組織工程氣管移植成功已有報道，脫細胞氣管支架的制備技術基本成熟，氣管移植過程中上皮、軟骨及血管再生問題就顯得尤為重要。隨著各種獲取和培養細胞的方法及促細胞生長分化的因子研究日趨成熟，使用組織工程技術實現氣管的上皮、軟骨及血管再生成為可能，解決氣管的上皮、軟骨及血管再生具有重要的臨床價值。本文就組織工程氣管移植過程中上皮、軟骨及血管再生情況及未來前景進行綜述。
引用本文： 張思泉, 仲崇浩, 史宏燦. 組織工程氣管再生的研究進展. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2015, 22(3): 257-260. doi: 10.7507/1007-4848.20150069 復制
2008年6月，世界上第一例組織工程氣管被成功移植到一例30歲的女性患者身上，術后隨訪5年，患者在未使用免疫抑制劑的情況下生活良好[1-2]。隨后又有一例12歲兒童氣管移植的報道，患兒術后2年氣道功能恢復并已回到學校上學[3]。以上兩例成功移植的案例為組織工程氣管移植展現了良好的前景。組織工程氣管涉及細胞獲取和培養、支架制備、生物反應器及藥物支持等問題。體外生物反應器存在操作復雜、耗時較長、成本較高等缺點[4]。原位氣管移植大大降低了制備組織工程氣管的成本及周期。在現存多種氣管支架的制備方法中，去污劑聯合酶法制備的脫細胞支架因其在組織相容性及保留細胞基質方面具有獨特的優越性，成為了最具前景的支架制備方法[5]。而上皮再生問題、軟骨再生問題及血管再生問題有待進一步研究與解決。本文主要就怎樣更好地促進血管再生，軟骨細胞、上皮細胞的最佳來源以及細胞獲取和培養方式進行綜述。
1 軟骨細胞再生
軟骨包括彈性軟骨、透明軟骨和纖維軟骨，不同來源的軟骨細胞具有不同的結構和生化性質。彈性軟骨存在于耳、會厭，透明軟骨存在于關節、鼻中隔、氣管、肋軟骨和喉軟骨，纖維軟骨存在于椎間盤、肌腱和韌帶中[6]。研究證明，軟骨細胞在維持組織工程氣管的機械性能、預防組織工程氣管支架塌陷方面具有重要作用[7-8]。
1.1 軟骨細胞的來源
軟骨細胞來源的主要問題是如何采取最簡單、安全、微創的方法獲得細胞，并且獲得的細胞能夠很好地在體外進行培養。耳、鼻中隔、氣管和肋軟骨是軟骨細胞的主要來源。耳軟骨細胞與原生氣管軟骨生物學性能相近，且獲取簡單、安全、微創，然而因其不能提供理想的力學特性，存在可能導致氣管內毛發生長和油脂產生等長期潛在并發癥[9]，所以耳軟骨并非首選。肋軟骨細胞具有和氣管軟骨細胞類似的生物活性和代謝活動[10]。然而，實際操作過程中，獲取這些軟骨細胞存在需要侵襲性活檢和局部或全身麻醉的缺點。研究發現骨髓間充質干細胞（MSC）可以分化成軟骨細胞[7]，這一發現解決了上述問題，MSC成為具有前景的軟骨細胞來源。
1.2 軟骨細胞的培養
眾所周知，體外培養軟骨細胞在經過幾個傳代培養后，細胞表型會發生改變。目前還沒有培養高質量軟骨細胞的統一標準。因此，培養高質量的軟骨細胞仍然是一大挑戰。軟骨形成是由幾個相關因子共同促進的，例如轉化生長因子β（TGF-β）、纖維母細胞生長因子（FGF）和胰島素樣生長因子（IGF）。TGF-β已被證明是最有效的促進軟骨細胞分化的生長因子[11]，其對軟骨細胞的分化形成起著重要作用，但是它的不同亞型所起的作用并不完全相同[12]。FGF和IGF家族可以通過調節細胞凋亡、增殖、分化等多種機制來影響軟骨細胞的分化。研究證明可以聯合多種生長因子共同作用，促進軟骨細胞的分化成熟。
1.3 軟骨細胞的再生
