引用本文： 王玉慶, 董力, 石應康, 侯江龍, 江虹, 付博. 漢族人心臟瓣膜置換術后華法林用藥劑量與基因型關系的相關性研究. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2016, 23(1): 1-6. doi: 10.7507/1007-4848.20160001 復制
華法林是屬香豆素類口服抗凝劑，心臟機械瓣膜置換術( mechanical heart valve replacement，MHVR)及部分生物瓣膜置換術后患者均需終身服用華法林行抗凝治療，然而該藥治療窗窄，其個體劑量差異可以相差多達20倍以上[1]，治療不當導致的出血與栓塞成為機械瓣膜置換術后最常見的嚴重并發癥[2]。華法林在臨床治療過程中，造成其劑量個體差異的原因很多，可分為遺傳因素和非遺傳因素[3]。從華法林藥動學和藥效學研究結果顯示，CYP2C9和VKORC1基因多態性是影響華法林劑量重要的遺傳因素。結合年齡和體重等非遺傳因素，VKORC1和CYP2C9基因多態性可解釋50%～60%的華法林劑量個體差異[4-6]。目前研究結果證實，利用藥物基因組學信息和臨床相關特征建立的華法林用藥劑量運算預測模型能夠更準確地估計其用藥劑量，降低治療開始階段抗凝治療過量導致的風險，并縮短華法林達到穩定治療的時間。盡管如此，很多研究仍存在方法上的限制，如未納入凝血因子、血藥濃度等與華法林藥效學和藥代學密切相關的檢測指標以及其他影響華法林用藥劑量變異的因素。此外，這些研究納入的患者多為高加索人、非洲人，亞洲人種樣本量較少。與高加索人相比，漢族人在抗凝治療過程中更容易發生出血并發癥而較少發生栓塞并發癥，目前國內多采用低強度抗凝治療[國際標準化比值（INR）1.5～2.5）]，但該治療的基礎研究如基因多態性與個體化抗凝治療的關系目前甚少報道。本研究以心臟瓣膜置換術后患者作為研究對象，明確VKORC1和CYP2C9等基因多態性與中國人華法林劑量個體差異的相關性，結合凝血因子活性和華法林血藥濃度、年齡及體表面積等非遺傳因素，預測患者華法林抗凝治療的合理用藥劑量，實現抗凝監測的個體化管理，減少其并發癥的發生。
1 資料與方法
1.1 研究對象和分組
1.1.1 臨床資料
連續性納入《中國人心臟瓣膜置換術后抗凝治療數據庫》中2011年1月1日至2012年12月31日在四川大學華西醫院行心臟瓣膜置換術、術后服用華法林行抗凝治療并接受抗凝監測INR的患者103例，其中男32例、女71例，年齡21～85 （48.64±11.66）歲；身高147～180 （160.59±6.89）cm，體重43～78 （57.17±8.38）kg；華法林用藥劑量為0.62～10.00 （2.99±1.41) mg/d；抗凝強度INR目標值：主動脈瓣置換術（AVR）1.5～1.8，二尖瓣置換術（MVR）及雙瓣（主動脈瓣和二尖瓣）置換術（DVR）1.8～2.0，三尖瓣置換術（TVR）（含其他瓣膜置換）2.0～2.5，患者均未發生出血或者栓塞等并發癥。
1.1.2 分組
按INR實測值在其目標值范圍的頻數（time within therapeutic INR target range，TTR）的高低將患者分為劑量穩定組（TTR > 75.7%）與不穩定組（TTR < 75.7%）[7]；再將穩定組按華法林劑量分為低劑量組（< 2.5 mg/d），中劑量組（2.5～5.0 mg/d）與高劑量組（> 5.0 mg/d）三組[8]；最后按CYP2C9（rs1057910）、VKORC1（rs9923231）兩個基因的突變情況將患者分為CYP2C9*1/*1組、CYP2C9*1/*3組和CYP2C9* 3/* 3組以及VKORC1-1639AA組、VKORC1-1639AG組和VKORC1-1639GG組。
1.2 方法
