引用本文： 劉光源, 朱江, 文彥, 何金濤. 非小細胞肺癌ALK、ROS1及RET融合基因檢測與臨床特性的相關性分析. 中國胸心血管外科臨床雜志, 2014, 21(4): 522-525. doi: 10.7507/1007-4848.20140147 復制
非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數的80%~85％，是最常見的、死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。肺癌的綜合治療及個體化治療已是全球共識。當表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)基因突變在非小細胞肺癌發生、發展過程中的機制明晰后，以小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)為代表的靶向治療成為繼手術、放療、化療之后應用最為廣泛的治療方式之一，并且取得了較好的臨床效果，基于分子病理診斷的個體化治療已深入人心。隨著肺癌驅動基因研究的深入，研究者們相繼發現了間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)、ROS1、RET等基因重排在非小細胞肺癌發生中的作用[2-3]，并成功研制了以ALK融合基因為靶點的激酶抑制劑——克唑替尼，已用于臨床。已有研究表明ALK，ROS1，RET融合基因在非小細胞肺癌患者中的陽性率分別為3%~7%、1.7%和1%~2%，歐美人種及高加索人群ALK融合基因發生率為2%~5%，ROS1及RET陽性率更低[4-5]。國內小量病例報道ALK融合基因發生率為7%~10%。其陽性率隨種族、組織表型、臨床特征及檢測方法等不同而存在差異。我們通過逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術檢測四川省腫瘤醫院310例非小細胞肺癌術后的病理標本，了解ALK、ROS1、RET基因重排在四川地區非小細胞肺癌中的陽性率，并分析其與臨床特征的相關性。
1 材料與方法
1.1 臨床資料
四川省腫瘤醫院肺部腫瘤科2009年3月至2012年3月收治非小細胞肺癌患者310例，均來自四川地區，其中男234例、女76例，年齡29~77歲，中位年齡60歲。組織學類型采用世界衛生組織第3版肺癌組織學分類標準；臨床病理分期采用第七版TNM分期。所有患者排除同時患有其它類型的癌癥，若有必要，行檢查明確是否為原發性肺癌。
1.2 實驗材料和儀器
實驗儀器采用安捷倫科技有限公司的熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(MX3000P美國)。核糖核酸(RNA)提取試劑盒，脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶及DNA提取試劑盒等均由廈門艾德生物醫藥科技有限公司提供。
1.3 實驗方法
收集外科手術切除的腫瘤組織(病理結果證實為非小細胞肺癌)標本，取出后浸泡于液氮中，隨后保存于-80°的冰箱中，標本預處理后經提取DNA、質量控制、加樣上機、結果判定等步驟，采用RT-PCR方法檢測其ALK、ROS1、RET基因的融合情況。
1.4 統計學分析
采用連續校正卡方檢驗(continuity correction X2檢驗)或Fisher精確概率法分析基因重排與年齡、性別、吸煙史、病理類型及組織分化等臨床特征的相關性，所有P值均基于雙向假設檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。用SPSS 13.0統計軟件進行統計處理。
2 結果
2.1 一般情況
非小細胞肺癌患者310例，男234例、女76例，中位年齡60歲；有吸煙史164例，無吸煙史或少量吸煙146例；腺癌142例，鱗癌138例，腺鱗癌10例，其它類型20例。見表 1。所有患者中共發生基因重排17例，其中ALK基因重排15例，陽性率4.84%；RET基因重排2例，陽性率0.64%；ROS1基因重排1例，陽性率0.32%；見表 2。
表1
310例基因檢測患者的臨床資料(例)
表2
基因重排發生率
