同種異體小鼠腹腔異位心臟移植模型是技術復雜的小動物顯微手術。對于初學者必須經歷一個學習曲線過程。學習曲線包括三個階段：（1）熟悉供體和受體小鼠的局部解剖；（2）掌握供體小鼠心臟采集和受體小鼠腹腔大血管的準備；（3）掌握大血管的吻合技術。學習曲線的瓶頸在于大血管的吻合技術。學習曲線中的漸進要點是“認識、熟悉、準備、提速”。
引用本文： 陳心足, Shi-junWang, ChengZhou, 胡建昆. 同種異體小鼠腹腔異位心臟移植模型的學習曲線. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(9): 879-882. doi: 10.7507/1007-4848.20150219 復制
同種異體小鼠腹腔異位心臟移植（allogeneic ectopic heart transplantation）是一項發展近50年的成熟動物實驗模型[1-3]。該模型主要用于移植免疫相關領域的基礎研究[4-5]。其優勢在于多數免疫應答與調節信號通路相關的基因敲除小鼠可以用于此領域進行相關深入的機制研究，是目前大鼠心臟移植模型所不能替代的[6]。此外，心臟移植模型中使用胸主動脈和肺動脈進行血管吻合重建，血管口徑大，可以作為其他小鼠器官移植模型，如腎移植、小腸移植的前期技術學習階段。本文就該動物模型構建的初學者經驗進行歸納和介紹。
1 學習曲線
1.1 供體和受體小鼠的局部解剖
第一階段，對于初學者，熟悉小鼠的局部解剖結構與層次特征是完成手術的必要條件（表 1）。在供體小鼠，需要重點觀察心臟的比鄰結構，如雙肺、胸腺、食管，以及心臟大血管的布局。在受體小鼠，需要重點觀察下腹腔大血管（左腎靜脈以下至髂血管分叉）的周圍筋膜層次和分支血管。另外，對于初學者也應該盡快適應顯微手術的眼手配合，一般在游離程序放大16倍，在縫合程序放大25～40倍。此階段如有觀摩和講解經驗，對縮短學習曲線有很大幫助。此階段約需至少5～10只小鼠解剖觀察經驗積累。
表1
學習曲線中相關手術技術和結果
1.2 供體小鼠心臟采集和受體小鼠腹腔大血管準備
第二階段，良好的供體心臟的條件和受體大血管的準備，是保證此動物實驗模型高成功率的重要因素之一（表 1）。在供體小鼠需要掌握的是雙肺切除、心臟周圍筋膜游離、胸主動脈升段和肺動脈主干的游離與吻合口修剪、供體心臟的灌注。需要注意避免對供體心臟的機械性損傷，尤其心耳損傷是導致移植完成后難控性出血和手術失敗的原因之一。在受體小鼠需要掌握的是下腹腔的腹主動脈和下腔靜脈的暴露和游離、大血管前方筋膜的充分裸化、大血管分支血管的處理、動靜脈吻合口的修剪。此階段約需有10~20只小鼠解剖經驗積累。
1.3 大血管的吻合技術
第三階段，血管吻合技術是動物實驗模型能否成功存活最直接的決定因素（表 1）。需要不斷練習動/靜脈吻合的縫合技巧，增加熟練度和提高縫合速度。按程序動脈吻合首先學習，因腹主動脈壁較下腔靜脈壁厚，因此動脈吻合更容易掌握。無論是動脈還是靜脈吻合，需要不斷實踐摸索的是針距、邊距、松緊度以及顯微鏡下器械打結的技巧。此階段是此動物模型的學習瓶頸，要勇于不斷嘗試摸索正確的手感，面對手術失敗的挫折應堅持不氣餒。
