引用本文： 許士俊, 穆軍升, 張健群, 伯平. 小分子化合物XAV939誘導小鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞的實驗研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(7): 714-718. doi: 10.7507/1007-4848.20160171 復制
心肌梗死是心血管疾病中發病率高、兇險程度高、近遠期死亡率高、預后不良的疾病。成熟哺乳動物的心臟細胞為永久細胞，一旦發生損傷便無法再生修復。心臟移植仍是目前治療心肌梗死后心力衰竭惟一有效的手段，其供體短缺是一個目前尚需解決的難題，因此，在臨床上需要更好的治療手段。針對這個問題，科學家們提出用新生的心肌細胞替代已經損傷壞死的細胞來治療梗死后心力衰竭。胚胎干細胞（ESC）具有自主復制、全能分化能力，在體外可分化為三胚層各類型細胞，是最有前景、最具發育潛能性的的種子細胞之一。目前，體外分離和培養胚胎干細胞的實驗方法已經非常成熟，并可以被大量的培養和分裂增殖以及定向分化為心肌細胞[1-2]。大量的實驗證明，將體外由胚胎干細胞誘導分化而來的心肌細胞植入大鼠和豬的心肌梗死模型中，能夠形成有功能的心肌組織，提高局部和整體的心功能[3-4]。但是，胚胎干細胞在體外自然分化為心肌細胞的效率很低，因此，尋找一種高效、低廉、安全的誘導方法具有重要意義。目前，運用較多的化學誘導劑如二甲基亞砜、5-氮胞苷等，雖能明顯提高胚胎干細胞分化為心肌細胞的效率，但因有一定的毒性，從而限制了這些誘導劑在臨床上的應用。本文中，我們采用一種小分子化合物XAV939作為誘導劑，探討XAV939對小鼠胚胎干細胞體外分化為心肌細胞的影響，以期建立一種新的、高效的體外誘導ES細胞分化為心肌細胞的實驗方法，為將來細胞移植治療缺血性心臟病打下基礎。
1 材料與方法
1.1 細胞來源、主要試劑和儀器
本研究中所用小鼠胚胎干細胞（mESC）來自于中國科學院動物研究所。本研究中使用的主要試劑包括高糖DMEM（Gibco）、1%的非必需氨基酸（Gibco）、L-谷氨酰胺（Gibco）、0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇（Gibco）、青鏈霉素（Gibco）、絲裂霉素C（Sigma）、5%血清替代品（SR，Gibco）、磷酸鹽緩沖液（PBS，Gibco）、0.05%胰酶（Gibco）、明膠、干細胞胎牛血清（FBS，Gibco）。本研究中使用的主要儀器包括高速控溫離心機（Thermo）、液氮罐（Thermofisher）、電動移液器（Thermo Scientific Finnpipette C1）、CO2培養箱（Thermo，HERA cell 150i）、凍存管（NUNC）、50 ml/15 ml 離心管（NUNC）、6 cm/10 cm 細胞培養皿（NUNC）、6孔板/24孔板/96孔板細胞培養皿（NUNC）、超凈臺、顯微鏡、水浴鍋。
1.2 實驗方法
1.2.1 制備小鼠胚胎干細胞飼養層
