引用本文： 丁士驁, 梅舉, 鮑春榮, 張俊文, 楊陽, 袁源, 尹航. 草酰乙酸對心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(3): 274-279. doi: 10.7507/1007-4848.20160064 復制
缺血性心臟病是一個公共健康問題，發病率呈逐年上升趨勢，在世界范圍內有著很高的患病率死亡率[1]。針對心肌缺血后恢復血流灌注的治療策略在臨床實踐中經常使用的，包括溶栓、血管成形術[2]。然而，在灌注過程中，恢復血流量往往達不到預期的的恢復效果，甚至加重細胞壞死[3]。體外循環下心臟手術典型的治療過程中有心臟缺血停跳及復灌復跳的過程，從而造成的心肌缺血再灌注損傷是影響手術治療效果及術后遠期恢復的重要因素。不同的病理因素，如炎癥、氧化應激、細胞凋亡，都參與了心肌缺血再灌注損傷的病理機制[4]。因此，缺血再灌注損傷多靶點的治療策略是我們迫切需要解決的問題。
多年來，一些藥物已被證明在動物實驗中具有心臟保護作用，然而只有極少數成功應用于臨床實踐[5]。這是由于，不僅藥物療效存在物種差異，更重要的還有很多全身性的副作用和有限的療效[6]。最近的一項研究表明，延胡索酸作為人體內三羧酸循環的小分子中間代謝產物具有很好的心肌保護作用，且安全性高[7]，據此我們推測其結構類似物是否也有相似的心肌保護作用。草酰乙酸作為延胡索酸的分子結構類似物，是生物體代謝過程中產生的重要有機酸。研究表明，草酰乙酸對腦的缺血再灌注損傷具有保護作用[8]。在本研究中，我們研究草酰乙酸對心肌缺血再灌注損傷的保護作用，及其可能的作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、實驗材料及分組
1.1.1 試驗動物
SD（Sprague Dawley）雄性健康大鼠60只，體重200～250 g，雄性、清潔級，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物許可證號碼：SCXK（滬） 2012-0002]。飼養環境：在溫度22～25℃、相對濕度40%～70%，光照時間隨自然變化，供給常規顆粒飼料和滅菌蒸餾水，自由飲食。
1.1.2 實驗藥品及試劑
實驗藥品及試劑包括草酰乙酸（上海晶純生化科技股份有限公司，批號：D1417062）,大鼠肌鈣蛋白I（cTn-I）ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號：20150126），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（上海藍怡科技有限公司，批號：R403ACA），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20150126），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20150124），抗體：Actin（Santa，批號：sc-1616r），NF-E2相關因子2（Nrf2）（Santa，批號：sc-722），Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1 （Keap1）（Bio World，批號：bs6783），血紅素氧合酶1（HO-1）（Santa，批號：sc-1797）。
1.1.3 分組
大鼠隨機分為6組，每組10只，分別是：陰性對照組、假手術組、模型組、草酰乙酸組5 mg/kg、草酰乙酸組60 mg/kg、草酰乙酸組240 mg/kg。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物模型建立