每位患者抽取2 ml外周靜脈全血，使用乙二胺四乙酸二鈉（EDTA2Na）抗凝。置于冰箱-20℃保存；基因組DNA的提取采用磁珠法，使用思洛生物技術股份有限公司的SnoMag Blood DNA Extraction Kit來提取患者基因組DNA，-20℃冷凍保存；分批將提取好的患者基因組DNA進行CYP2C9（rs1057910）、VKORC1（rs9923231）位點聚合酶鏈反應（PCR），對所需片段進行擴增，采用限制性片段長度多態性（RFLP）方法和測序技術對患者進行基因檢測。在基因檢測的同時，抽取2 ml外周靜脈全血，使用Sysmex CA7000 analyser試劑盒（Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany）檢測凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅳ、Ⅹ活性。將服用華法林鈉片（山東齊魯制藥廠，2.5 mg/片）治療2個月后的患者，在早晨同一時間（與測定PT-INR同一時間）采用超高效液相色譜法（HPLC）[9]檢測患者華法林血藥濃度。
1.3 統計學分析
計量資料用均數±標準差（x±s）表示，計數資料用頻數、頻率表示。計量資料的比較采用t檢驗或方差分析，計數資料的比較使用χ2檢驗。將年齡與華法林用藥劑量進行單因素方差分析，多因素線性回歸方法分析探討各因素對華法林用藥劑量影響的程度，用決定系數r2表示。P < 0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 華法林用藥劑量與性別、年齡、體重、身高等之間的相關性
男性患者華法林用藥劑量（3.08±1.15）mg/d，女性患者華法林用藥劑量（2.95±1.51）mg/d，不同性別間華法林用藥劑量差異無統計學意義（P > 0.05）。
103例患者按年齡段分為20～29歲、30～39歲、40～49歲、50～59歲、60～69歲以及> 70歲共6組（表 1），ANOVA分析結果顯示各年齡組之間華法林用藥劑量差異均有統計學意義（P < 0.05），患者華法林用藥劑量隨年齡的增高有遞減的趨勢。
表1
不同年齡組華法林用藥劑量情況（x±s）
體表面積（body surface area，BSA)是由體重和身高計算得出。體表面積與華法林用藥劑量的相關性采用直線回歸進行檢驗，以體表面積為自變量，華法林用藥劑量為應變量，擬建立一個直線回歸方程：Y=2.047X-0.463，經方差分析示：F=3.972，P=0.049，該方程式成立，故可認為華法林用藥劑量與體表面積之間有直線關系（圖 1），體表面積每增加1 m2，華法林用藥劑量的需求相應增加2.047 mg。
圖1
體表面積對華法林用藥劑量的影響
2.2 不同組別的華法林用藥劑量與基因多態性和華法林血藥濃度之間的關系
比較劑量穩定組和劑量不穩定組的華法林用藥劑量與基因多態性的關系（表 2），結果顯示：劑量穩定組中：（1）VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG所占比例分別為84.95%、15.05%和0.00%；（2）CYP2C9*1/*1和CYP2C9*1/*3基因型所占比例分別為96.77%和3.23%，未發現CYP2C9*3/*3基因型。劑量不穩定組中：（1）VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG的所占比例分別為30.00%、50.00%和20.00%；（2）CYP2C9*1/*1和CYP-2C9*1/*3基因型所占比例分別為60.00%和40.00%，未發現CYP2C9*3/*3基因型。對劑量不穩定組的患者加做CYP4F2、GGCX、CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6基因位點檢測。發現（1）GGCX、CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6四個基因位點突變率為0，（2）CYP4F2的突變率較高，其中CYP4F2TT和CYP4F2CT均為30.00%。
表2
華法林劑量穩定組與不穩定組患者基因多態性比較[例（%）]