將孕期13.5 d的昆明白鼠拉頸處死，浸泡酒精，無菌條件下去除子宮，用PBS充分洗滌，盡量將血跡洗干凈。然后剪開子宮和胎膜，取出胚胎后將其頭部和內臟去除，PBS清洗一遍，用細剪刀將其剪成1 mm3以下的碎塊，濾過濾網，將濾過液吸于離心管中靜置5～10 min，吸去上清，加入1 ml含0.25%胰酶+0.04% EDTA溶液，輕輕吹吸，消化2 min，加入等體積的MEF培養液（含10%胎牛血清的高糖DMEM）終止消化，吹吸后放入高速溫控離心機中，800 r，離心5 min，吸棄上清，放在血球計數板上計數，調整濃度后以5×105/ml 重懸于MEF生長培養基上，37℃、5%的細胞培養箱中培養至90%的融合度后傳代，當傳至第三代時，用10 μg/ml的絲裂霉素C處理2.5 h，吸去培養基，PBS將殘余培基及死細胞洗凈，適量胰酶消化，800 r離心4 min，收集細胞后重懸于培養基中，計數后以5×104/ml 接種于0.1%明膠包被的100 mm培養皿中。多余的細胞凍存備用。
1.2.2 小鼠胚胎干細胞的復蘇、培養和傳代
從液氮罐中取出一支凍存的小鼠胚胎干細胞，浸入37℃的水浴鍋中快速解凍，加入到50 ml離心管中800 r離心4飼養層，吸棄凍存液，2 ml干細胞培養基（高糖DMEM、1%的非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%的青鏈霉素、0.1%的β-巰基乙醇、10%的干細胞胎牛血清、1000 U/ml LIF）重懸細胞后接種于預先處理的小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上，37℃、5%的細胞培養箱中培養，隔天更換培養基。當細胞團過大或者較密時胰酶消化傳代，差速貼壁法去除MEF，接種于新準備的MEF飼養層上，繼續培養。
1.2.3 EBs的制備
取生長良好還未分化的mES細胞，胰酶消化后，離心后重懸細胞，計數后用干細胞分化培養基（5%的血清替代物、5%的干細胞胎牛血清、1%的非必需氨基酸、1%的谷氨酰胺、1%的青鏈霉素、0.1%的β-巰基乙醇）重懸細胞，稀釋至2.5×104個/ml，以20 μl為1滴，每滴含有500個細胞，懸滴于100 mm培養皿蓋上，每個皿50個，皿中加10 ml鹽酸鹽緩沖液（PBS）保持細胞培養皿濕潤（d0），培養3 d后形成球形擬胚體（d3），將形成的擬胚體吸出，種植于預先用0.1%明膠處理過的附有蓋玻片的24孔板中，每個孔2個EBs，分為兩組，一組加入小分子化合物XAV939（1 μM），在第五天換為不加任何誘導劑的分化培養基培養。另一組不加任何誘導劑進行分化培養。兩組在第五天后隔天更換培養基，每天觀察細胞的生長分化情況。
1.2.4 使用光學顯微鏡進行觀察
自擬胚體貼壁誘導分化后，每天在光學顯微鏡下觀察擬胚體的分化狀態及形態變化，記錄擬胚體出現自主跳動時的最初時間和數量，對出現跳動的區域進行顯微錄像，記錄跳動的頻率和節律并根據出現跳動心肌細胞的擬胚體數量與總的擬胚體數的比率計算誘導效率。
1.2.5 激光共聚焦顯微鏡
擬胚體貼壁誘導分化21 d后，對小鼠胚胎干細胞誘導分化為心肌細胞進行免疫熒光染色鑒定。將培養基吸出，用PBS洗滌3遍，用4%的多聚甲醛固定細胞20 min，吸棄，PBS洗3遍，每次洗5 min（用搖床）。用0.1% tritonX-100（PBS配置）處理細胞10 min，PBS洗3遍，每次5 min。吸棄后，用5%的牛血清蛋白（BSA）封閉處理30 min，PBS洗2遍。加入兔抗小鼠一抗心肌肌鈣蛋白T （cTnT，1: 200，PBS稀釋），4℃過夜，PBS洗3遍，每次5 min。加入山羊抗兔熒光二抗，室溫避光放置1 h，PBS洗3遍，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，室溫染45 min，PBS洗4遍，每次5 min。加入封片劑封片，指甲油固定，在激光共聚焦顯微鏡下觀察讀片。
