工程化心肌補片（engineered heart tissues， EHTs）因其理論上具備的諸多優勢現已成為自體心肌修補、再生的希望所在。但就臨床應用而言，該材料尚有許多現實困難有待克服。本文將從種子細胞、支架材料的選擇，到移植物再血管化和EHTs構建策略等方面綜述EHTs的研究進展，以期適合臨床應用的EHTs早日出現。
引用本文： 陳克功, 謝寶棟, 康凱, 蔣樹林. 工程化心肌補片——距走入臨床還有多遠. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(6): 591-595. doi: 10.7507/1007-4848.20150149 復制
工程化心肌補片（EHTs）是指根據工程學原理，將具有形成心肌細胞能力的種子細胞與適宜的支架材料復合，構建出可用于移植，修復或替代自體心肌的生物材料。目前，盡管EHTs的理論研究已獲得飛速發展，但現實的臨床應用仍面臨諸多挑戰，本文將從種子細胞的選擇，支架材料的構建，移植物再血管化的實現以及移植物構建策略等方面綜述其最新進展。
1 種子細胞的選擇
理想的種子細胞，應該具備易獲得、能擴增、沒有免疫原性和能分化為成熟有功能的心肌細胞能力等特點。理論上，天然心肌細胞的生理特性使得它們具備了作為種子細胞的先天條件。Li[1]，Leor等[2]早期構建的EHTs也多是采用心肌細胞作為種子細胞。不過，成年個體的心肌細胞屬于已分化的成體細胞，只有很弱的再生能力且不易獲得，而異源心肌細胞移植則勢必激起宿主的免疫排斥反應。因此，從臨床角度看，上述實驗只屬于“概念驗證”性研究，其本身并無實用價值。
另一類曾經引起廣泛關注的種子細胞是骨骼成肌細胞。相較于心肌細胞，前者具有易獲得、易擴增，不存在倫理學問題等優點。1995年，Chiu等[3]最先從狗骨骼肌中分離出了成肌細胞，將其標記并移植到自體心肌受損部位。此后，Taylor等[4]在兔子心臟進行類似實驗并獲得了心功能的改善。不過，其他學者的一些研究也證實，骨骼成肌細胞并不能與自體心肌組織形成有效的縫隙連接[5]，骨骼成肌細胞移植本身還有致心律失常的可能[6-7]，因此這一細胞也不是理想的種子細胞。
正常的心肌組織除了分化成熟的心肌細胞外，還存在著諸如成纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞和巨噬細胞等在內的其他多種細胞，它們對心肌細胞的存活和功能發揮也起著重要作用。這提示我們在種子細胞的選擇上，采用有多能向分化潛能的干細胞可能是一種更好的選擇。
迄今為止，胚胎干細胞（ESCs）仍被視為心肌再生醫學中最有前景的種子細胞來源[8]。ESCs具有強大的增殖和多能向分化能力，自然發生的ESCs可分化成包括心肌細胞在內的三個胚層中幾乎所有的細胞類型[9]，這對構建本身就是由多種細胞構成的心肌組織是一個巨大優勢。ESCs的主要問題在于其異源性和潛在的致瘤性，如何定向誘導向心肌細胞分化的機制也尚未完全闡明。
骨髓來源的基質干細胞（BM-MSCs）和脂肪組織來源的基質干細胞（AD-MSCs）是目前研究最廣泛的兩種成體干細胞。它們的優點包括自體來源，獲得方便，可體外擴增，無倫理學顧慮等。在一種名為5-雜氮胞苷（5-Aza）藥物的誘導下，BM-MSCs [10-11]及AD-MSCs[12]均能被誘導為自發跳動的心肌樣細胞，此外，后者還有不受衰老影響[13]，可分化為內皮細胞等優勢[14]。兩者共同的問題是在體定向分化的條件尚不清楚，目前趨于一致的看法是移植后存留細胞的旁分泌效應是心臟功能有所改善最可能的原因[15]。
