引用本文： 葛建華, 賈樂, 段可, 李洋, 馬月, 閆吉元, 段鑫, 巫桂兵. 一種新型復合人工骨材料的制備及性能研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(4): 488-494. doi: 10.7507/1002-1892.202211097 復制
臨床上常見因骨髓炎、骨不連、骨腫瘤及人工關節翻修等疾病造成的骨缺損，據統計我國每年約400萬患者因骨缺損需手術治療[1]。自體骨移植是臨床骨缺損修復的“金標準”，但來源有限。因此，尋找理想的自體骨替代材料成為骨科研究重點之一。
磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）是目前臨床使用較廣泛的骨移植替代材料，其鈣磷比與人體骨組織相似，具有良好生物相容性及骨傳導性。但TCP制備的生物陶瓷抗壓強度較低，且不具備自固化性，臨床應用存在凝固時間長、降解慢的問題，應用范圍有限[2-3]。硫酸鈣具有自固化性，且初期抗壓強度較高，可用作可注射骨填充材料，但其體內降解過快，對后期骨再生缺乏引導作用[4-5]。 本研究擬結合上述兩種材料特點，制備一種新型復合人工骨材料（以下簡稱復合材料），通過調整兩種材料比例，實現性能互補；進一步加入透明質酸（hyaluronic acid，HA），提升該復合材料的生物相容性、機械強度、降解速率及可注射性等性能，以期為臨床提供一種新的骨缺損修復材料。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑及儀器
二水硫酸鈣（calcium sulfate dihydrate，CSD）、磷酸氫二銨 ［（NH4）2HPO4，分析純］（成都市科隆化學品有限公司）；硝酸鈣 ［Ca（NO4）2，分析純；廣州化學試劑廠］；低分子量HA（40×103；華熙生物科技股份有限公司）；L929細胞（北京綠源大德生物科技有限公司）；FBS培養基（北京普利智誠生物技術有限公司）；MTT比色劑、PBS溶液、DMSO（上海吉至生化科技有限公司）。
DGL-508高壓蒸汽滅菌器（江蘇登冠醫療器械有限公司）；101-2BS電熱鼓風干燥箱（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；SX2-4-13高溫實驗爐（重慶觀致科技有限公司）；KYKY-EM6900掃描電鏡（北京中科科儀股份有限公司）；TD-3500 X射線衍射儀（丹東通達科技有限公司）；E10000電子動靜態萬能材料試驗機 ［英斯特朗（上海）試驗設備貿易有限公司］；酶標儀（上海邁瑞爾生化科技有限公司）。
1.2 材料制備方法
1.2.1 α-半水硫酸鈣（α-calcium sulfate hemihydrate，α-CSH）制備
采用水熱法制備α-CSH。具體步驟：將CSD粉末和去離子水按照2 g∶5 mL比例混合攪拌，再加入檸檬酸鈉等晶型轉化劑后，置于高壓蒸汽滅菌器中，設置溫度為120～140℃，反應時間2 h。在飽和蒸汽介質中，CSD經過溶解再結晶，形成α-CSH結晶體。取出后移入110℃電熱鼓風干燥箱中，在熱狀態下過濾、沸水洗滌、干燥、磨碎，得到高純度α-CSH粉末。
1.2.2 β-TCP制備
采用可溶性鈣鹽和磷酸鹽反應法制備β-TCP。將Ca（NO4）2和（NH4）2HPO4按照鈣磷比1.50混合后，加入去離子水配制溶液，混合過程中使用氨水調節反應溶液pH值約為12。充分反應后，可見乳白色絮狀沉淀生成，將沉淀物進行過濾、多次洗滌、干燥后，在高溫實驗爐中以1 100℃煅燒，可得到β-TCP粉末。
1.2.3 HA溶液制備
將HA與去離子水混合，充分攪拌、溶解，制備成濃度為0.1%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%的HA溶液。
1.2.4 復合材料制備