2 結果
2.1 光學顯微鏡觀察結果
小鼠胚胎干細胞呈克隆狀生長，形似圓形或橢圓、立體感強、未分化時邊緣整齊、細胞排列緊密、界限與形態難以分清、克隆結構均勻、邊緣光滑且有折光性，呈未分化狀態，見圖 1。mESC生長非常迅速，3 d即可傳代，傳代后生長更快。待克隆長大后，胰酶消化，計數后重懸細胞，懸滴3 d形成擬胚體，擬胚體是由分化細胞和未分化細胞組成的復合體，包含了3個胚層在內的所有組織細胞，擬胚體呈球形，將擬胚體種植于24孔板中進行誘導分化。
圖1
光學顯微鏡下mESC 來源的心肌細胞示意圖
注：A：mESC 經懸滴法形成的擬胚體；B：擬胚體出現搏動（搏動部位如黑色箭頭所示）
2.2 小鼠胚胎干細胞來源的心肌細胞觀察
EBs未貼壁時呈球形或橢圓形，見圖 2A，種植后2～3 h后開始貼壁生長，24 h后基本貼壁完成。EBs繼續分化，細胞從克隆中央向周圍部位爬出，經XAV939誘導，分化8 d后出現自發性搏動，搏動部位見圖 2B箭頭所示，搏動的頻率、節律均不同。這可能和分化的心肌細胞數量存在差異有關。隨著分化時間的延長，自發跳動的細胞明顯增多，約在分化10～14 d后，大量的EBs出現跳動，隨著EBs的進一步分化，心肌細胞逐漸成熟，跳動的細胞及頻率也隨之降低，跳動頻率大部分集中在70～90次/分之間。
圖2
光學顯微鏡下mESC 來源的心肌細胞示意圖
注：A：mESC 經懸滴法形成的擬胚體；B：擬胚體出現搏動（搏動部位如黑色箭頭所示）
2.3 心肌細胞的鑒定
在小鼠胚胎干細胞誘導分化21 d后，對其形成的搏動部位進行心肌特異性標志物cTnT免疫熒光染色。蛋白發出紅色熒光，位于細胞質中，細胞核被DAPI標記呈藍色熒光，見圖 3。
圖3
激光共聚焦顯微鏡下心肌細胞染色示意圖
注：A：心肌細胞特異性標志物cTnT 表達陽性，呈紅色熒光；B：細胞核被DAPI 染為藍色；C：A 和B 圖的融合，可見蛋白存在與細胞之中，包繞細胞核
2.4 加誘導劑與未加誘導劑的擬胚體分化效率和頻率分布
從擬胚體貼壁分化開始，每天顯微鏡下觀察和記錄克隆跳動的情況以及跳動的頻率，根據統計數據進行繪圖。加誘導劑的擬胚體在誘導分化第8 d就出現自發性搏動，而未加任何誘導劑的在擬胚體誘導分化第10 d才有部分擬胚體出現搏動。在第3～5 d加入小分子化合物XAV939對小鼠胚胎干細胞定向向心肌細胞誘導分化時，約有72.9%(效率最高的一組)的擬胚體出現自發搏動，而未添加任何誘導劑組僅有8.3%的EBs出現搏動的心肌合胞體。使用誘導劑的擬胚體分化跳動頻率、分化效率以及不同誘導時間點對應跳動擬胚體數分布見圖 4、圖 5。分化第10～15 d是出現跳動擬胚體數最多的階段，跳動克隆的頻率分布集中在70～90（81.5±3.5）次/分，誘導效率平均為71.85%±1.05%。
圖4
使用誘導劑擬胚體跳動頻率分布圖
圖5
使用誘導劑擬胚體不同誘導時間點對應跳動擬胚體數的分布圖
3 討論
心肌梗死是心血管系統疾病中發病率最高、最為兇險的一種，嚴重威脅著人類的健康。心肌細胞作為永久細胞，一旦缺血壞死便不可再生，只能由成纖維細胞修復、替代。盡管在藥物、介入和外科治療心力衰竭方面取得了很大的進步，但是仍然無法從根本上解決問題。心臟移植作為終末期心力衰竭最為有效地治療手段，但因為供體短缺并不能滿足臨床上的需要。鑒于此，科學家一直致力于研究用心肌再生的手段來治療終末期心力衰竭[5]。目前，干細胞治療心肌梗死成為研究的熱點和焦點[6]。近年來，隨著生物技術的發展，細胞治療在基礎研究領域取得了飛速發展，干細胞治療心臟病獲得了令人震驚的效果，展示了廣闊的臨床前景。細胞治療是利用活組織重建和更新病變及老化的組織，其具體機制仍然未知，臨床應用的安全性和有效性是目前研究者關注和爭論的焦點[7]。