比較低劑量組、中劑量組和高劑量組患者的基因多態性及華法林血藥濃度（表 3），結果顯示：低劑量組中，VKORC1基因型以VKORC1-1639AA為主，所占比例為93.75%，VKORC1-1639AG基因型為6.25%，而VKORC1-1639GG基因型為0.00，CYP2C9*1/*3基因型較高，為12.50%；中等劑量組中，VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG的所占比例分別為81.25%、17.19%和1.56%，CYP2C9*1/*3基因型為4.69%；高劑量組中，VKORC1基因型以VKORC1-1639AG、VKORC1-1639GG為主，分別占85.71%、14.29%，CYP2C9*1/*3基因型為0；各組均未發現CYP2C9*3/*3基因型。
表3
華法林不同劑量組別患者基因多態性比較[例（%）]
2.3 華法林用藥劑量與基因多態性之間的相關性
對103例患者根據CYP2C9 （rs1057910）、VKORC （rs9923231）兩個基因的突變情況進行分組，比較每組的華法林用藥劑量與基因多態性的關系，結果顯示：CYP2C9*1/*3基因型患者所需的華法林用藥劑量為（2.43±1.08）mg/d，顯著低于CYP2C9*1/*1基因型患者[（3.03±1.42）mg/d，P=0.001]。VKORC1-1639GG基因型患者所需華法林用藥劑量為（5.05±1.25）mg/d，AG基因型為（4.35±2.15）mg/d，AA基因型為（2.62±0.87）mg /d，差異有統計學意義（P < 0.05），VKORC1-1639 AG基因型和GG基因型患者所需華法林用藥劑量大于VKORC1-1639 AA基因型患者（表 4）。
表4
基因多態性對患者華法林用藥劑量的影響（x±s）
2.4 華法林用藥劑量與血藥濃度、凝血因子及基因多態性之間的關系
心臟瓣膜置換術后患者達到穩定INR后，華法林血藥濃度平均值為484.5～2 788.5 （1 202.68±434.95）ng/ml （圖 2）。本組華法林血藥濃度主要集中在700～1 800 ng/ml區間中，隨訪中所有患者均無出血及栓塞等抗凝并發癥發生。
圖2
103例心臟瓣膜置換術后患者華法林血藥濃度
不同基因型患者分組比較華法林用藥劑量與血藥濃度之間的關系（表 5）。就CYP2C9基因型分組分析可見，CYP2C9*1/*1組的患者華法林用藥劑量（3.03±1.42）mg/d比CYP2C9*1/*3組的華法林用藥劑量（2.42±1.08）mg/d明顯增高（P < 0.05），但兩組患者的華法林血藥濃度差異無統計學意義（P > 0.05）。而對于VKORC1基因型分組分析可見，患者華法林用藥劑量及血藥濃度在VKORC1-1639AA組、VKORC1-1639AG組及VKORC1-1639GG組中均呈遞增狀態，組間劑量差異有統計學意義（P < 0.05）。
表5
不同基因型患者華法林用藥劑量與血藥濃度的關系（x±s）
2.5 多元線形回歸分析
本研究以華法林用藥劑量為因變量（Y），以年齡、性別、體表面積、華法林血藥濃度、凝血因子活性和基因型等為自變量，進行多元線性回歸分析結果（表 6）顯示：性別、體表面積和凝血因子活性與華法林用藥劑量差異無統計學意義（P > 0.05），說明上述三因素對華法林用藥劑量的影響相對較弱；CYP2C9 *3、VKORC1-1639、華法林血藥濃度及年齡與華法林用藥劑量差異有統計學意義（P < 0.05），說明它們對華法林用藥劑量的影響相對較強；上述四因素對華法林用藥劑量的影響程度（r2）分別為1.2%、26.5%、43.4%和5.0%。并由此推導出回歸方程：Y=1.963-0.986×（CYP2C9*3）+0.893×（VKORC1-1639）+0.002×（華法林血藥濃度）-0.019×（年齡），F值為26.146，P=0.000，說明逐步擬合的多元線性回歸方程差異有統計學意義。r2=0.516，說明該回歸方程可解釋約51.6%華法林劑量個體差異。
表6
多元線性回歸分析結果
3 討論
