引用本文： 楊瑩瑩, 王剛, 楊前, 刁波. 過表達音猬因子的毛囊干細胞在毛囊再生中的作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(7): 868-878. doi: 10.7507/1002-1892.202304008 復制
脫發是一個造成患者心理困擾、影響社會交流的嚴重問題，治療效果不理想[1-2]。脫發可由各種病理、環境或心理因素引起，最終導致毛囊結構異常或再生障礙[3]。近年來關于如何調節毛囊生長的研究取得了一定進展，特別是發現了毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）[4]。HFSCs具有形成克隆、自我更新和多系譜分化的能力，因免疫原性低、分化再生能力強，已用于多種疾病的治療研究，成為生物醫學領域的研究熱點[5-6]。HFSCs可調節毛發生長周期，逆轉脫發發生[7]。已有實驗將人皮內和皮下脂肪組織來源的HFSCs用于治療雄激素性脫發患者，經過一定治療周期后發現患者毛發密度顯著增加[8]。但目前干細胞移植存在的最大問題之一就是移植后干細胞存活率較低。HFSCs的增殖與毛發生長周期息息相關[9-10]。因此，調控HFSCs的增殖活性有助于提高干細胞移植治療效果，促進毛囊再生。
音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）可調節包括毛囊在內的許多組織增殖和發育模式[11]。在胚胎發生過程中，Shh調節胚胎發育和成年動物毛囊發育，影響成年毛囊的循環和生長[12]。有研究在探究高脂飲食誘導HFSCs命運變化的機制中發現，Shh在肥胖小鼠的HFSCs中顯著下降；通過轉基因小鼠特異性抑制HFSCs中的Shh信號1周后，小鼠HFSCs開始枯竭，毛囊小型化或丟失，1個月后背部出現明顯脫毛[13]。Abe等[14]發現在毛囊成熟階段，Shh的缺失選擇性降低了毛發發育過程中毛囊內角質形成細胞增殖，從而使上皮細胞向下生長失敗，且Shh–/–小鼠的毛囊減少。這些研究均表明Shh對HFSCs的功能至關重要。但Shh在HFSCs中的功能及兩者協同對毛囊再生的影響，目前仍不清楚。
為提高干細胞移植治療效果，可對干細胞進行基因修飾、細胞因子預處理等措施[15]。基于此，我們通過對HFSCs中的基因進行改造，旨在改善HFSCs的生存和組織再生能力，將改造后的細胞用于脫發治療，提高干細胞移植的效率和治療效果。
1 材料與方法
1.1 實驗組織、動物及主要試劑、儀器
毛囊來自于2021年12月—2022年8月中國人民解放軍中部戰區總醫院皮膚科收治的20例40～50歲女性脫發患者，在獲取毛囊術前已告知患者及家屬手術風險與術后可能發生的不良反應，患者均知情同意并簽署知情同意書。
6～8周齡SPF級雌性BALB/c-nu裸鼠25只，體質量（20.88±0.52）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。
過表達Shh（NM_000193）慢病毒由上海吉凱基因化學技術有限公司合成；實驗所需引物由北京擎科生物技術有限公司合成；人MSCs無血清基礎培養基（天津灝洋華科生物科技有限公司）；100 U/mL 青、鏈霉素（石家莊制藥集團有限公司）；0.25%胰蛋白酶、無血清細胞凍存液（廣州賽國生物科技有限公司）；SYBR Green Master Mix試劑盒、HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR逆轉錄反應試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA總蛋白濃度測定裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；CD29、CD34、CD71流式抗體（Biolegend公司，美國）；Shh抗體、β-actin抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；細胞角蛋白15（cytokeratin 15，CK15）抗體（Abcam公司，英國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、細胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物技術股份有限公司）；濃縮型正常山羊血清（封閉）、熒光（Cy3）標記羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；DAPI（上海碧云天生物技術有限公司）。
超凈工作臺（蘇州集團安泰空氣技術有限公司）；CO2恒溫箱（SANYO公司，日本）；冷凍高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；流式細胞儀（BD Biosciences公司，美國）；Light Cycle96實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（上海羅氏集團）；WD-9413B凝膠成像分析儀（北京六一生物科技有限公司）；生物顯微鏡、熒光顯微鏡汞燈（Olympus公司，日本）；酶標儀（上海天能科技有限公司）；病理切片機（RM 2016輪轉式切片機；Leica公司，德國）；JK-6生物組織攤烤片機、JT-12J電腦生物組織脫水機（武漢俊杰電子有限公司）。
1.2 HFSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 HFSCs分離及培養
從20例脫發患者頭皮正常區和脫發區分別隨機拔取1個毛囊，得到40個毛囊樣本。從兩區毛囊中獲取原代HFSCs并傳代，得到正常組（H1組）和脫發組（H2組）HFSCs。具體方法：用75%乙醇消毒擬取樣部位頭皮，選取毛囊結構完整的毛發，在含100 U/mL青、鏈霉素的PBS中浸泡5 min；剪取毛囊中間段，接種于10 cm2培養皿底面上，添加5 mL 100 U/mL青、鏈霉素溶液的人MSCs無血清基礎培養基重懸于培養皿中，于37℃、5%CO2孵箱中培養。當毛囊貼壁時，繼續添加5 mL培養基，此后每隔3 d換液1次，直至周圍有細胞爬出時換液；然后每隔3 d換液1次，待細胞融合至80%時傳代。
1.2.2 流式細胞術鑒定HFSCs表面標志物
取兩組第4代生長良好的HFSCs，0.25%胰蛋白酶消化后添加相同體積新鮮培養基重懸細胞，制備密度為5×105個/mL的細胞懸液，分裝至15 mL離心管中（500 μL/管）；以離心半徑13.5 cm、1 500 r/min離心2 min，棄上清。加入約1 mL預冷后PBS進行細胞重懸，取300 μL細胞懸液平均分配至3個新的15 mL離心管內（10 μL/管）。按照抗體使用說明書，依次往3個離心管中添加 CD29、CD71、CD34流式抗體各5 μL，避光培養30 min；加入1 mL預冷后PBS沖洗未結合的抗體后，同上法離心2 min，棄上清。將300 μL預冷后PBS分別添加至3個離心管中，充分混勻后將細胞懸液依次轉入3個新的流式管中，上機檢測。
1.3 Shh在HFSCs傳代過程中的表達
1.3.1 RT-qPCR檢測
分別取兩組第4、7、10代細胞，以Trizol法提取細胞總mRNA，紫外分光光度計鑒定并定量。利用HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR逆轉錄反應試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。RT-qPCR反應按SYBR Green Master Mix試劑盒說明書進行。以β-actin為內參，用2–??Ct法計算Shh mRNA相對表達量。引物序列（5′→3′）：Shh正義TTCCCTTCATACCTTCCG，反義TAGTCCTCGTCTCCTCGC，產物長度166 bp；β-actin正義CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC，反義TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT，產物長度240 bp。
1.3.2 Western blot檢測