胚胎干細胞來自早期胚胎囊的內細胞團，具有自主復制、全能分化的特點，并能在保持未分化狀態下無限增值，可以分化為三個胚層所有類型細胞，包擴心房肌、心室肌、房室結、浦肯野細胞和竇房結樣細胞等多種心肌細胞[8]。體外培養條件下，干細胞可以自然分化為心肌細胞，但是效率不高，研究人員一直在尋找一種高效、低價和安全的誘導方法，包括各種蛋白、RNA和小分子化合物，由于化學誘導劑耗費低，濃度易于控制，分子量小，容易突破細胞膜而成為了最為常用的方法，研究比較多的有二甲基亞砜、5-氮胞苷等[9-10]，但是由于其本身存在毒性，因此臨床上限制了它們的應用。
在本研究中，我們利用干細胞中最具有潛力和研究價值的小鼠胚胎干細胞，利用懸滴法形成擬胚體，并在第3天和第5天加入小分子化合物XAV939，成功的將誘導效率提高到70.8%，并且經過免疫熒光鑒定了心肌細胞特異性標志物心肌肌鈣蛋白T（cTnT）的表達。在mESC的培養過程中，需要用特殊的干細胞培養基，此外，還需要一種特殊的細胞，將mES細胞鋪在上面，這層細胞叫作飼養層細胞，一方面可以模擬體內的生長環境，另一方面可以提供mESC增殖生長需要的細胞因子并且維持其全能性。本實驗中我們使用了小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養層細胞。
XAV939是Wnt/β-catenin通路的選擇性抑制劑。Wnt信號傳導通路與基因的表達、細胞的粘附、胚胎的發育等息息相關，分為經典的Wnt信號通路和非經典的Wnt信號通路[11]。經典的Wnt信號通路即Wnt/β-catenin通路，是Wnt信號中研究得最清楚的一條通路，其參與了調控細胞命運、細胞增殖、分化及凋亡等過程。研究證實，Wnt信號通路與胚胎心臟的生長發育關系密切[12]。對于經典Wnt信號轉導通路在胚胎心肌細胞分化過程中的作用，目前存在著兩種相反的觀點。一種觀點認為經典Wnt信號通路在胚胎心肌發育中具有抑制作用[13-15]，另一種觀點認為經典Wnt信號轉到通路在胚胎心肌細胞發育中具有促進作用。對于這樣的分歧，目前研究人員有兩種解釋，一種解釋認為在當前的科技水平下，還不能確定某一信號分子在胚胎發育中的作用，在胚胎發育過程中，存在著經典Wnt信號蛋白、非經典Wnt信號蛋白和Wnt信號抑制物，而且它們的表達非常復雜，而現在缺乏一個能夠完全模擬所有分子信息的數字模型，因此無法確定某種分子調控心肌分化的功能[16]；另一種解釋認為經典Wnt信號轉導通路對于胚胎心肌細胞的分化，既有抑制作用，也有促進作用；其依賴于分化時期，分化早期有促進作用，分化晚期有抑制作用[17-18]。目前有很多學者傾向于這種觀點，不過還需要更多實驗支持[19]。本實驗里，我們在小鼠胚胎干細胞分化的過程中，加入XAV939，成功的將小鼠胚胎干細胞誘導分化為心肌細胞的效率提高到72.9%，顯著高于不加誘導劑組（8.3%）。提示在干細胞誘導分化的第3天到第5天，抑制經典的Wnt信號通路，有利于mESC為心肌細胞，為干細胞定向誘導分化為心肌細胞提供了另一高效、安全的方法。小分子化合物XAV939相對其他誘導劑，分子量小易于通過細胞膜進入細胞內部且濃度易于控制，價格低廉、安全有效，因此是一種非常理想的化學誘導劑。
