引用本文： 尹迎春, 王新美, 李良, 韓紅梅, 張保華, 梁霄, 侯震波, 孟云霄. 非小細胞肺癌胸腔積液細胞蠟塊檢測EGFR與K-ras基因突變和EML4-ALK融合基因及其臨床病理特征. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(9): 870-874. doi: 10.7507/1007-4848.20150217 復制
晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 的治療已進入個體化靶向治療的時代，分子標志物指導下的治療已經成為當今研究的熱點[1-2]。有研究顯示，NSCLC患者表皮生長因子受體（epid-ermal growth factor receptor，EGFR）基因突變在所有相關基因改變中所占比例最大[3-4]，同時因為進行EGFR酪氨酸蛋白激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）治療，推薦每例NSCLC患者進行EGFR基因突變檢測[5]。K-ras及EML4-ALK融合基因是新近發現的NSCLC另一種較為常見的分子亞型。針對K-ras基因突變及EML4-ALK融合基因的靶向抑制劑厄洛替尼及克唑替尼已經廣泛應用于NSCLC臨床治療。目前，EGFR、K-ras和ALK基因突變檢測主要采用手術切除的腫瘤組織標本。但大約75%的NSCLC患者診斷時已為晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）[6]，可能無法獲得手術及組織學標本，細胞學標本可能是唯一可以用于病理診斷及檢測基因改變的標本。臨床上NSCLC細胞學標本包括胸腔積液（pleural effusion，PLE）、穿刺細胞學懸液、支氣管肺泡灌洗液、痰液和腦轉移后腦脊液等[7]。因此，探索新的檢測通路勢在必行。本研究中，我們通過對患者行胸腔穿刺方法獲得胸腔積液細胞學標本，探討采用細胞學標本檢測EGFR、K-ras基因突變和EML4-ALK融合基因情況，為NSCLC患者個體化治療提供依據。
1 材料與方法
1.1 一般資料
收集2012年1月至2014年6月淄博市中心醫院住院268例肺癌患者的胸腔積液標本，患者年齡53.6 （31～76） 歲；其中男165例、女103例。
1.2 方法
1.2.1 胸腔積液細胞蠟塊的制備
送檢細胞學樣本常規涂片完成后，取裝胸腔積液容器底部液體20 ml，離心半徑10 cm，2 000 r/min離心5 min。棄去上清液，加雞蛋清1 ml，輕輕振蕩離心管底部的細胞，盡量使細胞成團懸浮于蛋清中，2 000 r/min離心5 min，去除多余雞蛋清，此時只剩下蛋清包裹的細胞沉渣，取出用擦鏡紙包好，4%甲醛溶液固定，隨常規活組織檢查標本脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋、切片、60 ℃烤片備用。
1.2.2 免疫組織化學染色方法
每例樣本的細胞蠟塊切片同時進行CK7、TTF-1、Calretinin、P63、Syn、CgA、CD56、Ki-67等8項免疫組織化學染色，二抗試劑盒為Dako Envision通用多聚物酶標檢測系統。染色采用Lab Vision公司生產的Labvision Autostainer 720型自動免疫組織化學染色，采用Envision法，處理過程與一般的組織學檢查相同。陽性結果的判斷嚴格按照組織學檢測相同的定位、定性要求進行。
1.2.3 EGFR、K-ras及EML4-ALK基因檢測