2.2 ALK基因重排與臨床特征的相關性
ALK基因重排更容易發生在60歲以下、不吸煙、腺癌患者中(P < 0.05)；ALK基因重排與患者的性別及腫瘤分化程度無明顯相關性，見表 3。
表3
ALK基因重排與臨床特征的相關性
2.3 ROS1和RET基因重排
本組患者中ROS1和RET基因重排分別為1例和2例，陽性發生率分別為0.32%和0.64%，均為腺癌患者；其中ROS1同時合并有ALK基因重排。
3 討論
肺癌是當今世界發病率及死亡率最高的惡性腫瘤，嚴重危害人類的生命健康，其中大約有80%~85%為非小細胞肺癌，因此，對于非小細胞肺癌的治療直接關系到整體肺癌的治療效果。2004年，美國的科學家報道了表皮生長因子受體(EGFR)突變與酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)吉非替尼療效之間的關系，開啟了靶向治療的新紀元[6]，隨后一系列臨床研究奠定了靶向治療為繼手術、化療、放療之后最有效的肺癌治療手段地位[7]。隨著驅動基因的研究進展，肺癌的治療已逐漸發展為以分子病理為基礎的個體化、多學科綜合治療；隨著基因測序技術的進步，更多的驅動基因在肺癌中被發現，最典型的是ALK融合基因，其發生率雖然不如EGFR突變高，但針對龐大的肺癌發病人群具有顯著的臨床意義，由此，針對ALK基因重排的蛋白激酶抑制劑——克唑替尼(輝瑞公司)已用于臨床，取得了非常好的臨床效果。
ALK表達與間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)密切相關，其編碼產物是ALCL重要的分子標志物，是由1 620個氨基酸組成的跨膜蛋白，屬于酪氨酸受體中的胰島素受體亞家族[8]，在肺癌中發現的ALK融合基因主要為棘皮動物微管樣蛋白4-間變淋巴瘤激酶融合基因(EML4-ALK)。EML4-ALK融合基因由第2號染色體短臂插入引起，使兩個EML4-ALK分子的激酶區相互結合，通過自身磷酸化活化下游磷脂酰肌醇3激酶(PIK3)——蛋白激酶B信號傳導通路，從而引起細胞向惡性轉化。2007年Soda等[9]研究了75例日本非小細胞肺癌患者，首次檢測到其中5例(6.7％) EML4-ALK融合基因表達。Wong等[10]對266例非小細胞肺癌患者的組織標本進行EML4-ALK融合基因檢測，其中13例為陽性，其中11例為腺癌，2例為腺鱗癌。此后，多個國家均有報道，但陽性發生率有差異[11]，現有的檢測方法主要為熒光原位雜交技術(FISH)、免疫組織化學(IHC)和RT-PCR，檢測方法不同，其陽性率高低有差異，最佳的檢測方法有待評估[12]。我們采用RT-PCR方法進行檢測，該方法有靈敏、穩定、程序化操作和質量易于控制等特點。本組患者ALK基因重排檢測的陽性率為4.84%，腺癌、年輕、不吸煙或少吸煙患者中陽性率更高，而與性別和腫瘤細胞分化程度無相關性。同時發現ALK基因重排與EGFR突變相互排斥，與國內外報道相一致。另一項在2012ASCO上公布的Ⅱ期臨床試驗超過900例ALK陽性的晚期非小細胞肺癌患者接受克唑替尼治療，客觀緩解率(ORR) 53%，無進展生存期(PFS) 8.5個月[13]。同時患者臨床癥狀，如疼痛(包括胸痛)、咳嗽、呼吸困難、失眠、疲乏等顯著改善，生存質量顯著提高。因此，ALK已經成為繼EGFR以后重要的、具有顯著臨床意義的非小細胞肺癌的驅動基因[14-17]。基于本組資料為四川地區患者流行病學分布情況及臨床特征，有針對性的對EGFR突變陰性、相對年輕、不吸煙或少吸煙的腺癌患者進行ALK基因篩查，可顯著提升陽性患者的檢出率，減輕患者的經濟負擔。
人類ROS1基因屬于胰島素受體家族的一種跨膜酪氨酸激酶，與禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具同源性，因此被命名為ROS基因，其編碼是胰島素受體家族的一種跨膜酪氨酸激酶，它由一個酪氨酸激酶區域、一個跨膜區域和一個含N端糖基化位點的細胞外區域組成，編碼具有酪氨酸激酶活性的Ⅰ型完整膜蛋白。ROS1基因最顯著的特征在于細胞外區域由6個重復序列組成，與纖維連接蛋白具有高度同源性，在細胞黏附中伴有重要的作用[18-19]，它可以直接翻譯黏附分子參與細胞內的信號通路。2007年Rikova等[20]發現ROS1融合基因也在肺癌細胞株中表達。在非小細胞肺癌中ROS1基因主要與SLC34A2、CD74發生融合，ROS1融合后成為非小細胞肺癌的驅動基因，進而導致持續性的酪氨酸激酶活化，并與TKI藥物的敏感性有關，因為ROS1與ALK的激酶區域有同源性(49%)。