心臟瓣膜置換術是治療心臟瓣膜結構及功能損害的有效手段，我國每年瓣膜疾病總的手術量20余萬例[10]，占成人心臟外科手術第一位。國內瓣膜置換手術的病因以風濕性瓣膜疾病為主，患者的平均年齡較輕，選用心臟機械瓣膜的比例高達85%以上[2]，術后必須終身抗凝治療。華法林在臨床治療過程中，造成其用量個體差異的原因很多，可分為遺傳因素和非遺傳因素[3]。因此本研究以心臟瓣膜置換術后患者作為研究對象，研究VKORC1和CYP2C9等基因多態性與中國人華法林劑量個體差異的相關性，結合凝血因子活性和華法林血藥濃度、年齡、體重等非遺傳因素，探討建立華法林合理用藥劑量預測方法，其目標是確定明確的抗凝監測頻率，并讓劑量不穩定的患者在短時間內達到華法林用藥劑量穩定，減少抗凝并發癥的發生。
本研究結果可見：華法林用藥劑量差異無統計學意義，這與國外的研究結果[11-12]比較一致。年齡對華法林用藥劑量個體差異的影響是不可忽視的因素之一[11-14]，患者華法林用藥劑量隨年齡的增高有遞減的趨勢；此外，體表面積與華法林用藥劑量也呈正性相關[15]，隨著體表面積的增加，華法林用藥劑量則增大。然而，非遺傳因素只是導致華法林用量個體差異大的部分原因。
隨著華法林藥理作用分子機制的闡明和藥物基因組學的發展，目前國內外多項研究顯示遺傳因素是造成華法林用量個體差異主要因素，其中CYP2C9和VKORC1基因多態性是影響華法林劑量重要的遺傳因素[16]。據美國FDA推薦指南，CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6對華法林劑量的個體差異性影響較大。本研究對劑量不穩定組進行CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6三個位點的基因檢測，說明三種基因的突變率較低，對華法林用量及不良反應無明顯影響。CYP2C9*3以野生型（*1/*1型）為主，占總數的93.2%，CYP2C9*3基因突變型（*1/*3型）頻率為6.8%，與文獻報道[17]基本一致。CYP2C9*3的突變型編碼的酶活性比野生型CYP2C9*1降低了80%[18]，CYP酶活性降低，使患者體內華法林代謝速度減慢，導致有效血藥濃度升高，進而使藥物療效增強。本組CYP2C9*1/*1基因型患者所需華法林用藥劑量高于CYP2C9*1/*3基因型患者（P < 0.05）。因此，對國人來說，CYP2C9*1/*3基因型患者對華法林敏感，所需用藥劑量較少，故在常規給藥情況下容易導致使用初期出血率增加。
維生素K環氧化物還原酶復合體亞單位1 （VKORC1）基因編碼維生素K環氧化物還原酶，其在肝臟維生素K循環中起重要作用，也是華法林結合的一個靶點，其基因突變導致華法林與其結合力降低，抗凝作用減弱[19]。本研究結果示：VKORC1-1639AA型79.61%，GA型18.45%，GG型1.94%，與文獻報道基本一致，而西方高加索人群分別為16.3%，48.9%和36.7%[20]；且發現VKORC1-1639 （GG+AG）型患者需要的華法林劑量（4.42±2.07）mg/d明顯高于基因型為AA患者（2.62±0.87）mg/d （P < 0.01），這一分布規律與臨床觀察到的種族之間華法林用藥劑量的差異一致，即中國漢族人群華法林用藥劑量明顯低于高加索人，這也是亞洲人群抗凝治療華法林用藥劑量較少的內在原因。因此，對于漢族人來說，在達到相同的抗凝強度時，VKORC1基因發生變異的患者需要更高的華法林用藥劑量。
CYP2C9基因型對華法林血藥濃度幾乎無影響，VKORC1基因型和CYP4F2基因型華法林血藥濃度影響較大。通過監測血藥濃度可以準確穩定、定量地監測抗凝治療，我們建議將INR在1.5～2.5范圍內，達到華法林用藥劑量穩定的心臟機械瓣膜置換術后患者的血藥濃度監測指標建立在700～1 800 ng/ml區間。華法林血藥濃度與VKORC1基因型的多態性有較好的相關性，鑒于華法林血藥濃度檢測價格低廉、簡便易行，臨床上可部分取代基因檢測，了解華法林用藥劑量個體性差異。
本研究通過心臟瓣膜置換術后患者華法林用藥劑量與基因型關系的分析，結合凝血因子活性和華法林血藥濃度、年齡、體表面積等非遺傳因素，探討了華法林用藥劑量預測方法，部分揭示了不同人群用藥劑量個體差異性的原因。更精確的預測方法的建立，仍需大樣本多中心臨床研究。口服華法林前若能對患者進行基因學檢測，并根據其基因分型指導華法林的用藥劑量，勢必會減少抗凝相關并發癥的發生，避免多次華法林劑量調整帶來出血或栓塞并發癥的發生以及經濟負擔，從而節約醫療資源，達到個體化用藥的目的。