2 手術程序
2.1 供體
（1）腹腔注射麻醉，四肢伸展仰臥位固定，腹壁消毒，十字切口開腹。分離胰結腸韌帶，切開直腸系膜，打開腹主動脈前筋膜顯露腹主動脈。
（2）沿胸壁切開膈肌，經雙側側胸壁由下向上切斷各肋弓，將前胸壁向上翻起顯露心肺。剝除心包，遠離心房結扎切斷下腔靜脈，切斷下肺韌帶，分別于肺門結扎各肺葉蒂并切除肺葉（右三左二），鈍性分離心房后方于食管間疏松結蒂組織，鈍性分離上縱隔的胸腺組織，顯露肺動脈干和升主動脈。仔細剝除肺動脈干和升主動脈周圍筋膜與結蒂組織，肺動脈干游離至分叉平面下，升主動脈游離略長于肺動脈干。需注意肺動脈干與升主動脈之間及其后方的筋膜結蒂組織的剔除，尤其是在擬定吻合口平面周圍（圖 1）。
圖1
離體前供體小鼠心臟
注：A：升主動脈；B：肺動脈干（上方為小鼠頭側）
（3）于擬定吻合口平面一次性剪斷肺動脈干，盡可能避免二次修剪。血管夾阻斷腹主動脈遠端，在血管夾近心端穿刺用冰肝素生理鹽水灌注沖洗心臟3～4 ml。于擬定吻合口平面一次性剪斷升主動脈。一并結扎上腔靜脈及周圍上縱隔組織，切取供體心臟置于冰水浸泡冷藏備用。
2.2 受體
（1）腹腔注射麻醉，四肢伸展仰臥位固定，腹壁消毒。取腹正中全長切口入腹。將大小腸翻至右側腹腔，分離胰結腸韌帶，切開直腸系膜，棉片保護腸道、脾臟、肝臟，僅顯露左腎靜脈平面以下至髂血管分叉平面以上的腹主動脈和下腔靜脈。若大血管與髂腰肌之間有較大淋巴結影響操作，可以予以切除。分離進入腹主動脈血管鞘內，經鞘內間隙剝除血管前方筋膜，尤其注意擬定吻合口區域血管壁的充分裸化，也需注意保護雙側生殖血管避免損傷。大血管后方間隙的松解，一般有1～2處大血管至髂腰肌和脊柱的分支血管，小心電凝后切斷，此處遠/近心端的斷端活動性出血都較難控制，應特別小心操作。
（2）用無損傷血管夾分別阻斷游離大血管的遠近斷。在腹主動脈擬定吻合口的近遠點用10-0縫針縱向進針出針后保持位置，緊貼縫針下緣挑起剪去對應腹主動脈壁。在動脈吻合口對應平面縱向剪開下腔靜脈。經吻合口用生理鹽水充分沖洗動靜脈管腔內殘留積液和血凝塊。
（3）取出冷藏的供體心臟置入受體腹腔，避免直接夾持心肌、心房、吻合口，將心臟至于右側腹腔，調整心臟方位使供體升主動脈位于受體左側、肺動脈干位于受體右側。首先進行動脈吻合，用2根11-0縫線分別縫合吻合口上下角牽引固定，應外進內出進針使吻合口邊緣外翻并打結在腔外。用上角牽引線從上向下連續縫合動脈吻合口左側壁，進針一般6～8針，邊距盡量小，收線不宜過緊，與下角固定線尾打結（圖 2）。翻轉心臟至左側腹腔，用下角牽引線從下向上連續縫合動脈吻合口右側壁，與上角牽引線尾打結。心臟繼續置于左側腹腔，展開肺動脈干斷端，用11-0縫線縫合靜脈吻合口下角打結，從下向上連續縫合靜脈吻合口左側壁至上角，然后繼而轉向從上向下連續縫合靜脈吻合口右側壁至下角與線尾打結（圖 3）。
圖2
開放前動脈吻合口（箭頭示吻合口左側壁；上方為小鼠頭側）
圖3
開放前靜脈吻合口（箭頭示吻合口右側壁；上方為小鼠頭側）
