引用本文： 關煥帥, 曹若木, 趙奕威, 張杰聞, 李恒, 段續東, 李沂陽, 孔寧, 田潤, 王坤正, 楊佩. 褪黑素對卵巢摘除大鼠體內炎癥狀態及BMSCs成骨能力影響的研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(8): 1011-1020. doi: 10.7507/1002-1892.202304001 復制
骨質疏松癥是一種全身骨礦物質密度降低、骨微結構破壞和骨脆性增加的疾病[1]，已成為全球最嚴重的公共衛生問題之一，給絕經后婦女和老人帶來嚴重危害[2]。據調查，截至2016年中國已有1.4億人患有骨質疏松癥[3]，專家推測至2050年，中國的骨質疏松癥或骨密度降低患者數將達到2.12億[4]。目前臨床應用的抗骨質疏松癥藥物如雙磷酸鹽等存在副作用大、價格高、患者依從性差等缺點[5]。因此，探索新的針對骨質疏松癥的治療手段具有重要意義。
骨穩態失衡是導致骨質疏松癥發生的重要原因，而骨形成和骨吸收共同決定著骨穩態。骨形成和骨吸收之間的不平衡與各種疾病有關，其中炎癥會導致過度骨吸收以及骨形成受損[6-7]。促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6可促進破骨細胞生成，增強破骨細胞功能，引起骨吸收增加[8]；此外，它們還可以抑制成骨細胞生成，導致骨形成減少[9]。骨質疏松癥的發生可能與炎癥有關，有研究者發現雌激素水平降低和衰老促進體內低度炎癥并與骨量減少相關[10-13]，且許多炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的水平在骨質疏松癥發病過程中增加[7，14]。Wang等[15]發現衰老骨細胞產生的炎癥可介導與年齡相關的骨質流失。Cline-Smith等[10]則通過觀察卵巢摘除（ovariectomy，OVX）小鼠，發現雌激素缺失可誘導樹突狀細胞產生高水平的IL-17和IL-15，激活由記憶T細胞介導的慢性低度炎癥，進而在破骨形成和骨質流失中發揮作用。一項橫斷面研究顯示，全身免疫炎癥指數與絕經后婦女的骨密度降低和骨質疏松癥有關，而與絕經前婦女無關[16]。此外，Damani等[7]通過對12個月隨機對照試驗受試者的基線數據進行橫斷面二次分析，發現炎癥標志物與絕經后婦女的骨密度、幾何形狀和強度等成負相關，表明炎癥標志物可能是絕經后骨質流失的重要介質。因此，改善骨質疏松癥患者體內的低度炎癥狀態，可能為骨質疏松癥的治療提供新思路。
褪黑素（melatonin，MT）是一種主要由松果體分泌的激素，幾乎存在于哺乳動物體內的所有部位[17]。其已被證實能發揮多種生理作用，例如晝夜節律、調節睡眠、抑制炎癥、抗氧化應激等。許多研究表明，MT參與骨量的調節，可以減輕絕經后骨質疏松癥的骨丟失[18]。Ren等[19]發現MT可以通過PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信號通路修復鐵過載大鼠的骨質疏松性骨缺陷；而Da等[20]發現MT通過增強成骨細胞的檸檬酸鹽分泌，對絕經后的骨質流失起保護作用。此外，MT還被證實可以上調BMSCs的成骨作用[21-22]，增強骨形成。然而，MT能否降低骨質疏松癥的低度炎癥和挽救炎癥狀態下的成骨分化尚不明確。脂多糖是革蘭陰性菌的外膜成分，可以激活Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB信號通路并誘導促炎細胞因子表達，已在誘導炎癥等方面得到廣泛應用[23]。既往相關研究表明，脂多糖可以抑制MSCs的成骨分化[24]，因此我們選擇脂多糖刺激BMSCs產生炎癥反應。本研究旨在探究口服MT對OVX大鼠骨量和體內炎癥的影響，并進一步探究MT能否減弱脂多糖誘導的炎癥環境對BMSCs成骨分化的抑制作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
清潔級SD雌性大鼠18只（15只為12周齡，體質量290～310 g，平均302.0 g；3只為3周齡，體質量45、51、53 g），由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，分籠飼養，每籠5只，室內溫度22～24°C，相對濕度50%～60%，自然晝夜照明，光照時間12 h，自由飲水，標準實驗室嚙齒動物飼料喂食。
MT（MCE公司，美國）；脂多糖（北京索萊寶科技有限公司）；DMEM培養基、FBS、青/鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（GIBCO公司，美國）；PBS（武漢塞維爾生物科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；Donjindo公司，日本）；抗CD90、CD105、CD34、CD45流式抗體（BioLegend公司，美國）；ALP、茜素紅染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；TRIzol試劑（TaKaRa公司，日本）；PCR逆轉錄試劑盒（北京康潤誠業生物科技有限公司）；SYBR Green qPCR試劑（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；ELISA檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。