將α-CSH、β-TCP粉末按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合，即為固相；去離子水及0.1%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0% HA溶液為液相。于25℃、空氣濕度80%條件下，將不同比例混合粉末以及不同濃度HA溶液、去離子水分別按照液固比0.30、0.35混合，制備不同組分的HA/α-CSH/β-TCP、α-CSH/β-TCP復合材料。
1.3 觀測方法
1.3.1 掃描電鏡觀察
將α-CSH、β-TCP以及HA/α-CSH/β-TCP復合材料（固相粉末比例7∶3、液相1.0%HA溶液、液固比0.30）樣品黏于導電膠樣品臺上，對樣品斷面進行噴金，掃描電鏡觀察樣品表面形貌。
1.3.2 X射線衍射分析
取α-CSH、β-TCP、HA/α-CSH/β-TCP復合材料（固相粉末比例7∶3、液相1.0%HA溶液、液固比0.30）研磨成粉末，使用X射線衍射儀對樣品進行物相分析。X射線掃描角度為10°～90°，掃描速度為4°/min。
1.3.3 材料凝固時間測定
將1.2.4中按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合的α-CSH/β-TCP粉末，以液固比0.30分別與去離子水、1.0%HA溶液混合，制備成HA/α-CSH/β-TCP、α-CSH/β-TCP復合材料。于25℃干燥條件下，采用Gillmore雙針法[6]測定樣品凝固時間。輕針質量（113.0±0.5）g，直徑（2.12±0.05）mm，施加靜壓0.3 MPa，樣品承受輕針壓力而不留壓痕的時間為初凝時間；重針質量（453.6±0.5）g，直徑（1.06±0.05）mm，施加靜壓5 MPa，樣品承受重針而不留壓痕的時間為終凝時間。實驗重復5次。
1.3.4 材料降解實驗
實驗分為6組，將1.2.4中按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合的α-CSH/β-TCP粉末，分別與1.0%HA溶液以液固比0.30混合后，置于硅膠模具，制備成直徑5 mm、厚4 mm片狀樣品。各組樣品稱重（m1）后置于含4 mL模擬體液的離心管內，于37℃電熱鼓風干燥箱中，每3天更換1次模擬體液，2周后取出樣品，烘干后稱重（m2）。每組取5個樣品進行測試，按照以下公式計算降解率，公式：（m1–m2）/m1×100%。
1.3.5 材料抗壓強度測試
實驗分為6組，將1.2.4中按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合的α-CSH/β-TCP粉末，分別與1.0%HA溶液以液固比0.35混合后，填充至自制硅膠模具（直徑5 mm、高10 mm），制備成HA/α-CSH/β-TCP復合材料圓柱狀樣品。將樣品置于電子動靜態萬能材料試驗機平臺上，以壓縮速率為1 mm/min進行力學性能測試。按照以下公式計算抗壓強度：抗壓強度=壓縮樣品至碎裂時的最大壓力（N）/樣品底面積（mm2）。每組取5個樣品測試。
1.3.6 材料潰散情況觀察
實驗分為6組，將1.2.4中按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合的α-CSH/β-TCP粉末，分別與1.0%HA溶液以液固比0.30混合后，注入PBS溶液中，于37℃電熱鼓風干燥箱靜置，分別于0、1、2、12 h肉眼觀察材料崩解潰散、脫粉情況。
1.3.7 材料可注射性檢測
取5 mL注射器稱重記為m0。將α-CSH、β-TCP 粉末按照7∶3比例混合后，分別與去離子水以及0.1%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%HA溶液，按照液固比0.30混合后裝入注射器，稱重記為m1；擠壓注射器推桿至漿料不能擠出為止，剩余漿料及注射器稱重記為m2。按照以下公式計算注射能力系數：注射能力系數=（m1–m2）/（m1–m0）×100%。
1.3.8 材料細胞毒性實驗