術前連續給藥5 d，每天 2次，陰性對照組，假手術組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉溶液鼻飼。末次給藥30 min后，陰性對照組不開胸，假手術組予以開胸，但不結扎冠狀動脈前降支，模型組和藥物組大鼠結扎冠狀動脈前降支制備大鼠心肌缺血模型。以2%的戊巴比妥鈉 （2 ml/kg）腹內注射麻醉大鼠，將麻醉的大鼠腹面朝上縛于鼠臺上。行氣管切開，接于小動物呼吸機行正壓輔助通氣（小動物呼吸機）。分離右側頸總動脈，連接RM6240生物信號處理系統，記錄左心室內壓（LVSP），左心室內壓最大變化速率（±dp/dtmax）以及左心室舒張期末壓力（LVEDP），并同時記錄肢體導聯心電圖。沿大鼠胸骨左緣1 cm處做縱向切口，逐層分離。于左心耳下方2 mm處用6-0無損傷帶線縫合針結扎前降支。結扎前在結扎處放置一根直徑為4 mm、長5 mm的乳膠管，以便剪開結扎的絲線行再灌注。以Ⅱ導聯心電圖出現ST段抬高和出現左心缺血性顏色改變為標準判定急性心肌缺血。持續呼吸機正壓通氣，維持心肌缺血30 min，剪開結扎絲線，關閉胸腔，再灌注180 min。
1.2.2 血清生化指標測定
大鼠心肌缺血再灌注180 min后，給予10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，3 000 r離心10 min，分離取血清。測定各項指標：乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶按照試劑盒說明書操作，用生化分析儀進行測定；肌鈣蛋白Ⅰ采用酶聯免疫吸附法（ELISA）用酶標儀進行測定。
1.2.3 NBT染色測定心肌梗死面積
放血處死大鼠后，迅速取出心臟，置冰冷生理鹽水中沖洗除去血污，剔除心房、血管、脂肪等非心肌組織，置于-20℃冰箱放置30 min。在心臟結扎線下，平行冠狀溝將心臟自心尖至心底部切成6片（厚1.5～2 mm），后置于0.5% NBT磷酸鹽緩沖液中（pH 7.4）于37℃恒溫水浴中孵育10 min。NBT將大鼠心肌正常部分染色成均勻的藍色，而梗塞區不染色或者呈現灰黃色。待梗塞心肌界線清楚時立即取出，小心分離梗死區，稱取梗塞心肌（不染色者）重量（g）、左心室重量。以梗塞心肌與左室重量的百分比作為心肌梗死范圍的評定指標。
1.2.4 蛋白免疫印跡技術（Western Blot）測定
取灌注3 h的受損心肌組織利用蛋白免疫印跡技術檢測受損心肌組織中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白的含量，利用蛋白分離試劑盒（pierce，USA）分離核蛋白及細胞質蛋白，而另一組織樣本中進行心肌總蛋白的提取。取出液氮凍存的心肌組織，于冰上使用無菌手術刀切取約200 mg組織，轉移組織到干凈的1.5 ml離心管；每管加入1 ml的T-PER試劑，使用電動勻漿器進行組織勻漿，使組織充分裂解，直至液體變得黏稠；4℃、12 000離心加速度條件下離心5 min；收集上清液，進行總蛋白濃度檢測。利用改良Bradford法（Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA）測定蛋白濃度后，在SDS-PAGE上蛋白的電泳分離，將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，封閉后的PVDF膜封入稀釋好的一抗抗體[HO-1 （1:500），Keap1 （1:1 000）， Nrf2 （1:100 0）]，4 ℃孵育過夜，清洗后加入相應二抗[HO-1 （1:5 000），Keap1 （1:3 000），Nrf2 （1:3 000）]，室溫孵育1 h，取出膜緩沖液沖洗后，利用化學發光試劑檢測（Pierce? ECL Western Blotting Substrate，32106），凝膠定量分析軟件Quantity One處理系統分析目標帶的光密度值。
1.3 統計學分析
