有可能改善心功能。將收集到的培養干細胞的條件培養基加入到缺血的心肌組織中可以對心肌組織產生有利的作用[26]。這些研究表明，即使是在沒有干細胞存在的條件下，干細胞分泌到培養基中的因子依然可以起到刺激心肌再生的作用。此外，Dayan等[27]證明當干細胞被注射到急性心肌缺血的心肌中之后可以分泌較低水平的促炎及抗炎因子，其中一個重要的抗炎癥因子（IL-10）將會被分泌出來，而金屬肽酶-1的抑制劑金屬肽酶-2的分泌則會減少，這些都可以促進心臟左心室射血分數的增加。上述有利證據表明干細胞的旁分泌作用可能是心肌細胞再生的主要機制。
3 現有的MSCs移植方法
許多移植干細胞方法已報道，但所有方法都是試圖轉移最大量干細胞到梗死的心肌中去。在這些報道中，心肌內、靜脈的和經冠狀動脈內注射是最常見的移植干細胞到壞死心肌中的方法[28]。盡管這些方法都具有他們自己的優勢，但這些均有高度侵入性精細操作，缺乏特異性的靶目標而且還有很高器官栓塞機率。為克服這些問題，運用各種載體工具來轉移干細胞已經為人們所共識。在一項研究中發現，運用纖維蛋白膠轉移干細胞可以顯著增加移植細胞存活數量，減少梗死面積并增加缺血心肌血流量[29]。在另一項研究中，運用可注射的基底膜來轉移干細胞的研究結果顯示，相對于只接受了干細胞移植的對照組，干細胞基質膠組表現出更好的心肌恢復效果，移植/梗死比例在干細胞基質膠組中顯著升高（P < 0.034）[30]。近來，有研究者認為通過植入MSCs的熱敏凝膠進行心肌內遞送[31]。成肌細胞板由感溫、高分子接枝的細胞培養皿構成，兩個單層構造的成肌細胞板（5×106個細胞/板）的植入，結合造血干細胞的聚集，通過釋放基質細胞衍生因子-1和其他生長因子，可以成功修復受損心肌，減少心肌的纖維化，并阻止心肌重塑。以往的研究已經表明了干細胞療法對心肌再生的劑量-反應關系上的效果，這說明對梗死部位最佳的細胞送達十分重要[32-33]。
因此，盡管這些新方案較常規方法具有更多有益的結構和操作上的優勢，但這些新方案和直接干細胞注射一樣，仍然構成一種無差別的心臟給藥方式，具有很高的隨機性，需要進一步改善。因此，依然需要為干細胞的定向遞送設計一個適合的干細胞遞送系統。
4 干細胞療法在心肌再生中的作用以及其局限性
2001年，Strauer等[34]報道1例在心肌梗死后6 d接受自體骨髓干細胞移植術的46歲患者。結果表明該患者在移植了干細胞之后其心臟梗死面積從24.6%下降至15.7%，而且左心室射血分數也增加了20%。這一原始結果非常令人吃驚，進而促進了一系列臨床試驗的開展。到2007年底，三個重要的臨床研究已經完成：急性心肌梗死后輸入大量的祖細胞用來完成心肌重建、通過骨髓移植來加強ST段抬高的梗死心肌的再生、在急性心肌缺血的冠狀動脈內的骨髓干細胞移植術。這些試驗中采用了類似的設計，包括收獲自體的干細胞，以及隨后的缺血24 h至7 d之內冠狀動脈內輸入干細胞。總的來說，這些研究都表明干細胞輸入可以使左心室射血分數提升3.3%～5.9%[35-37]。Abdel-Latif等[38]對18組隨機和隊列的研究進行了Meta分析，研究共納入999例患者，結果發現左心室射血分數增加3.66%。另一項僅限于隨機試驗的Meta分析綜合了7例冠狀動脈或心臟內注射干細胞的試驗研究，共納入237例患者，結果表明左心室射血分數增加3.7%。以上研究結果都為心肌梗死的治療展示了令人期待的臨床治療途徑[39]。
