引用本文： 陳剛, 鄭乾, 劉蒙飛, 何海洋, 巨嘯晨, 姜侃. Kartogenin聯合脂肪干細胞對前交叉韌帶重建術后腱骨愈合的影響. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(8): 1002-1010. doi: 10.7507/1002-1892.202305011 復制
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是膝關節重要穩定結構，主要作用是防止脛骨過度前移[1]。ACL斷裂是一種常見運動損傷，可導致一系列并發癥，如半月板損傷、膝關節退行性病變、運動功能障礙等[2]。為恢復膝關節運動功能，往往需要在關節鏡下重建韌帶[3]。但重建術后韌帶仍可能發生再次撕裂，腱骨愈合不良是主要原因之一[4-6]。相比于骨與骨之間的愈合，腱骨愈合是一個復雜、多階段、耗時長的過程，一般愈合能力較差[7]。因為腱骨愈合不良，患者術后不能早期康復鍛煉，進而影響了手術效果[8]。因此，研究如何促進腱骨愈合、降低重建韌帶再次斷裂風險，對于改善康復效果和患者生活質量具有重要意義。
近年來，針對腱骨愈合的影響因素，不斷涌現出許多新的治療方法和技術，如生長因子治療、干細胞治療、自體組織移植、肌腱固定材料應用、改良手術方式等，雖取得了一定成效，但也存在一定局限性，例如生長因子半衰期短、難以持續高效表達，無法在局部持續發揮作用[9-11]。組織工程技術是一種利用細胞、生物材料和生長因子等修復重建組織、器官的方法，實現組織功能恢復和再生。利用組織工程技術促進ACL重建后腱骨愈合，也成為國內外研究熱點。脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有來源豐富、取材簡便、免疫原性低、增殖速度快等優點[12-13]，在特定誘導條件下可定向分化為骨、軟骨、肌肉、肌腱等組織，同時能促進軟骨和骨的局部修復和再生，已被廣泛應用于組織工程研究中[14-16]。但研究發現在腱骨界面直接注射ADSCs容易發生細胞丟失和細胞死亡，無法獲得最佳治療效果[17]。Kartogenin（KGN）是一種小分子化合物，能促進MSCs特異性分化為軟骨細胞，具有促軟骨形成和增強腱骨愈合的作用[18]。但其存在最大效應濃度，難以發揮最大生物學效應，而且單獨注射至腱骨界面會產生不良反應，在肌腱移植物中形成非腱性組織[19]。上述研究結果提示單獨使用MSCs或生物分子材料促進腱骨愈合具有一定局限性。為此，本研究應用組織工程技術將KGN與ADSCs聯合，通過兔ACL重建模型觀察其對腱骨愈合的影響，以期為促進腱骨愈合提供新方法。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年新西蘭大白兔80只，雌雄不限，體質量（2.5±0.5）kg，由新疆醫科大學動物實驗中心提供。飼養條件：室溫（25±2）℃，濕度60%～80%。
兔ADSCs（欣潤生物科技有限公司）；KGN（上海源葉生物科技有限公司）；凍干纖維蛋白膠（華蘭生物工程股份有限公司），活性成分包括凍干人纖維蛋白原、凍干人纖維蛋白原溶解液、凍干人凝血酶、凍干人凝血酶溶解液；FBS、PBS緩沖液、DMEM/F12培養基、DMSO、改良HE染色試劑盒、舒泰（Virbac公司，法國）；c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）試劑盒（上海康朗生物科技有限公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。
熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；數字化電子萬能生物材料試驗機（深圳德邁勝測控設備有限公司）；醫用電動鉆（天津正天醫療器械有限公司）；Image-Pro Plus（IPP）圖像分析系統（成都勝圖科技有限公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 ADSCs傳代培養
取原代ADSCs加入完全培養基（含10%FBS及1%青、鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基），置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。倒置相差顯微鏡下觀察約80%細胞貼壁時，使用胰蛋白酶消化處理后，按1∶3比例進行傳代培養，取第3代細胞進行實驗。
1.2.2 KGN-ADSCs上清液制備
將KGN粉末溶于DMSO中，制備濃度為10 μmol/L的KGN溶液備用。將3代ADSCs接種于6孔板，每孔2×105個細胞；加入含2%PBS的DMEM培養基、0.2 μmL KGN溶液，置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養72 h后，提取上清液備用。
1.2.3 纖維蛋白膠制備
37℃條件下，取凍干纖維蛋白膠中的凍干人纖維蛋白原溶解液，注入凍干人纖維蛋白原瓶內，獲得凍干人纖維蛋白原溶液；將凍干人凝血酶溶解液注入凍干人凝血酶瓶內，獲得凍干人凝血酶溶液。將2種溶液混合即得纖維蛋白膠，于使用前4 h制備后，按1∶1比例分別與0.1 mL ADSCs細胞懸液、0.1 mL KGN-ADSCs上清液混合。