微量移液器（Eppendorf公司，德國）；25 cm2培養瓶、6孔板、96孔板（浙江碩華生命科學研究股份有限公司）；酶標儀（Omega公司，德國）；倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；PCR、實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（Bio-Rad公司，美國）；流式細胞儀（BD公司，美國）；Y.Cheetah Micro-CT系統（Yxlon公司，德國）；VG Studio Max 3.0軟件（Volume Graphics公司，德國）；Image J軟件（National Institutes of Health，美國）。
1.2 MT對OVX大鼠骨量及血清炎癥因子的影響
1.2.1 動物模型制備及分組方法
取15只12周齡SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分為3組，假手術組、OVX組、OVX+MT組，每組5只。假手術組大鼠僅接受雙側側腹部切開縫合，OVX組行雙側OVX，OVX+MT組在雙側OVX術后進行100 mg/（kg·d）MT口服干預。干預8周后用戊巴比妥過量麻醉處死大鼠，取血液和股骨樣本備用。
1.2.2 Micro-CT檢測
取大鼠股骨樣本以4%多聚甲醛固定3 d后，使用Micro-CT系統對股骨遠端微結構進行掃描，使用VG Studio Max 3.0軟件行三維重建，并定量檢測骨體積分數（bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）來評價骨量及骨微結構情況。
1.2.3 ELISA檢測
將大鼠血液樣本以300×g離心15 min，小心吸取上清并置于新的EP管中；使用ELISA檢測試劑盒檢測血清中的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平。
1.3 MT對脂多糖刺激引起BMSCs炎癥及成骨能力改變的影響
1.3.1 BMSCs的分離及培養
將3只3周齡SD大鼠用過量戊巴比妥麻醉處死后置于75%乙醇中浸泡，分離股骨后用PBS沖洗。剪開股骨兩端，用適量DMEM培養基將骨髓沖至離心管中，反復多次，150×g離心5 min后用完全培養基（含10%FBS和1%青/鏈霉素溶液的DMEM培養基）重懸，在37°C、5%CO2孵箱中培養，每3天換液1次，細胞達80%～90%融合時，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞，按照1∶（2～3）比例傳代。取對數生長期的第3代細胞，采用流式細胞儀檢測表面標志物CD90、CD105、CD34、CD45表達。取第3～5代細胞用于后續實驗。
1.3.2 MT最佳藥物濃度測定
實驗分為5組，分別為空白對照組及1、10、100、1 000 μmol/L MT干預組。用完全培養基按1×103個/孔密度將BMSCs接種于96孔板中，在37°C、5%CO2孵箱中培養過夜，貼壁后進行相應干預。于干預0、24、48、72 h時將培養液吸出，加入90 μL DMEM培養液和10 μL CCK-8試劑，孵育約4 h后使用酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值。根據A值判斷細胞增殖與活力，A值越高細胞越多、活力越好，選擇不影響細胞活性的最大濃度為MT最佳藥物濃度。
1.3.3 細胞實驗分組及ELISA檢測
將BMSCs以1×106個/孔或5×105個/孔密度接種于6孔板或12孔板中，培養至60%～70%融合。首先將細胞分為4組，分別為A組 ［成骨誘導培養基（含0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL抗壞血酸的完全培養基）培養］、B組（成骨誘導培養基+1 μg/mL脂多糖培養）、C組（成骨誘導培養基+5 μg/mL脂多糖培養）、D組（成骨誘導培養基+10 μg/mL脂多糖培養）。每2～3天換液1次，收集各組培養48 h的培養液，同1.2.3方法用ELISA法檢測細胞培養液中炎癥因子表達水平。根據CCK-8法和ELISA檢測結果，用刺激炎癥效果最顯著濃度的脂多糖以及最佳藥物濃度的MT加成骨誘導培養基對細胞進行干預，并設為E組，同樣采用ELISA法檢測各炎癥因子表達水平。取A、D、E組細胞進行后續檢測。
1.3.4 ALP染色
培養7 d后吸去培養液，PBS清洗2次后加入4%多聚甲醛固定30 min；再次用PBS清洗2次后加入ALP染液，室溫下避光染色約60 min；吸去染色液后用PBS洗滌并拍照，之后使用Image J軟件分析陽性面積百分比。
1.3.5 茜素紅染色
培養14 d后吸去培養液，PBS清洗2次后使用4%多聚甲醛固定30 min；用雙蒸水沖洗后加入茜素紅染色液染色，室溫下染色約30 min后，再次用雙蒸水沖洗2次后拍照，之后使用Image J軟件分析陽性面積百分比。
1.3.6 RT-qPCR檢測