采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析。所有試驗數據均以均數±標準差（
2 結果
2.1 對大鼠心肌缺血再灌注后心功能的影響
2.1.1 缺血再灌注前各組大鼠LVSP、±dp/dtmax、LVEDP情況
大鼠缺血再灌注前，各組大鼠左心室內壓（LVSP）、左心室內壓最大變化速率（±dp/dtmax）以及左心室舒張期末壓力（LVEDP）水平相近（表 1）。
表1
缺血再灌注前各組大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax參數（2.1.2 缺血再灌注后各組大鼠LVSP、±dp/dtmax、LVEDP變化情況
缺血再灌注后，模型組較假手術組大鼠左心室內壓（LVSP）、左心室內壓最大變化速率（±dp/dtmax）水平顯著降低，大鼠左心室舒張末期壓力（LVEDP）顯著升高。與模型組比較，60 mg/kg、120 mg/kg的草酰乙酸組，大鼠左心室內壓（LVSP）和左心室內壓最大變化速率（±dp/dtmax）顯著升高，左心室舒張期末壓力（LVEDP）明顯降低，并且效果與蘋果酸濃度成正相關，效果差異有統計學意義（表 2）。
表2
缺血再灌注后各組大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax變化情況（2.2 大鼠血清酶指標的變化情況
2.2.1 肌鈣蛋白Ⅰ和乳酸脫氫酶的變化情況
與假手術組比較，模型組大鼠的肌鈣蛋白Ⅰ（CTn-Ⅰ）和乳酸脫氫酶（LDH）含量明顯增高，差異顯著（P<0.01）；與模型組比較，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸組能顯著降低大鼠肌鈣蛋白Ⅰ（CTn-Ⅰ）和乳酸脫氫酶（LDH）含量（P<0.05），差異有統計學意義（表 3）。
表3
各組大鼠CTn-I、LDH變化情況（2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的變化情況
與假手術組相比，模型組大鼠在心肌缺血再灌注后SOD和GSH-PX活性顯著降低；與模型組比較，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸組大鼠的SOD和GSH-PX活性明顯升高（P<0.05），并且隨著濃度的增加，抑制下降的作用越明顯，差異有統計學意義（表 4）。
表4
各組大鼠SOD、GSH-PX活性變化情況（2.3 大鼠心肌梗死面積的變化情況
與模型組比較，各給藥組均能減小心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌缺血梗死范圍，減小心肌梗塞面積，而且隨著濃度的進一步增加，效果繼續增強，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸組對大鼠心肌梗塞面積的減少的差異有統計學意義（P<0.05），結果見表 5。
表5
對大鼠心肌梗死面積的影響（2.4 Western Blot檢測結果
缺血再灌注3 h后，取240 mg/kg心肌缺血-再灌注（OAA）預處理后心肌組織，進行western blot檢測。結果顯示：與模型組相比，OAA組心肌細胞中總Nrf2表達和細胞核蛋白中Nrf2表達明顯升高（P<0.001）；OAA組心肌組織中的HO-1蛋白水平明顯增加，差異有統計學意義（P<0.001）；而Keap1作為Nrf2的特異性的抑制蛋白，在OAA預處理模型心肌中，表達下調，差異有統計學意義（P<0.001），結果見圖 1。
圖1
Western Blot檢測心肌組織蛋白的表達
注：與模型組比較，***
3 討論
當心肌發生缺血時，心臟組織中的氧和營養的需求下降，血液供應也受到嚴重的削弱[1]，長時間的心肌缺血后，重新恢復心肌組織的血流供應不但不能緩解原發性損傷，反而加重心肌損傷，最終導致患者心肌結構和功能發生變化[6]。然而，無論缺血再灌注損傷結果如何，提前使用合理藥物干預有助于減少缺血再灌注后心肌的損傷程度，促進術后恢復。