1.2.4 動物模型制備及分組
取80只新西蘭大白兔，采用隨機數字表法分為4組，分別為生理鹽水組（A組）、ADSCs組（B組）、KGN-ADSCs組（C組）、假手術組（D組），每組20只。各組動物肌肉注射舒泰（7 mg/kg）麻醉后，取雙后肢備皮消毒鋪巾。
① 肌腱移植物制備：A～C組于跟腱后方內側作長2 cm縱切口，取長3～4 cm、直徑2 mm跟腱，對折后使用5-0醫用綿綸單絲線編織縫合游離端，并預留長約10 cm線尾[20]。
② ACL重建：各組取膝關節髕旁內側手術入路，作長約2 cm縱切口，依次分離切開筋膜、關節囊及內側支持帶；將髕骨推向外側至脫位，充分暴露關節腔，其中A、B、C組切斷ACL，同時保留脛骨側殘端；D組不作ACL切斷及后續處理。屈曲膝關節于90° 位，采用直徑2 mm克氏針分別建立脛骨端與股骨端隧道。自脛骨端向股骨端引入肌腱移植物，將兩端肌腱收緊，并將預留的尾線穿過縫合針，使用縫合針穿透股骨與脛骨隧道骨質，隨后將尾線進行反復打結，將移植肌腱兩端固定于骨隧道外側，同時與周圍骨膜、筋膜等組織縫合加強固定，探查張力滿意，ACL重建模型制備成功[21]。根據分組分別于腱骨界面和移植肌腱間隙中注射0.2 mL相應材料，A組生理鹽水、B組ADSCs與纖維蛋白膠混合液、C組KGN-ADSCs上清液與纖維蛋白膠混合液。見圖1。
圖1
動物模型制備示意圖
a. 肌腱移植物；b. 重建ACL 箭頭示移植肌腱；c～e. 于ACL骨隧道及移植肌腱內注射材料
Figure1. Schematic diagram of the animal model preparationa. Tendon graft; b. Reconstruction of ACL Arrow for grafted tendon; c-e. Material was injected into ACL bone tunnels and grafted tendon
待腱骨界面及移植肌腱中注射材料充分吸收后，用生理鹽水充分沖洗關節腔，逐層縫合切口。術后分籠飼養，患肢不制動，切口不包扎，定期清潔換藥；術前及術后3 d內肌肉注射青霉素預防感染。于術后6、12周，每組各取10只動物，采用過量舒泰安樂死后取材進行觀測。
1.2.5 觀測指標
① 一般情況：術后觀察各組動物切口愈合以及后肢運動恢復情況，有無感染、死亡發生。
② HE染色：取A～C組一側后肢部分腱骨組織及ACL、D組一側正常ACL（脛骨側）標本，置于10%多聚甲醛溶液固定、脫水、浸蠟包埋、切片（片厚5 μm）。常規HE染色后，光鏡下觀察4組韌帶以及A～C組腱骨界面情況，每張切片取5個高倍視野（10×40），采用IPP 圖像分析系統計數韌帶組織中成纖維細胞，取均值。
③ TUNEL細胞凋亡檢測：取 ② 中制備的部分切片，按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行處理。光鏡下觀察呈棕褐色染色為陽性細胞，即凋亡細胞。隨機選取5個高倍視野，每個視野連續計數100個細胞中凋亡細胞數，取均值，即為凋亡指數（apotosis index，AI）[22]。
④ JNK免疫組織化學染色：參照JNK試劑盒說明書采用SP染色法進行操作。取 ② 中制備的部分切片脫蠟、水化預處理，抗原修復處理，加入JNK特異性一抗、辣根過氧化物酶標記二抗，DAB顯色，對樣本進行染色、脫水、透明化等后處理步驟。于光鏡下觀察韌帶中細胞核染色情況，以細胞核呈棕黃色為陽性染色，白色為陰性染色。測量陽性染色細胞率及染色強度并計分，其中陽性染色細胞率≤10% 0分、11%～25% 1分、26%～50% 2分、>50% 3分，陽性染色強度為無染色0分、黃色染色1分、棕黃色染色2分、棕褐色染色3分；兩項評分總和<2分為陰性表達，≥2分為陽性表達。計算JNK蛋白陽性表達率。
⑤ 生物力學檢測：取4組另一側后肢脛骨-韌帶-股骨標本，固定于數字化電子萬能生物材料試驗機進行拉力試驗。按1 mm/s速度拉伸直至樣本斷裂，記錄此時最大載荷及肌腱從韌帶止點脫出時的最大拉伸距離。
1.3 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組內兩時間點間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后8只動物因切口感染排除研究（A～C組分別為3、1、4只）；20只死亡（A～D組分別5、7、4、4只，其中腹瀉死亡7只、不明原因死亡5只、飼養不當死亡8只。最終52只動物納入研究，A～D組分別為12、12、12、16只。
2.2 HE染色觀察
2.2.1 腱骨界面
術后6周，A組移植肌腱與骨組織間可見明顯間隙，僅可見極少成纖維細胞；B組移植肌腱與骨組織間可見明顯間隙，有少量成纖維細胞；C組腱骨界面有大量膠原纖維形成，并凝集成束，肌腱與骨組織已結合，但連接不緊密，仍可見骨組織與移植肌腱存在少量間隙。見圖2a。
圖2
各組腱骨界面HE染色觀察（×40）
從左至右分別為A～C組 箭頭示移植肌腱與骨組織間隙，B：骨組織，T：移植肌腱 a. 術后6周；b. 術后12周