華法林是屬香豆素類口服抗凝劑，心臟機械瓣膜置換術( mechanical heart valve replacement，MHVR)及部分生物瓣膜置換術后患者均需終身服用華法林行抗凝治療，然而該藥治療窗窄，其個體劑量差異可以相差多達20倍以上[1]，治療不當導致的出血與栓塞成為機械瓣膜置換術后最常見的嚴重并發癥[2]。華法林在臨床治療過程中，造成其劑量個體差異的原因很多，可分為遺傳因素和非遺傳因素[3]。從華法林藥動學和藥效學研究結果顯示，CYP2C9和VKORC1基因多態性是影響華法林劑量重要的遺傳因素。結合年齡和體重等非遺傳因素，VKORC1和CYP2C9基因多態性可解釋50%～60%的華法林劑量個體差異[4-6]。目前研究結果證實，利用藥物基因組學信息和臨床相關特征建立的華法林用藥劑量運算預測模型能夠更準確地估計其用藥劑量，降低治療開始階段抗凝治療過量導致的風險，并縮短華法林達到穩定治療的時間。盡管如此，很多研究仍存在方法上的限制，如未納入凝血因子、血藥濃度等與華法林藥效學和藥代學密切相關的檢測指標以及其他影響華法林用藥劑量變異的因素。此外，這些研究納入的患者多為高加索人、非洲人，亞洲人種樣本量較少。與高加索人相比，漢族人在抗凝治療過程中更容易發生出血并發癥而較少發生栓塞并發癥，目前國內多采用低強度抗凝治療[國際標準化比值（INR）1.5～2.5）]，但該治療的基礎研究如基因多態性與個體化抗凝治療的關系目前甚少報道。本研究以心臟瓣膜置換術后患者作為研究對象，明確VKORC1和CYP2C9等基因多態性與中國人華法林劑量個體差異的相關性，結合凝血因子活性和華法林血藥濃度、年齡及體表面積等非遺傳因素，預測患者華法林抗凝治療的合理用藥劑量，實現抗凝監測的個體化管理，減少其并發癥的發生。
1 資料與方法
1.1 研究對象和分組
1.1.1 臨床資料
連續性納入《中國人心臟瓣膜置換術后抗凝治療數據庫》中2011年1月1日至2012年12月31日在四川大學華西醫院行心臟瓣膜置換術、術后服用華法林行抗凝治療并接受抗凝監測INR的患者103例，其中男32例、女71例，年齡21～85 （48.64±11.66）歲；身高147～180 （160.59±6.89）cm，體重43～78 （57.17±8.38）kg；華法林用藥劑量為0.62～10.00 （2.99±1.41) mg/d；抗凝強度INR目標值：主動脈瓣置換術（AVR）1.5～1.8，二尖瓣置換術（MVR）及雙瓣（主動脈瓣和二尖瓣）置換術（DVR）1.8～2.0，三尖瓣置換術（TVR）（含其他瓣膜置換）2.0～2.5，患者均未發生出血或者栓塞等并發癥。
1.1.2 分組
按INR實測值在其目標值范圍的頻數（time within therapeutic INR target range，TTR）的高低將患者分為劑量穩定組（TTR > 75.7%）與不穩定組（TTR < 75.7%）[7]；再將穩定組按華法林劑量分為低劑量組（< 2.5 mg/d），中劑量組（2.5～5.0 mg/d）與高劑量組（> 5.0 mg/d）三組[8]；最后按CYP2C9（rs1057910）、VKORC1（rs9923231）兩個基因的突變情況將患者分為CYP2C9*1/*1組、CYP2C9*1/*3組和CYP2C9* 3/* 3組以及VKORC1-1639AA組、VKORC1-1639AG組和VKORC1-1639GG組。
1.2 方法