盡管從干細胞到臨床的治療應用還有一段很長的路要走，但是我們有理由相信，通過我們深入的研究，在不久的將來，干細胞治療心力衰竭將會變為現實。
心肌梗死是心血管疾病中發病率高、兇險程度高、近遠期死亡率高、預后不良的疾病。成熟哺乳動物的心臟細胞為永久細胞，一旦發生損傷便無法再生修復。心臟移植仍是目前治療心肌梗死后心力衰竭惟一有效的手段，其供體短缺是一個目前尚需解決的難題，因此，在臨床上需要更好的治療手段。針對這個問題，科學家們提出用新生的心肌細胞替代已經損傷壞死的細胞來治療梗死后心力衰竭。胚胎干細胞（ESC）具有自主復制、全能分化能力，在體外可分化為三胚層各類型細胞，是最有前景、最具發育潛能性的的種子細胞之一。目前，體外分離和培養胚胎干細胞的實驗方法已經非常成熟，并可以被大量的培養和分裂增殖以及定向分化為心肌細胞[1-2]。大量的實驗證明，將體外由胚胎干細胞誘導分化而來的心肌細胞植入大鼠和豬的心肌梗死模型中，能夠形成有功能的心肌組織，提高局部和整體的心功能[3-4]。但是，胚胎干細胞在體外自然分化為心肌細胞的效率很低，因此，尋找一種高效、低廉、安全的誘導方法具有重要意義。目前，運用較多的化學誘導劑如二甲基亞砜、5-氮胞苷等，雖能明顯提高胚胎干細胞分化為心肌細胞的效率，但因有一定的毒性，從而限制了這些誘導劑在臨床上的應用。本文中，我們采用一種小分子化合物XAV939作為誘導劑，探討XAV939對小鼠胚胎干細胞體外分化為心肌細胞的影響，以期建立一種新的、高效的體外誘導ES細胞分化為心肌細胞的實驗方法，為將來細胞移植治療缺血性心臟病打下基礎。
1 材料與方法
1.1 細胞來源、主要試劑和儀器
本研究中所用小鼠胚胎干細胞（mESC）來自于中國科學院動物研究所。本研究中使用的主要試劑包括高糖DMEM（Gibco）、1%的非必需氨基酸（Gibco）、L-谷氨酰胺（Gibco）、0.1 mmol/Lβ-巰基乙醇（Gibco）、青鏈霉素（Gibco）、絲裂霉素C（Sigma）、5%血清替代品（SR，Gibco）、磷酸鹽緩沖液（PBS，Gibco）、0.05%胰酶（Gibco）、明膠、干細胞胎牛血清（FBS，Gibco）。本研究中使用的主要儀器包括高速控溫離心機（Thermo）、液氮罐（Thermofisher）、電動移液器（Thermo Scientific Finnpipette C1）、CO2培養箱（Thermo，HERA cell 150i）、凍存管（NUNC）、50 ml/15 ml 離心管（NUNC）、6 cm/10 cm 細胞培養皿（NUNC）、6孔板/24孔板/96孔板細胞培養皿（NUNC）、超凈臺、顯微鏡、水浴鍋。
1.2 實驗方法
1.2.1 制備小鼠胚胎干細胞飼養層
將孕期13.5 d的昆明白鼠拉頸處死，浸泡酒精，無菌條件下去除子宮，用PBS充分洗滌，盡量將血跡洗干凈。然后剪開子宮和胎膜，取出胚胎后將其頭部和內臟去除，PBS清洗一遍，用細剪刀將其剪成1 mm3以下的碎塊，濾過濾網，將濾過液吸于離心管中靜置5～10 min，吸去上清，加入1 ml含0.25%胰酶+0.04% EDTA溶液，輕輕吹吸，消化2 min，加入等體積的MEF培養液（含10%胎牛血清的高糖DMEM）終止消化，吹吸后放入高速溫控離心機中，800 r，離心5 min，吸棄上清，放在血球計數板上計數，調整濃度后以5×105/ml 重懸于MEF生長培養基上，37℃、5%的細胞培養箱中培養至90%的融合度后傳代，當傳至第三代時，用10 μg/ml的絲裂霉素C處理2.5 h，吸去培養基，PBS將殘余培基及死細胞洗凈，適量胰酶消化，800 r離心4 min，收集細胞后重懸于培養基中，計數后以5×104/ml 接種于0.1%明膠包被的100 mm培養皿中。多余的細胞凍存備用。