Figure2. HE staining observation of the tendon-bone interface in each group (×40)From left to right for groups A-C, respectively Arrow for the gap between the grafted tendon and the bone tissue, B: bone tissue, T: grafted tendon a. Six weeks after operation; b. Twelve weeks after operation
術后12周，A組移植肌腱與骨組織連接較前改善，間隙逐漸縮窄，但仍未連接融合，可見少量成纖維細胞浸潤；B組移植肌腱與骨組織間部分建立初步連接但仍疏松，間隙較前縮窄，可見大量成纖維細胞，并形成少量膠原纖維；C組腱骨界面可見大量軟骨組織形成，移植肌腱與骨組織連接致密，骨與肌腱逐步融合，腱骨愈合趨于成熟。見圖2b。
2.2.2 ACL
D組：正常ACL表面被大量滑膜組織包裹，成纖維細胞較少，其細胞核主要以橢圓形為主，且大部分分布在膠原纖維中，膠原纖維排列規則有序，呈波浪狀。
術后6周，A～C組成纖維細胞逐漸增多，均多于D組，且細胞排列紊亂，細胞核主要以梭形為主。12周時，A～C組成纖維細胞較6周時減少，但仍多于D組；其中A、B組細胞仍排列雜亂無規律，C組可見大量膠原纖維形成，逐漸凝集成束，排列有序，趨于形成正常ACL結構。見圖3。
圖3
各組ACL HE染色觀察（×40）
從左至右分別為A～D組 a. 術后6周；b. 術后12周
Figure3. HE staining observation of ACL in each group (×40)From left to right for groups A-D, respectively a. Six weeks after operation; b. Twelve weeks after operation
術后6、12周，4組間成纖維細胞計數差異均有統計學意義（P<0.05）。A～C組術后12周成纖維細胞計數均較6周減少，其中C組差異有統計學意義（P<0.05）； D組兩時間點間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
術后6、12周各組組織學及生物力學觀測指標比較（
）
Table1.
Comparison of histologic and biomechanical observations between groups at 6 and 12 weeks after operation（
）
2.3 TUNEL細胞凋亡檢測
術后6周，A～C組可見成纖維細胞形成，細胞核呈黑色梭形，且C組成纖維細胞明顯多于其余3組；12周時，A～C組成纖維細胞逐漸減少，存在部分細胞凋亡。D組兩時間點成纖維細胞數量未見明顯變化。見圖4。
圖4
各組細胞凋亡觀察（×40）
從左至右分別為A～D組 a. 術后6周；b. 術后12周
Figure4. Apoptosis observation in each group (×40)From left to right for groups A-D, respectively a. Six weeks after operation; b. Twelve weeks after operation
術后6、12周4組間AI差異均有統計學意義（P<0.05）。A～C組術后12周時AI較6周時降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；D組兩時間點差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
2.4 JNK免疫組織化學染色
術后6周各組細胞核均呈棕黃色，12周時染色逐漸變淺；兩時間點C組染色最深、B組其次（圖5）。術后6、12周，C組JNK蛋白陽性表達率高于其他3組，差異有統計學意義（P<0.05）； A、B、D組間差異無統計學意義（P>0.05）。術后12周A～C組JNK蛋白陽性表達率均較6周時下降，差異有統計學意義（P<0.05）；D組兩時間點間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
圖5
各組JNK免疫組織化學染色觀察（×10）
從左至右分別為A～D組 a. 術后6周；b. 術后12周
Figure5. JNK immunohistochemical staining observation in each group (×10)From left to right for groups A-D, respectively a. Six weeks after operation; b. Twelve weeks after operation
2.5 生物力學測試
術后6、12周，D組最大載荷高于A～C組，C組高于A、B組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間差異無統計學意義（P>0.05）。D組最大拉伸距離小于A～C組，C組小于A、B組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間差異無統計學意義（P>0.05）。