在本實驗中，我們通過建立大鼠的心肌缺血再灌注損傷模型，揭示草酰乙酸對心肌缺血再灌注損傷的保護性作用以及可能的作用機制。我們的研究結果提示，心肌缺血再灌注損傷可導致心肌細胞損傷、壞死，最終導致心肌梗死以及心臟功能障礙甚至喪失。而給予草酰乙酸預處理后可明顯提高缺血再灌注損傷后心臟的收縮功能（+dp/dtmax）、舒張功能（-dp/dtmax）、左室收縮壓（LVSP），降低左室舒張壓（LVEDP），能減少心肌梗死面積，促進心臟功能恢復，并降低血清中肌鈣蛋白及乳酸脫氫酶的含量。同時，實驗結果顯示，草酰乙酸對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用具有高度的藥物濃度依賴性。
現在普遍認為，心肌缺血再灌注損傷過程的特征是炎性病變、氧化損傷和細胞凋亡等。更重要的是這些因素之間的相互協同作用，比較公認的是心肌缺血再灌注時產生的活性氧（ROS）所導致的氧化應激，在缺血的發展起著決定性作用[9-10]。通常機體內抗氧化能力與自由基的產生保持動態均衡，然而當自由基的產生超過機體自身的抗氧化能力負荷時，則會發生氧化應激及相關的損傷[11]。體內有一系列抗氧化酶是負責清除體內過量的ROS。這些抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等協同作用在各種應激條件下（包括心肌缺血再灌注損傷）為機體提供了一道對抗氧化應激的堅固防線[12]。因此，那些能夠增強抗氧化酶的活性或者能夠上調那些抗氧化酶表達的藥物是抑制缺血再灌注引起的組織損傷的一個潛在的治療靶點，具有非常廣闊的臨床應用前景。本實驗中，草酰乙酸能夠顯著增加SOD、GSH-Px的含量，提示草酰乙酸的應用能夠在抗氧化應激層面起到心肌保護作用。
Nrf2是一種轉錄因子，能調節抗氧化應激相關的很多種基因的表達，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽過氧化物酶等[13]。研究顯示，敲除Nrf2基因的小鼠受到外界的氧化刺激后，ROS較野生小鼠明顯增多[14]。萊菔硫烷、硫化氫、黃岑素、延胡索酸[15-18]等物質通過激活Nrf2并促進其轉入細胞核內，促進下游抗氧化酶的表達而保護心肌細胞。本實驗中，測定心肌組織中總的Nrf2和細胞核內Nrf2含量以及Nrf2下游HO-1的表達。在經過草酰乙酸預處理的缺血再灌注的心肌組織中我們發現細胞總的Nrf2的表達和細胞核內Nrf2含量顯著增強，下游的HO-1表達明顯上調。因此，草酰乙酸通過上調Nrf2的表達以及增強Nrf2的細胞核轉移，增強下游抗氧化基因的表達，減少氧化應激導致的心肌損傷。
Keap1是一種胞漿蛋白，富含半胱氨酸殘基，常態下Keap1在胞質中與Nrf2組成復合物，使得胞質內的Nrf2持續通過泛素化途徑被蛋白降解，抑制Nrf2從胞質轉移到核內[19]。當機體或細胞受到外界氧化刺激時，Keap1從Kaep1-Nrf2復合物中解離，解離后的Nrf2的活性增加，有轉錄活性的Nrf2累積后易位到細胞核內，啟動Nrf2下游抗氧化基因如血紅素加氧酶（HO-1）等的表達，抑制氧化應激損傷[20]。到目前為止，藥物通過增加Nrf2的核轉移途徑保護心肌的研究很多，但是心肌保護藥物是否通過抑制Keap1的表達，減少Nrf2降解，促進其轉移進入細胞核，啟動抗氧化基因的表達的研究報道目前為止還很少。因此，草酰乙酸預處理是否抑制Keap1的表達很值得探索，與對照組相比，在經過草酰乙酸預處理的缺血再灌注的心肌組織中Keap1的表達是顯著減弱的。