分別取兩組第4、7、10代細胞，加入4℃預冷PBS洗滌細胞3次，隨后加入適量RIPA裂解緩沖液于冰上裂解10 min；4℃以離心半徑13.5 cm、12 000 r/min離心10 min后收集上清液，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白濃度定量。取蛋白樣本加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水中水浴10 min使其變性后，行SDS-PAGE電泳，電泳后轉膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，分別加入一抗Shh（1∶600）及內參GAPDH（1∶4 000）4℃過夜，再用TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫下振蕩孵育2 h；再次洗膜3次后加入ECL試劑顯色，放入凝膠成像儀中曝光成像，成像結束后采用Image-Pro Plus軟件分析膠片灰度值，以與內參β-actin比值作為Shh蛋白相對表達量。
1.4 慢病毒轉染HFSCs及驗證
1.4.1 慢病毒轉染
分別取兩組第7代細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后，制備密度為5×103個/mL的細胞懸液。待細胞貼壁融合約50%后，將細胞懸液加入10 cm2培養皿，添加培養基使皿中總體積為10 mL。從–80℃冰箱中取出Shh慢病毒溶液置于冰上融化，以預實驗確定的最佳感染復數100轉染細胞，得到過表達Shh 的正常組（H1-HFSCShh組）和脫發組（H2-HFSCShh組）；同時使用Shh陰性慢病毒和培養基轉染細胞，得到正常空載組（H1-HFSCNC組）和脫發空載組（H2-HFSCNC組）作為對照。然后于細胞培養箱中進行培養，24 h后更換新鮮培養基繼續培養。
1.4.2 慢病毒轉染驗證
病毒轉染72 h后，取各組細胞采用熒光顯微鏡觀察，若觀察到綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達，即為Shh慢病毒攜帶的熒光，根據以下公式計算病毒感染率：病毒感染率=熒光細胞數/明視野細胞數×100，病毒感染率達近90%即為轉染成功。
同1.3方法采用RT-qPCR和Western blot檢測各組Shh蛋白和mRNA相對表達量，并與H1組和H2組進行比較。
1.5 過表達Shh后HFSCs的增殖活性變化
1.5.1 CCK-8檢測
取增殖狀態好、在對數生長期的H1-HFSCNC組、H2-HFSCNC組、H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組細胞懸液，以1×104個/mL濃度加入96孔板，每孔100 μL。將其移入恒溫細胞培養箱中過夜（將100 μL無菌1×PBS添加至細胞周圍孔內），每組設3個復孔。于細胞接種后24、48、72、96 h分別加入10 μL CCK-8溶液，37℃培養4 h后酶標儀檢測450 nm處吸光度（A）值。
1.5.2 流式細胞周期測定
取處于生長期的H1-HFSCNC組、H2-HFSCNC組、H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組細胞，用胰蛋白酶消化，制備濃度為3×105個/mL的細胞懸液；4℃以離心半徑13.5 cm、1 500 r/min離心2 min，用預冷1×PBS重懸細胞沖洗2次，同上法離心吸棄上清液后用100 μL預冷1×PBS重懸細胞，然后緩慢加入預冷80%乙醇700 μL，4℃固定4 h以上；同上法離心2 min后重復預冷1×PBS潤洗2次；加入100 μL RNase（50 μg/mL）溶液，37℃孵育30 min；加入400 μL碘化丙啶（50 μg/mL），4℃避光染色30 min后上機檢測。比較各組G0/G1期、S期和G2/M期的細胞比例，按以下公式計算增殖指數：增殖指數=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。
1.6 裸鼠細胞移植實驗
消化收集4組（H1-HFSCNC組、H2-HFSCNC組、H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組）細胞，以無菌生理鹽水洗滌2次，再以無菌生理鹽水重懸制成濃度為4×106個/mL的細胞懸液。裸鼠適應性飼養1周后，根據注射溶液不同分為實驗組（H1-HFSCNC組、H2-HFSCNC組、H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組）和對照組（生理鹽水組），每組5只。實驗組取200 μL對應細胞懸液于裸鼠背部皮內單點注射，每周注射2次，對照組同法注射等量生理鹽水，共注射5周。每周觀察裸鼠背部注射部位毛發生長情況，5周后處死裸鼠，取注射部位皮膚組織進行觀測。
1.6.1 Western blot檢測
各組取100 mg皮膚組織置于培養皿中，手術剪剪成3 mm×3 mm左右小塊，加入0.5～1.0 mL RIPA裂解緩沖液，于低溫下玻璃勻漿器手動勻漿；取組織勻漿液轉移至1.5 mL預冷的離心管，4℃以離心半徑13.5 cm、12 000 r/min離心5 min后收集上清液；將上清液轉移至新的預冷離心管中，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒方法測定蛋白濃度，同1.3.2方法檢測Shh蛋白相對表達量。
1.6.2 HE染色
將各組組織標本石蠟包埋后行5 μm厚切片，取部分切片常規行HE染色，光鏡下觀察并計數各組毛囊數量。
1.6.3 免疫熒光染色
將上述部分標本切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，蒸餾水清洗3～5次，用濃縮型正常山羊血清封閉液處理20 min，分別加入一抗（CD71、CK15，稀釋比例為1∶200）4℃孵育過夜；次日，1×PBS清洗3次后，加入與一抗對應種屬的熒光二抗37℃反應30 min；PBS清洗3次，滴入DAPI復染，PBS清洗后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察各組HFSCs表面陽性標志物CD71和CK15的熒光強度差異，應用Image-Pro Plus 6.0軟件進行CD71、CK15熒光強度定量檢測。
1.7 統計學方法
采用Graphpad Prism 9.0軟件進行數據分析并統計作圖。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 人HFSCs形態觀察及鑒定
光鏡觀察示，培養72 h后可見梭形樣細胞從毛囊組織中向外爬出，早期原代細胞呈圓形、梭形、三角形等；經3次傳代后，細胞多為長梭形且貼壁速度快，H1組和H2組細胞形態無明顯差別。見圖1。流式細胞儀檢測示第4代細胞表面CD29和CD71呈高表達，接近100%， CD34基本不表達，提示培養細胞為HFSCs。見圖2。
圖1
第3代人HFSCs形態學觀察（×40）
a. H1組；b. H2組
Figure1. Morphological observation of the 3rd passage human HFSCs (×40)a. H1 group; b. H2 group
圖2
人HFSCs流式細胞術鑒定
從左至右依次為CD34、CD71、CD29 a. H1組；b. H2組
Figure2. Flow cytometry identification of human HFSCsFrom left to right for CD34, CD71, and CD29, respectively a. H1 group; b. H2 group
2.2 Shh在HFSCs傳代過程中的表達
RT-qPCR和Western blot檢測示，H1組和H2組細胞中Shh蛋白及mRNA相對表達量隨代次增加呈逐漸下降趨勢，各代次間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
Shh在HFSCs傳代過程中的表達
分別為Western blot電泳圖（Mr：相對分子質量，1～3：分別為第4、7、10代細胞）、Shh蛋白相對表達量、Shh mRNA相對表達量 a. H1組；b. H2組