與術后6周相比，術后12周A～C組最大載荷增大、最大拉伸距離減小，差異均有統計學意義（P<0.05）。D組兩時間點間差異均無統計學無意義（P>0.05）。見表1。
3 討論
Kosaka等[16]研究發現ADSCs移植后腱骨界面出現致密纖維血管組織，同時形成連接肌腱和骨組織的Sharpey樣纖維，且軟骨細胞排列均勻有序，增強了腱骨界面的最大載荷及剛度。Oh等[23]的研究顯示通過局部注射ADSCs，兔肩袖撕裂模型腱骨界面最大失效負荷提高，促進了腱骨愈合。KGN作為一種小分子材料，可刺激干細胞增殖以及誘導其向軟骨組織、骨組織、腱組織方向分化，并在體內加速肌腱組織形成軟骨組織，從而增強腱骨界面愈合[24-27]。但KGN存在疏水性、無靶向能力、循環效率差和功效有限等缺點[19]，因此單獨注射KGN溶液可能會擴散到鄰近區域，導致膝關節鄰近區域形成過多軟骨樣組織，對腱骨愈合產生負面影響，且不能有效形成纖維軟骨[28]。有研究發現低濃度KGN（10、100 nmol/L）能誘導BMSCs形成軟骨組織和骨組織，而較高濃度KGN（1、5 μmol/L）可使腱骨界面形成大量軟骨樣組織，有效促進腱骨界面的纖維軟骨帶形成[29]。為此，本研究將濃度為10 μmol/L的KGN聯合ADSCs注射至兔重建ACL的腱骨界面，探討其能否促進腱骨愈合。
組織學染色觀察是評估腱骨愈合最常用的研究方法[22]，本研究選擇該方法觀察術后骨與肌腱組織之間的間隙變化，評估腱骨愈合情況。結果顯示隨著時間推移，肌腱與骨組織空隙逐漸縮小，腱骨界面形成大量軟骨細胞及新骨并與肌腱移植物逐漸融合，形成膠原纖維與軟骨細胞移行帶。腱骨界面連接愈加緊密牢固，趨近于形成正常韌帶結構。我們分析KGN與ADSCs聯合應用促進腱骨愈合的原因主要有兩方面：一方面，KGN作為ADSCs載體，可以提供一種支持和促進細胞生長和分化的環境，同時還可以釋放生長因子，刺激細胞增殖、分化和再生，有助于腱骨愈合。另一方面，ADSCs彌補了KGN的疏水性、無靶向能力缺點，二者協同效應，共同促進軟骨形成，加速腱骨愈合，提高腱骨愈合質量。
肌腱移植物中的成纖維細胞計數是評估移植物愈合的重要指標[29]。本研究結果顯示，A～C組術后早期可見大量成纖維細胞，后期逐漸減少，表明肌腱移植物經歷了缺血性壞死、細胞生長和細胞消失的愈合過程，最后恢復為正常。但C組成纖維細胞數量顯著多于其余各組，分析引起成纖維細胞增殖的原因主要有以下幾點：首先，ADSCs能自我分化，調節細胞增殖、遷移、分化[30]，導致早期B、C組中成纖維細胞數量均高于D組。其次，后期由于肌腱移植物中干細胞濃度下降，導致對肌腱移植物中的細胞增殖作用明顯減弱。本研究KGN和ADSCs聯合運用后，KGN可促進ADSCs增殖并誘導其分化為腱組織，提高肌腱愈合質量；同時ADSCs能夠抑制炎癥反應，減輕韌帶水腫，減少中性粒細胞，從而使移植物肌腱更具彈性，瘢痕修復減少[31]。本研究KGN聯合ADSCs 組肌腱移植物中細胞排列規則有序，形成大量膠原纖維，且凝集成束，趨近于正常韌帶結構，其愈合效果有明顯優勢。
腱骨愈合過程中，生物因子往往是通過信號通路發揮生物學作用的。研究表明上調TGF-β的表達水平能促進ACL愈合，同時發現TGF-β/MAPK信號通路關鍵蛋白p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、c-Jun和c-Myc也隨之表達增加；隨后研究人員又通過TGF-β抑制實驗，進一步證明TGF-β/MAPK信號通路在腱骨愈合過程中的調節作用[29]。隨著TGF-β/MAPK信號通路被激活，其關鍵蛋白JNK的表達可調節細胞增殖、凋亡[32]。因此本研究采用免疫組織化學染色檢測JNK蛋白表達，結果顯示ACL重建術后早期隨著JNK蛋白表達增加，細胞增殖愈強，這與組織染色觀察結果一致。因此，我們分析腱骨愈合可能與TGF-β/MAPK信號通路有關，隨著信號通路被激活，關鍵蛋白JNK表達增加，促進了腱骨愈合。但腱骨愈合受多種信號通路影響，未來仍需要對其進行深入研究。
生物力學是評估ACL重建后肌腱移植物愈合質量的重要參數，可以反映肌腱移植物與骨組織之間的連接強度和抗拉能力。本研究結果顯示C組最大拉伸距離及最大載荷與A、B組存在顯著差異，可能是因為肌腱移植物生物力學特性取決于其在骨隧道內愈合情況，A、B組骨組織與腱組織愈合情況欠佳，肌腱與骨組織未建立連接，而C組隨著時間延長腱骨界面連接緊密，可提供腱骨界面機械強度及抗拉力性，和組織學結果表現一致。
綜上述， KGN聯合ADSCs可促進腱骨愈合，增強腱骨界面機械強度，使移植肌腱具有更強的抗拉力性、韌性和彈性，為ACL重建康復治療提供了新的思路和方法。但KGN促進ADSCs增殖分化的最佳劑量、KGN-ADSCs促進腱骨愈合的作用機制及其通路，均有待進一步研究明確。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經新疆醫科大學實驗動物倫理委員會批準（IACUC-2011015-03）；實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003