有臨床研究表明腫瘤標本中檢測到含有EML4-ALK的非小細胞肺癌患者可從ALK特異性激酶抑制劑克唑替尼中獲益，能顯著延長患者的總生存期[21-22]，另外，克唑替尼已用于ROS1陽性的進展期非小細胞肺癌患者的Ⅰ期臨床試驗，初步結果顯示13例陽性患者在第8周時客觀緩解率和疾病控制率分別為54%和85%[23]。針對ALK變異型肺癌的個體化治療正在不斷發展，不同的融合方式產生的酪氨酸激酶活性不同，導致從ALK-TKI中獲益的程度可能不同[2]。本組患者中有1例檢測出ROS1基因重排，并同時發生ALK基因重排，ALK和ROS1基因重排同時發生的患者激酶抑制劑療效是否更佳，或有其他臨床特點尚需進一步觀察。
RET原癌基因由Takahashi等首先在轉化小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3細胞)時發現，它因與其他基因重排而活化，因為在轉化中發生重排，將它命名為RET基因。它位于10q 11.2，含有21個外顯子，全長60 kb，與其他染色體易位或10號染色體發生倒置可使RET活化。RET原癌基因編碼一種跨膜的酪氨酸激酶受體RET蛋白，調節細胞的生長、分化。Takeuchi等[24]經分子和組織病理學檢測在1 526例肺癌患者樣本中發現14例(0.9%)腺癌存在新的融合基因KIF5B-RET和CCDC6-RET。另有文獻報道KIF5B-RET基因在肺腺癌的發生率為1%~2%，并發現RET激酶抑制劑凡德他尼(vandetanib)可抑制KIF5B-RET融合基因錨定的NIH3T3細胞的生長活性[25]。研究發現RET基因重排與其他肺癌驅動基因相互排斥，與包括EGFR、KRAS、ALK、HER2、BRAF、ROS1等有排他性，在其他肺癌驅動基因野生型的腺癌患者中有RET基因重排陽性率大約為6.3%。特異性RET激酶抑制劑或多靶點激酶抑制劑有效。該基因重排整體陽性率較低，臨床意義有待進一步探討。
非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數的80%~85％，是最常見的、死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。肺癌的綜合治療及個體化治療已是全球共識。當表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)基因突變在非小細胞肺癌發生、發展過程中的機制明晰后，以小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)為代表的靶向治療成為繼手術、放療、化療之后應用最為廣泛的治療方式之一，并且取得了較好的臨床效果，基于分子病理診斷的個體化治療已深入人心。隨著肺癌驅動基因研究的深入，研究者們相繼發現了間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)、ROS1、RET等基因重排在非小細胞肺癌發生中的作用[2-3]，并成功研制了以ALK融合基因為靶點的激酶抑制劑——克唑替尼，已用于臨床。已有研究表明ALK，ROS1，RET融合基因在非小細胞肺癌患者中的陽性率分別為3%~7%、1.7%和1%~2%，歐美人種及高加索人群ALK融合基因發生率為2%~5%，ROS1及RET陽性率更低[4-5]。國內小量病例報道ALK融合基因發生率為7%~10%。其陽性率隨種族、組織表型、臨床特征及檢測方法等不同而存在差異。我們通過逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術檢測四川省腫瘤醫院310例非小細胞肺癌術后的病理標本，了解ALK、ROS1、RET基因重排在四川地區非小細胞肺癌中的陽性率，并分析其與臨床特征的相關性。
1 材料與方法
1.1 臨床資料