Figure3. Expression of Shh in passage of HFSCsFor Western blot electropherograms (Mr: Relative molecular mass, 1-3: Cells of 4th, 7th, and 10th passages, respectively), relative expression of Shh protein, and relative expression of Shh mRNA, respectively a. H1 group; b. H2 group
2.3 慢病毒轉染HFSCs及驗證
將Shh慢病毒和陰性慢病毒轉染HFSCs 72 h后，熒光顯微鏡下均觀察到綠色熒光出現。H1-HFSCNC組、H1-HFSCShh組、H2-HFSCNC組和H2-HFSCShh組病毒感染率分別為85.65%±2.07%、87.16%±2.90%、85.31%±2.38%、82.80%±2.82%；提示目的基因在細胞內表達情況良好，可用于后續實驗。見圖4。
圖4
各組轉染Shh慢病毒后72 h熒光顯微鏡觀察（×100）
左、右分別為明場和暗場 a. H1-HFSCNC組；b. H1-HFSCShh組；c. H2-HFSCNC組；d. H2-HFSCShh組
Figure4. Fluorescence microscope observation at 72 hours after transfection of Shh lentivirus in each group (×100)Left and right for bright and dark fields, respectively a. H1-HFSCNC group; b. H1-HFSCShh group; c. H2-HFSCNC group; d. H2-HFSCShh group
RT-qPCR和Western blot檢測示，H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組中Shh蛋白及mRNA相對表達量均顯著高于對應的H1-HFSCNC組、H2-HFSCNC組及H1組、H2組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。表明已成功構建穩定過表達Shh的HFSCs細胞株，慢病毒轉染后達到了靶向調控Shh目的基因及蛋白的作用。
圖5
過表達Shh的HFSCs中Shh蛋白和mRNA表達情況
分別為Western blot電泳圖（Mr：相對分子質量，1～3：分別為H1/H2組、H1/H2-HFSCNC組、H1/H2-HFSCShh組）、Shh蛋白相對表達量、Shh mRNA相對表達量 a. H1組；b. H2組
Figure5. Shh protein and mRNA expression in the Shh overexpressed HFSCsFor Western blot electropherograms (Mr: Relative molecular mass, 1-3: H1/H2 group, H1/H2-HFSCNC group, and H1/H2-HFSCShh group, respectively), relative expression of Shh protein, and relative expression of Shh mRNA, respectively a. H1 group; b. H2 group
2.4 過表達Shh后HFSCs的增殖活性變化
2.4.1 CCK-8檢測
隨細胞接種時間延長，各組A值均呈逐漸增加趨勢。接種48 h后，H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組的增殖斜率分別顯著高于對應的H1-HFSCNC組和H2-HFSCNC組，H1-HFSCShh組顯著高于H2-HFSCShh組，H1-HFSCNC組亦顯著高于H2-HFSCNC組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
CCK-8檢測過表達Shh后對HFSCs增殖的影響
Figure6.
Effect of Shh overexpression on the proliferation of HFSCs detected by CCK-8 assay
2.4.2 流式細胞周期測定
在S期和G2/M期，H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組細胞周期百分比顯著高于對應的H1-HFSCNC組和H2-HFSCNC組，H1-HFSCShh組顯著高于H2-HFSCShh組，H1-HFSCNC組亦顯著高于H2-HFSCNC組；各組在G0/G1期的細胞比例與S期和G2/M期相反；以上差異均有統計學意義（P<0.05）。
H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組細胞增殖指數顯著高于對應的H1-HFSCNC組和H2-HFSCNC組，H1-HFSCShh組顯著高于H2-HFSCShh組，H1-HFSCNC組亦顯著高于H2-HFSCNC組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖7。
圖7
過表達Shh后對HFSCs細胞周期的影響
a～d. 分別為H1-HFSCNC組、H1-HFSCShh組、H2-HFSCNC組和H2-HFSCShh組細胞周期分布情況；e. 各組在各細胞分期的細胞周期百分比；f. 各組在整個細胞周期的增殖指數
Figure7. Effect of Shh overexpression on the cell cycle of HFSCsa-d. The cell cycle distribution of H1-HFSCNC, H1-HFSCShh, H2-HFSCNC, and H2-HFSCShh groups, respectively; e. Cell cycle percent of each group at each cell stage; f. Proliferation index of each group throughout the cell cycle
2.5 裸鼠細胞移植實驗
2.5.1 Western blot檢測
H1-HFSCShh組Shh蛋白相對表達量顯著高于H1-HFSCNC組和對照組，H2-HFSCShh組顯著高于H2-HFSCNC組和對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖8。
圖8
裸鼠細胞移植5周Western blot檢測各組Shh蛋白表達情況
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1～3：分別為對照組、H1-HFSCNC組、H1-HFSCShh組 4～6：分別為對照組、H2-HFSCNC組、H2-HFSCShh組；b. 蛋白相對表達量
Figure8. Western blot detection of Shh protein expression in nude mouse of each group after 5 weeks of cell transplantationa. Electropherogram Mr: Relative molecular mass 1-3: Control group, H1-HFSCNC group, and H1-HFSCShh group, respectively 4-6: Control group, H2-HFSCNC group, and H2-HFSCShh group, respectively; b. Relative protein expression
2.5.2 HE染色
各實驗組裸鼠背部皮膚組織內毛囊數量均顯著多于對照組，H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組分別多于對應的H1-HFSCNC組和H2-HFSCNC組，H1-HFSCShh組顯著多于H2-HFSCShh組，H1-HFSCNC組亦顯著多于H2-HFSCNC組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖9。
圖9
裸鼠細胞移植5周各組HE染色觀察