各種來源的軟骨細胞經體外培養種植于氣管支架的外表面可以使軟骨細胞再生，直接在氣管支架外表面種植MSC也可以分化成軟骨細胞[7]。使用MSC的優點：可以在局部麻醉下獲取細胞，避免了全身麻醉的風險；可以在體外擴增到相當大的數量，同時保持分化能力[11-13]。由于這些原因，自體MSC已經成為新的解決軟骨再生的替代來源。研究[3]發現可以使用TGF-β來提高自身MSC的募集，這為MSC的應用提供了更為廣闊的前景。
2 上皮細胞再生
氣管與吸入的空氣直接接觸，污染和感染風險相當高，在避免這些不良反應的過程中，上皮細胞發揮著關鍵作用[4]。研究表明[14-15]，一個內表面缺乏上皮細胞的氣管很容易遭受創傷，隨后氣管會變得狹窄。事實上，氣管上皮細胞具有許多功能，包括控制肺部液體平衡、吸附和活化炎癥細胞、代謝和清除吸入顆粒、調節氣管平滑肌功能。
2.1 上皮細胞的來源
上皮細胞可以從鼻或氣管黏膜上獲取[16]。鼻腔上皮細胞增殖快，比支氣管上皮細胞更易凋亡[17]。因此，支氣管上皮細胞可能更適宜氣管移植。最近有研究者[8, 18]利用MSC培養分化成上皮細胞，這為上皮細胞的來源又提供了新的可能。在提前給患者使用了粒細胞集落刺激因子后采集患者的外周血，然后從外周血中提取單核細胞，直接將單核細胞種植在組織工程氣管的內表面，成功分化成了上皮細胞。
2.2 上皮細胞的培養
從鼻、氣管或支氣管黏膜上獲取上皮細胞后，采用Rees等[19]的方法，使用特定的無血清培養基，加入牛垂體提取物和上皮生長因子，獲得上皮細胞，并已成功運用到脫細胞氣管支架移植的再上皮化過程中[20-21]。然而，長時間的體外培養會損害細胞的免疫原性以及細胞的質量。長期體外培養會使細胞迅速喪失原本的防御功能。研究[22]表明，在培養上皮細胞的過程中會使上皮細胞上的通道數量增加。傳代4次以上會使上皮細胞失去分泌粘蛋白的能力。通道數量增加會使纖毛細胞數量迅速下降。
2.3 上皮細胞的再生
組織工程氣管上皮的再生十分困難，如果沒有上皮再生，氣管就會發生阻塞從而導致移植失敗。由于氣管解剖結構和功能的特殊性，研究人員開始認識到氣管再上皮化在組織工程中的重要作用[23]。Weidenbecher等[24]使用肌肉皮瓣重建組織工程氣管的血供，可以使呼吸道黏膜快速從自身健康氣管遷移到脫細胞支架上。細胞角蛋白5和8染色陽性表明氣管移植再上皮化成功[4]。使用受體的頰黏膜做為上皮細胞來源，種植在脫細胞支架的內表面后發現氣管內表面有鱗狀上皮存在[25]。雖然證明了氣管內表面有上皮細胞存在，但目前還不清楚這些上皮細胞是來自種植的細胞還是從鄰近健康的呼吸道遷移過來的細胞[26]。但種植了上皮細胞的組織工程氣管為長段氣管狹窄的治療帶來了希望[24]。
3 血管再生
組織工程氣管失敗的常見原因是植入物的壞死或感染，這是因為缺乏有效的血管再生以致于受損細胞未能得到及時有效的修復，即使很少的壞死組織最終也會導致移植的失敗[27]。因此組織工程氣管移植過程中一個很重要的問題就是血管再生，能否快速生成血管是移植成功的關鍵[7]。
3.1 血管再生的方法
組織工程氣管移植的潛在問題之一是移植物的血液供應問題。因為直徑 > 1 mm的組織僅靠周圍組織液擴散來維持營養和氧氣供應是不夠的，如果沒有血管再生，移植物可能發生壞死。血管再生包括直接血管再生和間接血管再生。間接血管再生是將移植物放在患者前臂筋膜中4個月，促進血管再生，然后再原位移植[25]。直接血管再生包括使用網膜包裹以及帶有皮瓣的移植等[28]，另外在組織工程氣管種植內皮細胞和其他細胞之前整合一定的促進血管生成的生長因子。
3.2 血管再生因子