每位患者抽取2 ml外周靜脈全血，使用乙二胺四乙酸二鈉（EDTA2Na）抗凝。置于冰箱-20℃保存；基因組DNA的提取采用磁珠法，使用思洛生物技術股份有限公司的SnoMag Blood DNA Extraction Kit來提取患者基因組DNA，-20℃冷凍保存；分批將提取好的患者基因組DNA進行CYP2C9（rs1057910）、VKORC1（rs9923231）位點聚合酶鏈反應（PCR），對所需片段進行擴增，采用限制性片段長度多態性（RFLP）方法和測序技術對患者進行基因檢測。在基因檢測的同時，抽取2 ml外周靜脈全血，使用Sysmex CA7000 analyser試劑盒（Siemens Healthcare Diagnostics, Marburg, Germany）檢測凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅳ、Ⅹ活性。將服用華法林鈉片（山東齊魯制藥廠，2.5 mg/片）治療2個月后的患者，在早晨同一時間（與測定PT-INR同一時間）采用超高效液相色譜法（HPLC）[9]檢測患者華法林血藥濃度。
1.3 統計學分析
計量資料用均數±標準差（x±s）表示，計數資料用頻數、頻率表示。計量資料的比較采用t檢驗或方差分析，計數資料的比較使用χ2檢驗。將年齡與華法林用藥劑量進行單因素方差分析，多因素線性回歸方法分析探討各因素對華法林用藥劑量影響的程度，用決定系數r2表示。P < 0.05表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 華法林用藥劑量與性別、年齡、體重、身高等之間的相關性
男性患者華法林用藥劑量（3.08±1.15）mg/d，女性患者華法林用藥劑量（2.95±1.51）mg/d，不同性別間華法林用藥劑量差異無統計學意義（P > 0.05）。
103例患者按年齡段分為20～29歲、30～39歲、40～49歲、50～59歲、60～69歲以及> 70歲共6組（表 1），ANOVA分析結果顯示各年齡組之間華法林用藥劑量差異均有統計學意義（P < 0.05），患者華法林用藥劑量隨年齡的增高有遞減的趨勢。
表1
不同年齡組華法林用藥劑量情況（x±s）
體表面積（body surface area，BSA)是由體重和身高計算得出。體表面積與華法林用藥劑量的相關性采用直線回歸進行檢驗，以體表面積為自變量，華法林用藥劑量為應變量，擬建立一個直線回歸方程：Y=2.047X-0.463，經方差分析示：F=3.972，P=0.049，該方程式成立，故可認為華法林用藥劑量與體表面積之間有直線關系（圖 1），體表面積每增加1 m2，華法林用藥劑量的需求相應增加2.047 mg。
圖1
體表面積對華法林用藥劑量的影響
2.2 不同組別的華法林用藥劑量與基因多態性和華法林血藥濃度之間的關系
比較劑量穩定組和劑量不穩定組的華法林用藥劑量與基因多態性的關系（表 2），結果顯示：劑量穩定組中：（1）VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG所占比例分別為84.95%、15.05%和0.00%；（2）CYP2C9*1/*1和CYP2C9*1/*3基因型所占比例分別為96.77%和3.23%，未發現CYP2C9*3/*3基因型。劑量不穩定組中：（1）VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG的所占比例分別為30.00%、50.00%和20.00%；（2）CYP2C9*1/*1和CYP-2C9*1/*3基因型所占比例分別為60.00%和40.00%，未發現CYP2C9*3/*3基因型。對劑量不穩定組的患者加做CYP4F2、GGCX、CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6基因位點檢測。發現（1）GGCX、CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6四個基因位點突變率為0，（2）CYP4F2的突變率較高，其中CYP4F2TT和CYP4F2CT均為30.00%。
表2
華法林劑量穩定組與不穩定組患者基因多態性比較[例（%）]