a. H1-HFSCNC組（×200）；b. H1-HFSCShh組（×200）；c. H2-HFSCNC組（×200）；d. H2-HFSCShh組（×200）；e. 對照組（×200）；f. 各組背部皮膚組織內毛囊數量
Figure9. HE staining in nude mouse of each group after 5 weeks of cell transplantationa. H1-HFSCNC group (×200); b. H1-HFSCShh group (×200); c. H2-HFSCNC group (×200); d. H2-HFSCShh group (×200); e. Control group (×200); f. Number of hair follicles in the dorsal skin tissue in each group
2.5.3 免疫熒光染色
各實驗組CD71和CK15的熒光強度均顯著高于對照組，H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組高于對應的H1-HFSCNC組和H2-HFSCNC組，H1-HFSCShh組顯著高于H2-HFSCShh組，H1-HFSCNC組亦顯著高于H2-HFSCNC組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖10。
圖10
裸鼠細胞移植5周各組免疫熒光染色觀察
a～e. 分別為H1-HFSCNC組、H1-HFSCShh組、H2-HFSCNC組、H2-HFSCShh組和對照組CD71免疫熒光染色（熒光顯微鏡×200）；f. 各組CD71熒光強度比較；g～k. 分別為H1-HFSCNC組、H1-HFSCShh組、H2-HFSCNC組、H2-HFSCShh組和對照組CK15免疫熒光染色（熒光顯微鏡×200）；l. 各組CK15熒光強度比較
Figure10. Immunofluorescence staining in nude mouse of each group after 5 weeks of cell transplantationa-e. Immunofluorescence staining of CD71 in H1-HFSCNC, H1-HFSCShh, H2-HFSCNC, H2-HFSCShh, and control groups, respectively (Fluorescence microscope×200); f. Comparison of CD71 fluorescence intensity between groups; g-k. Immunofluorescence staining of CK15 in H1-HFSCNC, H1-HFSCShh, H2-HFSCNC, H2-HFSCShh, and control groups, respectively (Fluorescence microscope×200); l. Comparison of CK15 fluorescence intensity between groups
3 討論
HFSCs已被證實在毛發生長周期及毛囊再生中發揮著重要作用[16-17]。Shh通路是組織發育、體內平衡和修復中最重要的信號轉導通路之一，它在胚胎發生過程中調節各種器官的形態發生，對促進表皮發育和修復以及毛囊發育有著重要作用[18]。本研究中，我們成功分離人HFSCs，發現其Shh mRNA和蛋白表達水平隨體外培養時間延長而逐漸下調；用過表達Shh的慢病毒轉染HFSCs后，Shh在HFSCs內穩定表達，且經過轉染后的HFSCs增殖活性升高。此外，裸鼠經細胞移植后，各實驗組皮膚毛囊數量較對照組增多，HFSCs標記物表達水平也較對照組升高。上述結果表明，HFSCs對毛囊再生具有促進作用，過表達Shh的HFSCs能持續穩定地分泌和表達Shh，并結合干細胞和Shh的優勢共同促進毛囊再生。本研究為脫發的干細胞療法提供了一種新的治療思路和選擇。
HFSCs是較易獲取的多能干細胞之一，能夠快速增殖并分化成表皮細胞、毛囊細胞、內皮細胞和角質形成細胞等[19]。相關研究已顯示在機體的整個生命過程中，其通過靜止和激活之間的循環來促進毛囊產生，在毛發生長的開始階段，HFSCs經歷短暫的活化以增殖，在毛發周期的剩余階段又迅速恢復至靜止狀態[20]。由于細胞表面缺乏Ⅰ類主要組織相容性復合體和免疫細胞，HFSCs未顯示出免疫排斥反應，這也使其成為細胞療法的通用供體[21]。本次研究中，我們成功分離并鑒定了人HFSCs，為后續實驗提供了可靠的數據支持。
利用基因工程技術改造細胞是目前再生醫學中較為新穎的療法，對許多全身性疾病都有治療效果[22-23]。但在干細胞療法中，通過重復傳代培養收獲的干細胞往往會失去增殖和多能分化的能力，從而影響治療效果[24]。因此改善細胞增殖穩態和維持干細胞群是開發新的脫發療法的重要步驟。已知Shh通路對毛囊發育和毛發生長周期起到調節作用[12]。本研究中，我們通過Western blot和RT-qPCR檢測了正常組和脫發組第4、7、10代HFSCs中Shh蛋白和mRNA表達水平，發現二者表達水平隨體外培養時間延長呈逐漸下降趨勢，分析Shh表達可能與HFSCs的活性和增殖能力相關。因此我們采用Shh慢病毒轉染方法建立了過表達Shh的HFSCs，結果顯示病毒轉染72 h后，Shh蛋白和mRNA表達水平均顯著升高，提示本次研究已成功構建穩定過表達Shh的HFSCs細胞株。接著通過細胞增殖實驗檢測了轉染后的細胞增殖能力，結果顯示過表達Shh后HFSCs的增殖活性均較陰性對照組升高，且正常組細胞轉染前后的增殖活性均高于脫發組細胞，這也說明了HFSCs的增殖分化受其周圍微環境的影響，毛囊周圍的信號會影響HFSCs活性[25]。
毛囊作為一種多功能皮膚附屬物，在組織穩態中起著至關重要的作用，可提供物理屏障以抵御外部傷害、促進體溫調節和傳遞觸覺[26]。就人類而言，毛發會極大地影響一個人的外表和社會交流，各種破壞因素，如衰老、遺傳、炎癥和生理壓力，會導致過度脫發，無論性別或年齡如何[27]。目前已對脫發的治療進行了許多研究，市場上只有口服非那雄胺和外用米諾地爾兩種治療藥物獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）批準，但副作用較大，療效存在較大個體差異、用藥時間長，患者難以持續用藥，因此對脫發疾病的治療存在巨大需求[28-29]。近年來，再生醫學和毛發組織工程領域的顯著進步，為脫發的干細胞療法帶來了新希望。我們利用裸鼠模型進行體內研究，將轉染前后的人HFSCs移植到裸鼠體內，小鼠背部的毛囊與人類類似，也具備毛囊生長周期，由于鼠的性別和品種，毛囊周期的精確同步化時間略有差別，但它身體的毛發大部分都是同步的[30-31]。裸鼠先天沒有胸腺，存在免疫缺陷，是適宜于移植異種來源細胞的鼠的品種。在細胞移植5周后，背部組織Western blot結果顯示Shh蛋白也有穩定表達；毛囊HE染色結果示，各實驗組裸鼠背部毛囊數量均較對照組明顯增加，免疫熒光染色示HFSCs標記物熒光強度亦較對照組明顯升高，進一步表明過表達Shh可促進HFSCs的存活，進而促進毛囊再生。
本實驗存在一定局限性：① HFSCs的存活時間較短，若提取時間過長，可能存在細菌污染和細胞活力下降問題；② 分離培養的HFSCs如何將濃度提純至最大程度，降低外源性因素的干擾，也是一個關鍵問題；③ 由于人與鼠屬不同，其毛囊也有差異，因此針對鼠類動物進行的實驗并不能很好地用于人體臨床治療，未來仍需要在此問題上繼續深入探索。
綜上述，本研究表明HFSCs具有促進毛囊再生的潛力，過表達Shh后HFSCs的增殖活性顯著升高，能持續穩定地分泌和表達Shh，并結合干細胞和Shh的優勢共同促進毛囊再生，提高了細胞移植治療效果，為干細胞治療脫發提供一種新的治療思路和選擇。未來將進一步研究促進毛囊再生的分子靶點，為臨床治療脫發提供更多新途徑。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經中國人民解放軍中部戰區總醫院倫理委員會（［2022］032-01）及中國人民解放軍中部戰區總醫院動物實驗倫理委員會批準 ［中總動（福）第2022208號］；實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2018-0045
