引用本文： 張峰懿, 李定彪, 范振寧, 江宇, 李振華. 阻斷Wnt-1信號通路對裸鼠非小細胞肺癌的模型研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(6): 608-612. doi: 10.7507/1007-4848.20160144 復制
隨著工業的發展和汽車數量的增多，城鎮居民肺癌發病率呈逐年增高的趨勢。肺癌是男性罹癌致死率最高的腫瘤[1]，其中約80%的患者是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。在西南邊陲的云南省，有宣威和個舊兩個著名的肺癌高發地。鑒于早期發現和早期診斷在世界范圍內仍是未解決的難題，臨床醫師面對的仍然是大量中晚期肺癌的患者。因而在近幾十年來，外科手術加術后化療仍然是非小細胞肺癌治療的主要手段[3]。針對非小細胞肺癌，昆明市某醫院的研究顯示在行根治性手術切除138例患者的5年生存率為44.8%[4]。在單純的手術方面，伴隨電視胸腔鏡手術的飛速發展，手術已經基本可以切除無遠處轉移的低于ⅢB期的肺癌病灶[5]。因此，除了早期診斷和主要的手術治療之外，藥物治療已經成為基礎醫學最重要的研究方向。
配合化療的肺癌患者5年生存率明顯提高，但現在作為一線治療的化療藥物順鉑聯合吉西他濱治療肺癌患者主要不良反應為骨髓抑制及胃腸道反應。嚴重的不良反應可使階段性治療由于一些嚴重的副作用而暫停甚至終止，影響患者的住院治療效果和生存率。另外，運用吉西他濱聯合紫杉醇治療非小細胞肺癌患者的1年生存率為46.4%，中位生存期為10.8個月，其副作用主要是骨髓抑制及周圍神經毒性。在有效控制血小板和粒細胞的情況下，鉑類腫瘤化療藥物等聯合化療方案對情況較差的老年晚期患者仍然不能耐受[6]。由此可見作為一線用藥的鉑類藥物對晚期肺癌患者的有效性仍然有很大的提高空間。
鑒于這種現狀，在基礎研究方面，Wnt信號通路作為調控胚胎發育和腫瘤發生、發展的熱點，越來越得到學界的重視[7]。有免疫組織化學試驗研究顯示，針對151例肺癌患者Wnt-1的過表達與肺癌的惡性增殖成正相關，其中61例肺癌患者（40.4%）wnt-1表達呈陽性[8]。
對于阻斷Wnt-1信號通路對肺癌細胞影響的研究，國內外報道均比較少見。云南省的肺癌發病率和死亡率都居高不下，但針對地域性肺癌的基礎研究工作較少。本實驗通過對云南省宣威地區肺癌患者切除非小細胞肺癌的肺癌組織培養并接種于裸鼠內體，在活體動物生存期進行Wnt抗體的干涉來研究阻斷Wnt信號通路對非小細胞肺癌的影響，以期相關的實驗結果能對其臨床應用提供理論幫助。
1 資料與方法
1.1 荷瘤鼠模型和細胞系來源
本次實驗所用21只雄性Balb/c-Nu裸鼠（16～18 g）均購于北京華阜康生物科技有限公司。裸鼠喂養飼料：Co60滅菌飼料，購于北京華阜康生物科技有限公司。在取得知情同意后，收集昆明醫科大學附屬延安醫院未經放、化療的住院患者外科切除且病理診斷為非小細胞肺癌的肺癌組織。
1.2 主要試劑、儀器與設備
本次研究使用的主要試劑包括Wnt-1抗體（Milli pore公司）、多西他賽（多帕菲，昆明澤浩公司）、10%小牛血清的PMPI-1640培養基（Sigma公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、Hanks液（Sigma公司）。