作者貢獻聲明 巨嘯晨、姜侃：研究設計；陳剛：研究實施及文章撰寫；劉蒙飛、何海洋：數據收集整理；鄭乾：統計分析
前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是膝關節重要穩定結構，主要作用是防止脛骨過度前移[1]。ACL斷裂是一種常見運動損傷，可導致一系列并發癥，如半月板損傷、膝關節退行性病變、運動功能障礙等[2]。為恢復膝關節運動功能，往往需要在關節鏡下重建韌帶[3]。但重建術后韌帶仍可能發生再次撕裂，腱骨愈合不良是主要原因之一[4-6]。相比于骨與骨之間的愈合，腱骨愈合是一個復雜、多階段、耗時長的過程，一般愈合能力較差[7]。因為腱骨愈合不良，患者術后不能早期康復鍛煉，進而影響了手術效果[8]。因此，研究如何促進腱骨愈合、降低重建韌帶再次斷裂風險，對于改善康復效果和患者生活質量具有重要意義。
近年來，針對腱骨愈合的影響因素，不斷涌現出許多新的治療方法和技術，如生長因子治療、干細胞治療、自體組織移植、肌腱固定材料應用、改良手術方式等，雖取得了一定成效，但也存在一定局限性，例如生長因子半衰期短、難以持續高效表達，無法在局部持續發揮作用[9-11]。組織工程技術是一種利用細胞、生物材料和生長因子等修復重建組織、器官的方法，實現組織功能恢復和再生。利用組織工程技術促進ACL重建后腱骨愈合，也成為國內外研究熱點。脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有來源豐富、取材簡便、免疫原性低、增殖速度快等優點[12-13]，在特定誘導條件下可定向分化為骨、軟骨、肌肉、肌腱等組織，同時能促進軟骨和骨的局部修復和再生，已被廣泛應用于組織工程研究中[14-16]。但研究發現在腱骨界面直接注射ADSCs容易發生細胞丟失和細胞死亡，無法獲得最佳治療效果[17]。Kartogenin（KGN）是一種小分子化合物，能促進MSCs特異性分化為軟骨細胞，具有促軟骨形成和增強腱骨愈合的作用[18]。但其存在最大效應濃度，難以發揮最大生物學效應，而且單獨注射至腱骨界面會產生不良反應，在肌腱移植物中形成非腱性組織[19]。上述研究結果提示單獨使用MSCs或生物分子材料促進腱骨愈合具有一定局限性。為此，本研究應用組織工程技術將KGN與ADSCs聯合，通過兔ACL重建模型觀察其對腱骨愈合的影響，以期為促進腱骨愈合提供新方法。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年新西蘭大白兔80只，雌雄不限，體質量（2.5±0.5）kg，由新疆醫科大學動物實驗中心提供。飼養條件：室溫（25±2）℃，濕度60%～80%。
兔ADSCs（欣潤生物科技有限公司）；KGN（上海源葉生物科技有限公司）；凍干纖維蛋白膠（華蘭生物工程股份有限公司），活性成分包括凍干人纖維蛋白原、凍干人纖維蛋白原溶解液、凍干人凝血酶、凍干人凝血酶溶解液；FBS、PBS緩沖液、DMEM/F12培養基、DMSO、改良HE染色試劑盒、舒泰（Virbac公司，法國）；c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）試劑盒（上海康朗生物科技有限公司）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。
熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；數字化電子萬能生物材料試驗機（深圳德邁勝測控設備有限公司）；醫用電動鉆（天津正天醫療器械有限公司）；Image-Pro Plus（IPP）圖像分析系統（成都勝圖科技有限公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 ADSCs傳代培養
取原代ADSCs加入完全培養基（含10%FBS及1%青、鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基），置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。倒置相差顯微鏡下觀察約80%細胞貼壁時，使用胰蛋白酶消化處理后，按1∶3比例進行傳代培養，取第3代細胞進行實驗。
1.2.2 KGN-ADSCs上清液制備
將KGN粉末溶于DMSO中，制備濃度為10 μmol/L的KGN溶液備用。將3代ADSCs接種于6孔板，每孔2×105個細胞；加入含2%PBS的DMEM培養基、0.2 μmL KGN溶液，置于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養72 h后，提取上清液備用。
1.2.3 纖維蛋白膠制備
37℃條件下，取凍干纖維蛋白膠中的凍干人纖維蛋白原溶解液，注入凍干人纖維蛋白原瓶內，獲得凍干人纖維蛋白原溶液；將凍干人凝血酶溶解液注入凍干人凝血酶瓶內，獲得凍干人凝血酶溶液。將2種溶液混合即得纖維蛋白膠，于使用前4 h制備后，按1∶1比例分別與0.1 mL ADSCs細胞懸液、0.1 mL KGN-ADSCs上清液混合。
1.2.4 動物模型制備及分組