作者貢獻聲明 楊瑩瑩：研究實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；王剛：研究設計、數據收集整理及統計分析、行政支持；楊前：研究實施；刁波：研究設計、行政及經費支持
脫發是一個造成患者心理困擾、影響社會交流的嚴重問題，治療效果不理想[1-2]。脫發可由各種病理、環境或心理因素引起，最終導致毛囊結構異常或再生障礙[3]。近年來關于如何調節毛囊生長的研究取得了一定進展，特別是發現了毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）[4]。HFSCs具有形成克隆、自我更新和多系譜分化的能力，因免疫原性低、分化再生能力強，已用于多種疾病的治療研究，成為生物醫學領域的研究熱點[5-6]。HFSCs可調節毛發生長周期，逆轉脫發發生[7]。已有實驗將人皮內和皮下脂肪組織來源的HFSCs用于治療雄激素性脫發患者，經過一定治療周期后發現患者毛發密度顯著增加[8]。但目前干細胞移植存在的最大問題之一就是移植后干細胞存活率較低。HFSCs的增殖與毛發生長周期息息相關[9-10]。因此，調控HFSCs的增殖活性有助于提高干細胞移植治療效果，促進毛囊再生。
音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）可調節包括毛囊在內的許多組織增殖和發育模式[11]。在胚胎發生過程中，Shh調節胚胎發育和成年動物毛囊發育，影響成年毛囊的循環和生長[12]。有研究在探究高脂飲食誘導HFSCs命運變化的機制中發現，Shh在肥胖小鼠的HFSCs中顯著下降；通過轉基因小鼠特異性抑制HFSCs中的Shh信號1周后，小鼠HFSCs開始枯竭，毛囊小型化或丟失，1個月后背部出現明顯脫毛[13]。Abe等[14]發現在毛囊成熟階段，Shh的缺失選擇性降低了毛發發育過程中毛囊內角質形成細胞增殖，從而使上皮細胞向下生長失敗，且Shh–/–小鼠的毛囊減少。這些研究均表明Shh對HFSCs的功能至關重要。但Shh在HFSCs中的功能及兩者協同對毛囊再生的影響，目前仍不清楚。
為提高干細胞移植治療效果，可對干細胞進行基因修飾、細胞因子預處理等措施[15]。基于此，我們通過對HFSCs中的基因進行改造，旨在改善HFSCs的生存和組織再生能力，將改造后的細胞用于脫發治療，提高干細胞移植的效率和治療效果。
1 材料與方法
1.1 實驗組織、動物及主要試劑、儀器
毛囊來自于2021年12月—2022年8月中國人民解放軍中部戰區總醫院皮膚科收治的20例40～50歲女性脫發患者，在獲取毛囊術前已告知患者及家屬手術風險與術后可能發生的不良反應，患者均知情同意并簽署知情同意書。
6～8周齡SPF級雌性BALB/c-nu裸鼠25只，體質量（20.88±0.52）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。
過表達Shh（NM_000193）慢病毒由上海吉凱基因化學技術有限公司合成；實驗所需引物由北京擎科生物技術有限公司合成；人MSCs無血清基礎培養基（天津灝洋華科生物科技有限公司）；100 U/mL 青、鏈霉素（石家莊制藥集團有限公司）；0.25%胰蛋白酶、無血清細胞凍存液（廣州賽國生物科技有限公司）；SYBR Green Master Mix試劑盒、HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR逆轉錄反應試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA總蛋白濃度測定裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；CD29、CD34、CD71流式抗體（Biolegend公司，美國）；Shh抗體、β-actin抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；細胞角蛋白15（cytokeratin 15，CK15）抗體（Abcam公司，英國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、細胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物技術股份有限公司）；濃縮型正常山羊血清（封閉）、熒光（Cy3）標記羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）；DAPI（上海碧云天生物技術有限公司）。
超凈工作臺（蘇州集團安泰空氣技術有限公司）；CO2恒溫箱（SANYO公司，日本）；冷凍高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；流式細胞儀（BD Biosciences公司，美國）；Light Cycle96實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀（上海羅氏集團）；WD-9413B凝膠成像分析儀（北京六一生物科技有限公司）；生物顯微鏡、熒光顯微鏡汞燈（Olympus公司，日本）；酶標儀（上海天能科技有限公司）；病理切片機（RM 2016輪轉式切片機；Leica公司，德國）；JK-6生物組織攤烤片機、JT-12J電腦生物組織脫水機（武漢俊杰電子有限公司）。
1.2 HFSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 HFSCs分離及培養
從20例脫發患者頭皮正常區和脫發區分別隨機拔取1個毛囊，得到40個毛囊樣本。從兩區毛囊中獲取原代HFSCs并傳代，得到正常組（H1組）和脫發組（H2組）HFSCs。具體方法：用75%乙醇消毒擬取樣部位頭皮，選取毛囊結構完整的毛發，在含100 U/mL青、鏈霉素的PBS中浸泡5 min；剪取毛囊中間段，接種于10 cm2培養皿底面上，添加5 mL 100 U/mL青、鏈霉素溶液的人MSCs無血清基礎培養基重懸于培養皿中，于37℃、5%CO2孵箱中培養。當毛囊貼壁時，繼續添加5 mL培養基，此后每隔3 d換液1次，直至周圍有細胞爬出時換液；然后每隔3 d換液1次，待細胞融合至80%時傳代。
1.2.2 流式細胞術鑒定HFSCs表面標志物
取兩組第4代生長良好的HFSCs，0.25%胰蛋白酶消化后添加相同體積新鮮培養基重懸細胞，制備密度為5×105個/mL的細胞懸液，分裝至15 mL離心管中（500 μL/管）；以離心半徑13.5 cm、1 500 r/min離心2 min，棄上清。加入約1 mL預冷后PBS進行細胞重懸，取300 μL細胞懸液平均分配至3個新的15 mL離心管內（10 μL/管）。按照抗體使用說明書，依次往3個離心管中添加 CD29、CD71、CD34流式抗體各5 μL，避光培養30 min；加入1 mL預冷后PBS沖洗未結合的抗體后，同上法離心2 min，棄上清。將300 μL預冷后PBS分別添加至3個離心管中，充分混勻后將細胞懸液依次轉入3個新的流式管中，上機檢測。
1.3 Shh在HFSCs傳代過程中的表達
1.3.1 RT-qPCR檢測
分別取兩組第4、7、10代細胞，以Trizol法提取細胞總mRNA，紫外分光光度計鑒定并定量。利用HiScript?ⅡQ RT SuperMix for qPCR逆轉錄反應試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。RT-qPCR反應按SYBR Green Master Mix試劑盒說明書進行。以β-actin為內參，用2–??Ct法計算Shh mRNA相對表達量。引物序列（5′→3′）：Shh正義TTCCCTTCATACCTTCCG，反義TAGTCCTCGTCTCCTCGC，產物長度166 bp；β-actin正義CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC，反義TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT，產物長度240 bp。
1.3.2 Western blot檢測