EGFR和K-ras基因突變檢測試劑盒（熒光PCR法）及EML4-ALK融合基因檢測試劑盒（熒光PCR法），均選用廈門艾德生物醫藥科技有限公司產品。本組中有76例的細胞蠟塊樣本進行EGFR、K-ras基因突變及EML4-ALK融合基因的檢測。按照說明書每份標本分別提取 DNA后用PCR方法檢測EGFR和K-ras基因突變，提取RNA后進行逆轉錄得到cDNA用PCR方法檢測EML4-ALK融合基因。每次實驗中，每份樣本和陽性對照、陰性對照共同進行分析。
1.3 統計學分析
應用SPSS 17.0統計軟件分析，計數資料比較采用四格表χ2檢驗及四格表校正χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 免疫組織化學染色結果及組織學分型
胸腔積液脫落細胞離心沉淀后用雞蛋清凝集成團收集的細胞數量多，經4%甲醛溶液固定后能像組織塊一樣進行脫水、包埋、切片。HE染色顯示細胞數目多，排列結構在切片中比常規胸腔積液細胞學涂片完整，核漿對比清晰、染色鮮艷。可見異型細胞染色質粗、散在或成團分布，見圖 1。免疫細胞化學染色顯示背景干凈，對比度好，陽性細胞數多，陽性信號定位準確，見圖 2。甲狀腺轉錄因子1 (thyriod transcription factor 1，TTF-1) 和CK7為肺腺癌指標，p63為鱗癌診斷指標，Calretinin、P63為間皮細胞的診斷指標，Syn、CgA、CD56為神經內分泌腫瘤的指標。結合細胞形態及免疫組織化學結果，268例患者診斷為腺癌48例，鱗狀細胞癌45例，神經內分泌腫瘤3例，其他病例172例。因為患者大量胸腔積液，肺部腫瘤巨大或者腫瘤位于特殊部位無法手術。胸腔穿刺，細胞蠟塊的制作，保存了有限的腫瘤細胞，為基因檢測提供了足夠的細胞，提高了惡性腫瘤的陽性檢出率，保證了正確的組織學分型和基因分子檢測的成功率。
圖1
胸腔積液肺癌細胞蠟塊標本成團腺癌細胞，排列成團或者聚集成腺管狀 HE染色 ×400 ? ?圖 2 CK7染色陽性免疫組織化學Envision二步法×400
2.2 標本DNA提取及質量控制
93例NSCLC標本，有17例標本DNA和/或RNA提取純度低而被舍去。細胞學標本提取DNA和/或RNA的滿意率為81.72% （76/93）。76例NSCLC包括39例腺癌和37例鱗狀細胞癌，均被用于基因檢測。同時對這76例患者給予肺部腫瘤穿刺，對穿刺的組織學標本同時進行PCR檢測EGFR、K-ras基因突變及EML4-ALK融合基因。
2.3 EGFR基因突變與患者臨床病理因素的關系
76例NSCLC患者細胞學標本及組織學標本PCR結果均顯示，EGFR基因突變26例，突變率為34.21% （26/76），一致率100%。EGFR基因突變與患者年齡、性別、吸煙及腫瘤組織學類型有關，其差異有統計學意義（P＜0.05），見表 1。
表1
EGFR基因突變和NSCLC患者76例的臨床特征[例（%）]
2.4 K-ras基因突變情況
76例NSCLC患者細胞學標本及組織學標本PCR結果均顯示，K-ras基因突變5例，突變率為6.58% （5/76），一致率100%。K-ras基因突變與患者年齡、性別、吸煙及腫瘤組織學類型有關，其差異有統計學意義（P＜0.05），見表 2。
表2
K-ras基因突變和NSCLC患者76例的臨床特征[例（%）]
2.5 EML4-ALK融合基因情況
76例NSCLC患者細胞學標本及組織學標本PCR結果均顯示，EML4-ALK融合基因6例，陽性率為7.89% （6/76），一致率100%。EML4-ALK融合基因陽性率與患者年齡、性別、吸煙及腫瘤組織學類型有關，其差異有統計學意義(P＜0.05) ，見表 3。
表3
EML4-ALK基因融合和NSCLC患者76例的臨床特征[例(%)]
3 討論
細胞學樣本制作細胞蠟塊技術在國內已經成熟，細胞蠟塊具有細胞集中、可重復制片、背景清楚等特點是常規涂片所不具備的，在常規涂片制作完成后剩余樣本制作細胞蠟塊已經成為共識[8]，本組樣本結果提示細胞蠟塊結合常規涂片及免疫組織化學染色，可使利用制作成功的細胞蠟塊細胞學樣本做出正確的組織學分型的比例接近90%，對NSCLC的進一步成功分型的比例也達85%，與國外的文獻報道接近[9-10]。因此在實際工作中要盡量利用少量寶貴的剩余樣本制作細胞蠟塊，在常規涂片的基礎上，細胞蠟塊結合免疫組織化學染色可以最大限度做出正確的組織學分型。