盡管動物實驗跟臨床試驗之間都存在差異，但迄今為止所有的證據都證明干細胞移植技術沒有對患者預后產生不利的影響。這表明，在臨床實施方案中觀察到的干細胞治療缺乏全細胞潛能，這可能與異質細胞的類型和數量有關，與細胞滯留狀況較差和成熟MSCs質量較差以及選的傳遞路徑有關。體內外研究表明，在干細胞注射到體內的第一個24 h內細胞存活率僅為10%～44.8%[40-41]。一直以來，移植以后干細胞的丟失都推測是由于細胞的死亡，或者是由于心臟的跳動引起的一種機械性的驅趕。將干細胞移植到受損的心肌中的最主要問題是由于灌注不足再加上大量的自由基形成從而導致了細胞的壞死和凋亡[42-43]。這些因素都促發了激烈的炎癥反應，并可能引起新的心肌缺血。因此，細胞凋亡加上由于心跳所導致的機械性因素進一步降低了干細胞的滯留，進而影響了干細胞移植治療的效果。
5 MSCs治療方法的前景
大量的實驗已經證實，MSCs移植入受損的心臟中可以減小梗死面積，提高左心室射血分數[44-45]。但是，用MSCs移植療法治療缺血性心臟疾病還沒有完全發揮其應有的治療潛能，一個很重要的受限因素就是移植后的MSCs只有很少一部分能存活下來。如何解決這個問題依然是干細胞移植療法治療CHF的一個重要環節。如果能找到某種方法來提高干細胞的存活率，那么干細胞治療心肌梗死以及CHF的療效將大大的提高。
隨著心肌梗死治療技術的進步以及對心肌缺血早期診斷的增加，心肌缺血性疾病的院內死亡率已經顯著下降，這也間接導致缺血后患有充血性心力衰竭（congestive heart failure, CHF）的患者數量明顯增加[1-2]。常規藥物治療不能使受損的心肌復原，因此并不能使CHF得到顯著改善[3]。骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有很高的分化潛能，已被證實可以用于治療CHF[4-5]。用MSCs治療CHF主要涉及到心肌缺血后局部細胞因子的表達變化、細胞因子干細胞的趨化歸巢作用以及干細胞歸巢后的治療作用。有研究表明，MSCs移植療法能增加有功能的心肌細胞數目，修復受損的心肌細胞，繼而使心肌梗死灶面積減小，左心室射血分數增加，顯著改善心臟功能[6-9]。因此，MSCs可能是治療CHF最有效的方法之一。本文主要對現有的間充質干細胞治療心肌梗死的現狀、原理及前景做較全面的論述，以期為將來的臨床治療提供更好的理論指導。
1 骨髓間充質干細胞的分化潛能
目前用于嘗試治療CHF的干細胞主要是MSCs，因為其特有的優勢：（1）MSCs是造血組織的前體細胞，它可以相對較容易地從自身骨髓中獲得；（2）通過體外擴增，這些MSCs依然具有多向分化的潛能，表現出較低的免疫原性，并且容易冷凍；（3）MSCs可以在具有血管內皮生長因子的培養條件下分化成血管內皮細胞，而且可以在刺激下分化成心肌細胞[10-11]；（4）其分化來的心肌細胞能與周圍宿主心肌細胞形成有效的電-機械耦聯。因此，MSCs更適用于臨床。
通過修復和再生受損的心肌是對傳統的治療機制的挑戰。內源性修復方式是將MSCs移植到受損的心肌區域，使之增殖分化，形成新的血管和心肌組織，從而修補損傷的心肌細胞，恢復心肌的功能[12-14]。已有的研究表明，心肌梗死后將MSCs移植入損傷的心臟之后，可以分化成心肌細胞和血管內皮細胞[15-17]。Fukuda [18]證明在體外實驗中，MSCs在5氮胞苷的作用下可以自發轉化為心肌肌管樣組織。Supokawej等[19]發現經過5氮胞苷處理過的間充質干細胞可以表達包括心房肽、腦鈉素、心肌細胞特異性轉錄因子及Nkx2.5/Csx在內的心肌細胞基因。