分別取兩組第4、7、10代細胞，加入4℃預冷PBS洗滌細胞3次，隨后加入適量RIPA裂解緩沖液于冰上裂解10 min；4℃以離心半徑13.5 cm、12 000 r/min離心10 min后收集上清液，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進行蛋白濃度定量。取蛋白樣本加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水中水浴10 min使其變性后，行SDS-PAGE電泳，電泳后轉膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，分別加入一抗Shh（1∶600）及內參GAPDH（1∶4 000）4℃過夜，再用TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫下振蕩孵育2 h；再次洗膜3次后加入ECL試劑顯色，放入凝膠成像儀中曝光成像，成像結束后采用Image-Pro Plus軟件分析膠片灰度值，以與內參β-actin比值作為Shh蛋白相對表達量。
1.4 慢病毒轉染HFSCs及驗證
1.4.1 慢病毒轉染
分別取兩組第7代細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后，制備密度為5×103個/mL的細胞懸液。待細胞貼壁融合約50%后，將細胞懸液加入10 cm2培養皿，添加培養基使皿中總體積為10 mL。從–80℃冰箱中取出Shh慢病毒溶液置于冰上融化，以預實驗確定的最佳感染復數100轉染細胞，得到過表達Shh 的正常組（H1-HFSCShh組）和脫發組（H2-HFSCShh組）；同時使用Shh陰性慢病毒和培養基轉染細胞，得到正常空載組（H1-HFSCNC組）和脫發空載組（H2-HFSCNC組）作為對照。然后于細胞培養箱中進行培養，24 h后更換新鮮培養基繼續培養。
1.4.2 慢病毒轉染驗證
病毒轉染72 h后，取各組細胞采用熒光顯微鏡觀察，若觀察到綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達，即為Shh慢病毒攜帶的熒光，根據以下公式計算病毒感染率：病毒感染率=熒光細胞數/明視野細胞數×100，病毒感染率達近90%即為轉染成功。
同1.3方法采用RT-qPCR和Western blot檢測各組Shh蛋白和mRNA相對表達量，并與H1組和H2組進行比較。
1.5 過表達Shh后HFSCs的增殖活性變化
1.5.1 CCK-8檢測
取增殖狀態好、在對數生長期的H1-HFSCNC組、H2-HFSCNC組、H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組細胞懸液，以1×104個/mL濃度加入96孔板，每孔100 μL。將其移入恒溫細胞培養箱中過夜（將100 μL無菌1×PBS添加至細胞周圍孔內），每組設3個復孔。于細胞接種后24、48、72、96 h分別加入10 μL CCK-8溶液，37℃培養4 h后酶標儀檢測450 nm處吸光度（A）值。
1.5.2 流式細胞周期測定
取處于生長期的H1-HFSCNC組、H2-HFSCNC組、H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組細胞，用胰蛋白酶消化，制備濃度為3×105個/mL的細胞懸液；4℃以離心半徑13.5 cm、1 500 r/min離心2 min，用預冷1×PBS重懸細胞沖洗2次，同上法離心吸棄上清液后用100 μL預冷1×PBS重懸細胞，然后緩慢加入預冷80%乙醇700 μL，4℃固定4 h以上；同上法離心2 min后重復預冷1×PBS潤洗2次；加入100 μL RNase（50 μg/mL）溶液，37℃孵育30 min；加入400 μL碘化丙啶（50 μg/mL），4℃避光染色30 min后上機檢測。比較各組G0/G1期、S期和G2/M期的細胞比例，按以下公式計算增殖指數：增殖指數=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。
1.6 裸鼠細胞移植實驗
消化收集4組（H1-HFSCNC組、H2-HFSCNC組、H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組）細胞，以無菌生理鹽水洗滌2次，再以無菌生理鹽水重懸制成濃度為4×106個/mL的細胞懸液。裸鼠適應性飼養1周后，根據注射溶液不同分為實驗組（H1-HFSCNC組、H2-HFSCNC組、H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組）和對照組（生理鹽水組），每組5只。實驗組取200 μL對應細胞懸液于裸鼠背部皮內單點注射，每周注射2次，對照組同法注射等量生理鹽水，共注射5周。每周觀察裸鼠背部注射部位毛發生長情況，5周后處死裸鼠，取注射部位皮膚組織進行觀測。
1.6.1 Western blot檢測
各組取100 mg皮膚組織置于培養皿中，手術剪剪成3 mm×3 mm左右小塊，加入0.5～1.0 mL RIPA裂解緩沖液，于低溫下玻璃勻漿器手動勻漿；取組織勻漿液轉移至1.5 mL預冷的離心管，4℃以離心半徑13.5 cm、12 000 r/min離心5 min后收集上清液；將上清液轉移至新的預冷離心管中，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒方法測定蛋白濃度，同1.3.2方法檢測Shh蛋白相對表達量。
1.6.2 HE染色
將各組組織標本石蠟包埋后行5 μm厚切片，取部分切片常規行HE染色，光鏡下觀察并計數各組毛囊數量。
1.6.3 免疫熒光染色
將上述部分標本切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，蒸餾水清洗3～5次，用濃縮型正常山羊血清封閉液處理20 min，分別加入一抗（CD71、CK15，稀釋比例為1∶200）4℃孵育過夜；次日，1×PBS清洗3次后，加入與一抗對應種屬的熒光二抗37℃反應30 min；PBS清洗3次，滴入DAPI復染，PBS清洗后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察各組HFSCs表面陽性標志物CD71和CK15的熒光強度差異，應用Image-Pro Plus 6.0軟件進行CD71、CK15熒光強度定量檢測。
1.7 統計學方法
采用Graphpad Prism 9.0軟件進行數據分析并統計作圖。計量資料行正態性檢驗，均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 人HFSCs形態觀察及鑒定
光鏡觀察示，培養72 h后可見梭形樣細胞從毛囊組織中向外爬出，早期原代細胞呈圓形、梭形、三角形等；經3次傳代后，細胞多為長梭形且貼壁速度快，H1組和H2組細胞形態無明顯差別。見圖1。流式細胞儀檢測示第4代細胞表面CD29和CD71呈高表達，接近100%， CD34基本不表達，提示培養細胞為HFSCs。見圖2。
圖1
第3代人HFSCs形態學觀察（×40）
a. H1組；b. H2組
Figure1. Morphological observation of the 3rd passage human HFSCs (×40)a. H1 group; b. H2 group
圖2
人HFSCs流式細胞術鑒定
從左至右依次為CD34、CD71、CD29 a. H1組；b. H2組
Figure2. Flow cytometry identification of human HFSCsFrom left to right for CD34, CD71, and CD29, respectively a. H1 group; b. H2 group
2.2 Shh在HFSCs傳代過程中的表達
RT-qPCR和Western blot檢測示，H1組和H2組細胞中Shh蛋白及mRNA相對表達量隨代次增加呈逐漸下降趨勢，各代次間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
Shh在HFSCs傳代過程中的表達
分別為Western blot電泳圖（Mr：相對分子質量，1～3：分別為第4、7、10代細胞）、Shh蛋白相對表達量、Shh mRNA相對表達量 a. H1組；b. H2組