培養7 d后吸去培養液，使用TRIzol法提取細胞中的總RNA，再按照說明書將RNA逆轉錄為cDNA。之后按照以下條件進行RT-qPCR：95℃、3 min；95℃、5 s，60℃、32 s，42個循環。以GAPDH為內參，采用2–ΔΔCt法計算目的基因Ⅰ型膠原α1鏈（collagen type Ⅰ alpha 1 chain，Col1a1）、RUNX家族轉錄因子2（RUNX family transcription factor 2，Runx2）mRNA相對表達量。引物序列見表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of RT-qPCR
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MT對OVX大鼠骨量及血清炎癥因子的影響
2.1.1 MT對OVX大鼠骨量的影響
Micro-CT檢測示，OVX組大鼠骨量較假手術組減少，骨小梁明顯稀疏，排列紊亂；而OVX+MT組大鼠骨量較OVX組有所增加，骨小梁稀疏程度得到改善，排列更加規則有序。見圖1a～c。定量檢測示，假手術組和OVX+MT組BV/TV、Tb.N均顯著高于OVX組，差異有統計學意義（P<0.05）；假手術組和OVX+MT組間差異亦有統計學意義（P<0.05）。3組間Tb.Th比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖1d～f。
圖1
大鼠股骨遠端Micro-CT檢測
a～c. 分別為大鼠股骨遠端重建圖、水平面圖、冠狀面圖 從左至右分別為假手術組、OVX組、OVX+MT組；d～f. 各組骨相關參數BV/TV、Tb.Th、Tb.N比較 *
a-c. Reconstruction figures, transverse position figures, and coronal position figures of distal femurs in rats From left to right for Sham group, OVX group, and OVX+MT group, respectively; d-f. Comparison of BV/TV, Tb.Th, and Tb.N in each group *
2.1.2 MT對OVX大鼠體內炎癥的影響
ELISA檢測示，OVX組大鼠體內炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表達水平顯著高于假手術組和OVX+MT組，差異有統計學意義（P<0.05）；OVX+MT組IL-6、TNF-α表達水平高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05），兩組間IL-1β表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。
圖2
ELISA檢測各組大鼠血清炎癥因子表達水平
*
*
2.2 MT對脂多糖刺激引起BMSCs炎癥及成骨能力改變的影響
2.2.1 BMSCs形態學觀察、鑒定及MT對BMSCs活力的影響
倒置顯微鏡觀察示原代細胞呈長梭形。流式分析結果示，細胞CD90和CD105為陽性表達，CD34和CD45為陰性表達，符合MSCs的表達特性。CCK-8法檢測示，隨時間延長各組A值均逐漸增加，0、24、48 h時各組間A值比較差異均無統計學意義（P>0.05）； 72 h時1 000 μmol/L MT干預組細胞活力明顯低于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）。因此，為了不影響細胞活力，選擇100 μmol/L MT進行后續實驗。見圖3。
圖3
BMSCs形態學觀察、流式鑒定及CCK-8檢測
a. 原代BMSCs形態學觀察（倒置顯微鏡×40）；b～e. BMSCs的流式分析鑒定；f. CCK-8法檢測各組細胞活力 *
a. The morphology of primary BMSCs (Inverted microscope×40); b-e. Flow cytometry detection of BMSCs; f. Cell viability detected by CCK-8 assay *
2.2.2 MT對脂多糖刺激下BMSCs成骨分化的影響
ELISA檢測示，加入脂多糖刺激后，B～D組細胞培養液中的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平明顯升高，與A組比較差異均有統計學意義（P<0.05）；并且呈濃度依賴性，D組各炎癥因子表達水平明顯高于B、C組，差異有統計學意義（P<0.05）；因此選擇10 μg/mL作為脂多糖刺激炎癥最顯著濃度進行后續檢測。E組加入MT干預后，各炎癥因子表達水平較D組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4 a。
圖4
MT對脂多糖刺激下BMSCs成骨分化的影響
*
*
ALP染色、茜素紅染色及RT-qPCR檢測示，與A組比較，D組ALP和茜素紅陽性面積百分比以及Col1a1、Runx2 mRNA相對表達量均顯著降低，經MT干預后E組上述指標均顯著提升，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4b～d。