（4）檢查動/靜脈吻合口有無缺損，首先控制性開放遠心端血管夾，觀察靜脈吻合口有無活動性出血。若需修補則立即再次阻斷遠端血供，一般出血點單針修補即可。將心臟翻至右側腹腔，控制性開放近心端血管夾觀察動脈吻合口有無活動性出血，若有出血同法再次阻斷修補。心耳出血點縫扎或電凝都可能加重出血，相反壓迫止血相對可靠。檢查吻合口和心臟血液循環正常后（圖 4），將心臟經直腸后方穿過置于右側腹腔。腹腔注入溫熱生理鹽水補液復溫然后關閉腹部切口。
圖4
開放后移植心臟（箭頭示再灌注的移植物；上方為小鼠頭側）
3 討論
據文獻報道，我國于1991年首次引入小鼠異位心臟移植的動物手術模型[7]。2000年后，小鼠異位心臟移植模型在我國才較廣泛地應用于移植免疫研究領域[8-10]。腹腔異位心臟移植是最基礎的模型，在此之后不少研究者對這個模型進行了改良。最常見的改良就是小鼠頸部異位心臟移植模型[11-13]。據研究者的經驗，小鼠頸部異位心臟移植模型是一種降低手術難度、易于暴露、手術時間短、創傷小、污染少、觀察方便、成功率高的簡單實用的技術[11, 14]。為進一步簡化構建模型的技術，在大血管吻合程序中有學者嘗試了Cuff技術和套管法，其具有明顯降低手術難度、手術時間短、創傷小、成功率高的優點[15-17]。
不管模型構建的手術技術如何改良，至近年小鼠腹腔異位心臟移植模型始終在此領域中普遍采用[18-20]。傳統腹腔模型的優點首先是腹腔的漿膜腔環境更接近心包漿膜腔，對移植心臟的生存環境模擬和功能保護是其他改良模型無法替代的。腹腔異位移植心臟的存活時間更長，是更適合需長期觀察實驗的動物模型。動靜脈采用傳統的手工吻合技術發生血栓形成的幾率降低，也因此長期存活時間延長。此外，術后觀察移植心臟存活情況可通過視診和觸診檢測移植物的搏動情況，但有時移植物雖已經壞死但仍可以隨受體腹主動脈搏動造成錯誤的評判影響實驗分析。一般移植心臟在術后1 d停跳則應判定為手術失敗[20]。更準確的評價移植心臟生理病理狀態的方法是小動物心電圖檢測提示兩套心電波形則為移植心臟存活，另外處死后病理學檢查可確定心肌細胞的形態學和排斥情況。
導致手術失敗的因素較多，麻醉藥物初始劑量和追加劑量的控制不準確可能導致術中受體呼吸衰竭和術后不能復蘇。無論是供體或受體的盲目粗暴操作都可能導致手術的失敗，供體最常見的是心耳損傷導致移植結束開放血供后心耳出血無法止血，而受體最常見的是下腔靜脈骨骼化或吻合過程中撕裂。在吻合技術上有缺陷同樣導致受體死亡率高、移植物死亡率高。若吻合不確切，術中因受體血容量不足無明顯出血，術后血容量和血壓回升后出現術后吻合口出血致死。吻合口狹窄是因為連續縫合收線過緊或進針邊距過大引起。腹主動脈吻合口的遠側角易狹窄而血栓形成，術后表現為小鼠后肢癱瘓。下腔靜脈吻合狹窄或排出道不暢表現為術中移植心臟淤血和高張力。還有就是移植心臟放置方向扭轉，但罕有發生。
同種異體小鼠腹腔異位心臟移植模型屬于技術難度大的小動物顯微手術，同所有外科技術一樣都存在一個學習曲線的過程。有學者認為學習此動物模型手術需初期累積140～150 h手術練習時間[20]。據筆者經驗，發現需完成7對成功的動物模型手術以后，供體和受體的總手術時間才能降至80 min左右（圖 5）。在學習曲線中，需要經歷“認識、熟悉、準確、提速”這四個過程。只要突破學習曲線之后，進入技術平臺期，實驗動物存活率大幅提高而且穩定。