Figure3. Expression of Shh in passage of HFSCsFor Western blot electropherograms (Mr: Relative molecular mass, 1-3: Cells of 4th, 7th, and 10th passages, respectively), relative expression of Shh protein, and relative expression of Shh mRNA, respectively a. H1 group; b. H2 group
2.3 慢病毒轉染HFSCs及驗證
將Shh慢病毒和陰性慢病毒轉染HFSCs 72 h后，熒光顯微鏡下均觀察到綠色熒光出現。H1-HFSCNC組、H1-HFSCShh組、H2-HFSCNC組和H2-HFSCShh組病毒感染率分別為85.65%±2.07%、87.16%±2.90%、85.31%±2.38%、82.80%±2.82%；提示目的基因在細胞內表達情況良好，可用于后續實驗。見圖4。
圖4
各組轉染Shh慢病毒后72 h熒光顯微鏡觀察（×100）
左、右分別為明場和暗場 a. H1-HFSCNC組；b. H1-HFSCShh組；c. H2-HFSCNC組；d. H2-HFSCShh組
Figure4. Fluorescence microscope observation at 72 hours after transfection of Shh lentivirus in each group (×100)Left and right for bright and dark fields, respectively a. H1-HFSCNC group; b. H1-HFSCShh group; c. H2-HFSCNC group; d. H2-HFSCShh group
RT-qPCR和Western blot檢測示，H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組中Shh蛋白及mRNA相對表達量均顯著高于對應的H1-HFSCNC組、H2-HFSCNC組及H1組、H2組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。表明已成功構建穩定過表達Shh的HFSCs細胞株，慢病毒轉染后達到了靶向調控Shh目的基因及蛋白的作用。
圖5
過表達Shh的HFSCs中Shh蛋白和mRNA表達情況
分別為Western blot電泳圖（Mr：相對分子質量，1～3：分別為H1/H2組、H1/H2-HFSCNC組、H1/H2-HFSCShh組）、Shh蛋白相對表達量、Shh mRNA相對表達量 a. H1組；b. H2組
Figure5. Shh protein and mRNA expression in the Shh overexpressed HFSCsFor Western blot electropherograms (Mr: Relative molecular mass, 1-3: H1/H2 group, H1/H2-HFSCNC group, and H1/H2-HFSCShh group, respectively), relative expression of Shh protein, and relative expression of Shh mRNA, respectively a. H1 group; b. H2 group
2.4 過表達Shh后HFSCs的增殖活性變化
2.4.1 CCK-8檢測
隨細胞接種時間延長，各組A值均呈逐漸增加趨勢。接種48 h后，H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組的增殖斜率分別顯著高于對應的H1-HFSCNC組和H2-HFSCNC組，H1-HFSCShh組顯著高于H2-HFSCShh組，H1-HFSCNC組亦顯著高于H2-HFSCNC組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖6。
圖6
CCK-8檢測過表達Shh后對HFSCs增殖的影響
Figure6.
Effect of Shh overexpression on the proliferation of HFSCs detected by CCK-8 assay
2.4.2 流式細胞周期測定
在S期和G2/M期，H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組細胞周期百分比顯著高于對應的H1-HFSCNC組和H2-HFSCNC組，H1-HFSCShh組顯著高于H2-HFSCShh組，H1-HFSCNC組亦顯著高于H2-HFSCNC組；各組在G0/G1期的細胞比例與S期和G2/M期相反；以上差異均有統計學意義（P<0.05）。
H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組細胞增殖指數顯著高于對應的H1-HFSCNC組和H2-HFSCNC組，H1-HFSCShh組顯著高于H2-HFSCShh組，H1-HFSCNC組亦顯著高于H2-HFSCNC組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖7。
圖7
過表達Shh后對HFSCs細胞周期的影響
a～d. 分別為H1-HFSCNC組、H1-HFSCShh組、H2-HFSCNC組和H2-HFSCShh組細胞周期分布情況；e. 各組在各細胞分期的細胞周期百分比；f. 各組在整個細胞周期的增殖指數
Figure7. Effect of Shh overexpression on the cell cycle of HFSCsa-d. The cell cycle distribution of H1-HFSCNC, H1-HFSCShh, H2-HFSCNC, and H2-HFSCShh groups, respectively; e. Cell cycle percent of each group at each cell stage; f. Proliferation index of each group throughout the cell cycle
2.5 裸鼠細胞移植實驗
2.5.1 Western blot檢測
H1-HFSCShh組Shh蛋白相對表達量顯著高于H1-HFSCNC組和對照組，H2-HFSCShh組顯著高于H2-HFSCNC組和對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖8。
圖8
裸鼠細胞移植5周Western blot檢測各組Shh蛋白表達情況
a. 電泳圖 Mr：相對分子質量 1～3：分別為對照組、H1-HFSCNC組、H1-HFSCShh組 4～6：分別為對照組、H2-HFSCNC組、H2-HFSCShh組；b. 蛋白相對表達量
Figure8. Western blot detection of Shh protein expression in nude mouse of each group after 5 weeks of cell transplantationa. Electropherogram Mr: Relative molecular mass 1-3: Control group, H1-HFSCNC group, and H1-HFSCShh group, respectively 4-6: Control group, H2-HFSCNC group, and H2-HFSCShh group, respectively; b. Relative protein expression
2.5.2 HE染色
各實驗組裸鼠背部皮膚組織內毛囊數量均顯著多于對照組，H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組分別多于對應的H1-HFSCNC組和H2-HFSCNC組，H1-HFSCShh組顯著多于H2-HFSCShh組，H1-HFSCNC組亦顯著多于H2-HFSCNC組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖9。
圖9
裸鼠細胞移植5周各組HE染色觀察
a. H1-HFSCNC組（×200）；b. H1-HFSCShh組（×200）；c. H2-HFSCNC組（×200）；d. H2-HFSCShh組（×200）；e. 對照組（×200）；f. 各組背部皮膚組織內毛囊數量