比較低劑量組、中劑量組和高劑量組患者的基因多態性及華法林血藥濃度（表 3），結果顯示：低劑量組中，VKORC1基因型以VKORC1-1639AA為主，所占比例為93.75%，VKORC1-1639AG基因型為6.25%，而VKORC1-1639GG基因型為0.00，CYP2C9*1/*3基因型較高，為12.50%；中等劑量組中，VKORC1基因型VKORC1-1639AA、VKORC1-1639AG和VKORC1-1639GG的所占比例分別為81.25%、17.19%和1.56%，CYP2C9*1/*3基因型為4.69%；高劑量組中，VKORC1基因型以VKORC1-1639AG、VKORC1-1639GG為主，分別占85.71%、14.29%，CYP2C9*1/*3基因型為0；各組均未發現CYP2C9*3/*3基因型。
表3
華法林不同劑量組別患者基因多態性比較[例（%）]
2.3 華法林用藥劑量與基因多態性之間的相關性
對103例患者根據CYP2C9 （rs1057910）、VKORC （rs9923231）兩個基因的突變情況進行分組，比較每組的華法林用藥劑量與基因多態性的關系，結果顯示：CYP2C9*1/*3基因型患者所需的華法林用藥劑量為（2.43±1.08）mg/d，顯著低于CYP2C9*1/*1基因型患者[（3.03±1.42）mg/d，P=0.001]。VKORC1-1639GG基因型患者所需華法林用藥劑量為（5.05±1.25）mg/d，AG基因型為（4.35±2.15）mg/d，AA基因型為（2.62±0.87）mg /d，差異有統計學意義（P < 0.05），VKORC1-1639 AG基因型和GG基因型患者所需華法林用藥劑量大于VKORC1-1639 AA基因型患者（表 4）。
表4
基因多態性對患者華法林用藥劑量的影響（x±s）
2.4 華法林用藥劑量與血藥濃度、凝血因子及基因多態性之間的關系
心臟瓣膜置換術后患者達到穩定INR后，華法林血藥濃度平均值為484.5～2 788.5 （1 202.68±434.95）ng/ml （圖 2）。本組華法林血藥濃度主要集中在700～1 800 ng/ml區間中，隨訪中所有患者均無出血及栓塞等抗凝并發癥發生。
圖2
103例心臟瓣膜置換術后患者華法林血藥濃度
不同基因型患者分組比較華法林用藥劑量與血藥濃度之間的關系（表 5）。就CYP2C9基因型分組分析可見，CYP2C9*1/*1組的患者華法林用藥劑量（3.03±1.42）mg/d比CYP2C9*1/*3組的華法林用藥劑量（2.42±1.08）mg/d明顯增高（P < 0.05），但兩組患者的華法林血藥濃度差異無統計學意義（P > 0.05）。而對于VKORC1基因型分組分析可見，患者華法林用藥劑量及血藥濃度在VKORC1-1639AA組、VKORC1-1639AG組及VKORC1-1639GG組中均呈遞增狀態，組間劑量差異有統計學意義（P < 0.05）。
表5
不同基因型患者華法林用藥劑量與血藥濃度的關系（x±s）
2.5 多元線形回歸分析
本研究以華法林用藥劑量為因變量（Y），以年齡、性別、體表面積、華法林血藥濃度、凝血因子活性和基因型等為自變量，進行多元線性回歸分析結果（表 6）顯示：性別、體表面積和凝血因子活性與華法林用藥劑量差異無統計學意義（P > 0.05），說明上述三因素對華法林用藥劑量的影響相對較弱；CYP2C9 *3、VKORC1-1639、華法林血藥濃度及年齡與華法林用藥劑量差異有統計學意義（P < 0.05），說明它們對華法林用藥劑量的影響相對較強；上述四因素對華法林用藥劑量的影響程度（r2）分別為1.2%、26.5%、43.4%和5.0%。并由此推導出回歸方程：Y=1.963-0.986×（CYP2C9*3）+0.893×（VKORC1-1639）+0.002×（華法林血藥濃度）-0.019×（年齡），F值為26.146，P=0.000，說明逐步擬合的多元線性回歸方程差異有統計學意義。r2=0.516，說明該回歸方程可解釋約51.6%華法林劑量個體差異。
表6
多元線性回歸分析結果
3 討論
心臟瓣膜置換術是治療心臟瓣膜結構及功能損害的有效手段，我國每年瓣膜疾病總的手術量20余萬例[10]，占成人心臟外科手術第一位。國內瓣膜置換手術的病因以風濕性瓣膜疾病為主，患者的平均年齡較輕，選用心臟機械瓣膜的比例高達85%以上[2]，術后必須終身抗凝治療。華法林在臨床治療過程中，造成其用量個體差異的原因很多，可分為遺傳因素和非遺傳因素[3]。因此本研究以心臟瓣膜置換術后患者作為研究對象，研究VKORC1和CYP2C9等基因多態性與中國人華法林劑量個體差異的相關性，結合凝血因子活性和華法林血藥濃度、年齡、體重等非遺傳因素，探討建立華法林合理用藥劑量預測方法，其目標是確定明確的抗凝監測頻率，并讓劑量不穩定的患者在短時間內達到華法林用藥劑量穩定，減少抗凝并發癥的發生。