在組織工程中用血管生長因子來誘導新生血管的方法很受歡迎，然而重組的血管內皮生長因子（VEGF）或基本成纖維細胞生長因子（b-FGF）的分子結構不穩定以及遠期效果不確定，使其在組織工程領域的使用受到一定限制[26]。研究發現脫細胞支架可以促進血管再生，免疫組織化學顯示脫細胞支架上仍然存在重要的血管再生因子b-FGF和TGF-β[29]，脫細胞組織工程氣管移植4 d后，在氣管壁上檢測到了微血管的生長，移植1個月后氣管壁黏膜活檢發現有出血，證實有完整的血管再生[17]。因此，我們認為脫細胞并沒有去除所有促血管再生因子[7]。脫細胞支架上的血管再生因子可以促進血管的再生，從而表明了保留氣管基質的重要性[30]。然而，為了保證組織工程氣管血管再生的成功，通常還需額外添加生長因子，如b-FGF和TGF-β。
3.3 血管再生的監測
組織工程氣管移植后，活檢氣管內壁黏膜，如果發生出血，則證明血管再生成功[7, 17]。然而在體外實驗的過程中，這一方法并不適用。這時，可以采用雞胚絨毛尿囊膜（CAM）測定的方法來評價組織工程氣管血管再生的能力[27]，方法為：白來航雞受精雞蛋在37℃、恒定濕度下孵化至第3 d，正方形開窗打開殼分離尿囊膜，用注射器抽取2～3 ml白蛋白以形成假性氣室，然后用玻璃密封，繼續孵化；孵化至第8 d，在假氣室內種植氣管，然后繼續孵化；每天觀察血管生長情況直到第12 d，評估血管向氣管縱向再生情況，用以表示組織工程氣管的血管再生能力。
4 小結
脫細胞支架保留了促進血管再生的生長因子，在組織工程氣管移植過程中，添加促血管再生因子b-FGF和TGF-β有利于血管再生。骨髓間充質干細胞在軟骨再生方面比其他來源的細胞表現更佳，獲取簡單，創傷較小，體外培養相對簡單。在移植前、移植后以及軟骨細胞培養過程中使用TGF-β對軟骨細胞再生起著重要的促進作用，另外添加一些生長因子也對軟骨的再生有促進作用，但具體如何添加還沒有統一的認識。骨髓間充質干細胞也可以分化成上皮細胞，這為上皮細胞的來源又提供了一種新的可能，但上皮細胞在體外培養過程中很容易改變原來的細胞學特性，為避免這種情況的發生，有研究者利用外周血單核細胞直接種植在氣管內表面，獲得了成功。另外使用促紅細胞生成素（EPO）等生長因子可以通過抑制細胞凋亡來促進傷口愈合及血管再生，有研究表明巨噬細胞在氣管移植后傷口愈合過程中也起著重要的作用。在組織工程氣管方面我們的認識還很局限，氣管再生的機制、細胞遷移的途徑等問題尚不清楚，還需進一步研究。
2008年6月，世界上第一例組織工程氣管被成功移植到一例30歲的女性患者身上，術后隨訪5年，患者在未使用免疫抑制劑的情況下生活良好[1-2]。隨后又有一例12歲兒童氣管移植的報道，患兒術后2年氣道功能恢復并已回到學校上學[3]。以上兩例成功移植的案例為組織工程氣管移植展現了良好的前景。組織工程氣管涉及細胞獲取和培養、支架制備、生物反應器及藥物支持等問題。體外生物反應器存在操作復雜、耗時較長、成本較高等缺點[4]。原位氣管移植大大降低了制備組織工程氣管的成本及周期。在現存多種氣管支架的制備方法中，去污劑聯合酶法制備的脫細胞支架因其在組織相容性及保留細胞基質方面具有獨特的優越性，成為了最具前景的支架制備方法[5]。而上皮再生問題、軟骨再生問題及血管再生問題有待進一步研究與解決。本文主要就怎樣更好地促進血管再生，軟骨細胞、上皮細胞的最佳來源以及細胞獲取和培養方式進行綜述。
1 軟骨細胞再生
軟骨包括彈性軟骨、透明軟骨和纖維軟骨，不同來源的軟骨細胞具有不同的結構和生化性質。彈性軟骨存在于耳、會厭，透明軟骨存在于關節、鼻中隔、氣管、肋軟骨和喉軟骨，纖維軟骨存在于椎間盤、肌腱和韌帶中[6]。研究證明，軟骨細胞在維持組織工程氣管的機械性能、預防組織工程氣管支架塌陷方面具有重要作用[7-8]。
1.1 軟骨細胞的來源