綜上所述，本實驗揭示草酰乙酸預處理可減少缺血再灌注損傷后大鼠心肌梗死面積，減少心肌細胞的損傷，抗氧化損傷機制發揮重要作用，它能下調Keap1的表達，增強Nrf2的表達和核轉移，增加下游抗氧化蛋白的表達。然而，草酰乙酸是通過抑制Keap1,減少Nrf2的降解，還是除此之外具有直接上調Nrf2的表達的作用，還需要進一步通過實驗去探索。本實驗不僅證實草酰乙酸具有可靠的心肌保護作用，更重要的是提示人體的內源性小分子本身也具有很好的保護心肌的作用，且內源性的小分子的安全性高，具有很廣闊的研究及臨床應用前景。
缺血性心臟病是一個公共健康問題，發病率呈逐年上升趨勢，在世界范圍內有著很高的患病率死亡率[1]。針對心肌缺血后恢復血流灌注的治療策略在臨床實踐中經常使用的，包括溶栓、血管成形術[2]。然而，在灌注過程中，恢復血流量往往達不到預期的的恢復效果，甚至加重細胞壞死[3]。體外循環下心臟手術典型的治療過程中有心臟缺血停跳及復灌復跳的過程，從而造成的心肌缺血再灌注損傷是影響手術治療效果及術后遠期恢復的重要因素。不同的病理因素，如炎癥、氧化應激、細胞凋亡，都參與了心肌缺血再灌注損傷的病理機制[4]。因此，缺血再灌注損傷多靶點的治療策略是我們迫切需要解決的問題。
多年來，一些藥物已被證明在動物實驗中具有心臟保護作用，然而只有極少數成功應用于臨床實踐[5]。這是由于，不僅藥物療效存在物種差異，更重要的還有很多全身性的副作用和有限的療效[6]。最近的一項研究表明，延胡索酸作為人體內三羧酸循環的小分子中間代謝產物具有很好的心肌保護作用，且安全性高[7]，據此我們推測其結構類似物是否也有相似的心肌保護作用。草酰乙酸作為延胡索酸的分子結構類似物，是生物體代謝過程中產生的重要有機酸。研究表明，草酰乙酸對腦的缺血再灌注損傷具有保護作用[8]。在本研究中，我們研究草酰乙酸對心肌缺血再灌注損傷的保護作用，及其可能的作用機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物、實驗材料及分組
1.1.1 試驗動物
SD（Sprague Dawley）雄性健康大鼠60只，體重200～250 g，雄性、清潔級，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物許可證號碼：SCXK（滬） 2012-0002]。飼養環境：在溫度22～25℃、相對濕度40%～70%，光照時間隨自然變化，供給常規顆粒飼料和滅菌蒸餾水，自由飲食。
1.1.2 實驗藥品及試劑
實驗藥品及試劑包括草酰乙酸（上海晶純生化科技股份有限公司，批號：D1417062）,大鼠肌鈣蛋白I（cTn-I）ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號：20150126），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（上海藍怡科技有限公司，批號：R403ACA），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20150126），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20150124），抗體：Actin（Santa，批號：sc-1616r），NF-E2相關因子2（Nrf2）（Santa，批號：sc-722），Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1 （Keap1）（Bio World，批號：bs6783），血紅素氧合酶1（HO-1）（Santa，批號：sc-1797）。
1.1.3 分組
大鼠隨機分為6組，每組10只，分別是：陰性對照組、假手術組、模型組、草酰乙酸組5 mg/kg、草酰乙酸組60 mg/kg、草酰乙酸組240 mg/kg。
1.2 實驗方法
1.2.1 動物模型建立