圖5
12對成功完成移植的供體與受體的手術時間（r=0.874，P＜0.001，Spearman's rho test）
同種異體小鼠腹腔異位心臟移植（allogeneic ectopic heart transplantation）是一項發展近50年的成熟動物實驗模型[1-3]。該模型主要用于移植免疫相關領域的基礎研究[4-5]。其優勢在于多數免疫應答與調節信號通路相關的基因敲除小鼠可以用于此領域進行相關深入的機制研究，是目前大鼠心臟移植模型所不能替代的[6]。此外，心臟移植模型中使用胸主動脈和肺動脈進行血管吻合重建，血管口徑大，可以作為其他小鼠器官移植模型，如腎移植、小腸移植的前期技術學習階段。本文就該動物模型構建的初學者經驗進行歸納和介紹。
1 學習曲線
1.1 供體和受體小鼠的局部解剖
第一階段，對于初學者，熟悉小鼠的局部解剖結構與層次特征是完成手術的必要條件（表 1）。在供體小鼠，需要重點觀察心臟的比鄰結構，如雙肺、胸腺、食管，以及心臟大血管的布局。在受體小鼠，需要重點觀察下腹腔大血管（左腎靜脈以下至髂血管分叉）的周圍筋膜層次和分支血管。另外，對于初學者也應該盡快適應顯微手術的眼手配合，一般在游離程序放大16倍，在縫合程序放大25～40倍。此階段如有觀摩和講解經驗，對縮短學習曲線有很大幫助。此階段約需至少5～10只小鼠解剖觀察經驗積累。
表1
學習曲線中相關手術技術和結果
1.2 供體小鼠心臟采集和受體小鼠腹腔大血管準備
第二階段，良好的供體心臟的條件和受體大血管的準備，是保證此動物實驗模型高成功率的重要因素之一（表 1）。在供體小鼠需要掌握的是雙肺切除、心臟周圍筋膜游離、胸主動脈升段和肺動脈主干的游離與吻合口修剪、供體心臟的灌注。需要注意避免對供體心臟的機械性損傷，尤其心耳損傷是導致移植完成后難控性出血和手術失敗的原因之一。在受體小鼠需要掌握的是下腹腔的腹主動脈和下腔靜脈的暴露和游離、大血管前方筋膜的充分裸化、大血管分支血管的處理、動靜脈吻合口的修剪。此階段約需有10~20只小鼠解剖經驗積累。
1.3 大血管的吻合技術
第三階段，血管吻合技術是動物實驗模型能否成功存活最直接的決定因素（表 1）。需要不斷練習動/靜脈吻合的縫合技巧，增加熟練度和提高縫合速度。按程序動脈吻合首先學習，因腹主動脈壁較下腔靜脈壁厚，因此動脈吻合更容易掌握。無論是動脈還是靜脈吻合，需要不斷實踐摸索的是針距、邊距、松緊度以及顯微鏡下器械打結的技巧。此階段是此動物模型的學習瓶頸，要勇于不斷嘗試摸索正確的手感，面對手術失敗的挫折應堅持不氣餒。
2 手術程序
2.1 供體
（1）腹腔注射麻醉，四肢伸展仰臥位固定，腹壁消毒，十字切口開腹。分離胰結腸韌帶，切開直腸系膜，打開腹主動脈前筋膜顯露腹主動脈。