取80只新西蘭大白兔，采用隨機數字表法分為4組，分別為生理鹽水組（A組）、ADSCs組（B組）、KGN-ADSCs組（C組）、假手術組（D組），每組20只。各組動物肌肉注射舒泰（7 mg/kg）麻醉后，取雙后肢備皮消毒鋪巾。
① 肌腱移植物制備：A～C組于跟腱后方內側作長2 cm縱切口，取長3～4 cm、直徑2 mm跟腱，對折后使用5-0醫用綿綸單絲線編織縫合游離端，并預留長約10 cm線尾[20]。
② ACL重建：各組取膝關節髕旁內側手術入路，作長約2 cm縱切口，依次分離切開筋膜、關節囊及內側支持帶；將髕骨推向外側至脫位，充分暴露關節腔，其中A、B、C組切斷ACL，同時保留脛骨側殘端；D組不作ACL切斷及后續處理。屈曲膝關節于90° 位，采用直徑2 mm克氏針分別建立脛骨端與股骨端隧道。自脛骨端向股骨端引入肌腱移植物，將兩端肌腱收緊，并將預留的尾線穿過縫合針，使用縫合針穿透股骨與脛骨隧道骨質，隨后將尾線進行反復打結，將移植肌腱兩端固定于骨隧道外側，同時與周圍骨膜、筋膜等組織縫合加強固定，探查張力滿意，ACL重建模型制備成功[21]。根據分組分別于腱骨界面和移植肌腱間隙中注射0.2 mL相應材料，A組生理鹽水、B組ADSCs與纖維蛋白膠混合液、C組KGN-ADSCs上清液與纖維蛋白膠混合液。見圖1。
圖1
動物模型制備示意圖
a. 肌腱移植物；b. 重建ACL 箭頭示移植肌腱；c～e. 于ACL骨隧道及移植肌腱內注射材料
Figure1. Schematic diagram of the animal model preparationa. Tendon graft; b. Reconstruction of ACL Arrow for grafted tendon; c-e. Material was injected into ACL bone tunnels and grafted tendon
待腱骨界面及移植肌腱中注射材料充分吸收后，用生理鹽水充分沖洗關節腔，逐層縫合切口。術后分籠飼養，患肢不制動，切口不包扎，定期清潔換藥；術前及術后3 d內肌肉注射青霉素預防感染。于術后6、12周，每組各取10只動物，采用過量舒泰安樂死后取材進行觀測。
1.2.5 觀測指標
① 一般情況：術后觀察各組動物切口愈合以及后肢運動恢復情況，有無感染、死亡發生。
② HE染色：取A～C組一側后肢部分腱骨組織及ACL、D組一側正常ACL（脛骨側）標本，置于10%多聚甲醛溶液固定、脫水、浸蠟包埋、切片（片厚5 μm）。常規HE染色后，光鏡下觀察4組韌帶以及A～C組腱骨界面情況，每張切片取5個高倍視野（10×40），采用IPP 圖像分析系統計數韌帶組織中成纖維細胞，取均值。
③ TUNEL細胞凋亡檢測：取 ② 中制備的部分切片，按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行處理。光鏡下觀察呈棕褐色染色為陽性細胞，即凋亡細胞。隨機選取5個高倍視野，每個視野連續計數100個細胞中凋亡細胞數，取均值，即為凋亡指數（apotosis index，AI）[22]。
④ JNK免疫組織化學染色：參照JNK試劑盒說明書采用SP染色法進行操作。取 ② 中制備的部分切片脫蠟、水化預處理，抗原修復處理，加入JNK特異性一抗、辣根過氧化物酶標記二抗，DAB顯色，對樣本進行染色、脫水、透明化等后處理步驟。于光鏡下觀察韌帶中細胞核染色情況，以細胞核呈棕黃色為陽性染色，白色為陰性染色。測量陽性染色細胞率及染色強度并計分，其中陽性染色細胞率≤10% 0分、11%～25% 1分、26%～50% 2分、>50% 3分，陽性染色強度為無染色0分、黃色染色1分、棕黃色染色2分、棕褐色染色3分；兩項評分總和<2分為陰性表達，≥2分為陽性表達。計算JNK蛋白陽性表達率。
⑤ 生物力學檢測：取4組另一側后肢脛骨-韌帶-股骨標本，固定于數字化電子萬能生物材料試驗機進行拉力試驗。按1 mm/s速度拉伸直至樣本斷裂，記錄此時最大載荷及肌腱從韌帶止點脫出時的最大拉伸距離。
1.3 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料經正態性檢驗，均符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組內兩時間點間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
術后8只動物因切口感染排除研究（A～C組分別為3、1、4只）；20只死亡（A～D組分別5、7、4、4只，其中腹瀉死亡7只、不明原因死亡5只、飼養不當死亡8只。最終52只動物納入研究，A～D組分別為12、12、12、16只。
2.2 HE染色觀察
2.2.1 腱骨界面
術后6周，A組移植肌腱與骨組織間可見明顯間隙，僅可見極少成纖維細胞；B組移植肌腱與骨組織間可見明顯間隙，有少量成纖維細胞；C組腱骨界面有大量膠原纖維形成，并凝集成束，肌腱與骨組織已結合，但連接不緊密，仍可見骨組織與移植肌腱存在少量間隙。見圖2a。
圖2
各組腱骨界面HE染色觀察（×40）
從左至右分別為A～C組 箭頭示移植肌腱與骨組織間隙，B：骨組織，T：移植肌腱 a. 術后6周；b. 術后12周