Figure9. HE staining in nude mouse of each group after 5 weeks of cell transplantationa. H1-HFSCNC group (×200); b. H1-HFSCShh group (×200); c. H2-HFSCNC group (×200); d. H2-HFSCShh group (×200); e. Control group (×200); f. Number of hair follicles in the dorsal skin tissue in each group
2.5.3 免疫熒光染色
各實驗組CD71和CK15的熒光強度均顯著高于對照組，H1-HFSCShh組和H2-HFSCShh組高于對應的H1-HFSCNC組和H2-HFSCNC組，H1-HFSCShh組顯著高于H2-HFSCShh組，H1-HFSCNC組亦顯著高于H2-HFSCNC組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖10。
圖10
裸鼠細胞移植5周各組免疫熒光染色觀察
a～e. 分別為H1-HFSCNC組、H1-HFSCShh組、H2-HFSCNC組、H2-HFSCShh組和對照組CD71免疫熒光染色（熒光顯微鏡×200）；f. 各組CD71熒光強度比較；g～k. 分別為H1-HFSCNC組、H1-HFSCShh組、H2-HFSCNC組、H2-HFSCShh組和對照組CK15免疫熒光染色（熒光顯微鏡×200）；l. 各組CK15熒光強度比較
Figure10. Immunofluorescence staining in nude mouse of each group after 5 weeks of cell transplantationa-e. Immunofluorescence staining of CD71 in H1-HFSCNC, H1-HFSCShh, H2-HFSCNC, H2-HFSCShh, and control groups, respectively (Fluorescence microscope×200); f. Comparison of CD71 fluorescence intensity between groups; g-k. Immunofluorescence staining of CK15 in H1-HFSCNC, H1-HFSCShh, H2-HFSCNC, H2-HFSCShh, and control groups, respectively (Fluorescence microscope×200); l. Comparison of CK15 fluorescence intensity between groups
3 討論
HFSCs已被證實在毛發生長周期及毛囊再生中發揮著重要作用[16-17]。Shh通路是組織發育、體內平衡和修復中最重要的信號轉導通路之一，它在胚胎發生過程中調節各種器官的形態發生，對促進表皮發育和修復以及毛囊發育有著重要作用[18]。本研究中，我們成功分離人HFSCs，發現其Shh mRNA和蛋白表達水平隨體外培養時間延長而逐漸下調；用過表達Shh的慢病毒轉染HFSCs后，Shh在HFSCs內穩定表達，且經過轉染后的HFSCs增殖活性升高。此外，裸鼠經細胞移植后，各實驗組皮膚毛囊數量較對照組增多，HFSCs標記物表達水平也較對照組升高。上述結果表明，HFSCs對毛囊再生具有促進作用，過表達Shh的HFSCs能持續穩定地分泌和表達Shh，并結合干細胞和Shh的優勢共同促進毛囊再生。本研究為脫發的干細胞療法提供了一種新的治療思路和選擇。
HFSCs是較易獲取的多能干細胞之一，能夠快速增殖并分化成表皮細胞、毛囊細胞、內皮細胞和角質形成細胞等[19]。相關研究已顯示在機體的整個生命過程中，其通過靜止和激活之間的循環來促進毛囊產生，在毛發生長的開始階段，HFSCs經歷短暫的活化以增殖，在毛發周期的剩余階段又迅速恢復至靜止狀態[20]。由于細胞表面缺乏Ⅰ類主要組織相容性復合體和免疫細胞，HFSCs未顯示出免疫排斥反應，這也使其成為細胞療法的通用供體[21]。本次研究中，我們成功分離并鑒定了人HFSCs，為后續實驗提供了可靠的數據支持。
利用基因工程技術改造細胞是目前再生醫學中較為新穎的療法，對許多全身性疾病都有治療效果[22-23]。但在干細胞療法中，通過重復傳代培養收獲的干細胞往往會失去增殖和多能分化的能力，從而影響治療效果[24]。因此改善細胞增殖穩態和維持干細胞群是開發新的脫發療法的重要步驟。已知Shh通路對毛囊發育和毛發生長周期起到調節作用[12]。本研究中，我們通過Western blot和RT-qPCR檢測了正常組和脫發組第4、7、10代HFSCs中Shh蛋白和mRNA表達水平，發現二者表達水平隨體外培養時間延長呈逐漸下降趨勢，分析Shh表達可能與HFSCs的活性和增殖能力相關。因此我們采用Shh慢病毒轉染方法建立了過表達Shh的HFSCs，結果顯示病毒轉染72 h后，Shh蛋白和mRNA表達水平均顯著升高，提示本次研究已成功構建穩定過表達Shh的HFSCs細胞株。接著通過細胞增殖實驗檢測了轉染后的細胞增殖能力，結果顯示過表達Shh后HFSCs的增殖活性均較陰性對照組升高，且正常組細胞轉染前后的增殖活性均高于脫發組細胞，這也說明了HFSCs的增殖分化受其周圍微環境的影響，毛囊周圍的信號會影響HFSCs活性[25]。
毛囊作為一種多功能皮膚附屬物，在組織穩態中起著至關重要的作用，可提供物理屏障以抵御外部傷害、促進體溫調節和傳遞觸覺[26]。就人類而言，毛發會極大地影響一個人的外表和社會交流，各種破壞因素，如衰老、遺傳、炎癥和生理壓力，會導致過度脫發，無論性別或年齡如何[27]。目前已對脫發的治療進行了許多研究，市場上只有口服非那雄胺和外用米諾地爾兩種治療藥物獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）批準，但副作用較大，療效存在較大個體差異、用藥時間長，患者難以持續用藥，因此對脫發疾病的治療存在巨大需求[28-29]。近年來，再生醫學和毛發組織工程領域的顯著進步，為脫發的干細胞療法帶來了新希望。我們利用裸鼠模型進行體內研究，將轉染前后的人HFSCs移植到裸鼠體內，小鼠背部的毛囊與人類類似，也具備毛囊生長周期，由于鼠的性別和品種，毛囊周期的精確同步化時間略有差別，但它身體的毛發大部分都是同步的[30-31]。裸鼠先天沒有胸腺，存在免疫缺陷，是適宜于移植異種來源細胞的鼠的品種。在細胞移植5周后，背部組織Western blot結果顯示Shh蛋白也有穩定表達；毛囊HE染色結果示，各實驗組裸鼠背部毛囊數量均較對照組明顯增加，免疫熒光染色示HFSCs標記物熒光強度亦較對照組明顯升高，進一步表明過表達Shh可促進HFSCs的存活，進而促進毛囊再生。
本實驗存在一定局限性：① HFSCs的存活時間較短，若提取時間過長，可能存在細菌污染和細胞活力下降問題；② 分離培養的HFSCs如何將濃度提純至最大程度，降低外源性因素的干擾，也是一個關鍵問題；③ 由于人與鼠屬不同，其毛囊也有差異，因此針對鼠類動物進行的實驗并不能很好地用于人體臨床治療，未來仍需要在此問題上繼續深入探索。
綜上述，本研究表明HFSCs具有促進毛囊再生的潛力，過表達Shh后HFSCs的增殖活性顯著升高，能持續穩定地分泌和表達Shh，并結合干細胞和Shh的優勢共同促進毛囊再生，提高了細胞移植治療效果，為干細胞治療脫發提供一種新的治療思路和選擇。未來將進一步研究促進毛囊再生的分子靶點，為臨床治療脫發提供更多新途徑。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經中國人民解放軍中部戰區總醫院倫理委員會（［2022］032-01）及中國人民解放軍中部戰區總醫院動物實驗倫理委員會批準 ［中總動（福）第2022208號］；實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2018-0045
作者貢獻聲明 楊瑩瑩：研究實施、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；王剛：研究設計、數據收集整理及統計分析、行政支持；楊前：研究實施；刁波：研究設計、行政及經費支持