另一類大有希望的種子細胞是心臟干細胞（CSCs）。長久以來，人們一直認為成年心臟不具有心肌再生的能力，直到2003年，Beltrami等[16]在成年大鼠的心臟內發現了一類內源性心臟干細胞。這類細胞具有干細胞的特性：自我更新、克隆性和多能分化的能力，在分化培養液內可以分化為心肌細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞。隨后，Ellison等[17]也在成年人體內證實了這類干細胞的存在。近期的研究顯示[18]，將CSCs植入梗死的心肌區域，能促進新的心肌細胞形成并改善左心室的收縮功能。作為種子細胞，CSCs最大的優勢在于可明確分化為心肌細胞和血管細胞，這是其它成體干細胞所不具備的。當然，至今CSCs移植仍處于動物實驗階段，長期預后和安全性如何尚未報道，其臨床應用的安全性和有效性還有待繼續探索。
誘導多能干細胞（iPSCs）是利用逆轉錄技術將4種特殊基因導入到成人成纖維細胞內，從而得到一種具有類似ESCs特性的多能干細胞。因其為自體來源，故克服了ESCs的免疫原性和倫理顧慮等缺陷，故成為一種極具前景的種子細胞。目前，國外已有學者利用iPSCs誘導出的心肌細胞作為EHTs研究中種子細胞的嘗試[19]，這也使其成為迄今為止最具前途的種子細胞。
2 支架材料的選擇
從材料學的觀點看，構建EHTs的支架除要符合一般組織工程器官對材料性能的要求外，心臟組織自身的特性也對其提出了特殊的要求。心肌組織對乏氧敏感，終生搏動，心肌纖維排列復雜，具有特殊的空間構像，這些特性決定了用來構建EHTs的材料必須要有良好的通透性，完美的機械性能和特殊的三維結構等特性[20]。雖然迄今為止，多種天然材料及人工合成材料都曾用來構建EHTs （表 1），但還沒有哪種材料完全符合上述要求。總的來說，天然材料特別是細胞外基質材料多具有組織相容性好，降解產物炎性反應輕，空間構型滿意等優點；人工材料的優勢在于其機械性能，空間構像及降解速度的可控性，可批量生產。因此，采用所謂的“Hybrid技術”，將天然材料與人工材料進行整合，并加以生長因子的修飾，建立具有“聰明表面”的支架材料是目前EHTs研究中的一個新方向[21]。
表1
目前常用于組織工程心肌研究的材料
此外，隨著研究的不斷深入，一些全新的理念，如“無支架”或“全器官”EHTs也不斷涌現。前者是將心肌細胞種植于一種溫度敏感型材料上，通過調整環境溫度制作一種細胞片層，然后，將各個細胞片層用連接蛋白-43連接起來，就可獲得一種產生一致性收縮的EHTs。這一材料的優點是可以根據需要將不同種類的細胞堆積起來，構建類器官培養物。目前，利用這一技術構建的EHTs在小鼠[22]、恒河猴[23]甚至人體[24]都取得了較好的效果。后者則是通過灌注特殊的去垢劑將尸心上的細胞成分完全去除而保留其全部的細胞外成分，這一方法目前已在小鼠[25]，大鼠[26]、豬[27]以及人體[28]心臟上獲得了成功。上述方法的共同優點是避免了外源性的應用支架材料，從而避免了免疫原性和病原性的風險。
3 移植物的再血管化研究
實現移植材料的快速血管化是EHTs研究中的另一個核心問題。心肌組織是人體內代謝率和耗氧率最高的組織，也是人體內毛細血管密度最高的組織[29]。Radisic等[30]研究顯示，如果沒有內生毛細血管網而僅依賴局部彌散的話，能保證移植細胞生存的EHTs的最大厚度僅為150～200 μm。很顯然，這一厚度的EHTs難以滿足臨床需要。為促進移植材料的快速血管化，多種研究策略曾為學者所采用。
早期經典的辦法是采用所謂的“細胞分層種植技術”。如Iyer等[31]就證明，在聚乙二醇（PEG）補片上預先種植以成纖維細胞和內皮細胞，再種植心肌細胞會較同時接種三種細胞產生更好的血管生成效果。Shimizu等[32]采用細胞片層疊加技術，利用所謂的“三明治”法，在兩層心肌細胞片層間加入內皮細胞片層也實現了更好的再血管化效果。