四川省腫瘤醫院肺部腫瘤科2009年3月至2012年3月收治非小細胞肺癌患者310例，均來自四川地區，其中男234例、女76例，年齡29~77歲，中位年齡60歲。組織學類型采用世界衛生組織第3版肺癌組織學分類標準；臨床病理分期采用第七版TNM分期。所有患者排除同時患有其它類型的癌癥，若有必要，行檢查明確是否為原發性肺癌。
1.2 實驗材料和儀器
實驗儀器采用安捷倫科技有限公司的熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀(MX3000P美國)。核糖核酸(RNA)提取試劑盒，脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶及DNA提取試劑盒等均由廈門艾德生物醫藥科技有限公司提供。
1.3 實驗方法
收集外科手術切除的腫瘤組織(病理結果證實為非小細胞肺癌)標本，取出后浸泡于液氮中，隨后保存于-80°的冰箱中，標本預處理后經提取DNA、質量控制、加樣上機、結果判定等步驟，采用RT-PCR方法檢測其ALK、ROS1、RET基因的融合情況。
1.4 統計學分析
采用連續校正卡方檢驗(continuity correction X2檢驗)或Fisher精確概率法分析基因重排與年齡、性別、吸煙史、病理類型及組織分化等臨床特征的相關性，所有P值均基于雙向假設檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。用SPSS 13.0統計軟件進行統計處理。
2 結果
2.1 一般情況
非小細胞肺癌患者310例，男234例、女76例，中位年齡60歲；有吸煙史164例，無吸煙史或少量吸煙146例；腺癌142例，鱗癌138例，腺鱗癌10例，其它類型20例。見表 1。所有患者中共發生基因重排17例，其中ALK基因重排15例，陽性率4.84%；RET基因重排2例，陽性率0.64%；ROS1基因重排1例，陽性率0.32%；見表 2。
表1
310例基因檢測患者的臨床資料(例)
表2
基因重排發生率
2.2 ALK基因重排與臨床特征的相關性
ALK基因重排更容易發生在60歲以下、不吸煙、腺癌患者中(P < 0.05)；ALK基因重排與患者的性別及腫瘤分化程度無明顯相關性，見表 3。
表3
ALK基因重排與臨床特征的相關性
2.3 ROS1和RET基因重排
本組患者中ROS1和RET基因重排分別為1例和2例，陽性發生率分別為0.32%和0.64%，均為腺癌患者；其中ROS1同時合并有ALK基因重排。
3 討論
肺癌是當今世界發病率及死亡率最高的惡性腫瘤，嚴重危害人類的生命健康，其中大約有80%~85%為非小細胞肺癌，因此，對于非小細胞肺癌的治療直接關系到整體肺癌的治療效果。2004年，美國的科學家報道了表皮生長因子受體(EGFR)突變與酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)吉非替尼療效之間的關系，開啟了靶向治療的新紀元[6]，隨后一系列臨床研究奠定了靶向治療為繼手術、化療、放療之后最有效的肺癌治療手段地位[7]。隨著驅動基因的研究進展，肺癌的治療已逐漸發展為以分子病理為基礎的個體化、多學科綜合治療；隨著基因測序技術的進步，更多的驅動基因在肺癌中被發現，最典型的是ALK融合基因，其發生率雖然不如EGFR突變高，但針對龐大的肺癌發病人群具有顯著的臨床意義，由此，針對ALK基因重排的蛋白激酶抑制劑——克唑替尼(輝瑞公司)已用于臨床，取得了非常好的臨床效果。
ALK表達與間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)密切相關，其編碼產物是ALCL重要的分子標志物，是由1 620個氨基酸組成的跨膜蛋白，屬于酪氨酸受體中的胰島素受體亞家族[8]，在肺癌中發現的ALK融合基因主要為棘皮動物微管樣蛋白4-間變淋巴瘤激酶融合基因(EML4-ALK)。EML4-ALK融合基因由第2號染色體短臂插入引起，使兩個EML4-ALK分子的激酶區相互結合，通過自身磷酸化活化下游磷脂酰肌醇3激酶(PIK3)——蛋白激酶B信號傳導通路，從而引起細胞向惡性轉化。2007年Soda等[9]研究了75例日本非小細胞肺癌患者，首次檢測到其中5例(6.7％) EML4-ALK融合基因表達。