本研究結果可見：華法林用藥劑量差異無統計學意義，這與國外的研究結果[11-12]比較一致。年齡對華法林用藥劑量個體差異的影響是不可忽視的因素之一[11-14]，患者華法林用藥劑量隨年齡的增高有遞減的趨勢；此外，體表面積與華法林用藥劑量也呈正性相關[15]，隨著體表面積的增加，華法林用藥劑量則增大。然而，非遺傳因素只是導致華法林用量個體差異大的部分原因。
隨著華法林藥理作用分子機制的闡明和藥物基因組學的發展，目前國內外多項研究顯示遺傳因素是造成華法林用量個體差異主要因素，其中CYP2C9和VKORC1基因多態性是影響華法林劑量重要的遺傳因素[16]。據美國FDA推薦指南，CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*5和CYP2C9*6對華法林劑量的個體差異性影響較大。本研究對劑量不穩定組進行CYP2C9*2、CYP2C9*5和CYP2C9*6三個位點的基因檢測，說明三種基因的突變率較低，對華法林用量及不良反應無明顯影響。CYP2C9*3以野生型（*1/*1型）為主，占總數的93.2%，CYP2C9*3基因突變型（*1/*3型）頻率為6.8%，與文獻報道[17]基本一致。CYP2C9*3的突變型編碼的酶活性比野生型CYP2C9*1降低了80%[18]，CYP酶活性降低，使患者體內華法林代謝速度減慢，導致有效血藥濃度升高，進而使藥物療效增強。本組CYP2C9*1/*1基因型患者所需華法林用藥劑量高于CYP2C9*1/*3基因型患者（P < 0.05）。因此，對國人來說，CYP2C9*1/*3基因型患者對華法林敏感，所需用藥劑量較少，故在常規給藥情況下容易導致使用初期出血率增加。
維生素K環氧化物還原酶復合體亞單位1 （VKORC1）基因編碼維生素K環氧化物還原酶，其在肝臟維生素K循環中起重要作用，也是華法林結合的一個靶點，其基因突變導致華法林與其結合力降低，抗凝作用減弱[19]。本研究結果示：VKORC1-1639AA型79.61%，GA型18.45%，GG型1.94%，與文獻報道基本一致，而西方高加索人群分別為16.3%，48.9%和36.7%[20]；且發現VKORC1-1639 （GG+AG）型患者需要的華法林劑量（4.42±2.07）mg/d明顯高于基因型為AA患者（2.62±0.87）mg/d （P < 0.01），這一分布規律與臨床觀察到的種族之間華法林用藥劑量的差異一致，即中國漢族人群華法林用藥劑量明顯低于高加索人，這也是亞洲人群抗凝治療華法林用藥劑量較少的內在原因。因此，對于漢族人來說，在達到相同的抗凝強度時，VKORC1基因發生變異的患者需要更高的華法林用藥劑量。
CYP2C9基因型對華法林血藥濃度幾乎無影響，VKORC1基因型和CYP4F2基因型華法林血藥濃度影響較大。通過監測血藥濃度可以準確穩定、定量地監測抗凝治療，我們建議將INR在1.5～2.5范圍內，達到華法林用藥劑量穩定的心臟機械瓣膜置換術后患者的血藥濃度監測指標建立在700～1 800 ng/ml區間。華法林血藥濃度與VKORC1基因型的多態性有較好的相關性，鑒于華法林血藥濃度檢測價格低廉、簡便易行，臨床上可部分取代基因檢測，了解華法林用藥劑量個體性差異。
本研究通過心臟瓣膜置換術后患者華法林用藥劑量與基因型關系的分析，結合凝血因子活性和華法林血藥濃度、年齡、體表面積等非遺傳因素，探討了華法林用藥劑量預測方法，部分揭示了不同人群用藥劑量個體差異性的原因。更精確的預測方法的建立，仍需大樣本多中心臨床研究。口服華法林前若能對患者進行基因學檢測，并根據其基因分型指導華法林的用藥劑量，勢必會減少抗凝相關并發癥的發生，避免多次華法林劑量調整帶來出血或栓塞并發癥的發生以及經濟負擔，從而節約醫療資源，達到個體化用藥的目的。