1.2.2 小鼠胚胎干細胞的復蘇、培養和傳代
從液氮罐中取出一支凍存的小鼠胚胎干細胞，浸入37℃的水浴鍋中快速解凍，加入到50 ml離心管中800 r離心4飼養層，吸棄凍存液，2 ml干細胞培養基（高糖DMEM、1%的非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、1%的青鏈霉素、0.1%的β-巰基乙醇、10%的干細胞胎牛血清、1000 U/ml LIF）重懸細胞后接種于預先處理的小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上，37℃、5%的細胞培養箱中培養，隔天更換培養基。當細胞團過大或者較密時胰酶消化傳代，差速貼壁法去除MEF，接種于新準備的MEF飼養層上，繼續培養。
1.2.3 EBs的制備
取生長良好還未分化的mES細胞，胰酶消化后，離心后重懸細胞，計數后用干細胞分化培養基（5%的血清替代物、5%的干細胞胎牛血清、1%的非必需氨基酸、1%的谷氨酰胺、1%的青鏈霉素、0.1%的β-巰基乙醇）重懸細胞，稀釋至2.5×104個/ml，以20 μl為1滴，每滴含有500個細胞，懸滴于100 mm培養皿蓋上，每個皿50個，皿中加10 ml鹽酸鹽緩沖液（PBS）保持細胞培養皿濕潤（d0），培養3 d后形成球形擬胚體（d3），將形成的擬胚體吸出，種植于預先用0.1%明膠處理過的附有蓋玻片的24孔板中，每個孔2個EBs，分為兩組，一組加入小分子化合物XAV939（1 μM），在第五天換為不加任何誘導劑的分化培養基培養。另一組不加任何誘導劑進行分化培養。兩組在第五天后隔天更換培養基，每天觀察細胞的生長分化情況。
1.2.4 使用光學顯微鏡進行觀察
自擬胚體貼壁誘導分化后，每天在光學顯微鏡下觀察擬胚體的分化狀態及形態變化，記錄擬胚體出現自主跳動時的最初時間和數量，對出現跳動的區域進行顯微錄像，記錄跳動的頻率和節律并根據出現跳動心肌細胞的擬胚體數量與總的擬胚體數的比率計算誘導效率。
1.2.5 激光共聚焦顯微鏡
擬胚體貼壁誘導分化21 d后，對小鼠胚胎干細胞誘導分化為心肌細胞進行免疫熒光染色鑒定。將培養基吸出，用PBS洗滌3遍，用4%的多聚甲醛固定細胞20 min，吸棄，PBS洗3遍，每次洗5 min（用搖床）。用0.1% tritonX-100（PBS配置）處理細胞10 min，PBS洗3遍，每次5 min。吸棄后，用5%的牛血清蛋白（BSA）封閉處理30 min，PBS洗2遍。加入兔抗小鼠一抗心肌肌鈣蛋白T （cTnT，1: 200，PBS稀釋），4℃過夜，PBS洗3遍，每次5 min。加入山羊抗兔熒光二抗，室溫避光放置1 h，PBS洗3遍，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)，室溫染45 min，PBS洗4遍，每次5 min。加入封片劑封片，指甲油固定，在激光共聚焦顯微鏡下觀察讀片。
2 結果
2.1 光學顯微鏡觀察結果