（2）沿胸壁切開膈肌，經雙側側胸壁由下向上切斷各肋弓，將前胸壁向上翻起顯露心肺。剝除心包，遠離心房結扎切斷下腔靜脈，切斷下肺韌帶，分別于肺門結扎各肺葉蒂并切除肺葉（右三左二），鈍性分離心房后方于食管間疏松結蒂組織，鈍性分離上縱隔的胸腺組織，顯露肺動脈干和升主動脈。仔細剝除肺動脈干和升主動脈周圍筋膜與結蒂組織，肺動脈干游離至分叉平面下，升主動脈游離略長于肺動脈干。需注意肺動脈干與升主動脈之間及其后方的筋膜結蒂組織的剔除，尤其是在擬定吻合口平面周圍（圖 1）。
圖1
離體前供體小鼠心臟
注：A：升主動脈；B：肺動脈干（上方為小鼠頭側）
（3）于擬定吻合口平面一次性剪斷肺動脈干，盡可能避免二次修剪。血管夾阻斷腹主動脈遠端，在血管夾近心端穿刺用冰肝素生理鹽水灌注沖洗心臟3～4 ml。于擬定吻合口平面一次性剪斷升主動脈。一并結扎上腔靜脈及周圍上縱隔組織，切取供體心臟置于冰水浸泡冷藏備用。
2.2 受體
（1）腹腔注射麻醉，四肢伸展仰臥位固定，腹壁消毒。取腹正中全長切口入腹。將大小腸翻至右側腹腔，分離胰結腸韌帶，切開直腸系膜，棉片保護腸道、脾臟、肝臟，僅顯露左腎靜脈平面以下至髂血管分叉平面以上的腹主動脈和下腔靜脈。若大血管與髂腰肌之間有較大淋巴結影響操作，可以予以切除。分離進入腹主動脈血管鞘內，經鞘內間隙剝除血管前方筋膜，尤其注意擬定吻合口區域血管壁的充分裸化，也需注意保護雙側生殖血管避免損傷。大血管后方間隙的松解，一般有1～2處大血管至髂腰肌和脊柱的分支血管，小心電凝后切斷，此處遠/近心端的斷端活動性出血都較難控制，應特別小心操作。
（2）用無損傷血管夾分別阻斷游離大血管的遠近斷。在腹主動脈擬定吻合口的近遠點用10-0縫針縱向進針出針后保持位置，緊貼縫針下緣挑起剪去對應腹主動脈壁。在動脈吻合口對應平面縱向剪開下腔靜脈。經吻合口用生理鹽水充分沖洗動靜脈管腔內殘留積液和血凝塊。
（3）取出冷藏的供體心臟置入受體腹腔，避免直接夾持心肌、心房、吻合口，將心臟至于右側腹腔，調整心臟方位使供體升主動脈位于受體左側、肺動脈干位于受體右側。首先進行動脈吻合，用2根11-0縫線分別縫合吻合口上下角牽引固定，應外進內出進針使吻合口邊緣外翻并打結在腔外。用上角牽引線從上向下連續縫合動脈吻合口左側壁，進針一般6～8針，邊距盡量小，收線不宜過緊，與下角固定線尾打結（圖 2）。翻轉心臟至左側腹腔，用下角牽引線從下向上連續縫合動脈吻合口右側壁，與上角牽引線尾打結。心臟繼續置于左側腹腔，展開肺動脈干斷端，用11-0縫線縫合靜脈吻合口下角打結，從下向上連續縫合靜脈吻合口左側壁至上角，然后繼而轉向從上向下連續縫合靜脈吻合口右側壁至下角與線尾打結（圖 3）。
圖2
開放前動脈吻合口（箭頭示吻合口左側壁；上方為小鼠頭側）
圖3
開放前靜脈吻合口（箭頭示吻合口右側壁；上方為小鼠頭側）
（4）檢查動/靜脈吻合口有無缺損，首先控制性開放遠心端血管夾，觀察靜脈吻合口有無活動性出血。若需修補則立即再次阻斷遠端血供，一般出血點單針修補即可。將心臟翻至右側腹腔，控制性開放近心端血管夾觀察動脈吻合口有無活動性出血，若有出血同法再次阻斷修補。心耳出血點縫扎或電凝都可能加重出血，相反壓迫止血相對可靠。檢查吻合口和心臟血液循環正常后（圖 4），將心臟經直腸后方穿過置于右側腹腔。腹腔注入溫熱生理鹽水補液復溫然后關閉腹部切口。