此外，在心臟修補前，先將EHTs植入體內血運豐富的部位進行“預血管化”處理也是一種策略。如Zhang等就曾利用血運豐富的大網膜覆蓋移植材料[33]或直接用腹膜作EHTs的支架[34]以改善移植細胞的血液供應；Morritt等[35]則利用植入于大鼠腹股溝皮下的一種股動靜脈瘺模型構建出了迄今為止體積最大（直徑2 mm）的EHTs。
促移植物再血管化的另一大策略是將各種促血管生長因子整合進移植材料內，以實現生長因子的局部、持續、緩慢釋放。例如Steffens等[36]及Lee等[37]的團隊就分別采取不同技術將血管內皮細胞生長因子（VEGF）結合于肝素化的膠原基質或巖藻酸凝膠上，在體實驗都取得較好的促血管形成的效果。Gao等[38]和Chiu等[39]的研究團隊則分別利用“焊接蛋白”——偶聯有膠原結合區的VEGF（CBD-VEGF）或“碳化二亞胺法”（EDC法）實現了將VEGF共價結合于膠原海綿的目的并取得了改善移植物再血管化的效果。
雖然，不同研究策略都顯示出了不同程度的改進，但迄今為止，人們所構建出的EHTs的最大厚度仍不超過2 mm[35]。因此，繼續尋找新的促血管化方法和移植策略仍是構建有臨床應用價值的EHTs的核心問題。
4 EHTs構建方式的探索
傳統的體外靜態培養不能逼真模擬心肌組織的生成環境，構建的EHTs從結構到功能都與自體心肌相去甚遠。這些問題催生出了一系列新的EHTs構建方法的建立。
首先是各種生物細胞反應器的構建。人們很早就注意到了體外構建動態的培養環境對改善種子細胞生存的意義[40]。實驗顯示，在這樣的條件下培養的細胞比一般二維培養的單層心肌細胞在功能上更接近于正常的心肌組織[41]。動態血流提高了氧氣和營養物質的供給效率[42]，持續的機械刺激更提供了新生細胞發育成熟所必須的生長要素，改善了種子細胞在支架內的空間分布和對支架組織的粘附能力 [43]，這些都為提高EHTs在體移植前的活性提供了有力的保證。當然，鑒于心肌組織天然的電-機械偶聯的特性，在EHTs的構建過程中加入適當頻率的電流刺激同樣可以改善種子細胞的空間分布，加速生物電流的傳導速度，乃至改善與心肌收縮密切相關的鈣離子的跨膜轉運[44]。目前，如何將機械刺激與電刺激整合進同一系統是第二代生物細胞反應器所要解決的問題[45-46]。
此外，目前的研究已證實自體心肌組織特殊的拓撲空間構型對于其機械收縮和電生理性能都具有重要的意義。自體心肌組織具有極為復雜的微觀和宏觀構型，這要求我們在EHTs構建過程中就要注意對這一結構進行模擬。例如，Terracio等[47]早在1988年就發現適宜的機械拉伸對心肌細胞的分化和排列具有良好的作用；隨后，高強度的磁場[48]，顯微光刻技術[49]都曾被用來改善EHTs中細胞的排列。通過不同種類細胞片層的疊加，Shimizu等[32]構建出了迄今收縮壓最大的心肌組織以及多種類器官組織培養物。而利用“離心卷軸”技術[50]，“納米水平的凝膠鑄型”技術[51]以及細胞外基質沖壓技術[52]都構建出了可誘導心肌細胞極性分布的支架材料。而近年發展起來“器官打印”技術更是實現的體外EHTs構建的快速、簡便和結構優化。這是一種利用計算機技術輔助，根據仿生學原理，精確地將不同種類的細胞或細胞集合體分層沉積到特制的組織材料上，進而構建出高度仿生三維心肌組織塊[53]的技術。但是，該技術目前還停留在二維水平EHTs的構建上，距真正心肌組織的三維重建仍有很長的一段路要走。