小鼠胚胎干細胞呈克隆狀生長，形似圓形或橢圓、立體感強、未分化時邊緣整齊、細胞排列緊密、界限與形態難以分清、克隆結構均勻、邊緣光滑且有折光性，呈未分化狀態，見圖 1。mESC生長非常迅速，3 d即可傳代，傳代后生長更快。待克隆長大后，胰酶消化，計數后重懸細胞，懸滴3 d形成擬胚體，擬胚體是由分化細胞和未分化細胞組成的復合體，包含了3個胚層在內的所有組織細胞，擬胚體呈球形，將擬胚體種植于24孔板中進行誘導分化。
圖1
光學顯微鏡下mESC 來源的心肌細胞示意圖
注：A：mESC 經懸滴法形成的擬胚體；B：擬胚體出現搏動（搏動部位如黑色箭頭所示）
2.2 小鼠胚胎干細胞來源的心肌細胞觀察
EBs未貼壁時呈球形或橢圓形，見圖 2A，種植后2～3 h后開始貼壁生長，24 h后基本貼壁完成。EBs繼續分化，細胞從克隆中央向周圍部位爬出，經XAV939誘導，分化8 d后出現自發性搏動，搏動部位見圖 2B箭頭所示，搏動的頻率、節律均不同。這可能和分化的心肌細胞數量存在差異有關。隨著分化時間的延長，自發跳動的細胞明顯增多，約在分化10～14 d后，大量的EBs出現跳動，隨著EBs的進一步分化，心肌細胞逐漸成熟，跳動的細胞及頻率也隨之降低，跳動頻率大部分集中在70～90次/分之間。
圖2
光學顯微鏡下mESC 來源的心肌細胞示意圖
注：A：mESC 經懸滴法形成的擬胚體；B：擬胚體出現搏動（搏動部位如黑色箭頭所示）
2.3 心肌細胞的鑒定
在小鼠胚胎干細胞誘導分化21 d后，對其形成的搏動部位進行心肌特異性標志物cTnT免疫熒光染色。蛋白發出紅色熒光，位于細胞質中，細胞核被DAPI標記呈藍色熒光，見圖 3。
圖3
激光共聚焦顯微鏡下心肌細胞染色示意圖
注：A：心肌細胞特異性標志物cTnT 表達陽性，呈紅色熒光；B：細胞核被DAPI 染為藍色；C：A 和B 圖的融合，可見蛋白存在與細胞之中，包繞細胞核
2.4 加誘導劑與未加誘導劑的擬胚體分化效率和頻率分布
從擬胚體貼壁分化開始，每天顯微鏡下觀察和記錄克隆跳動的情況以及跳動的頻率，根據統計數據進行繪圖。加誘導劑的擬胚體在誘導分化第8 d就出現自發性搏動，而未加任何誘導劑的在擬胚體誘導分化第10 d才有部分擬胚體出現搏動。在第3～5 d加入小分子化合物XAV939對小鼠胚胎干細胞定向向心肌細胞誘導分化時，約有72.9%(效率最高的一組)的擬胚體出現自發搏動，而未添加任何誘導劑組僅有8.3%的EBs出現搏動的心肌合胞體。使用誘導劑的擬胚體分化跳動頻率、分化效率以及不同誘導時間點對應跳動擬胚體數分布見圖 4、圖 5。分化第10～15 d是出現跳動擬胚體數最多的階段，跳動克隆的頻率分布集中在70～90（81.5±3.5）次/分，誘導效率平均為71.85%±1.05%。
圖4
使用誘導劑擬胚體跳動頻率分布圖
圖5
使用誘導劑擬胚體不同誘導時間點對應跳動擬胚體數的分布圖
3 討論
心肌梗死是心血管系統疾病中發病率最高、最為兇險的一種，嚴重威脅著人類的健康。心肌細胞作為永久細胞，一旦缺血壞死便不可再生，只能由成纖維細胞修復、替代。盡管在藥物、介入和外科治療心力衰竭方面取得了很大的進步，但是仍然無法從根本上解決問題。心臟移植作為終末期心力衰竭最為有效地治療手段，但因為供體短缺并不能滿足臨床上的需要。鑒于此，科學家一直致力于研究用心肌再生的手段來治療終末期心力衰竭[5]。目前，干細胞治療心肌梗死成為研究的熱點和焦點[6]。近年來，隨著生物技術的發展，細胞治療在基礎研究領域取得了飛速發展，干細胞治療心臟病獲得了令人震驚的效果，展示了廣闊的臨床前景。細胞治療是利用活組織重建和更新病變及老化的組織，其具體機制仍然未知，臨床應用的安全性和有效性是目前研究者關注和爭論的焦點[7]。