軟骨細胞來源的主要問題是如何采取最簡單、安全、微創的方法獲得細胞，并且獲得的細胞能夠很好地在體外進行培養。耳、鼻中隔、氣管和肋軟骨是軟骨細胞的主要來源。耳軟骨細胞與原生氣管軟骨生物學性能相近，且獲取簡單、安全、微創，然而因其不能提供理想的力學特性，存在可能導致氣管內毛發生長和油脂產生等長期潛在并發癥[9]，所以耳軟骨并非首選。肋軟骨細胞具有和氣管軟骨細胞類似的生物活性和代謝活動[10]。然而，實際操作過程中，獲取這些軟骨細胞存在需要侵襲性活檢和局部或全身麻醉的缺點。研究發現骨髓間充質干細胞（MSC）可以分化成軟骨細胞[7]，這一發現解決了上述問題，MSC成為具有前景的軟骨細胞來源。
1.2 軟骨細胞的培養
眾所周知，體外培養軟骨細胞在經過幾個傳代培養后，細胞表型會發生改變。目前還沒有培養高質量軟骨細胞的統一標準。因此，培養高質量的軟骨細胞仍然是一大挑戰。軟骨形成是由幾個相關因子共同促進的，例如轉化生長因子β（TGF-β）、纖維母細胞生長因子（FGF）和胰島素樣生長因子（IGF）。TGF-β已被證明是最有效的促進軟骨細胞分化的生長因子[11]，其對軟骨細胞的分化形成起著重要作用，但是它的不同亞型所起的作用并不完全相同[12]。FGF和IGF家族可以通過調節細胞凋亡、增殖、分化等多種機制來影響軟骨細胞的分化。研究證明可以聯合多種生長因子共同作用，促進軟骨細胞的分化成熟。
1.3 軟骨細胞的再生
各種來源的軟骨細胞經體外培養種植于氣管支架的外表面可以使軟骨細胞再生，直接在氣管支架外表面種植MSC也可以分化成軟骨細胞[7]。使用MSC的優點：可以在局部麻醉下獲取細胞，避免了全身麻醉的風險；可以在體外擴增到相當大的數量，同時保持分化能力[11-13]。由于這些原因，自體MSC已經成為新的解決軟骨再生的替代來源。研究[3]發現可以使用TGF-β來提高自身MSC的募集，這為MSC的應用提供了更為廣闊的前景。
2 上皮細胞再生
氣管與吸入的空氣直接接觸，污染和感染風險相當高，在避免這些不良反應的過程中，上皮細胞發揮著關鍵作用[4]。研究表明[14-15]，一個內表面缺乏上皮細胞的氣管很容易遭受創傷，隨后氣管會變得狹窄。事實上，氣管上皮細胞具有許多功能，包括控制肺部液體平衡、吸附和活化炎癥細胞、代謝和清除吸入顆粒、調節氣管平滑肌功能。
2.1 上皮細胞的來源
上皮細胞可以從鼻或氣管黏膜上獲取[16]。鼻腔上皮細胞增殖快，比支氣管上皮細胞更易凋亡[17]。因此，支氣管上皮細胞可能更適宜氣管移植。最近有研究者[8, 18]利用MSC培養分化成上皮細胞，這為上皮細胞的來源又提供了新的可能。在提前給患者使用了粒細胞集落刺激因子后采集患者的外周血，然后從外周血中提取單核細胞，直接將單核細胞種植在組織工程氣管的內表面，成功分化成了上皮細胞。
2.2 上皮細胞的培養
從鼻、氣管或支氣管黏膜上獲取上皮細胞后，采用Rees等[19]的方法，使用特定的無血清培養基，加入牛垂體提取物和上皮生長因子，獲得上皮細胞，并已成功運用到脫細胞氣管支架移植的再上皮化過程中[20-21]。然而，長時間的體外培養會損害細胞的免疫原性以及細胞的質量。長期體外培養會使細胞迅速喪失原本的防御功能。研究[22]表明，在培養上皮細胞的過程中會使上皮細胞上的通道數量增加。傳代4次以上會使上皮細胞失去分泌粘蛋白的能力。通道數量增加會使纖毛細胞數量迅速下降。
2.3 上皮細胞的再生
組織工程氣管上皮的再生十分困難，如果沒有上皮再生，氣管就會發生阻塞從而導致移植失敗。由于氣管解剖結構和功能的特殊性，研究人員開始認識到氣管再上皮化在組織工程中的重要作用[23]。Weidenbecher等[24]使用肌肉皮瓣重建組織工程氣管的血供，可以使呼吸道黏膜快速從自身健康氣管遷移到脫細胞支架上。細胞角蛋白5和8染色陽性表明氣管移植再上皮化成功[4]。使用受體的頰黏膜做為上皮細胞來源，種植在脫細胞支架的內表面后發現氣管內表面有鱗狀上皮存在[25]。雖然證明了氣管內表面有上皮細胞存在，但目前還不清楚這些上皮細胞是來自種植的細胞還是從鄰近健康的呼吸道遷移過來的細胞[26]。但種植了上皮細胞的組織工程氣管為長段氣管狹窄的治療帶來了希望[24]。