3 討論
絕經后骨質疏松癥的特征是雌激素減少、骨量降低和骨微結構破壞，其發生與骨形成和骨吸收失衡密不可分。MT作為松果體產生的一種激素，可在多種疾病中發揮抗炎和抗氧化作用[18]。越來越多證據表明MT對骨骼健康起有益作用[18-19，25]。研究者發現血漿MT水平降低與骨量減少之間存在關聯[26]。Cao等[27]發現絕經后骨質疏松癥女性的血清MT水平有明顯降低，OVX大鼠中也可觀察到血清MT濃度降低，絕經后骨質疏松癥發展的骨代謝標志物也與血清MT的變化顯著相關[18]；此外，在松果體摘除的羊中可觀察到骨量減少和骨微結構破壞[28]；這些結果均提示絕經后骨質疏松癥與MT相關。MT可以通過調節PRMT1介導的信號傳導來抑制OVX小鼠的破骨細胞生成和骨質流失[29]，也可以通過肝細胞生長因子/Wnt/β-連鎖蛋白信號通路促進BMSCs的成骨分化[21]。此外，MT可以通過MT受體2/NF-κB信號通路抑制破骨細胞生成[22]。這些結果顯示MT可能是一種新的絕經后骨質疏松癥治療手段。
絕經后骨質疏松癥的發生可能與炎癥有關。炎癥在許多疾病中發揮重要作用，絕經后雌激素水平降低，炎癥因子在體內積累，導致骨形成受損和骨量減少[30-31]。炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α刺激破骨細胞的分化、激活和存活，增強其活性，導致骨吸收增加[32]。研究表明，絕經后骨質疏松癥女性血清中高表達IL-1β、IL-6和TNF-α[33-34]；去OVX大鼠血清中炎癥因子水平也顯著升高[35-36]；提示炎癥反應可能參與了絕經后骨質疏松癥的發生與發展，炎癥標志物可能是絕經后骨質流失的重要介質。而MT具有抗炎特性及維持骨量的功能，其可能通過抑制體內的低度炎癥狀態來挽救絕經后骨質疏松癥患者的骨量，但這需要進一步驗證。本研究中，Micro-CT掃描顯示OVX大鼠的骨量明顯減少，提示骨質疏松癥模型建立成功；ELISA檢測示OVX大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平顯著升高，提示其體內存在炎癥。經MT治療后OVX大鼠體內炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平顯著降低，提示MT可能通過降低體內炎癥對絕經后骨質疏松癥的骨量產生影響，與既往研究結果類似[21-22]。炎癥因子可以通過激活NF-κB信號通路來介導骨生理學，增加骨質疏松癥和骨脆性骨折風險[14]；TNF-α和IL-1β可激活NF-κB和MAPK信號通路，增強RANKL和巨噬細胞集落刺激因子的產生并下調骨保護素的表達，導致骨重塑缺陷[6]。OVX后大鼠海馬體中的TLR4和活性NF-κB水平顯著增加，進而引起神經炎癥[37]；而TLR4/NF-κB信號通路已被證明在其他疾病中可以介導MT發揮抗炎特性[38]，因此也可能介導MT抑制絕經后骨質疏松癥引起的低度炎癥，但仍需進一步研究明確。
BMSCs具有自我更新和多向分化的潛能，是維持骨穩態的重要造骨細胞[39]。在炎癥環境下，BMSCs表現出促炎表型，產生促炎因子[40]。炎癥可抑制BMSCs成骨分化，炎癥相關NF-κB信號通路的持續表達可以減少BMSCs的遷移和成骨分化，而炎癥因子則誘導BMSCs凋亡和抑制BMSCs成骨分化[40]。脂多糖已被證明可以在BMSCs[41]和MC3T3-E1細胞[42]中誘導炎癥并引起成骨分化的抑制作用。本研究發現脂多糖濃度依賴性地誘導BMSCs培養液中IL-1β、IL-6和TNF-α的產生，其中10 μg/mL脂多糖能顯著增加培養液中炎癥因子的產生，誘導炎癥環境。而MT干預能顯著降低細胞培養液中炎癥因子水平，抑制脂多糖誘導的炎癥。Col1a1和Runx2是常用的成骨分化標志物，其表達水平在一定程度上能反映成骨能力；而ALP和骨礦化水平則是直接反映成骨能力的指標[43]。在本研究中，脂多糖誘導的炎癥環境下BMSCs的ALP水平和礦化能力明顯下降，Col1a1和Runx2的水平也明顯下降，表明脂多糖誘導的炎癥環境明顯抑制了BMSCs的成骨。MT通過Wnt/β-catenin通路促進BMSCs成骨分化，通過PPARγ通路抑制BMSCs成脂分化[44-45]；通過調節SIRT1/p66SHC通路來抑制H2O2誘導的成骨細胞氧化應激損傷并促進成骨[46]。TLR4是細菌內毒素的信號受體，脂多糖可以激活TLR4，進而導致NF-κB激活，從而調節各種炎癥介質表達，最終引起組織破壞[47]。本研究發現，MT干預能增加脂多糖誘導下BMSCs的成骨能力，表明其可以減弱脂多糖對BMSCs的成骨抑制從而挽救其成骨能力，且這種作用可能通過TLR4/NF-κB信號通路實現。
綜上述，本研究發現OVX大鼠體內存在炎癥，MT治療可能通過抑制OVX大鼠體內的炎癥減少骨丟失，挽救骨量。脂多糖刺激能引起BMSCs細胞培養液中炎癥因子增多，抑制成骨分化；MT干預能減少炎癥因子產生，挽救BMSCs的成骨能力。但具體作用機制有待進一步研究明確。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經西安交通大學醫學部醫學生物科研倫理委員會批準（2021-1566）；實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2020-005