Figure2. HE staining observation of the tendon-bone interface in each group (×40)From left to right for groups A-C, respectively Arrow for the gap between the grafted tendon and the bone tissue, B: bone tissue, T: grafted tendon a. Six weeks after operation; b. Twelve weeks after operation
術后12周，A組移植肌腱與骨組織連接較前改善，間隙逐漸縮窄，但仍未連接融合，可見少量成纖維細胞浸潤；B組移植肌腱與骨組織間部分建立初步連接但仍疏松，間隙較前縮窄，可見大量成纖維細胞，并形成少量膠原纖維；C組腱骨界面可見大量軟骨組織形成，移植肌腱與骨組織連接致密，骨與肌腱逐步融合，腱骨愈合趨于成熟。見圖2b。
2.2.2 ACL
D組：正常ACL表面被大量滑膜組織包裹，成纖維細胞較少，其細胞核主要以橢圓形為主，且大部分分布在膠原纖維中，膠原纖維排列規則有序，呈波浪狀。
術后6周，A～C組成纖維細胞逐漸增多，均多于D組，且細胞排列紊亂，細胞核主要以梭形為主。12周時，A～C組成纖維細胞較6周時減少，但仍多于D組；其中A、B組細胞仍排列雜亂無規律，C組可見大量膠原纖維形成，逐漸凝集成束，排列有序，趨于形成正常ACL結構。見圖3。
圖3
各組ACL HE染色觀察（×40）
從左至右分別為A～D組 a. 術后6周；b. 術后12周
Figure3. HE staining observation of ACL in each group (×40)From left to right for groups A-D, respectively a. Six weeks after operation; b. Twelve weeks after operation
術后6、12周，4組間成纖維細胞計數差異均有統計學意義（P<0.05）。A～C組術后12周成纖維細胞計數均較6周減少，其中C組差異有統計學意義（P<0.05）； D組兩時間點間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
術后6、12周各組組織學及生物力學觀測指標比較（）
Table1.
Comparison of histologic and biomechanical observations between groups at 6 and 12 weeks after operation（）
2.3 TUNEL細胞凋亡檢測
術后6周，A～C組可見成纖維細胞形成，細胞核呈黑色梭形，且C組成纖維細胞明顯多于其余3組；12周時，A～C組成纖維細胞逐漸減少，存在部分細胞凋亡。D組兩時間點成纖維細胞數量未見明顯變化。見圖4。
圖4
各組細胞凋亡觀察（×40）
從左至右分別為A～D組 a. 術后6周；b. 術后12周
Figure4. Apoptosis observation in each group (×40)From left to right for groups A-D, respectively a. Six weeks after operation; b. Twelve weeks after operation
術后6、12周4組間AI差異均有統計學意義（P<0.05）。A～C組術后12周時AI較6周時降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；D組兩時間點差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
2.4 JNK免疫組織化學染色
術后6周各組細胞核均呈棕黃色，12周時染色逐漸變淺；兩時間點C組染色最深、B組其次（圖5）。術后6、12周，C組JNK蛋白陽性表達率高于其他3組，差異有統計學意義（P<0.05）； A、B、D組間差異無統計學意義（P>0.05）。術后12周A～C組JNK蛋白陽性表達率均較6周時下降，差異有統計學意義（P<0.05）；D組兩時間點間差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。
圖5
各組JNK免疫組織化學染色觀察（×10）
從左至右分別為A～D組 a. 術后6周；b. 術后12周
Figure5. JNK immunohistochemical staining observation in each group (×10)From left to right for groups A-D, respectively a. Six weeks after operation; b. Twelve weeks after operation
2.5 生物力學測試
術后6、12周，D組最大載荷高于A～C組，C組高于A、B組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間差異無統計學意義（P>0.05）。D組最大拉伸距離小于A～C組，C組小于A、B組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、B組間差異無統計學意義（P>0.05）。