將1.2.4中按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合的α-CSH/β-TCP 粉末，分別與1.0%HA溶液以液固比0.35混合，固化后用聚乙烯塑料袋雙層密封，γ射線（25 kGy）滅菌。樣品按照0.2 g/mL比例加入FBS培養基，于37℃恒溫振蕩箱中動態浸提24 h，制備樣品浸提液。
將L929細胞密度調整為1×104個/mL后接種于96孔板中，每孔200 μL；置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。將細胞隨機分為7組（實驗1～6組及對照組），每組5孔。實驗1～6組加入上述制備的不同復合材料浸提液進行培養，對照組為FBS培養基。繼續培養24 h后各組棄培養液，每孔加入25 μL MTT比色劑，37℃培養4 h。吸棄培養液，PBS液沖洗后，每孔加入150 μL DMSO，搖晃震蕩15 min。用酶標儀在450 nm波長處讀取吸光度（A）值，按照以下公式計算細胞相對生長率（cell relative growth rate，RGR）：RGR=實驗組A值/對照組A值×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均服從正態分布，數據以均數±標準差表示；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 掃描電鏡觀察
α-CSH呈六方短柱狀，粒徑集中在30～50 μm之間。β-TCP呈塊狀結構，粒徑在200～400 nm之間。HA/α-CSH/β-TCP復合材料固化后表面粗糙，可見較大不規則片塊狀顆粒與較小片狀、條狀顆粒密集堆積，且表面呈微孔結構，孔徑主要在5～15 μm之間。見圖1。
圖1
材料掃描電鏡觀察
a. α-CSH（×200）；b. β-TCP（×3 000）；c. HA/α-CSH/β-TCP復合材料（×2 000）
Figure1. Scanning electron microscope observation of materialsa. α-CSH (×200); b. β-TCP (×3 000); c. HA/α-CSH/β-TCP composite material (×2 000)
2.2 X射線衍射分析
α-CSH、β-TCP的X射線衍射特征峰與標準卡片中的特征衍射峰峰值無明顯偏移，說明實驗制備原料無誤。
HA/α-CSH/β-TCP復合材料中，α-CSH特征衍射峰與CSD特征衍射峰重合（2θ=12°、21°、39°、31°、33°）；β-TCP特征衍射峰與羥基磷灰石特征衍射峰重合（主峰2θ=31.8°，次強峰2θ=31.2°、 31.9°、25.9°、49.5° ）。見圖2。
圖2
材料X射線衍射圖譜
Figure2.
X-ray diffraction patterns of materials
2.3 材料凝固時間測定
同一復合材料隨β-TCP含量增加，初凝、終凝時間逐漸延長（P<0.05）；但當α-CSH/β-TCP比例達3∶7時，樣品凝固時間超過30 min，無臨床應用價值，故統計分析排除該比例材料。
同一α-CSH/β-TCP比例，HA/α-CSH/β-TCP、α-CSH/β-TCP復合材料間初凝時間、終凝時間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
各復合材料凝固時間比較（n=5，
，min）
Table1.
Comparison of setting time between composite materials of different ratios of α-CSH/β-TCP (n=5, 
, min)
2.4 材料降解性及抗壓強度測試
隨著β-TCP含量增大，HA/α-CSH/β-TCP復合材料降解率呈下降趨勢（P<0.05）；而抗壓強度呈先增大，至β-TCP含量達20%時達峰值，之后逐漸降低趨勢（P<0.05）。見表2。
表2
復合材料降解率及抗壓強度比較（n=5，
）
Table2.