肺癌細胞學樣本在組織學分型及分子檢測實際工作中主要的問題是樣本本身質量和腫瘤細胞數量的不確定性，我們的經驗是所有細胞學樣本細胞蠟塊制作成功率在70%～90%，必須指出少數樣本雖然細胞蠟塊制作成功，由于腫瘤細胞數量過少仍無法進一步進行免疫組織化學和分子學檢測。實時熒光定量RT-PCR操作簡便、快速，敏感性高，并同時能明確EGFR、ALK及K-ras基因突變的位點，但需要特定的試劑盒和儀器，目前已經有獲得FDA批準用于臨床檢測的RT-PCR商業化試劑盒。
化療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，而臨床上多憑經驗給藥，而公式化治療往往具有盲目性而造成多藥耐藥，不良反應大，療效不佳[11]。目前，基于分子靶點的個體化治療，針對EGFR、K-ras和EML4-ALK融合基因的靶向治療已使NSCLC的治療有了跨時代的進步。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）通過與EGFR結構域中高度保守的ATP結合位點競爭性結合EGFR，阻止酪氨酸殘基磷酸化，從而阻止EGFR信號通路的傳導，最終抑制腫瘤細胞的增生、侵襲、轉移和血管生成，促進腫瘤細胞的凋亡[12]。有研究顯示，EGFR第18～21外顯子和K-ras第12或第13密碼子的突變與EGFR-TKIs的療效有關，且EGFR基因在肺腺癌中的突變率明顯高于其他病理類型的肺癌[13]。因此，準確檢測肺癌患者中EGFR和K-ras基因的突變狀態，有助于篩選出適合EGFR-TKIs治療的人群。
EGFR在我國NSCLC中的突變率明可達40%左右[14]。本研究中，檢測76例NSCLC患者細胞學標本中EGFR及K-ras基因突變，突變率分別為34.21%及6.58%，與文獻報道亞裔肺癌患者組織中K-ras基因突變率（4.7%～13.0%）相符[15]。但有關研究顯示，歐美NSCLC患者組織標本中K-ras突變率為20%～30%，其中腺癌突變率（20%～40%）明顯高于亞裔NSCLC患者，可能與種族相關[16-17]。本研究中，K-ras與EGFR基因突變未發生在同一患者中。有研究表明，K-ras與EGFR基因突變幾乎從不同時發生于同一NSCLC患者中，提示在肺癌的發生中K-ras與EGFR基因突變相互排斥[16]。
人們曾經認為EGFR的突變與EML4-ALK融合基因在同一個病例中是互相排斥的[18]，但近年來隨著EGFR及EML4-ALK檢測的推廣、檢測人群的增加，發現了存在EGFR與ALK雙突變的人群，并且發現這些患者可能會對EGFR-TKI或ALK-TKI有不同程度的療效[19]。對于病理科而言，EGFR與ALK的檢測對指導臨床靶向治療有重要意義。ALK融合基因陽性的晚期NSCLC患者可進行克唑替尼治療[20-21]。
本研究中的76例患者同時進行了PCR檢測了EGFR、K-ras基因突變及AML4-ALK融合基因，其陽性率分別為34.21%、6.58%和7.89%，EGFR與ALK融合基因的臨床特征明顯存在于腺癌、不吸煙、年輕患者的腫瘤樣本中，與文獻相吻合[22-23]。ALK融合基因陽性（簡稱ALK陽性）的NSCLC約占NSCLC的7%，主要出現在不吸煙的肺腺癌患者中，且通常與EGFR基因突變不同時存在于同一患者。不吸煙而EGFR未突變的肺腺癌患者的ALK陽性率可達25%～30%；我國EGFR、K-ras均為野生型的腺癌中ALK陽性率高達30%～42%[24]。