與術后6周相比，術后12周A～C組最大載荷增大、最大拉伸距離減小，差異均有統計學意義（P<0.05）。D組兩時間點間差異均無統計學無意義（P>0.05）。見表1。
3 討論
Kosaka等[16]研究發現ADSCs移植后腱骨界面出現致密纖維血管組織，同時形成連接肌腱和骨組織的Sharpey樣纖維，且軟骨細胞排列均勻有序，增強了腱骨界面的最大載荷及剛度。Oh等[23]的研究顯示通過局部注射ADSCs，兔肩袖撕裂模型腱骨界面最大失效負荷提高，促進了腱骨愈合。KGN作為一種小分子材料，可刺激干細胞增殖以及誘導其向軟骨組織、骨組織、腱組織方向分化，并在體內加速肌腱組織形成軟骨組織，從而增強腱骨界面愈合[24-27]。但KGN存在疏水性、無靶向能力、循環效率差和功效有限等缺點[19]，因此單獨注射KGN溶液可能會擴散到鄰近區域，導致膝關節鄰近區域形成過多軟骨樣組織，對腱骨愈合產生負面影響，且不能有效形成纖維軟骨[28]。有研究發現低濃度KGN（10、100 nmol/L）能誘導BMSCs形成軟骨組織和骨組織，而較高濃度KGN（1、5 μmol/L）可使腱骨界面形成大量軟骨樣組織，有效促進腱骨界面的纖維軟骨帶形成[29]。為此，本研究將濃度為10 μmol/L的KGN聯合ADSCs注射至兔重建ACL的腱骨界面，探討其能否促進腱骨愈合。
組織學染色觀察是評估腱骨愈合最常用的研究方法[22]，本研究選擇該方法觀察術后骨與肌腱組織之間的間隙變化，評估腱骨愈合情況。結果顯示隨著時間推移，肌腱與骨組織空隙逐漸縮小，腱骨界面形成大量軟骨細胞及新骨并與肌腱移植物逐漸融合，形成膠原纖維與軟骨細胞移行帶。腱骨界面連接愈加緊密牢固，趨近于形成正常韌帶結構。我們分析KGN與ADSCs聯合應用促進腱骨愈合的原因主要有兩方面：一方面，KGN作為ADSCs載體，可以提供一種支持和促進細胞生長和分化的環境，同時還可以釋放生長因子，刺激細胞增殖、分化和再生，有助于腱骨愈合。另一方面，ADSCs彌補了KGN的疏水性、無靶向能力缺點，二者協同效應，共同促進軟骨形成，加速腱骨愈合，提高腱骨愈合質量。
肌腱移植物中的成纖維細胞計數是評估移植物愈合的重要指標[29]。本研究結果顯示，A～C組術后早期可見大量成纖維細胞，后期逐漸減少，表明肌腱移植物經歷了缺血性壞死、細胞生長和細胞消失的愈合過程，最后恢復為正常。但C組成纖維細胞數量顯著多于其余各組，分析引起成纖維細胞增殖的原因主要有以下幾點：首先，ADSCs能自我分化，調節細胞增殖、遷移、分化[30]，導致早期B、C組中成纖維細胞數量均高于D組。其次，后期由于肌腱移植物中干細胞濃度下降，導致對肌腱移植物中的細胞增殖作用明顯減弱。本研究KGN和ADSCs聯合運用后，KGN可促進ADSCs增殖并誘導其分化為腱組織，提高肌腱愈合質量；同時ADSCs能夠抑制炎癥反應，減輕韌帶水腫，減少中性粒細胞，從而使移植物肌腱更具彈性，瘢痕修復減少[31]。本研究KGN聯合ADSCs 組肌腱移植物中細胞排列規則有序，形成大量膠原纖維，且凝集成束，趨近于正常韌帶結構，其愈合效果有明顯優勢。
腱骨愈合過程中，生物因子往往是通過信號通路發揮生物學作用的。研究表明上調TGF-β的表達水平能促進ACL愈合，同時發現TGF-β/MAPK信號通路關鍵蛋白p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、c-Jun和c-Myc也隨之表達增加；隨后研究人員又通過TGF-β抑制實驗，進一步證明TGF-β/MAPK信號通路在腱骨愈合過程中的調節作用[29]。隨著TGF-β/MAPK信號通路被激活，其關鍵蛋白JNK的表達可調節細胞增殖、凋亡[32]。因此本研究采用免疫組織化學染色檢測JNK蛋白表達，結果顯示ACL重建術后早期隨著JNK蛋白表達增加，細胞增殖愈強，這與組織染色觀察結果一致。因此，我們分析腱骨愈合可能與TGF-β/MAPK信號通路有關，隨著信號通路被激活，關鍵蛋白JNK表達增加，促進了腱骨愈合。但腱骨愈合受多種信號通路影響，未來仍需要對其進行深入研究。
生物力學是評估ACL重建后肌腱移植物愈合質量的重要參數，可以反映肌腱移植物與骨組織之間的連接強度和抗拉能力。本研究結果顯示C組最大拉伸距離及最大載荷與A、B組存在顯著差異，可能是因為肌腱移植物生物力學特性取決于其在骨隧道內愈合情況，A、B組骨組織與腱組織愈合情況欠佳，肌腱與骨組織未建立連接，而C組隨著時間延長腱骨界面連接緊密，可提供腱骨界面機械強度及抗拉力性，和組織學結果表現一致。
綜上述， KGN聯合ADSCs可促進腱骨愈合，增強腱骨界面機械強度，使移植肌腱具有更強的抗拉力性、韌性和彈性，為ACL重建康復治療提供了新的思路和方法。但KGN促進ADSCs增殖分化的最佳劑量、KGN-ADSCs促進腱骨愈合的作用機制及其通路，均有待進一步研究明確。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經新疆醫科大學實驗動物倫理委員會批準（IACUC-2011015-03）；實驗動物使用許可證號：SYXK（新）2018-0003
作者貢獻聲明 巨嘯晨、姜侃：研究設計；陳剛：研究實施及文章撰寫；劉蒙飛、何海洋：數據收集整理；鄭乾：統計分析