圖4
開放后移植心臟（箭頭示再灌注的移植物；上方為小鼠頭側）
3 討論
據文獻報道，我國于1991年首次引入小鼠異位心臟移植的動物手術模型[7]。2000年后，小鼠異位心臟移植模型在我國才較廣泛地應用于移植免疫研究領域[8-10]。腹腔異位心臟移植是最基礎的模型，在此之后不少研究者對這個模型進行了改良。最常見的改良就是小鼠頸部異位心臟移植模型[11-13]。據研究者的經驗，小鼠頸部異位心臟移植模型是一種降低手術難度、易于暴露、手術時間短、創傷小、污染少、觀察方便、成功率高的簡單實用的技術[11, 14]。為進一步簡化構建模型的技術，在大血管吻合程序中有學者嘗試了Cuff技術和套管法，其具有明顯降低手術難度、手術時間短、創傷小、成功率高的優點[15-17]。
不管模型構建的手術技術如何改良，至近年小鼠腹腔異位心臟移植模型始終在此領域中普遍采用[18-20]。傳統腹腔模型的優點首先是腹腔的漿膜腔環境更接近心包漿膜腔，對移植心臟的生存環境模擬和功能保護是其他改良模型無法替代的。腹腔異位移植心臟的存活時間更長，是更適合需長期觀察實驗的動物模型。動靜脈采用傳統的手工吻合技術發生血栓形成的幾率降低，也因此長期存活時間延長。此外，術后觀察移植心臟存活情況可通過視診和觸診檢測移植物的搏動情況，但有時移植物雖已經壞死但仍可以隨受體腹主動脈搏動造成錯誤的評判影響實驗分析。一般移植心臟在術后1 d停跳則應判定為手術失敗[20]。更準確的評價移植心臟生理病理狀態的方法是小動物心電圖檢測提示兩套心電波形則為移植心臟存活，另外處死后病理學檢查可確定心肌細胞的形態學和排斥情況。
導致手術失敗的因素較多，麻醉藥物初始劑量和追加劑量的控制不準確可能導致術中受體呼吸衰竭和術后不能復蘇。無論是供體或受體的盲目粗暴操作都可能導致手術的失敗，供體最常見的是心耳損傷導致移植結束開放血供后心耳出血無法止血，而受體最常見的是下腔靜脈骨骼化或吻合過程中撕裂。在吻合技術上有缺陷同樣導致受體死亡率高、移植物死亡率高。若吻合不確切，術中因受體血容量不足無明顯出血，術后血容量和血壓回升后出現術后吻合口出血致死。吻合口狹窄是因為連續縫合收線過緊或進針邊距過大引起。腹主動脈吻合口的遠側角易狹窄而血栓形成，術后表現為小鼠后肢癱瘓。下腔靜脈吻合狹窄或排出道不暢表現為術中移植心臟淤血和高張力。還有就是移植心臟放置方向扭轉，但罕有發生。
同種異體小鼠腹腔異位心臟移植模型屬于技術難度大的小動物顯微手術，同所有外科技術一樣都存在一個學習曲線的過程。有學者認為學習此動物模型手術需初期累積140～150 h手術練習時間[20]。據筆者經驗，發現需完成7對成功的動物模型手術以后，供體和受體的總手術時間才能降至80 min左右（圖 5）。在學習曲線中，需要經歷“認識、熟悉、準確、提速”這四個過程。只要突破學習曲線之后，進入技術平臺期，實驗動物存活率大幅提高而且穩定。
圖5
12對成功完成移植的供體與受體的手術時間（r=0.874，P＜0.001，Spearman's rho test）