作者貢獻聲明 關煥帥：論文撰寫、數據采集及資料收集；曹若木、趙奕威、張杰聞：數據收集及論文修改；李恒、段續東、李沂陽：數據收集及分析；孔寧、田潤：論文指導；王坤正、楊佩：課題設計及經費支持
骨質疏松癥是一種全身骨礦物質密度降低、骨微結構破壞和骨脆性增加的疾病[1]，已成為全球最嚴重的公共衛生問題之一，給絕經后婦女和老人帶來嚴重危害[2]。據調查，截至2016年中國已有1.4億人患有骨質疏松癥[3]，專家推測至2050年，中國的骨質疏松癥或骨密度降低患者數將達到2.12億[4]。目前臨床應用的抗骨質疏松癥藥物如雙磷酸鹽等存在副作用大、價格高、患者依從性差等缺點[5]。因此，探索新的針對骨質疏松癥的治療手段具有重要意義。
骨穩態失衡是導致骨質疏松癥發生的重要原因，而骨形成和骨吸收共同決定著骨穩態。骨形成和骨吸收之間的不平衡與各種疾病有關，其中炎癥會導致過度骨吸收以及骨形成受損[6-7]。促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6可促進破骨細胞生成，增強破骨細胞功能，引起骨吸收增加[8]；此外，它們還可以抑制成骨細胞生成，導致骨形成減少[9]。骨質疏松癥的發生可能與炎癥有關，有研究者發現雌激素水平降低和衰老促進體內低度炎癥并與骨量減少相關[10-13]，且許多炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的水平在骨質疏松癥發病過程中增加[7，14]。Wang等[15]發現衰老骨細胞產生的炎癥可介導與年齡相關的骨質流失。Cline-Smith等[10]則通過觀察卵巢摘除（ovariectomy，OVX）小鼠，發現雌激素缺失可誘導樹突狀細胞產生高水平的IL-17和IL-15，激活由記憶T細胞介導的慢性低度炎癥，進而在破骨形成和骨質流失中發揮作用。一項橫斷面研究顯示，全身免疫炎癥指數與絕經后婦女的骨密度降低和骨質疏松癥有關，而與絕經前婦女無關[16]。此外，Damani等[7]通過對12個月隨機對照試驗受試者的基線數據進行橫斷面二次分析，發現炎癥標志物與絕經后婦女的骨密度、幾何形狀和強度等成負相關，表明炎癥標志物可能是絕經后骨質流失的重要介質。因此，改善骨質疏松癥患者體內的低度炎癥狀態，可能為骨質疏松癥的治療提供新思路。
褪黑素（melatonin，MT）是一種主要由松果體分泌的激素，幾乎存在于哺乳動物體內的所有部位[17]。其已被證實能發揮多種生理作用，例如晝夜節律、調節睡眠、抑制炎癥、抗氧化應激等。許多研究表明，MT參與骨量的調節，可以減輕絕經后骨質疏松癥的骨丟失[18]。Ren等[19]發現MT可以通過PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信號通路修復鐵過載大鼠的骨質疏松性骨缺陷；而Da等[20]發現MT通過增強成骨細胞的檸檬酸鹽分泌，對絕經后的骨質流失起保護作用。此外，MT還被證實可以上調BMSCs的成骨作用[21-22]，增強骨形成。然而，MT能否降低骨質疏松癥的低度炎癥和挽救炎癥狀態下的成骨分化尚不明確。脂多糖是革蘭陰性菌的外膜成分，可以激活Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB信號通路并誘導促炎細胞因子表達，已在誘導炎癥等方面得到廣泛應用[23]。既往相關研究表明，脂多糖可以抑制MSCs的成骨分化[24]，因此我們選擇脂多糖刺激BMSCs產生炎癥反應。本研究旨在探究口服MT對OVX大鼠骨量和體內炎癥的影響，并進一步探究MT能否減弱脂多糖誘導的炎癥環境對BMSCs成骨分化的抑制作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
清潔級SD雌性大鼠18只（15只為12周齡，體質量290～310 g，平均302.0 g；3只為3周齡，體質量45、51、53 g），由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，分籠飼養，每籠5只，室內溫度22～24°C，相對濕度50%～60%，自然晝夜照明，光照時間12 h，自由飲水，標準實驗室嚙齒動物飼料喂食。
MT（MCE公司，美國）；脂多糖（北京索萊寶科技有限公司）；DMEM培養基、FBS、青/鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（GIBCO公司，美國）；PBS（武漢塞維爾生物科技有限公司）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；Donjindo公司，日本）；抗CD90、CD105、CD34、CD45流式抗體（BioLegend公司，美國）；ALP、茜素紅染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；TRIzol試劑（TaKaRa公司，日本）；PCR逆轉錄試劑盒（北京康潤誠業生物科技有限公司）；SYBR Green qPCR試劑（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；ELISA檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。