本次研究所用主要儀器與設備包括二氧化碳細胞培養箱（德國Thermo Fisher Scientific）、倒置相差顯微鏡（日本Olympus）、超低溫冰箱（美國Eectrolux公司）、高速冷凍臺式離心機（美國Thermo公司）、高速離心機（美國Thermo公司）、精密電子天平FA2004（上海精科天平)、SPF級動物飼養實驗室（昆醫附屬延安醫院中心實驗室）。
1.3 方法
1.3.1 細胞培養及傳代
將瘤組織切成1～2 mm3小塊，用Hanks液洗3次，接種于事先涂有鼠尾膠原的培養瓶中，并將培養瓶置于37℃、5%CO2的普通恒溫箱中培養。在上述的碎組織塊中加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴30 min后液洗3次，盛于完全培養基并制成（5～10）×108個/L細胞濃度的懸液。在37℃、5%CO2含有10%小牛血清的PMPI-1640培養基培養并以此作為初代細胞。每3 d更換一次培養液，并觀察、記錄細胞貼壁生長情況。當細胞長滿培養瓶時，用5 ml 0.25%胰蛋白酶消化5 min直至細胞呈球形回縮時加入5 ml培養液終止消化并將培養瓶中的懸浮液分裝傳代培養。將第五代細胞，用0.25%胰蛋白酶消化5 min并加入無血清PMPI-1640液1 200轉/min離心三次。
1.3.2 荷瘤模型的構建
在上述細胞液中加入生理鹽水稀釋至2×107個/ml，并在裸鼠背部皮下接種約0.1 ml細胞液。1周后接種部位均肉眼可見直徑約3～5 mm腫瘤結節生長。將接種后的裸鼠置于適宜光照、溫度、濕度條件下的SPF級動物飼養室內，定時給予飼料、蒸餾水，每天觀察、記錄裸鼠活動及死亡情況。間隔三天用游標卡尺測量接種小鼠背部腫瘤結節長徑（a）與短徑（b），用公式V=1/2ab2計算所測瘤體體積并繪制腫瘤時間-體積曲線。將16只小鼠背部瘤體直徑達4 mm時設定為荷瘤第1天。在荷瘤第6天時將裸鼠按體重從小到大編為1～21號并隨機分組（表 1）。
表1
裸鼠隨機分組表
1.3.3 分組注射抗腫瘤藥物
第6天時分別給予實驗組、對照組、空白組小鼠背部腫瘤周邊皮下注射Wnt-1抗體（0.2 ml/只）、多西他賽（0.2 ml/只）、生理鹽水（0.2 ml/只）。每4天注射一次，共進行6次注射。抗瘤藥物注射后每3天測量腫瘤體積并觀察、記錄裸鼠活動及死亡情況，直至最后一次注射后再行兩次連續測量為止，瘤體積抑制率：腫瘤體積抑制率=（對照組平均體積 —實驗組平均體積）/對照組平均體積×100%。
1.3.4 裸鼠處死取標本
在行第10次測量腫瘤體積后斷頸處死裸鼠，將整個移植瘤取下并用天平稱取腫瘤組織（圖 1）重量（w）。取下組織浸泡在福爾馬林溶液中保存備用。
圖1
腫瘤組織示意圖
注：從左到右依次為空白組、實驗組、對照組腫瘤
1.4 統計學分析
應用SPSS20.0軟件進行數據處理，計量資料采用均數±標準差（
2 結果
完成最后一次測量前無裸鼠死亡，三組裸鼠外觀可見腫瘤體積的差異，部分裸鼠背部腫瘤有潰瘍形成。為保證實驗的均衡性在第一次開始注射抗瘤藥物時（即飼養第6天時）將各組間抗瘤藥物注入后及注入前腫瘤體積進行統計學分析，比較各組間移植瘤體積是否有差異（表 2）。