對于晚期肺癌患者無法獲得腫瘤手術組織，利用胸腔積液的脫落細胞制成細胞蠟塊檢測EGFR、ALK及K-ras基因突變可以為更多的患者帶來治療機會。EGFR、K-ras和ALK這三個靶點的發現和相關藥物的發展，使NSCLC的治療進入了基于分子靶點的個體化治療時代。在NSCLC個體化治療的發展中具有里程碑式的意義[25-26]。
晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC） 的治療已進入個體化靶向治療的時代，分子標志物指導下的治療已經成為當今研究的熱點[1-2]。有研究顯示，NSCLC患者表皮生長因子受體（epid-ermal growth factor receptor，EGFR）基因突變在所有相關基因改變中所占比例最大[3-4]，同時因為進行EGFR酪氨酸蛋白激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）治療，推薦每例NSCLC患者進行EGFR基因突變檢測[5]。K-ras及EML4-ALK融合基因是新近發現的NSCLC另一種較為常見的分子亞型。針對K-ras基因突變及EML4-ALK融合基因的靶向抑制劑厄洛替尼及克唑替尼已經廣泛應用于NSCLC臨床治療。目前，EGFR、K-ras和ALK基因突變檢測主要采用手術切除的腫瘤組織標本。但大約75%的NSCLC患者診斷時已為晚期（Ⅲ期或Ⅳ期）[6]，可能無法獲得手術及組織學標本，細胞學標本可能是唯一可以用于病理診斷及檢測基因改變的標本。臨床上NSCLC細胞學標本包括胸腔積液（pleural effusion，PLE）、穿刺細胞學懸液、支氣管肺泡灌洗液、痰液和腦轉移后腦脊液等[7]。因此，探索新的檢測通路勢在必行。本研究中，我們通過對患者行胸腔穿刺方法獲得胸腔積液細胞學標本，探討采用細胞學標本檢測EGFR、K-ras基因突變和EML4-ALK融合基因情況，為NSCLC患者個體化治療提供依據。
1 材料與方法
1.1 一般資料
收集2012年1月至2014年6月淄博市中心醫院住院268例肺癌患者的胸腔積液標本，患者年齡53.6 （31～76） 歲；其中男165例、女103例。
1.2 方法
1.2.1 胸腔積液細胞蠟塊的制備
送檢細胞學樣本常規涂片完成后，取裝胸腔積液容器底部液體20 ml，離心半徑10 cm，2 000 r/min離心5 min。棄去上清液，加雞蛋清1 ml，輕輕振蕩離心管底部的細胞，盡量使細胞成團懸浮于蛋清中，2 000 r/min離心5 min，去除多余雞蛋清，此時只剩下蛋清包裹的細胞沉渣，取出用擦鏡紙包好，4%甲醛溶液固定，隨常規活組織檢查標本脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋、切片、60 ℃烤片備用。
1.2.2 免疫組織化學染色方法
每例樣本的細胞蠟塊切片同時進行CK7、TTF-1、Calretinin、P63、Syn、CgA、CD56、Ki-67等8項免疫組織化學染色，二抗試劑盒為Dako Envision通用多聚物酶標檢測系統。染色采用Lab Vision公司生產的Labvision Autostainer 720型自動免疫組織化學染色，采用Envision法，處理過程與一般的組織學檢查相同。陽性結果的判斷嚴格按照組織學檢測相同的定位、定性要求進行。
1.2.3 EGFR、K-ras及EML4-ALK基因檢測
EGFR和K-ras基因突變檢測試劑盒（熒光PCR法）及EML4-ALK融合基因檢測試劑盒（熒光PCR法），均選用廈門艾德生物醫藥科技有限公司產品。本組中有76例的細胞蠟塊樣本進行EGFR、K-ras基因突變及EML4-ALK融合基因的檢測。按照說明書每份標本分別提取 DNA后用PCR方法檢測EGFR和K-ras基因突變，提取RNA后進行逆轉錄得到cDNA用PCR方法檢測EML4-ALK融合基因。每次實驗中，每份樣本和陽性對照、陰性對照共同進行分析。