組織工程研究的最終目的是建立起與病損組織或器官完全相同的構件從而實現其結構和功能的完全替代。從這一角度講，目前EHTs的研究距離真正的實現心肌的完全再生仍相距甚遠。在未來的研究中，我們仍需綜合利用細胞生物學，材料工程學，分子生物學，仿生學乃至計算機科學等領域的相關知識去克服目前研究中的各項“瓶頸”問題，為EHTs真正走入臨床，造福人類貢獻力量。
工程化心肌補片（EHTs）是指根據工程學原理，將具有形成心肌細胞能力的種子細胞與適宜的支架材料復合，構建出可用于移植，修復或替代自體心肌的生物材料。目前，盡管EHTs的理論研究已獲得飛速發展，但現實的臨床應用仍面臨諸多挑戰，本文將從種子細胞的選擇，支架材料的構建，移植物再血管化的實現以及移植物構建策略等方面綜述其最新進展。
1 種子細胞的選擇
理想的種子細胞，應該具備易獲得、能擴增、沒有免疫原性和能分化為成熟有功能的心肌細胞能力等特點。理論上，天然心肌細胞的生理特性使得它們具備了作為種子細胞的先天條件。Li[1]，Leor等[2]早期構建的EHTs也多是采用心肌細胞作為種子細胞。不過，成年個體的心肌細胞屬于已分化的成體細胞，只有很弱的再生能力且不易獲得，而異源心肌細胞移植則勢必激起宿主的免疫排斥反應。因此，從臨床角度看，上述實驗只屬于“概念驗證”性研究，其本身并無實用價值。
另一類曾經引起廣泛關注的種子細胞是骨骼成肌細胞。相較于心肌細胞，前者具有易獲得、易擴增，不存在倫理學問題等優點。1995年，Chiu等[3]最先從狗骨骼肌中分離出了成肌細胞，將其標記并移植到自體心肌受損部位。此后，Taylor等[4]在兔子心臟進行類似實驗并獲得了心功能的改善。不過，其他學者的一些研究也證實，骨骼成肌細胞并不能與自體心肌組織形成有效的縫隙連接[5]，骨骼成肌細胞移植本身還有致心律失常的可能[6-7]，因此這一細胞也不是理想的種子細胞。
正常的心肌組織除了分化成熟的心肌細胞外，還存在著諸如成纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞和巨噬細胞等在內的其他多種細胞，它們對心肌細胞的存活和功能發揮也起著重要作用。這提示我們在種子細胞的選擇上，采用有多能向分化潛能的干細胞可能是一種更好的選擇。
迄今為止，胚胎干細胞（ESCs）仍被視為心肌再生醫學中最有前景的種子細胞來源[8]。ESCs具有強大的增殖和多能向分化能力，自然發生的ESCs可分化成包括心肌細胞在內的三個胚層中幾乎所有的細胞類型[9]，這對構建本身就是由多種細胞構成的心肌組織是一個巨大優勢。ESCs的主要問題在于其異源性和潛在的致瘤性，如何定向誘導向心肌細胞分化的機制也尚未完全闡明。
骨髓來源的基質干細胞（BM-MSCs）和脂肪組織來源的基質干細胞（AD-MSCs）是目前研究最廣泛的兩種成體干細胞。它們的優點包括自體來源，獲得方便，可體外擴增，無倫理學顧慮等。在一種名為5-雜氮胞苷（5-Aza）藥物的誘導下，BM-MSCs [10-11]及AD-MSCs[12]均能被誘導為自發跳動的心肌樣細胞，此外，后者還有不受衰老影響[13]，可分化為內皮細胞等優勢[14]。兩者共同的問題是在體定向分化的條件尚不清楚，目前趨于一致的看法是移植后存留細胞的旁分泌效應是心臟功能有所改善最可能的原因[15]。