微量移液器（Eppendorf公司，德國）；25 cm2培養瓶、6孔板、96孔板（浙江碩華生命科學研究股份有限公司）；酶標儀（Omega公司，德國）；倒置顯微鏡（Nikon公司，日本）；PCR、實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（Bio-Rad公司，美國）；流式細胞儀（BD公司，美國）；Y.Cheetah Micro-CT系統（Yxlon公司，德國）；VG Studio Max 3.0軟件（Volume Graphics公司，德國）；Image J軟件（National Institutes of Health，美國）。
1.2 MT對OVX大鼠骨量及血清炎癥因子的影響
1.2.1 動物模型制備及分組方法
取15只12周齡SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分為3組，假手術組、OVX組、OVX+MT組，每組5只。假手術組大鼠僅接受雙側側腹部切開縫合，OVX組行雙側OVX，OVX+MT組在雙側OVX術后進行100 mg/（kg·d）MT口服干預。干預8周后用戊巴比妥過量麻醉處死大鼠，取血液和股骨樣本備用。
1.2.2 Micro-CT檢測
取大鼠股骨樣本以4%多聚甲醛固定3 d后，使用Micro-CT系統對股骨遠端微結構進行掃描，使用VG Studio Max 3.0軟件行三維重建，并定量檢測骨體積分數（bone volume fraction，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）來評價骨量及骨微結構情況。
1.2.3 ELISA檢測
將大鼠血液樣本以300×g離心15 min，小心吸取上清并置于新的EP管中；使用ELISA檢測試劑盒檢測血清中的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平。
1.3 MT對脂多糖刺激引起BMSCs炎癥及成骨能力改變的影響
1.3.1 BMSCs的分離及培養
將3只3周齡SD大鼠用過量戊巴比妥麻醉處死后置于75%乙醇中浸泡，分離股骨后用PBS沖洗。剪開股骨兩端，用適量DMEM培養基將骨髓沖至離心管中，反復多次，150×g離心5 min后用完全培養基（含10%FBS和1%青/鏈霉素溶液的DMEM培養基）重懸，在37°C、5%CO2孵箱中培養，每3天換液1次，細胞達80%～90%融合時，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細胞，按照1∶（2～3）比例傳代。取對數生長期的第3代細胞，采用流式細胞儀檢測表面標志物CD90、CD105、CD34、CD45表達。取第3～5代細胞用于后續實驗。
1.3.2 MT最佳藥物濃度測定
實驗分為5組，分別為空白對照組及1、10、100、1 000 μmol/L MT干預組。用完全培養基按1×103個/孔密度將BMSCs接種于96孔板中，在37°C、5%CO2孵箱中培養過夜，貼壁后進行相應干預。于干預0、24、48、72 h時將培養液吸出，加入90 μL DMEM培養液和10 μL CCK-8試劑，孵育約4 h后使用酶標儀測定450 nm處吸光度（A）值。根據A值判斷細胞增殖與活力，A值越高細胞越多、活力越好，選擇不影響細胞活性的最大濃度為MT最佳藥物濃度。
1.3.3 細胞實驗分組及ELISA檢測
將BMSCs以1×106個/孔或5×105個/孔密度接種于6孔板或12孔板中，培養至60%～70%融合。首先將細胞分為4組，分別為A組 ［成骨誘導培養基（含0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL抗壞血酸的完全培養基）培養］、B組（成骨誘導培養基+1 μg/mL脂多糖培養）、C組（成骨誘導培養基+5 μg/mL脂多糖培養）、D組（成骨誘導培養基+10 μg/mL脂多糖培養）。每2～3天換液1次，收集各組培養48 h的培養液，同1.2.3方法用ELISA法檢測細胞培養液中炎癥因子表達水平。根據CCK-8法和ELISA檢測結果，用刺激炎癥效果最顯著濃度的脂多糖以及最佳藥物濃度的MT加成骨誘導培養基對細胞進行干預，并設為E組，同樣采用ELISA法檢測各炎癥因子表達水平。取A、D、E組細胞進行后續檢測。
1.3.4 ALP染色
培養7 d后吸去培養液，PBS清洗2次后加入4%多聚甲醛固定30 min；再次用PBS清洗2次后加入ALP染液，室溫下避光染色約60 min；吸去染色液后用PBS洗滌并拍照，之后使用Image J軟件分析陽性面積百分比。
1.3.5 茜素紅染色
培養14 d后吸去培養液，PBS清洗2次后使用4%多聚甲醛固定30 min；用雙蒸水沖洗后加入茜素紅染色液染色，室溫下染色約30 min后，再次用雙蒸水沖洗2次后拍照，之后使用Image J軟件分析陽性面積百分比。
1.3.6 RT-qPCR檢測
培養7 d后吸去培養液，使用TRIzol法提取細胞中的總RNA，再按照說明書將RNA逆轉錄為cDNA。之后按照以下條件進行RT-qPCR：95℃、3 min；95℃、5 s，60℃、32 s，42個循環。以GAPDH為內參，采用2–ΔΔCt法計算目的基因Ⅰ型膠原α1鏈（collagen type Ⅰ alpha 1 chain，Col1a1）、RUNX家族轉錄因子2（RUNX family transcription factor 2，Runx2）mRNA相對表達量。引物序列見表1。