此外，這些細胞還顯示出了心肌細胞連接所特有的閏盤結構，形成肌絲并且自發的產生收縮。Wang等報道MSCs注射進入心肌組織之后，甚至不需要5氮胞苷處理就可以分化并表現出心肌細胞的特性，而且注射的間充質干細胞在正常心肌中較疤痕組織中更易分化為心肌細胞。Madonna等[20]證明移植MSCs可以使受損的心室中形成新的心肌組織。標記的移植干細胞可以表達心肌細胞增強因子，心肌特異性轉錄因子-4和連接蛋白-43。在體內實驗的嚙齒類和大型動物實驗模型以及Meta分析的結果均顯示干細胞處理組可以顯著改善左心室射血分數，減少梗死瘢痕的面積，并降低左心室收縮期末容積，還可以進一步減少心肌梗死、死亡，心衰再入院以及重復的血運重建的發生[21-23]。
2 心肌細胞再生的機制
圍繞受損心肌的修復和再生問題，學者們做了許多工作，探討心肌細胞再生的可能性和了解心肌細胞再生的機制，以發現有效修復受損心肌細胞及功能的方法。目前對心肌細胞再生的機制有如下3種假設。
2.1 轉分化理論
此理論是在間充質干細胞與乳鼠心肌細胞共培養之后，發現可以表達連接蛋白-43、心房肽以及肌鈣蛋白-I，而第一次被提出的。這些有意義的結果和轉分化理論的提出是有爭議的，在2004年Murry等[24]用基因失蹤技術來研究注射入心肌梗死之后的小鼠心臟中的干細胞，結果他們未發現任何的轉分化證據。一系列的研究表明移植以后的干細胞保存在體內的機率很低，因此轉分化理論可能并不是干細胞分化的機制。
2.2 心肌融合理論
Rose等[25]將用綠色熒光蛋白標記的MSCs注入急性缺血的心肌組織中，接著他們發現綠色熒光蛋白陽性的細胞可以表現出心肌細胞特異的標記和形態。他們用轉基因技術標記的基因證明了這些細胞是已經融合的結果而不是轉分化的結果。然而，相關研究也表明這種融合機率非常低。盡管細胞融合看起來是存在的，但是這并不是細胞心肌化的最主要機制。
2.3 干細胞調節的旁分泌作用
目前，這種假說理論已經被廣泛接受。這種理論的支持者認為干細胞釋放的炎癥趨化因子和炎性分子的作用上調宿主細胞的再生過程。梗死的心肌組織中植入干細胞以后，組織中的血管內皮生長因子，成纖維細胞生長因子（bFGF）以及胰島素樣生長因子-1的表達量都出現上調，這些都有可能改善心功能。將收集到的培養干細胞的條件培養基加入到缺血的心肌組織中可以對心肌組織產生有利的作用[26]。這些研究表明，即使是在沒有干細胞存在的條件下，干細胞分泌到培養基中的因子依然可以起到刺激心肌再生的作用。此外，Dayan等[27]證明當干細胞被注射到急性心肌缺血的心肌中之后可以分泌較低水平的促炎及抗炎因子，其中一個重要的抗炎癥因子（IL-10）將會被分泌出來，而金屬肽酶-1的抑制劑金屬肽酶-2的分泌則會減少，這些都可以促進心臟左心室射血分數的增加。上述有利證據表明干細胞的旁分泌作用可能是心肌細胞再生的主要機制。
3 現有的MSCs移植方法
許多移植干細胞方法已報道，但所有方法都是試圖轉移最大量干細胞到梗死的心肌中去。在這些報道中，心肌內、靜脈的和經冠狀動脈內注射是最常見的移植干細胞到壞死心肌中的方法[28]。盡管這些方法都具有他們自己的優勢，但這些均有高度侵入性精細操作，缺乏特異性的靶目標而且還有很高器官栓塞機率。為克服這些問題，運用各種載體工具來轉移干細胞已經為人們所共識。在一項研究中發現，運用纖維蛋白膠轉移干細胞可以顯著增加移植細胞存活數量，減少梗死面積并增加缺血心肌血流量[29]。