術前連續給藥5 d，每天 2次，陰性對照組，假手術組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉溶液鼻飼。末次給藥30 min后，陰性對照組不開胸，假手術組予以開胸，但不結扎冠狀動脈前降支，模型組和藥物組大鼠結扎冠狀動脈前降支制備大鼠心肌缺血模型。以2%的戊巴比妥鈉 （2 ml/kg）腹內注射麻醉大鼠，將麻醉的大鼠腹面朝上縛于鼠臺上。行氣管切開，接于小動物呼吸機行正壓輔助通氣（小動物呼吸機）。分離右側頸總動脈，連接RM6240生物信號處理系統，記錄左心室內壓（LVSP），左心室內壓最大變化速率（±dp/dtmax）以及左心室舒張期末壓力（LVEDP），并同時記錄肢體導聯心電圖。沿大鼠胸骨左緣1 cm處做縱向切口，逐層分離。于左心耳下方2 mm處用6-0無損傷帶線縫合針結扎前降支。結扎前在結扎處放置一根直徑為4 mm、長5 mm的乳膠管，以便剪開結扎的絲線行再灌注。以Ⅱ導聯心電圖出現ST段抬高和出現左心缺血性顏色改變為標準判定急性心肌缺血。持續呼吸機正壓通氣，維持心肌缺血30 min，剪開結扎絲線，關閉胸腔，再灌注180 min。
1.2.2 血清生化指標測定
大鼠心肌缺血再灌注180 min后，給予10%水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，3 000 r離心10 min，分離取血清。測定各項指標：乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶按照試劑盒說明書操作，用生化分析儀進行測定；肌鈣蛋白Ⅰ采用酶聯免疫吸附法（ELISA）用酶標儀進行測定。
1.2.3 NBT染色測定心肌梗死面積
放血處死大鼠后，迅速取出心臟，置冰冷生理鹽水中沖洗除去血污，剔除心房、血管、脂肪等非心肌組織，置于-20℃冰箱放置30 min。在心臟結扎線下，平行冠狀溝將心臟自心尖至心底部切成6片（厚1.5～2 mm），后置于0.5% NBT磷酸鹽緩沖液中（pH 7.4）于37℃恒溫水浴中孵育10 min。NBT將大鼠心肌正常部分染色成均勻的藍色，而梗塞區不染色或者呈現灰黃色。待梗塞心肌界線清楚時立即取出，小心分離梗死區，稱取梗塞心肌（不染色者）重量（g）、左心室重量。以梗塞心肌與左室重量的百分比作為心肌梗死范圍的評定指標。
1.2.4 蛋白免疫印跡技術（Western Blot）測定
取灌注3 h的受損心肌組織利用蛋白免疫印跡技術檢測受損心肌組織中Nrf2、Keap1和HO-1蛋白的含量，利用蛋白分離試劑盒（pierce，USA）分離核蛋白及細胞質蛋白，而另一組織樣本中進行心肌總蛋白的提取。取出液氮凍存的心肌組織，于冰上使用無菌手術刀切取約200 mg組織，轉移組織到干凈的1.5 ml離心管；每管加入1 ml的T-PER試劑，使用電動勻漿器進行組織勻漿，使組織充分裂解，直至液體變得黏稠；4℃、12 000離心加速度條件下離心5 min；收集上清液，進行總蛋白濃度檢測。利用改良Bradford法（Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA）測定蛋白濃度后，在SDS-PAGE上蛋白的電泳分離，將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，封閉后的PVDF膜封入稀釋好的一抗抗體[HO-1 （1:500），Keap1 （1:1 000）， Nrf2 （1:100 0）]，4 ℃孵育過夜，清洗后加入相應二抗[HO-1 （1:5 000），Keap1 （1:3 000），Nrf2 （1:3 000）]，室溫孵育1 h，取出膜緩沖液沖洗后，利用化學發光試劑檢測（Pierce? ECL Western Blotting Substrate，32106），凝膠定量分析軟件Quantity One處理系統分析目標帶的光密度值。
1.3 統計學分析
采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析。所有試驗數據均以均數±標準差（
2 結果
2.1 對大鼠心肌缺血再灌注后心功能的影響