表1
RT-qPCR各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of RT-qPCR
1.4 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MT對OVX大鼠骨量及血清炎癥因子的影響
2.1.1 MT對OVX大鼠骨量的影響
Micro-CT檢測示，OVX組大鼠骨量較假手術組減少，骨小梁明顯稀疏，排列紊亂；而OVX+MT組大鼠骨量較OVX組有所增加，骨小梁稀疏程度得到改善，排列更加規則有序。見圖1a～c。定量檢測示，假手術組和OVX+MT組BV/TV、Tb.N均顯著高于OVX組，差異有統計學意義（P<0.05）；假手術組和OVX+MT組間差異亦有統計學意義（P<0.05）。3組間Tb.Th比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖1d～f。
圖1
大鼠股骨遠端Micro-CT檢測
a～c. 分別為大鼠股骨遠端重建圖、水平面圖、冠狀面圖 從左至右分別為假手術組、OVX組、OVX+MT組；d～f. 各組骨相關參數BV/TV、Tb.Th、Tb.N比較 *
a-c. Reconstruction figures, transverse position figures, and coronal position figures of distal femurs in rats From left to right for Sham group, OVX group, and OVX+MT group, respectively; d-f. Comparison of BV/TV, Tb.Th, and Tb.N in each group *
2.1.2 MT對OVX大鼠體內炎癥的影響
ELISA檢測示，OVX組大鼠體內炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表達水平顯著高于假手術組和OVX+MT組，差異有統計學意義（P<0.05）；OVX+MT組IL-6、TNF-α表達水平高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05），兩組間IL-1β表達水平差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2。
圖2
ELISA檢測各組大鼠血清炎癥因子表達水平
*
*
2.2 MT對脂多糖刺激引起BMSCs炎癥及成骨能力改變的影響
2.2.1 BMSCs形態學觀察、鑒定及MT對BMSCs活力的影響
倒置顯微鏡觀察示原代細胞呈長梭形。流式分析結果示，細胞CD90和CD105為陽性表達，CD34和CD45為陰性表達，符合MSCs的表達特性。CCK-8法檢測示，隨時間延長各組A值均逐漸增加，0、24、48 h時各組間A值比較差異均無統計學意義（P>0.05）； 72 h時1 000 μmol/L MT干預組細胞活力明顯低于其余各組，差異有統計學意義（P<0.05）。因此，為了不影響細胞活力，選擇100 μmol/L MT進行后續實驗。見圖3。
圖3
BMSCs形態學觀察、流式鑒定及CCK-8檢測
a. 原代BMSCs形態學觀察（倒置顯微鏡×40）；b～e. BMSCs的流式分析鑒定；f. CCK-8法檢測各組細胞活力 *
a. The morphology of primary BMSCs (Inverted microscope×40); b-e. Flow cytometry detection of BMSCs; f. Cell viability detected by CCK-8 assay *
2.2.2 MT對脂多糖刺激下BMSCs成骨分化的影響
ELISA檢測示，加入脂多糖刺激后，B～D組細胞培養液中的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平明顯升高，與A組比較差異均有統計學意義（P<0.05）；并且呈濃度依賴性，D組各炎癥因子表達水平明顯高于B、C組，差異有統計學意義（P<0.05）；因此選擇10 μg/mL作為脂多糖刺激炎癥最顯著濃度進行后續檢測。E組加入MT干預后，各炎癥因子表達水平較D組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖4 a。
圖4
MT對脂多糖刺激下BMSCs成骨分化的影響
*
*
ALP染色、茜素紅染色及RT-qPCR檢測示，與A組比較，D組ALP和茜素紅陽性面積百分比以及Col1a1、Runx2 mRNA相對表達量均顯著降低，經MT干預后E組上述指標均顯著提升，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4b～d。
3 討論