表2
抗瘤藥物注射時各組間腫瘤體積比較（
圖2
腫瘤時間-體積變化曲線圖
上表數據經方差齊性檢驗符合正態分布，各組間差異無統計學意義（F=0.375，P>0.05），即注射抗瘤藥物時隨機分為三組時各組間腫瘤體積無差異，說明均衡性較好可以進行抗瘤藥物注射。
根據研究數據繪制腫瘤時間-體積變化曲線圖，由圖可知由于各組注射藥物不同，各組間腫瘤體積也出現差異，對照組與空白組差異尤為明顯。從第18天起各組間開始出現較明顯差異，第27天時空白組與其他兩組差異均有統計學意義。多西他賽較Wnt-1抗體有更強的抑制腫瘤的作用。各組測量日的標準差均在正常范圍內，差異有統計學意義。第12天時，實驗組標準差值為0.352遠大于其他兩組且曲線高于空白組，考慮原因可能是因為第6天即第一次給A組部分裸鼠注射Wnt-1抗體時出現操作問題。
對各組藥物注入裸鼠體內后不同時間段各組間腫瘤體積差異進行比較分析，抗瘤藥物注射前6天，三組比較均無差異；第二次注射藥物后，對照組出現抑瘤作用；自第三次注射藥物時空白組與其他兩組相比腫瘤體積有上升趨勢，這說明抗瘤藥物對腫瘤生長的抑制要在一周至兩周時間表現出來；第21天，對照組與實驗組相對于空白組出現較為明顯的腫瘤抑制作用，其結果與時間-體積曲線圖走勢相符；第24天，對照組和實驗組與空白組相比，差異均有統計學意義（P<0.05）。說明兩種抗瘤藥物在抑制腫瘤生長方面具均有效且多西他賽相對于Wnt-1抗體抑瘤作用更加明顯（表 3、表 4）。
表3
藥物注射后不同時間點腫瘤的體積（
表4
抗瘤藥物注射后不同時間點腫瘤體積組間比較
根據研究數據繪制腫瘤時間-抑制率曲線圖（圖 3）。從圖中可以看出，抗腫瘤藥物在前15 d抑瘤效果不明顯，15 d到24 d抑瘤效果對照組強于實驗組，從24 d開始至裸鼠解剖抑瘤效果明顯提高。二者腫瘤體積抑制率差異有統計學意義。考慮空白組部分裸鼠出現腫瘤潰瘍，出現已經明顯的惡病質，因此觀察至33 d。另外12 d測量Wnt-1組腫瘤相對于空白組腫瘤生長旺盛，考慮原因可能是Wnt-1抗體的注射操作問題。
圖3
腫瘤時間-抑制率曲線圖
3 討論
非小細胞肺癌是對人類危害最大的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升的趨勢，其發生、發展是一個多因素多步驟的過程，主要表現為生活習慣的改變、環境的變化。治療主要以根治性手術切除為主，肺癌的發生被認為是一系列多基因改變累積的結果。雖然，在過去的幾十年肺癌的診斷和治療都取得了很大的進展，但是其死亡率依然很高，特別是在肺癌晚期，肺癌細胞發生侵襲和轉移。即使抗腫瘤治療能有效的控制腫瘤遷移，但是效果只是暫時的，大多數轉移瘤的復發是很迅速的[9]。其中，經典Wnt信號通路表達失調或其核心成員的異常與腫瘤的發生、進展密切相關[10]。
Wnt信號通路（即果蠅中的Wg信號通路）是一類在發育上保守的信號通路，在動物發育和組織形成后的動態平衡中，具有重要功能[11-12]。Wnt來源于無翅基因（wingless，Wg）與Int基因[13]。Wg基因最早在果蠅中發現，對胚胎發育有重要作用[14]，可促進成年動物的肢體形成[15]，其突變可導致無翅畸形。Int基因最早于1982年由Nusse等在探討小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）轉錄機制過程中發現[11-16]。由于Int-1基因與Wg基因具有同源性，現已將有關的兩類基因統一命名為Wnt基因家族。在多種細胞中，Wnt信號通路起著關鍵作用，參與細胞的增殖、分化、凋亡等基本過程，尤其是調控正常組織發育以及腫瘤形成[17-19]。