3 血管再生
組織工程氣管失敗的常見原因是植入物的壞死或感染，這是因為缺乏有效的血管再生以致于受損細胞未能得到及時有效的修復，即使很少的壞死組織最終也會導致移植的失敗[27]。因此組織工程氣管移植過程中一個很重要的問題就是血管再生，能否快速生成血管是移植成功的關鍵[7]。
3.1 血管再生的方法
組織工程氣管移植的潛在問題之一是移植物的血液供應問題。因為直徑 > 1 mm的組織僅靠周圍組織液擴散來維持營養和氧氣供應是不夠的，如果沒有血管再生，移植物可能發生壞死。血管再生包括直接血管再生和間接血管再生。間接血管再生是將移植物放在患者前臂筋膜中4個月，促進血管再生，然后再原位移植[25]。直接血管再生包括使用網膜包裹以及帶有皮瓣的移植等[28]，另外在組織工程氣管種植內皮細胞和其他細胞之前整合一定的促進血管生成的生長因子。
3.2 血管再生因子
在組織工程中用血管生長因子來誘導新生血管的方法很受歡迎，然而重組的血管內皮生長因子（VEGF）或基本成纖維細胞生長因子（b-FGF）的分子結構不穩定以及遠期效果不確定，使其在組織工程領域的使用受到一定限制[26]。研究發現脫細胞支架可以促進血管再生，免疫組織化學顯示脫細胞支架上仍然存在重要的血管再生因子b-FGF和TGF-β[29]，脫細胞組織工程氣管移植4 d后，在氣管壁上檢測到了微血管的生長，移植1個月后氣管壁黏膜活檢發現有出血，證實有完整的血管再生[17]。因此，我們認為脫細胞并沒有去除所有促血管再生因子[7]。脫細胞支架上的血管再生因子可以促進血管的再生，從而表明了保留氣管基質的重要性[30]。然而，為了保證組織工程氣管血管再生的成功，通常還需額外添加生長因子，如b-FGF和TGF-β。
3.3 血管再生的監測
組織工程氣管移植后，活檢氣管內壁黏膜，如果發生出血，則證明血管再生成功[7, 17]。然而在體外實驗的過程中，這一方法并不適用。這時，可以采用雞胚絨毛尿囊膜（CAM）測定的方法來評價組織工程氣管血管再生的能力[27]，方法為：白來航雞受精雞蛋在37℃、恒定濕度下孵化至第3 d，正方形開窗打開殼分離尿囊膜，用注射器抽取2～3 ml白蛋白以形成假性氣室，然后用玻璃密封，繼續孵化；孵化至第8 d，在假氣室內種植氣管，然后繼續孵化；每天觀察血管生長情況直到第12 d，評估血管向氣管縱向再生情況，用以表示組織工程氣管的血管再生能力。
4 小結
脫細胞支架保留了促進血管再生的生長因子，在組織工程氣管移植過程中，添加促血管再生因子b-FGF和TGF-β有利于血管再生。骨髓間充質干細胞在軟骨再生方面比其他來源的細胞表現更佳，獲取簡單，創傷較小，體外培養相對簡單。在移植前、移植后以及軟骨細胞培養過程中使用TGF-β對軟骨細胞再生起著重要的促進作用，另外添加一些生長因子也對軟骨的再生有促進作用，但具體如何添加還沒有統一的認識。骨髓間充質干細胞也可以分化成上皮細胞，這為上皮細胞的來源又提供了一種新的可能，但上皮細胞在體外培養過程中很容易改變原來的細胞學特性，為避免這種情況的發生，有研究者利用外周血單核細胞直接種植在氣管內表面，獲得了成功。另外使用促紅細胞生成素（EPO）等生長因子可以通過抑制細胞凋亡來促進傷口愈合及血管再生，有研究表明巨噬細胞在氣管移植后傷口愈合過程中也起著重要的作用。在組織工程氣管方面我們的認識還很局限，氣管再生的機制、細胞遷移的途徑等問題尚不清楚，還需進一步研究。