另一類大有希望的種子細胞是心臟干細胞（CSCs）。長久以來，人們一直認為成年心臟不具有心肌再生的能力，直到2003年，Beltrami等[16]在成年大鼠的心臟內發現了一類內源性心臟干細胞。這類細胞具有干細胞的特性：自我更新、克隆性和多能分化的能力，在分化培養液內可以分化為心肌細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞。隨后，Ellison等[17]也在成年人體內證實了這類干細胞的存在。近期的研究顯示[18]，將CSCs植入梗死的心肌區域，能促進新的心肌細胞形成并改善左心室的收縮功能。作為種子細胞，CSCs最大的優勢在于可明確分化為心肌細胞和血管細胞，這是其它成體干細胞所不具備的。當然，至今CSCs移植仍處于動物實驗階段，長期預后和安全性如何尚未報道，其臨床應用的安全性和有效性還有待繼續探索。
誘導多能干細胞（iPSCs）是利用逆轉錄技術將4種特殊基因導入到成人成纖維細胞內，從而得到一種具有類似ESCs特性的多能干細胞。因其為自體來源，故克服了ESCs的免疫原性和倫理顧慮等缺陷，故成為一種極具前景的種子細胞。目前，國外已有學者利用iPSCs誘導出的心肌細胞作為EHTs研究中種子細胞的嘗試[19]，這也使其成為迄今為止最具前途的種子細胞。
2 支架材料的選擇
從材料學的觀點看，構建EHTs的支架除要符合一般組織工程器官對材料性能的要求外，心臟組織自身的特性也對其提出了特殊的要求。心肌組織對乏氧敏感，終生搏動，心肌纖維排列復雜，具有特殊的空間構像，這些特性決定了用來構建EHTs的材料必須要有良好的通透性，完美的機械性能和特殊的三維結構等特性[20]。雖然迄今為止，多種天然材料及人工合成材料都曾用來構建EHTs （表 1），但還沒有哪種材料完全符合上述要求。總的來說，天然材料特別是細胞外基質材料多具有組織相容性好，降解產物炎性反應輕，空間構型滿意等優點；人工材料的優勢在于其機械性能，空間構像及降解速度的可控性，可批量生產。因此，采用所謂的“Hybrid技術”，將天然材料與人工材料進行整合，并加以生長因子的修飾，建立具有“聰明表面”的支架材料是目前EHTs研究中的一個新方向[21]。
表1
目前常用于組織工程心肌研究的材料
此外，隨著研究的不斷深入，一些全新的理念，如“無支架”或“全器官”EHTs也不斷涌現。前者是將心肌細胞種植于一種溫度敏感型材料上，通過調整環境溫度制作一種細胞片層，然后，將各個細胞片層用連接蛋白-43連接起來，就可獲得一種產生一致性收縮的EHTs。這一材料的優點是可以根據需要將不同種類的細胞堆積起來，構建類器官培養物。目前，利用這一技術構建的EHTs在小鼠[22]、恒河猴[23]甚至人體[24]都取得了較好的效果。后者則是通過灌注特殊的去垢劑將尸心上的細胞成分完全去除而保留其全部的細胞外成分，這一方法目前已在小鼠[25]，大鼠[26]、豬[27]以及人體[28]心臟上獲得了成功。上述方法的共同優點是避免了外源性的應用支架材料，從而避免了免疫原性和病原性的風險。
3 移植物的再血管化研究
實現移植材料的快速血管化是EHTs研究中的另一個核心問題。心肌組織是人體內代謝率和耗氧率最高的組織，也是人體內毛細血管密度最高的組織[29]。Radisic等[30]研究顯示，如果沒有內生毛細血管網而僅依賴局部彌散的話，能保證移植細胞生存的EHTs的最大厚度僅為150～200 μm。很顯然，這一厚度的EHTs難以滿足臨床需要。為促進移植材料的快速血管化，多種研究策略曾為學者所采用。
早期經典的辦法是采用所謂的“細胞分層種植技術”。如Iyer等[31]就證明，在聚乙二醇（PEG）補片上預先種植以成纖維細胞和內皮細胞，再種植心肌細胞會較同時接種三種細胞產生更好的血管生成效果。Shimizu等[32]采用細胞片層疊加技術，利用所謂的“三明治”法，在兩層心肌細胞片層間加入內皮細胞片層也實現了更好的再血管化效果。