本實驗通過研究Wnt信號通路比較三組間的組間差異來驗證Wnt信號通路在非小細胞肺癌中的影響。通過對裸鼠荷瘤模型的構建，研究阻斷Wnt信號通路對腫瘤生長的影響。實驗發現同為6次抗腫瘤藥物注射的Wnt-1抗體與多西他賽比較，其兩者有著共同的抑制腫瘤生長的作用。而被人們熟知的多西他賽常與鉑類制劑配伍作為抗非小細胞肺癌的二線用藥，其效應部位為抗細胞的有絲分裂，并且作為晚期轉移性非小細胞肺癌的常規用藥，其抗瘤作用已被認可。兩種抗腫瘤藥物在前15 d抑瘤效果不明顯，15 d到24 d抑瘤效果多西他賽組強于Wnt-1組，24天開始至裸鼠解剖，抑瘤效果明顯提高。腫瘤體積第27 d時空白組分別與實驗組（P=0.002），對照組（P=0.000）出現明顯差異，驗證了Wnt-1抗體阻斷Wnt/β-catenin信號通路后，對活體動物腫瘤生長的抑制影響是確切的。本實驗用Wnt-1抗體，主要用于阻斷Wnt/β-catenin信號通路，大部分用于免疫組化與Western blotting等實驗室應用，國內外目前很少有直接用于裸鼠本身的注射。由于抗體內含有有毒性物質，因此，對裸鼠的生存有一定的影響，所以本實驗中參照部分文獻給出的最低劑量，給予50 μg/kg注射。33天解剖動物時，實驗組無裸鼠死亡。但 50 μg/kg并非抗瘤的最佳劑量，因此，抗瘤效果沒有二線用藥的多西他賽效果顯著。
本研究結果表明，Wnt-1可以作為分子靶向治療非小細胞肺癌。阻斷Wnt-1信號通路，采用小分子或者RNA抑制可以對Wnt-1過表達的非小細胞肺癌患者提供有效的治療。如今對Wnt信號通路的基本認識，以及Wnt信號通路與肺癌之間關系的各項研究在逐漸增多，但在臨床上希望通過該信號傳導途徑治療肺癌的研究仍相對較少。美國學者Curtin等[20]針對癌癥干細胞的Wnt信號通路進行藥物探索方面具有自我更新能力和多潛能性，并能推動腫瘤的發生和維護。首先，確定干細胞在血液系統惡性腫瘤中發揮重要作用，現在被認為腫瘤干細胞存在于多種實體腫瘤，其中包括非小細胞肺癌。通常是通過Wnt信號途徑、Notch和Hedgehog（HH）通路來激活各種不同類型的癌癥。雖然通過Notch和HH通路進行治療方面已經取得了實質性的進展，但是Wnt信號通路仍然是一個難以實現的治療目標。本研究主要是通過了解Wnt信號通路在干細胞和腫瘤細胞生物學的臨床意義來針對Wnt和/或β-catenin信號途徑進行干預和治療方面的研究。在非小細胞肺癌方面已被證明其胞內有高水平的游離β-catenin，并且表現出較高基礎水平的Wnt/β-catenin的轉錄激活[21]。
針對Wnt抗體的動物研究發現裸鼠和人的Wnt信號通路，以及它們的受體共享一個高度相關的同源性，并已被證明能在功能上的互換。雖然這些體外實驗結果是激動人心的，但是Wnt基因抗體的特性還需要近一步的探索。