Wong等[10]對266例非小細胞肺癌患者的組織標本進行EML4-ALK融合基因檢測，其中13例為陽性，其中11例為腺癌，2例為腺鱗癌。此后，多個國家均有報道，但陽性發生率有差異[11]，現有的檢測方法主要為熒光原位雜交技術(FISH)、免疫組織化學(IHC)和RT-PCR，檢測方法不同，其陽性率高低有差異，最佳的檢測方法有待評估[12]。我們采用RT-PCR方法進行檢測，該方法有靈敏、穩定、程序化操作和質量易于控制等特點。本組患者ALK基因重排檢測的陽性率為4.84%，腺癌、年輕、不吸煙或少吸煙患者中陽性率更高，而與性別和腫瘤細胞分化程度無相關性。同時發現ALK基因重排與EGFR突變相互排斥，與國內外報道相一致。另一項在2012ASCO上公布的Ⅱ期臨床試驗超過900例ALK陽性的晚期非小細胞肺癌患者接受克唑替尼治療，客觀緩解率(ORR) 53%，無進展生存期(PFS) 8.5個月[13]。同時患者臨床癥狀，如疼痛(包括胸痛)、咳嗽、呼吸困難、失眠、疲乏等顯著改善，生存質量顯著提高。因此，ALK已經成為繼EGFR以后重要的、具有顯著臨床意義的非小細胞肺癌的驅動基因[14-17]。基于本組資料為四川地區患者流行病學分布情況及臨床特征，有針對性的對EGFR突變陰性、相對年輕、不吸煙或少吸煙的腺癌患者進行ALK基因篩查，可顯著提升陽性患者的檢出率，減輕患者的經濟負擔。
人類ROS1基因屬于胰島素受體家族的一種跨膜酪氨酸激酶，與禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具同源性，因此被命名為ROS基因，其編碼是胰島素受體家族的一種跨膜酪氨酸激酶，它由一個酪氨酸激酶區域、一個跨膜區域和一個含N端糖基化位點的細胞外區域組成，編碼具有酪氨酸激酶活性的Ⅰ型完整膜蛋白。ROS1基因最顯著的特征在于細胞外區域由6個重復序列組成，與纖維連接蛋白具有高度同源性，在細胞黏附中伴有重要的作用[18-19]，它可以直接翻譯黏附分子參與細胞內的信號通路。2007年Rikova等[20]發現ROS1融合基因也在肺癌細胞株中表達。在非小細胞肺癌中ROS1基因主要與SLC34A2、CD74發生融合，ROS1融合后成為非小細胞肺癌的驅動基因，進而導致持續性的酪氨酸激酶活化，并與TKI藥物的敏感性有關，因為ROS1與ALK的激酶區域有同源性(49%)。
有臨床研究表明腫瘤標本中檢測到含有EML4-ALK的非小細胞肺癌患者可從ALK特異性激酶抑制劑克唑替尼中獲益，能顯著延長患者的總生存期[21-22]，另外，克唑替尼已用于ROS1陽性的進展期非小細胞肺癌患者的Ⅰ期臨床試驗，初步結果顯示13例陽性患者在第8周時客觀緩解率和疾病控制率分別為54%和85%[23]。針對ALK變異型肺癌的個體化治療正在不斷發展，不同的融合方式產生的酪氨酸激酶活性不同，導致從ALK-TKI中獲益的程度可能不同[2]。本組患者中有1例檢測出ROS1基因重排，并同時發生ALK基因重排，ALK和ROS1基因重排同時發生的患者激酶抑制劑療效是否更佳，或有其他臨床特點尚需進一步觀察。
RET原癌基因由Takahashi等首先在轉化小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3細胞)時發現，它因與其他基因重排而活化，因為在轉化中發生重排，將它命名為RET基因。它位于10q 11.2，含有21個外顯子，全長60 kb，與其他染色體易位或10號染色體發生倒置可使RET活化。RET原癌基因編碼一種跨膜的酪氨酸激酶受體RET蛋白，調節細胞的生長、分化。Takeuchi等[24]經分子和組織病理學檢測在1 526例肺癌患者樣本中發現14例(0.9%)腺癌存在新的融合基因KIF5B-RET和CCDC6-RET。另有文獻報道KIF5B-RET基因在肺腺癌的發生率為1%~2%，并發現RET激酶抑制劑凡德他尼(vandetanib)可抑制KIF5B-RET融合基因錨定的NIH3T3細胞的生長活性[25]。研究發現RET基因重排與其他肺癌驅動基因相互排斥，與包括EGFR、KRAS、ALK、HER2、BRAF、ROS1等有排他性，在其他肺癌驅動基因野生型的腺癌患者中有RET基因重排陽性率大約為6.3%。特異性RET激酶抑制劑或多靶點激酶抑制劑有效。該基因重排整體陽性率較低，臨床意義有待進一步探討。