1.3 統計學分析
應用SPSS 17.0統計軟件分析，計數資料比較采用四格表χ2檢驗及四格表校正χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 免疫組織化學染色結果及組織學分型
胸腔積液脫落細胞離心沉淀后用雞蛋清凝集成團收集的細胞數量多，經4%甲醛溶液固定后能像組織塊一樣進行脫水、包埋、切片。HE染色顯示細胞數目多，排列結構在切片中比常規胸腔積液細胞學涂片完整，核漿對比清晰、染色鮮艷。可見異型細胞染色質粗、散在或成團分布，見圖 1。免疫細胞化學染色顯示背景干凈，對比度好，陽性細胞數多，陽性信號定位準確，見圖 2。甲狀腺轉錄因子1 (thyriod transcription factor 1，TTF-1) 和CK7為肺腺癌指標，p63為鱗癌診斷指標，Calretinin、P63為間皮細胞的診斷指標，Syn、CgA、CD56為神經內分泌腫瘤的指標。結合細胞形態及免疫組織化學結果，268例患者診斷為腺癌48例，鱗狀細胞癌45例，神經內分泌腫瘤3例，其他病例172例。因為患者大量胸腔積液，肺部腫瘤巨大或者腫瘤位于特殊部位無法手術。胸腔穿刺，細胞蠟塊的制作，保存了有限的腫瘤細胞，為基因檢測提供了足夠的細胞，提高了惡性腫瘤的陽性檢出率，保證了正確的組織學分型和基因分子檢測的成功率。
圖1
胸腔積液肺癌細胞蠟塊標本成團腺癌細胞，排列成團或者聚集成腺管狀 HE染色 ×400 ? ?圖 2 CK7染色陽性免疫組織化學Envision二步法×400
2.2 標本DNA提取及質量控制
93例NSCLC標本，有17例標本DNA和/或RNA提取純度低而被舍去。細胞學標本提取DNA和/或RNA的滿意率為81.72% （76/93）。76例NSCLC包括39例腺癌和37例鱗狀細胞癌，均被用于基因檢測。同時對這76例患者給予肺部腫瘤穿刺，對穿刺的組織學標本同時進行PCR檢測EGFR、K-ras基因突變及EML4-ALK融合基因。
2.3 EGFR基因突變與患者臨床病理因素的關系
76例NSCLC患者細胞學標本及組織學標本PCR結果均顯示，EGFR基因突變26例，突變率為34.21% （26/76），一致率100%。EGFR基因突變與患者年齡、性別、吸煙及腫瘤組織學類型有關，其差異有統計學意義（P＜0.05），見表 1。
表1
EGFR基因突變和NSCLC患者76例的臨床特征[例（%）]
2.4 K-ras基因突變情況
76例NSCLC患者細胞學標本及組織學標本PCR結果均顯示，K-ras基因突變5例，突變率為6.58% （5/76），一致率100%。K-ras基因突變與患者年齡、性別、吸煙及腫瘤組織學類型有關，其差異有統計學意義（P＜0.05），見表 2。
表2
K-ras基因突變和NSCLC患者76例的臨床特征[例（%）]
2.5 EML4-ALK融合基因情況
76例NSCLC患者細胞學標本及組織學標本PCR結果均顯示，EML4-ALK融合基因6例，陽性率為7.89% （6/76），一致率100%。EML4-ALK融合基因陽性率與患者年齡、性別、吸煙及腫瘤組織學類型有關，其差異有統計學意義(P＜0.05) ，見表 3。
表3
EML4-ALK基因融合和NSCLC患者76例的臨床特征[例(%)]
3 討論
細胞學樣本制作細胞蠟塊技術在國內已經成熟，細胞蠟塊具有細胞集中、可重復制片、背景清楚等特點是常規涂片所不具備的，在常規涂片制作完成后剩余樣本制作細胞蠟塊已經成為共識[8]，本組樣本結果提示細胞蠟塊結合常規涂片及免疫組織化學染色，可使利用制作成功的細胞蠟塊細胞學樣本做出正確的組織學分型的比例接近90%，對NSCLC的進一步成功分型的比例也達85%，與國外的文獻報道接近[9-10]。因此在實際工作中要盡量利用少量寶貴的剩余樣本制作細胞蠟塊，在常規涂片的基礎上，細胞蠟塊結合免疫組織化學染色可以最大限度做出正確的組織學分型。