前景分析認為，Wnt/β-catenin信號傳導途徑作為新的靶點進行針對非小細胞肺癌的臨床治療，需要從實驗室試劑向藥物方面的轉化。如何降低藥物的毒性作用及提高藥物穿透力達到高效能阻斷Wnt經典信號通路將決定腫瘤患者預后及遠期生存率。
隨著工業的發展和汽車數量的增多，城鎮居民肺癌發病率呈逐年增高的趨勢。肺癌是男性罹癌致死率最高的腫瘤[1]，其中約80%的患者是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。在西南邊陲的云南省，有宣威和個舊兩個著名的肺癌高發地。鑒于早期發現和早期診斷在世界范圍內仍是未解決的難題，臨床醫師面對的仍然是大量中晚期肺癌的患者。因而在近幾十年來，外科手術加術后化療仍然是非小細胞肺癌治療的主要手段[3]。針對非小細胞肺癌，昆明市某醫院的研究顯示在行根治性手術切除138例患者的5年生存率為44.8%[4]。在單純的手術方面，伴隨電視胸腔鏡手術的飛速發展，手術已經基本可以切除無遠處轉移的低于ⅢB期的肺癌病灶[5]。因此，除了早期診斷和主要的手術治療之外，藥物治療已經成為基礎醫學最重要的研究方向。
配合化療的肺癌患者5年生存率明顯提高，但現在作為一線治療的化療藥物順鉑聯合吉西他濱治療肺癌患者主要不良反應為骨髓抑制及胃腸道反應。嚴重的不良反應可使階段性治療由于一些嚴重的副作用而暫停甚至終止，影響患者的住院治療效果和生存率。另外，運用吉西他濱聯合紫杉醇治療非小細胞肺癌患者的1年生存率為46.4%，中位生存期為10.8個月，其副作用主要是骨髓抑制及周圍神經毒性。在有效控制血小板和粒細胞的情況下，鉑類腫瘤化療藥物等聯合化療方案對情況較差的老年晚期患者仍然不能耐受[6]。由此可見作為一線用藥的鉑類藥物對晚期肺癌患者的有效性仍然有很大的提高空間。
鑒于這種現狀，在基礎研究方面，Wnt信號通路作為調控胚胎發育和腫瘤發生、發展的熱點，越來越得到學界的重視[7]。有免疫組織化學試驗研究顯示，針對151例肺癌患者Wnt-1的過表達與肺癌的惡性增殖成正相關，其中61例肺癌患者（40.4%）wnt-1表達呈陽性[8]。
對于阻斷Wnt-1信號通路對肺癌細胞影響的研究，國內外報道均比較少見。云南省的肺癌發病率和死亡率都居高不下，但針對地域性肺癌的基礎研究工作較少。本實驗通過對云南省宣威地區肺癌患者切除非小細胞肺癌的肺癌組織培養并接種于裸鼠內體，在活體動物生存期進行Wnt抗體的干涉來研究阻斷Wnt信號通路對非小細胞肺癌的影響，以期相關的實驗結果能對其臨床應用提供理論幫助。
1 資料與方法
1.1 荷瘤鼠模型和細胞系來源
本次實驗所用21只雄性Balb/c-Nu裸鼠（16～18 g）均購于北京華阜康生物科技有限公司。裸鼠喂養飼料：Co60滅菌飼料，購于北京華阜康生物科技有限公司。在取得知情同意后，收集昆明醫科大學附屬延安醫院未經放、化療的住院患者外科切除且病理診斷為非小細胞肺癌的肺癌組織。
1.2 主要試劑、儀器與設備
本次研究使用的主要試劑包括Wnt-1抗體（Milli pore公司）、多西他賽（多帕菲，昆明澤浩公司）、10%小牛血清的PMPI-1640培養基（Sigma公司）、胰蛋白酶（Sigma公司）、Hanks液（Sigma公司）。