在另一項研究中，運用可注射的基底膜來轉移干細胞的研究結果顯示，相對于只接受了干細胞移植的對照組，干細胞基質膠組表現出更好的心肌恢復效果，移植/梗死比例在干細胞基質膠組中顯著升高（P < 0.034）[30]。近來，有研究者認為通過植入MSCs的熱敏凝膠進行心肌內遞送[31]。成肌細胞板由感溫、高分子接枝的細胞培養皿構成，兩個單層構造的成肌細胞板（5×106個細胞/板）的植入，結合造血干細胞的聚集，通過釋放基質細胞衍生因子-1和其他生長因子，可以成功修復受損心肌，減少心肌的纖維化，并阻止心肌重塑。以往的研究已經表明了干細胞療法對心肌再生的劑量-反應關系上的效果，這說明對梗死部位最佳的細胞送達十分重要[32-33]。
因此，盡管這些新方案較常規方法具有更多有益的結構和操作上的優勢，但這些新方案和直接干細胞注射一樣，仍然構成一種無差別的心臟給藥方式，具有很高的隨機性，需要進一步改善。因此，依然需要為干細胞的定向遞送設計一個適合的干細胞遞送系統。
4 干細胞療法在心肌再生中的作用以及其局限性
2001年，Strauer等[34]報道1例在心肌梗死后6 d接受自體骨髓干細胞移植術的46歲患者。結果表明該患者在移植了干細胞之后其心臟梗死面積從24.6%下降至15.7%，而且左心室射血分數也增加了20%。這一原始結果非常令人吃驚，進而促進了一系列臨床試驗的開展。到2007年底，三個重要的臨床研究已經完成：急性心肌梗死后輸入大量的祖細胞用來完成心肌重建、通過骨髓移植來加強ST段抬高的梗死心肌的再生、在急性心肌缺血的冠狀動脈內的骨髓干細胞移植術。這些試驗中采用了類似的設計，包括收獲自體的干細胞，以及隨后的缺血24 h至7 d之內冠狀動脈內輸入干細胞。總的來說，這些研究都表明干細胞輸入可以使左心室射血分數提升3.3%～5.9%[35-37]。Abdel-Latif等[38]對18組隨機和隊列的研究進行了Meta分析，研究共納入999例患者，結果發現左心室射血分數增加3.66%。另一項僅限于隨機試驗的Meta分析綜合了7例冠狀動脈或心臟內注射干細胞的試驗研究，共納入237例患者，結果表明左心室射血分數增加3.7%。以上研究結果都為心肌梗死的治療展示了令人期待的臨床治療途徑[39]。
盡管動物實驗跟臨床試驗之間都存在差異，但迄今為止所有的證據都證明干細胞移植技術沒有對患者預后產生不利的影響。這表明，在臨床實施方案中觀察到的干細胞治療缺乏全細胞潛能，這可能與異質細胞的類型和數量有關，與細胞滯留狀況較差和成熟MSCs質量較差以及選的傳遞路徑有關。體內外研究表明，在干細胞注射到體內的第一個24 h內細胞存活率僅為10%～44.8%[40-41]。一直以來，移植以后干細胞的丟失都推測是由于細胞的死亡，或者是由于心臟的跳動引起的一種機械性的驅趕。將干細胞移植到受損的心肌中的最主要問題是由于灌注不足再加上大量的自由基形成從而導致了細胞的壞死和凋亡[42-43]。這些因素都促發了激烈的炎癥反應，并可能引起新的心肌缺血。因此，細胞凋亡加上由于心跳所導致的機械性因素進一步降低了干細胞的滯留，進而影響了干細胞移植治療的效果。
5 MSCs治療方法的前景
大量的實驗已經證實，MSCs移植入受損的心臟中可以減小梗死面積，提高左心室射血分數[44-45]。但是，用MSCs移植療法治療缺血性心臟疾病還沒有完全發揮其應有的治療潛能，一個很重要的受限因素就是移植后的MSCs只有很少一部分能存活下來。如何解決這個問題依然是干細胞移植療法治療CHF的一個重要環節。如果能找到某種方法來提高干細胞的存活率，那么干細胞治療心肌梗死以及CHF的療效將大大的提高。