此外，在心臟修補前，先將EHTs植入體內血運豐富的部位進行“預血管化”處理也是一種策略。如Zhang等就曾利用血運豐富的大網膜覆蓋移植材料[33]或直接用腹膜作EHTs的支架[34]以改善移植細胞的血液供應；Morritt等[35]則利用植入于大鼠腹股溝皮下的一種股動靜脈瘺模型構建出了迄今為止體積最大（直徑2 mm）的EHTs。
促移植物再血管化的另一大策略是將各種促血管生長因子整合進移植材料內，以實現生長因子的局部、持續、緩慢釋放。例如Steffens等[36]及Lee等[37]的團隊就分別采取不同技術將血管內皮細胞生長因子（VEGF）結合于肝素化的膠原基質或巖藻酸凝膠上，在體實驗都取得較好的促血管形成的效果。Gao等[38]和Chiu等[39]的研究團隊則分別利用“焊接蛋白”——偶聯有膠原結合區的VEGF（CBD-VEGF）或“碳化二亞胺法”（EDC法）實現了將VEGF共價結合于膠原海綿的目的并取得了改善移植物再血管化的效果。
雖然，不同研究策略都顯示出了不同程度的改進，但迄今為止，人們所構建出的EHTs的最大厚度仍不超過2 mm[35]。因此，繼續尋找新的促血管化方法和移植策略仍是構建有臨床應用價值的EHTs的核心問題。
4 EHTs構建方式的探索
傳統的體外靜態培養不能逼真模擬心肌組織的生成環境，構建的EHTs從結構到功能都與自體心肌相去甚遠。這些問題催生出了一系列新的EHTs構建方法的建立。
首先是各種生物細胞反應器的構建。人們很早就注意到了體外構建動態的培養環境對改善種子細胞生存的意義[40]。實驗顯示，在這樣的條件下培養的細胞比一般二維培養的單層心肌細胞在功能上更接近于正常的心肌組織[41]。動態血流提高了氧氣和營養物質的供給效率[42]，持續的機械刺激更提供了新生細胞發育成熟所必須的生長要素，改善了種子細胞在支架內的空間分布和對支架組織的粘附能力 [43]，這些都為提高EHTs在體移植前的活性提供了有力的保證。當然，鑒于心肌組織天然的電-機械偶聯的特性，在EHTs的構建過程中加入適當頻率的電流刺激同樣可以改善種子細胞的空間分布，加速生物電流的傳導速度，乃至改善與心肌收縮密切相關的鈣離子的跨膜轉運[44]。目前，如何將機械刺激與電刺激整合進同一系統是第二代生物細胞反應器所要解決的問題[45-46]。
此外，目前的研究已證實自體心肌組織特殊的拓撲空間構型對于其機械收縮和電生理性能都具有重要的意義。自體心肌組織具有極為復雜的微觀和宏觀構型，這要求我們在EHTs構建過程中就要注意對這一結構進行模擬。例如，Terracio等[47]早在1988年就發現適宜的機械拉伸對心肌細胞的分化和排列具有良好的作用；隨后，高強度的磁場[48]，顯微光刻技術[49]都曾被用來改善EHTs中細胞的排列。通過不同種類細胞片層的疊加，Shimizu等[32]構建出了迄今收縮壓最大的心肌組織以及多種類器官組織培養物。而利用“離心卷軸”技術[50]，“納米水平的凝膠鑄型”技術[51]以及細胞外基質沖壓技術[52]都構建出了可誘導心肌細胞極性分布的支架材料。而近年發展起來“器官打印”技術更是實現的體外EHTs構建的快速、簡便和結構優化。這是一種利用計算機技術輔助，根據仿生學原理，精確地將不同種類的細胞或細胞集合體分層沉積到特制的組織材料上，進而構建出高度仿生三維心肌組織塊[53]的技術。但是，該技術目前還停留在二維水平EHTs的構建上，距真正心肌組織的三維重建仍有很長的一段路要走。
組織工程研究的最終目的是建立起與病損組織或器官完全相同的構件從而實現其結構和功能的完全替代。從這一角度講，目前EHTs的研究距離真正的實現心肌的完全再生仍相距甚遠。在未來的研究中，我們仍需綜合利用細胞生物學，材料工程學，分子生物學，仿生學乃至計算機科學等領域的相關知識去克服目前研究中的各項“瓶頸”問題，為EHTs真正走入臨床，造福人類貢獻力量。