本次研究所用主要儀器與設備包括二氧化碳細胞培養箱（德國Thermo Fisher Scientific）、倒置相差顯微鏡（日本Olympus）、超低溫冰箱（美國Eectrolux公司）、高速冷凍臺式離心機（美國Thermo公司）、高速離心機（美國Thermo公司）、精密電子天平FA2004（上海精科天平)、SPF級動物飼養實驗室（昆醫附屬延安醫院中心實驗室）。
1.3 方法
1.3.1 細胞培養及傳代
將瘤組織切成1～2 mm3小塊，用Hanks液洗3次，接種于事先涂有鼠尾膠原的培養瓶中，并將培養瓶置于37℃、5%CO2的普通恒溫箱中培養。在上述的碎組織塊中加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴30 min后液洗3次，盛于完全培養基并制成（5～10）×108個/L細胞濃度的懸液。在37℃、5%CO2含有10%小牛血清的PMPI-1640培養基培養并以此作為初代細胞。每3 d更換一次培養液，并觀察、記錄細胞貼壁生長情況。當細胞長滿培養瓶時，用5 ml 0.25%胰蛋白酶消化5 min直至細胞呈球形回縮時加入5 ml培養液終止消化并將培養瓶中的懸浮液分裝傳代培養。將第五代細胞，用0.25%胰蛋白酶消化5 min并加入無血清PMPI-1640液1 200轉/min離心三次。
1.3.2 荷瘤模型的構建
在上述細胞液中加入生理鹽水稀釋至2×107個/ml，并在裸鼠背部皮下接種約0.1 ml細胞液。1周后接種部位均肉眼可見直徑約3～5 mm腫瘤結節生長。將接種后的裸鼠置于適宜光照、溫度、濕度條件下的SPF級動物飼養室內，定時給予飼料、蒸餾水，每天觀察、記錄裸鼠活動及死亡情況。間隔三天用游標卡尺測量接種小鼠背部腫瘤結節長徑（a）與短徑（b），用公式V=1/2ab2計算所測瘤體體積并繪制腫瘤時間-體積曲線。將16只小鼠背部瘤體直徑達4 mm時設定為荷瘤第1天。在荷瘤第6天時將裸鼠按體重從小到大編為1～21號并隨機分組（表 1）。
表1
裸鼠隨機分組表
1.3.3 分組注射抗腫瘤藥物
第6天時分別給予實驗組、對照組、空白組小鼠背部腫瘤周邊皮下注射Wnt-1抗體（0.2 ml/只）、多西他賽（0.2 ml/只）、生理鹽水（0.2 ml/只）。每4天注射一次，共進行6次注射。抗瘤藥物注射后每3天測量腫瘤體積并觀察、記錄裸鼠活動及死亡情況，直至最后一次注射后再行兩次連續測量為止，瘤體積抑制率：腫瘤體積抑制率=（對照組平均體積 —實驗組平均體積）/對照組平均體積×100%。
1.3.4 裸鼠處死取標本
在行第10次測量腫瘤體積后斷頸處死裸鼠，將整個移植瘤取下并用天平稱取腫瘤組織（圖 1）重量（w）。取下組織浸泡在福爾馬林溶液中保存備用。
圖1
腫瘤組織示意圖
注：從左到右依次為空白組、實驗組、對照組腫瘤
1.4 統計學分析
應用SPSS20.0軟件進行數據處理，計量資料采用均數±標準差（
2 結果
完成最后一次測量前無裸鼠死亡，三組裸鼠外觀可見腫瘤體積的差異，部分裸鼠背部腫瘤有潰瘍形成。為保證實驗的均衡性在第一次開始注射抗瘤藥物時（即飼養第6天時）將各組間抗瘤藥物注入后及注入前腫瘤體積進行統計學分析，比較各組間移植瘤體積是否有差異（表 2）。
表2
抗瘤藥物注射時各組間腫瘤體積比較（
圖2
腫瘤時間-體積變化曲線圖