2.1.1 缺血再灌注前各組大鼠LVSP、±dp/dtmax、LVEDP情況
大鼠缺血再灌注前，各組大鼠左心室內壓（LVSP）、左心室內壓最大變化速率（±dp/dtmax）以及左心室舒張期末壓力（LVEDP）水平相近（表 1）。
表1
缺血再灌注前各組大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax參數（2.1.2 缺血再灌注后各組大鼠LVSP、±dp/dtmax、LVEDP變化情況
缺血再灌注后，模型組較假手術組大鼠左心室內壓（LVSP）、左心室內壓最大變化速率（±dp/dtmax）水平顯著降低，大鼠左心室舒張末期壓力（LVEDP）顯著升高。與模型組比較，60 mg/kg、120 mg/kg的草酰乙酸組，大鼠左心室內壓（LVSP）和左心室內壓最大變化速率（±dp/dtmax）顯著升高，左心室舒張期末壓力（LVEDP）明顯降低，并且效果與蘋果酸濃度成正相關，效果差異有統計學意義（表 2）。
表2
缺血再灌注后各組大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax變化情況（2.2 大鼠血清酶指標的變化情況
2.2.1 肌鈣蛋白Ⅰ和乳酸脫氫酶的變化情況
與假手術組比較，模型組大鼠的肌鈣蛋白Ⅰ（CTn-Ⅰ）和乳酸脫氫酶（LDH）含量明顯增高，差異顯著（P<0.01）；與模型組比較，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸組能顯著降低大鼠肌鈣蛋白Ⅰ（CTn-Ⅰ）和乳酸脫氫酶（LDH）含量（P<0.05），差異有統計學意義（表 3）。
表3
各組大鼠CTn-I、LDH變化情況（2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性的變化情況
與假手術組相比，模型組大鼠在心肌缺血再灌注后SOD和GSH-PX活性顯著降低；與模型組比較，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸組大鼠的SOD和GSH-PX活性明顯升高（P<0.05），并且隨著濃度的增加，抑制下降的作用越明顯，差異有統計學意義（表 4）。
表4
各組大鼠SOD、GSH-PX活性變化情況（2.3 大鼠心肌梗死面積的變化情況
與模型組比較，各給藥組均能減小心肌缺血再灌注損傷大鼠的心肌缺血梗死范圍，減小心肌梗塞面積，而且隨著濃度的進一步增加，效果繼續增強，60 mg/kg、240 mg/kg草酰乙酸組對大鼠心肌梗塞面積的減少的差異有統計學意義（P<0.05），結果見表 5。
表5
對大鼠心肌梗死面積的影響（2.4 Western Blot檢測結果
缺血再灌注3 h后，取240 mg/kg心肌缺血-再灌注（OAA）預處理后心肌組織，進行western blot檢測。結果顯示：與模型組相比，OAA組心肌細胞中總Nrf2表達和細胞核蛋白中Nrf2表達明顯升高（P<0.001）；OAA組心肌組織中的HO-1蛋白水平明顯增加，差異有統計學意義（P<0.001）；而Keap1作為Nrf2的特異性的抑制蛋白，在OAA預處理模型心肌中，表達下調，差異有統計學意義（P<0.001），結果見圖 1。
圖1
Western Blot檢測心肌組織蛋白的表達
注：與模型組比較，***
3 討論
當心肌發生缺血時，心臟組織中的氧和營養的需求下降，血液供應也受到嚴重的削弱[1]，長時間的心肌缺血后，重新恢復心肌組織的血流供應不但不能緩解原發性損傷，反而加重心肌損傷，最終導致患者心肌結構和功能發生變化[6]。然而，無論缺血再灌注損傷結果如何，提前使用合理藥物干預有助于減少缺血再灌注后心肌的損傷程度，促進術后恢復。