胚胎干細胞來自早期胚胎囊的內細胞團，具有自主復制、全能分化的特點，并能在保持未分化狀態下無限增值，可以分化為三個胚層所有類型細胞，包擴心房肌、心室肌、房室結、浦肯野細胞和竇房結樣細胞等多種心肌細胞[8]。體外培養條件下，干細胞可以自然分化為心肌細胞，但是效率不高，研究人員一直在尋找一種高效、低價和安全的誘導方法，包括各種蛋白、RNA和小分子化合物，由于化學誘導劑耗費低，濃度易于控制，分子量小，容易突破細胞膜而成為了最為常用的方法，研究比較多的有二甲基亞砜、5-氮胞苷等[9-10]，但是由于其本身存在毒性，因此臨床上限制了它們的應用。
在本研究中，我們利用干細胞中最具有潛力和研究價值的小鼠胚胎干細胞，利用懸滴法形成擬胚體，并在第3天和第5天加入小分子化合物XAV939，成功的將誘導效率提高到70.8%，并且經過免疫熒光鑒定了心肌細胞特異性標志物心肌肌鈣蛋白T（cTnT）的表達。在mESC的培養過程中，需要用特殊的干細胞培養基，此外，還需要一種特殊的細胞，將mES細胞鋪在上面，這層細胞叫作飼養層細胞，一方面可以模擬體內的生長環境，另一方面可以提供mESC增殖生長需要的細胞因子并且維持其全能性。本實驗中我們使用了小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養層細胞。
XAV939是Wnt/β-catenin通路的選擇性抑制劑。Wnt信號傳導通路與基因的表達、細胞的粘附、胚胎的發育等息息相關，分為經典的Wnt信號通路和非經典的Wnt信號通路[11]。經典的Wnt信號通路即Wnt/β-catenin通路，是Wnt信號中研究得最清楚的一條通路，其參與了調控細胞命運、細胞增殖、分化及凋亡等過程。研究證實，Wnt信號通路與胚胎心臟的生長發育關系密切[12]。對于經典Wnt信號轉導通路在胚胎心肌細胞分化過程中的作用，目前存在著兩種相反的觀點。一種觀點認為經典Wnt信號通路在胚胎心肌發育中具有抑制作用[13-15]，另一種觀點認為經典Wnt信號轉到通路在胚胎心肌細胞發育中具有促進作用。對于這樣的分歧，目前研究人員有兩種解釋，一種解釋認為在當前的科技水平下，還不能確定某一信號分子在胚胎發育中的作用，在胚胎發育過程中，存在著經典Wnt信號蛋白、非經典Wnt信號蛋白和Wnt信號抑制物，而且它們的表達非常復雜，而現在缺乏一個能夠完全模擬所有分子信息的數字模型，因此無法確定某種分子調控心肌分化的功能[16]；另一種解釋認為經典Wnt信號轉導通路對于胚胎心肌細胞的分化，既有抑制作用，也有促進作用；其依賴于分化時期，分化早期有促進作用，分化晚期有抑制作用[17-18]。目前有很多學者傾向于這種觀點，不過還需要更多實驗支持[19]。本實驗里，我們在小鼠胚胎干細胞分化的過程中，加入XAV939，成功的將小鼠胚胎干細胞誘導分化為心肌細胞的效率提高到72.9%，顯著高于不加誘導劑組（8.3%）。提示在干細胞誘導分化的第3天到第5天，抑制經典的Wnt信號通路，有利于mESC為心肌細胞，為干細胞定向誘導分化為心肌細胞提供了另一高效、安全的方法。小分子化合物XAV939相對其他誘導劑，分子量小易于通過細胞膜進入細胞內部且濃度易于控制，價格低廉、安全有效，因此是一種非常理想的化學誘導劑。
盡管從干細胞到臨床的治療應用還有一段很長的路要走，但是我們有理由相信，通過我們深入的研究，在不久的將來，干細胞治療心力衰竭將會變為現實。