上表數據經方差齊性檢驗符合正態分布，各組間差異無統計學意義（F=0.375，P>0.05），即注射抗瘤藥物時隨機分為三組時各組間腫瘤體積無差異，說明均衡性較好可以進行抗瘤藥物注射。
根據研究數據繪制腫瘤時間-體積變化曲線圖，由圖可知由于各組注射藥物不同，各組間腫瘤體積也出現差異，對照組與空白組差異尤為明顯。從第18天起各組間開始出現較明顯差異，第27天時空白組與其他兩組差異均有統計學意義。多西他賽較Wnt-1抗體有更強的抑制腫瘤的作用。各組測量日的標準差均在正常范圍內，差異有統計學意義。第12天時，實驗組標準差值為0.352遠大于其他兩組且曲線高于空白組，考慮原因可能是因為第6天即第一次給A組部分裸鼠注射Wnt-1抗體時出現操作問題。
對各組藥物注入裸鼠體內后不同時間段各組間腫瘤體積差異進行比較分析，抗瘤藥物注射前6天，三組比較均無差異；第二次注射藥物后，對照組出現抑瘤作用；自第三次注射藥物時空白組與其他兩組相比腫瘤體積有上升趨勢，這說明抗瘤藥物對腫瘤生長的抑制要在一周至兩周時間表現出來；第21天，對照組與實驗組相對于空白組出現較為明顯的腫瘤抑制作用，其結果與時間-體積曲線圖走勢相符；第24天，對照組和實驗組與空白組相比，差異均有統計學意義（P<0.05）。說明兩種抗瘤藥物在抑制腫瘤生長方面具均有效且多西他賽相對于Wnt-1抗體抑瘤作用更加明顯（表 3、表 4）。
表3
藥物注射后不同時間點腫瘤的體積（
表4
抗瘤藥物注射后不同時間點腫瘤體積組間比較
根據研究數據繪制腫瘤時間-抑制率曲線圖（圖 3）。從圖中可以看出，抗腫瘤藥物在前15 d抑瘤效果不明顯，15 d到24 d抑瘤效果對照組強于實驗組，從24 d開始至裸鼠解剖抑瘤效果明顯提高。二者腫瘤體積抑制率差異有統計學意義。考慮空白組部分裸鼠出現腫瘤潰瘍，出現已經明顯的惡病質，因此觀察至33 d。另外12 d測量Wnt-1組腫瘤相對于空白組腫瘤生長旺盛，考慮原因可能是Wnt-1抗體的注射操作問題。
圖3
腫瘤時間-抑制率曲線圖
3 討論
非小細胞肺癌是對人類危害最大的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升的趨勢，其發生、發展是一個多因素多步驟的過程，主要表現為生活習慣的改變、環境的變化。治療主要以根治性手術切除為主，肺癌的發生被認為是一系列多基因改變累積的結果。雖然，在過去的幾十年肺癌的診斷和治療都取得了很大的進展，但是其死亡率依然很高，特別是在肺癌晚期，肺癌細胞發生侵襲和轉移。即使抗腫瘤治療能有效的控制腫瘤遷移，但是效果只是暫時的，大多數轉移瘤的復發是很迅速的[9]。其中，經典Wnt信號通路表達失調或其核心成員的異常與腫瘤的發生、進展密切相關[10]。
Wnt信號通路（即果蠅中的Wg信號通路）是一類在發育上保守的信號通路，在動物發育和組織形成后的動態平衡中，具有重要功能[11-12]。Wnt來源于無翅基因（wingless，Wg）與Int基因[13]。Wg基因最早在果蠅中發現，對胚胎發育有重要作用[14]，可促進成年動物的肢體形成[15]，其突變可導致無翅畸形。Int基因最早于1982年由Nusse等在探討小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）轉錄機制過程中發現[11-16]。由于Int-1基因與Wg基因具有同源性，現已將有關的兩類基因統一命名為Wnt基因家族。在多種細胞中，Wnt信號通路起著關鍵作用，參與細胞的增殖、分化、凋亡等基本過程，尤其是調控正常組織發育以及腫瘤形成[17-19]。