在本實驗中，我們通過建立大鼠的心肌缺血再灌注損傷模型，揭示草酰乙酸對心肌缺血再灌注損傷的保護性作用以及可能的作用機制。我們的研究結果提示，心肌缺血再灌注損傷可導致心肌細胞損傷、壞死，最終導致心肌梗死以及心臟功能障礙甚至喪失。而給予草酰乙酸預處理后可明顯提高缺血再灌注損傷后心臟的收縮功能（+dp/dtmax）、舒張功能（-dp/dtmax）、左室收縮壓（LVSP），降低左室舒張壓（LVEDP），能減少心肌梗死面積，促進心臟功能恢復，并降低血清中肌鈣蛋白及乳酸脫氫酶的含量。同時，實驗結果顯示，草酰乙酸對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用具有高度的藥物濃度依賴性。
現在普遍認為，心肌缺血再灌注損傷過程的特征是炎性病變、氧化損傷和細胞凋亡等。更重要的是這些因素之間的相互協同作用，比較公認的是心肌缺血再灌注時產生的活性氧（ROS）所導致的氧化應激，在缺血的發展起著決定性作用[9-10]。通常機體內抗氧化能力與自由基的產生保持動態均衡，然而當自由基的產生超過機體自身的抗氧化能力負荷時，則會發生氧化應激及相關的損傷[11]。體內有一系列抗氧化酶是負責清除體內過量的ROS。這些抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等協同作用在各種應激條件下（包括心肌缺血再灌注損傷）為機體提供了一道對抗氧化應激的堅固防線[12]。因此，那些能夠增強抗氧化酶的活性或者能夠上調那些抗氧化酶表達的藥物是抑制缺血再灌注引起的組織損傷的一個潛在的治療靶點，具有非常廣闊的臨床應用前景。本實驗中，草酰乙酸能夠顯著增加SOD、GSH-Px的含量，提示草酰乙酸的應用能夠在抗氧化應激層面起到心肌保護作用。
Nrf2是一種轉錄因子，能調節抗氧化應激相關的很多種基因的表達，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽過氧化物酶等[13]。研究顯示，敲除Nrf2基因的小鼠受到外界的氧化刺激后，ROS較野生小鼠明顯增多[14]。萊菔硫烷、硫化氫、黃岑素、延胡索酸[15-18]等物質通過激活Nrf2并促進其轉入細胞核內，促進下游抗氧化酶的表達而保護心肌細胞。本實驗中，測定心肌組織中總的Nrf2和細胞核內Nrf2含量以及Nrf2下游HO-1的表達。在經過草酰乙酸預處理的缺血再灌注的心肌組織中我們發現細胞總的Nrf2的表達和細胞核內Nrf2含量顯著增強，下游的HO-1表達明顯上調。因此，草酰乙酸通過上調Nrf2的表達以及增強Nrf2的細胞核轉移，增強下游抗氧化基因的表達，減少氧化應激導致的心肌損傷。
Keap1是一種胞漿蛋白，富含半胱氨酸殘基，常態下Keap1在胞質中與Nrf2組成復合物，使得胞質內的Nrf2持續通過泛素化途徑被蛋白降解，抑制Nrf2從胞質轉移到核內[19]。當機體或細胞受到外界氧化刺激時，Keap1從Kaep1-Nrf2復合物中解離，解離后的Nrf2的活性增加，有轉錄活性的Nrf2累積后易位到細胞核內，啟動Nrf2下游抗氧化基因如血紅素加氧酶（HO-1）等的表達，抑制氧化應激損傷[20]。到目前為止，藥物通過增加Nrf2的核轉移途徑保護心肌的研究很多，但是心肌保護藥物是否通過抑制Keap1的表達，減少Nrf2降解，促進其轉移進入細胞核，啟動抗氧化基因的表達的研究報道目前為止還很少。因此，草酰乙酸預處理是否抑制Keap1的表達很值得探索，與對照組相比，在經過草酰乙酸預處理的缺血再灌注的心肌組織中Keap1的表達是顯著減弱的。
綜上所述，本實驗揭示草酰乙酸預處理可減少缺血再灌注損傷后大鼠心肌梗死面積，減少心肌細胞的損傷，抗氧化損傷機制發揮重要作用，它能下調Keap1的表達，增強Nrf2的表達和核轉移，增加下游抗氧化蛋白的表達。然而，草酰乙酸是通過抑制Keap1,減少Nrf2的降解，還是除此之外具有直接上調Nrf2的表達的作用，還需要進一步通過實驗去探索。本實驗不僅證實草酰乙酸具有可靠的心肌保護作用，更重要的是提示人體的內源性小分子本身也具有很好的保護心肌的作用，且內源性的小分子的安全性高，具有很廣闊的研究及臨床應用前景。