肺癌細胞學樣本在組織學分型及分子檢測實際工作中主要的問題是樣本本身質量和腫瘤細胞數量的不確定性，我們的經驗是所有細胞學樣本細胞蠟塊制作成功率在70%～90%，必須指出少數樣本雖然細胞蠟塊制作成功，由于腫瘤細胞數量過少仍無法進一步進行免疫組織化學和分子學檢測。實時熒光定量RT-PCR操作簡便、快速，敏感性高，并同時能明確EGFR、ALK及K-ras基因突變的位點，但需要特定的試劑盒和儀器，目前已經有獲得FDA批準用于臨床檢測的RT-PCR商業化試劑盒。
化療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，而臨床上多憑經驗給藥，而公式化治療往往具有盲目性而造成多藥耐藥，不良反應大，療效不佳[11]。目前，基于分子靶點的個體化治療，針對EGFR、K-ras和EML4-ALK融合基因的靶向治療已使NSCLC的治療有了跨時代的進步。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）通過與EGFR結構域中高度保守的ATP結合位點競爭性結合EGFR，阻止酪氨酸殘基磷酸化，從而阻止EGFR信號通路的傳導，最終抑制腫瘤細胞的增生、侵襲、轉移和血管生成，促進腫瘤細胞的凋亡[12]。有研究顯示，EGFR第18～21外顯子和K-ras第12或第13密碼子的突變與EGFR-TKIs的療效有關，且EGFR基因在肺腺癌中的突變率明顯高于其他病理類型的肺癌[13]。因此，準確檢測肺癌患者中EGFR和K-ras基因的突變狀態，有助于篩選出適合EGFR-TKIs治療的人群。
EGFR在我國NSCLC中的突變率明可達40%左右[14]。本研究中，檢測76例NSCLC患者細胞學標本中EGFR及K-ras基因突變，突變率分別為34.21%及6.58%，與文獻報道亞裔肺癌患者組織中K-ras基因突變率（4.7%～13.0%）相符[15]。但有關研究顯示，歐美NSCLC患者組織標本中K-ras突變率為20%～30%，其中腺癌突變率（20%～40%）明顯高于亞裔NSCLC患者，可能與種族相關[16-17]。本研究中，K-ras與EGFR基因突變未發生在同一患者中。有研究表明，K-ras與EGFR基因突變幾乎從不同時發生于同一NSCLC患者中，提示在肺癌的發生中K-ras與EGFR基因突變相互排斥[16]。
人們曾經認為EGFR的突變與EML4-ALK融合基因在同一個病例中是互相排斥的[18]，但近年來隨著EGFR及EML4-ALK檢測的推廣、檢測人群的增加，發現了存在EGFR與ALK雙突變的人群，并且發現這些患者可能會對EGFR-TKI或ALK-TKI有不同程度的療效[19]。對于病理科而言，EGFR與ALK的檢測對指導臨床靶向治療有重要意義。ALK融合基因陽性的晚期NSCLC患者可進行克唑替尼治療[20-21]。
本研究中的76例患者同時進行了PCR檢測了EGFR、K-ras基因突變及AML4-ALK融合基因，其陽性率分別為34.21%、6.58%和7.89%，EGFR與ALK融合基因的臨床特征明顯存在于腺癌、不吸煙、年輕患者的腫瘤樣本中，與文獻相吻合[22-23]。ALK融合基因陽性（簡稱ALK陽性）的NSCLC約占NSCLC的7%，主要出現在不吸煙的肺腺癌患者中，且通常與EGFR基因突變不同時存在于同一患者。不吸煙而EGFR未突變的肺腺癌患者的ALK陽性率可達25%～30%；我國EGFR、K-ras均為野生型的腺癌中ALK陽性率高達30%～42%[24]。
對于晚期肺癌患者無法獲得腫瘤手術組織，利用胸腔積液的脫落細胞制成細胞蠟塊檢測EGFR、ALK及K-ras基因突變可以為更多的患者帶來治療機會。EGFR、K-ras和ALK這三個靶點的發現和相關藥物的發展，使NSCLC的治療進入了基于分子靶點的個體化治療時代。在NSCLC個體化治療的發展中具有里程碑式的意義[25-26]。