絕經后骨質疏松癥的特征是雌激素減少、骨量降低和骨微結構破壞，其發生與骨形成和骨吸收失衡密不可分。MT作為松果體產生的一種激素，可在多種疾病中發揮抗炎和抗氧化作用[18]。越來越多證據表明MT對骨骼健康起有益作用[18-19，25]。研究者發現血漿MT水平降低與骨量減少之間存在關聯[26]。Cao等[27]發現絕經后骨質疏松癥女性的血清MT水平有明顯降低，OVX大鼠中也可觀察到血清MT濃度降低，絕經后骨質疏松癥發展的骨代謝標志物也與血清MT的變化顯著相關[18]；此外，在松果體摘除的羊中可觀察到骨量減少和骨微結構破壞[28]；這些結果均提示絕經后骨質疏松癥與MT相關。MT可以通過調節PRMT1介導的信號傳導來抑制OVX小鼠的破骨細胞生成和骨質流失[29]，也可以通過肝細胞生長因子/Wnt/β-連鎖蛋白信號通路促進BMSCs的成骨分化[21]。此外，MT可以通過MT受體2/NF-κB信號通路抑制破骨細胞生成[22]。這些結果顯示MT可能是一種新的絕經后骨質疏松癥治療手段。
絕經后骨質疏松癥的發生可能與炎癥有關。炎癥在許多疾病中發揮重要作用，絕經后雌激素水平降低，炎癥因子在體內積累，導致骨形成受損和骨量減少[30-31]。炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α刺激破骨細胞的分化、激活和存活，增強其活性，導致骨吸收增加[32]。研究表明，絕經后骨質疏松癥女性血清中高表達IL-1β、IL-6和TNF-α[33-34]；去OVX大鼠血清中炎癥因子水平也顯著升高[35-36]；提示炎癥反應可能參與了絕經后骨質疏松癥的發生與發展，炎癥標志物可能是絕經后骨質流失的重要介質。而MT具有抗炎特性及維持骨量的功能，其可能通過抑制體內的低度炎癥狀態來挽救絕經后骨質疏松癥患者的骨量，但這需要進一步驗證。本研究中，Micro-CT掃描顯示OVX大鼠的骨量明顯減少，提示骨質疏松癥模型建立成功；ELISA檢測示OVX大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平顯著升高，提示其體內存在炎癥。經MT治療后OVX大鼠體內炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平顯著降低，提示MT可能通過降低體內炎癥對絕經后骨質疏松癥的骨量產生影響，與既往研究結果類似[21-22]。炎癥因子可以通過激活NF-κB信號通路來介導骨生理學，增加骨質疏松癥和骨脆性骨折風險[14]；TNF-α和IL-1β可激活NF-κB和MAPK信號通路，增強RANKL和巨噬細胞集落刺激因子的產生并下調骨保護素的表達，導致骨重塑缺陷[6]。OVX后大鼠海馬體中的TLR4和活性NF-κB水平顯著增加，進而引起神經炎癥[37]；而TLR4/NF-κB信號通路已被證明在其他疾病中可以介導MT發揮抗炎特性[38]，因此也可能介導MT抑制絕經后骨質疏松癥引起的低度炎癥，但仍需進一步研究明確。
BMSCs具有自我更新和多向分化的潛能，是維持骨穩態的重要造骨細胞[39]。在炎癥環境下，BMSCs表現出促炎表型，產生促炎因子[40]。炎癥可抑制BMSCs成骨分化，炎癥相關NF-κB信號通路的持續表達可以減少BMSCs的遷移和成骨分化，而炎癥因子則誘導BMSCs凋亡和抑制BMSCs成骨分化[40]。脂多糖已被證明可以在BMSCs[41]和MC3T3-E1細胞[42]中誘導炎癥并引起成骨分化的抑制作用。本研究發現脂多糖濃度依賴性地誘導BMSCs培養液中IL-1β、IL-6和TNF-α的產生，其中10 μg/mL脂多糖能顯著增加培養液中炎癥因子的產生，誘導炎癥環境。而MT干預能顯著降低細胞培養液中炎癥因子水平，抑制脂多糖誘導的炎癥。Col1a1和Runx2是常用的成骨分化標志物，其表達水平在一定程度上能反映成骨能力；而ALP和骨礦化水平則是直接反映成骨能力的指標[43]。在本研究中，脂多糖誘導的炎癥環境下BMSCs的ALP水平和礦化能力明顯下降，Col1a1和Runx2的水平也明顯下降，表明脂多糖誘導的炎癥環境明顯抑制了BMSCs的成骨。MT通過Wnt/β-catenin通路促進BMSCs成骨分化，通過PPARγ通路抑制BMSCs成脂分化[44-45]；通過調節SIRT1/p66SHC通路來抑制H2O2誘導的成骨細胞氧化應激損傷并促進成骨[46]。TLR4是細菌內毒素的信號受體，脂多糖可以激活TLR4，進而導致NF-κB激活，從而調節各種炎癥介質表達，最終引起組織破壞[47]。本研究發現，MT干預能增加脂多糖誘導下BMSCs的成骨能力，表明其可以減弱脂多糖對BMSCs的成骨抑制從而挽救其成骨能力，且這種作用可能通過TLR4/NF-κB信號通路實現。
綜上述，本研究發現OVX大鼠體內存在炎癥，MT治療可能通過抑制OVX大鼠體內的炎癥減少骨丟失，挽救骨量。脂多糖刺激能引起BMSCs細胞培養液中炎癥因子增多，抑制成骨分化；MT干預能減少炎癥因子產生，挽救BMSCs的成骨能力。但具體作用機制有待進一步研究明確。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突
倫理聲明 研究方案經西安交通大學醫學部醫學生物科研倫理委員會批準（2021-1566）；實驗動物使用許可證號：SYXK（陜）2020-005
作者貢獻聲明 關煥帥：論文撰寫、數據采集及資料收集；曹若木、趙奕威、張杰聞：數據收集及論文修改；李恒、段續東、李沂陽：數據收集及分析；孔寧、田潤：論文指導；王坤正、楊佩：課題設計及經費支持