本實驗通過研究Wnt信號通路比較三組間的組間差異來驗證Wnt信號通路在非小細胞肺癌中的影響。通過對裸鼠荷瘤模型的構建，研究阻斷Wnt信號通路對腫瘤生長的影響。實驗發現同為6次抗腫瘤藥物注射的Wnt-1抗體與多西他賽比較，其兩者有著共同的抑制腫瘤生長的作用。而被人們熟知的多西他賽常與鉑類制劑配伍作為抗非小細胞肺癌的二線用藥，其效應部位為抗細胞的有絲分裂，并且作為晚期轉移性非小細胞肺癌的常規用藥，其抗瘤作用已被認可。兩種抗腫瘤藥物在前15 d抑瘤效果不明顯，15 d到24 d抑瘤效果多西他賽組強于Wnt-1組，24天開始至裸鼠解剖，抑瘤效果明顯提高。腫瘤體積第27 d時空白組分別與實驗組（P=0.002），對照組（P=0.000）出現明顯差異，驗證了Wnt-1抗體阻斷Wnt/β-catenin信號通路后，對活體動物腫瘤生長的抑制影響是確切的。本實驗用Wnt-1抗體，主要用于阻斷Wnt/β-catenin信號通路，大部分用于免疫組化與Western blotting等實驗室應用，國內外目前很少有直接用于裸鼠本身的注射。由于抗體內含有有毒性物質，因此，對裸鼠的生存有一定的影響，所以本實驗中參照部分文獻給出的最低劑量，給予50 μg/kg注射。33天解剖動物時，實驗組無裸鼠死亡。但 50 μg/kg并非抗瘤的最佳劑量，因此，抗瘤效果沒有二線用藥的多西他賽效果顯著。
本研究結果表明，Wnt-1可以作為分子靶向治療非小細胞肺癌。阻斷Wnt-1信號通路，采用小分子或者RNA抑制可以對Wnt-1過表達的非小細胞肺癌患者提供有效的治療。如今對Wnt信號通路的基本認識，以及Wnt信號通路與肺癌之間關系的各項研究在逐漸增多，但在臨床上希望通過該信號傳導途徑治療肺癌的研究仍相對較少。美國學者Curtin等[20]針對癌癥干細胞的Wnt信號通路進行藥物探索方面具有自我更新能力和多潛能性，并能推動腫瘤的發生和維護。首先，確定干細胞在血液系統惡性腫瘤中發揮重要作用，現在被認為腫瘤干細胞存在于多種實體腫瘤，其中包括非小細胞肺癌。通常是通過Wnt信號途徑、Notch和Hedgehog（HH）通路來激活各種不同類型的癌癥。雖然通過Notch和HH通路進行治療方面已經取得了實質性的進展，但是Wnt信號通路仍然是一個難以實現的治療目標。本研究主要是通過了解Wnt信號通路在干細胞和腫瘤細胞生物學的臨床意義來針對Wnt和/或β-catenin信號途徑進行干預和治療方面的研究。在非小細胞肺癌方面已被證明其胞內有高水平的游離β-catenin，并且表現出較高基礎水平的Wnt/β-catenin的轉錄激活[21]。
針對Wnt抗體的動物研究發現裸鼠和人的Wnt信號通路，以及它們的受體共享一個高度相關的同源性，并已被證明能在功能上的互換。雖然這些體外實驗結果是激動人心的，但是Wnt基因抗體的特性還需要近一步的探索。
前景分析認為，Wnt/β-catenin信號傳導途徑作為新的靶點進行針對非小細胞肺癌的臨床治療，需要從實驗室試劑向藥物方面的轉化。如何降低藥物的毒性作用及提高藥物穿透力達到高效能阻斷Wnt經典信號通路將決定腫瘤患者預后及遠期生存率。