Comparison of degradation rate and compressive strength between composite materials of different ratios of α-CSH/β-TCP (n=5, 
)
2.5 材料潰散情況觀察
各組材料均能固化成形，隨著靜置時間增加，固化產物邊緣開始出現粉末沉著，斷端出現膨大、松散，即發生潰散現象，且靜置時間越長，潰散越明顯。同一時間點，隨著HA/α-CSH/β-TCP復合材料中β-TCP含量增加，潰散現象越明顯。見圖3。
圖3
復合材料潰散情況觀察
從上至下分別為靜置0、1、2、12 h，從左至右分別為α-CSH/β-TCP比例為10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7
Figure3. Dispersion observation of composite materialsFrom top to bottom for 0, 1, 2, and 12 hours, respectively; from left to right for the ratio of α-CSH/β-TCP of 10∶0, 9∶1, 8∶2, 7∶3, 5∶5, and 3∶7, respectively
2.6 材料可注射性檢測
添加去離子水及0.1%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%HA溶液后，各復合材料注射性能逐漸提高，注射能力系數分別為31.9%±1.1%、32.3%±1.0%、35.38%±1.2%、65.9%±2.0%、92.9%±1.2%、95.0%±1.4%，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.7 材料細胞毒性檢測
實驗1～6組RGR分別為92.4%、93.9%、92.8%、92.3%、93.3%、90.9%，均高于75%，細胞毒性等級為0～1級[7]，提示制備的樣品均無細胞毒性。
3 討論
3.1 復合材料組分選擇
理想的人工骨修復材料需要滿足以下特性[8-10]：① 良好生物相容性；② 合適的生物降解性；③ 骨傳導性及骨誘導性；④ 一定機械強度；⑤ 可塑形性、可注射性；⑥ 自凝且凝固時間合適；⑦ 具有表面微孔結構；⑧ 原料廣泛，生產成本低；⑨ 易消毒、滅菌。為了滿足以上要求，本研究選擇制備復合材料，保留不同材料的優點，互補其缺點。
α-CSH具有良好生物相容性、可塑形性、可降解性、抗壓強度、骨傳導性及成骨能力，作為一種較理想的骨移植替代材料已廣泛應用于臨床[11-12]。但α-CSH吸水形成CSD后，降解過快，同時降解后的酸性環境不利于新骨生成，限制其單獨用于臨床骨缺損修復。但固化的CSD是一種良好黏合劑，復合磷酸鈣、羧甲基殼聚糖鋅、羥基磷灰石等材料能獲得穩固結構的復合材料，還能添加BMP、自體骨、抗生素等[4-5, 13]，有利于骨缺損修復。β-TCP也具有與α-CSH類似的生物相容性及優良理化性能[2-3]，但其脆性大，缺乏骨誘導性，降解速率與凝固時間不可控，也限制了其臨床單獨使用。而且β-TCP降解較慢，且體內降解比體外降解更慢[14-15]，目前研究均通過復合其他材料，以期改善其生物學性能，調控降解速率、增加抗壓強度等，從而滿足臨床骨缺損修復需求[16-17]。HA是哺乳動物結締組織細胞外基質的重要組分，具有高親水性、高滲透性、高黏彈性以及誘導血管生成活性，無毒性和免疫原性，具備抑菌、抗炎、抗水腫以及減小排斥反應等優點[18-20]。基于此，本研究選擇上述3種材料制備復合材料。
關于各材料復合比例，本課題組在參考相關文獻 ［13，21］ 基礎上進行了一系列預實驗。結果顯示α-CSH、β-TCP以10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7比例混合制備的復合材料，掃描電鏡觀察結果相似，但預實驗抗壓強度、降解性能、凝固時間、細胞生長情況等項目以7∶3比例制備的復合材料最佳，能較好地滿足臨床需求，故本次研究掃描電鏡、X射線衍射分析均取該比例材料進行觀測。
對于HA溶液濃度的篩選，我們在復合材料可注射性能研究時發現2.0%HA黏稠度太高，不易與粉體混合均勻，結合復合材料注射能力系數隨HA溶液濃度增加而增大以及既往相關研究結論 ［22-23］，為最大程度滿足臨床應用需要，最終除材料注射性能外，其余實驗均選擇1.0%HA溶液。
另外，在預實驗中液固比低于0.3時，復合材料成形困難；高于0.4時，凝固時間明顯延長，不滿足臨床需求，且液固比越高，材料強度越低。因此，本研究首先確定材料制備液固比在0.3～0.4之間（0.30、0.35）。但當進行抗壓強度、細胞毒性實驗時，本研究需要將材料制備成圓柱狀，按照液固比0.35混合形成的漿料流動性更佳，更利于模具澆注成形，因此上述實驗選擇該液固比，其余觀測指標采用液固比0.30。
3.2 研究結果分析
本研究結果顯示制備的HA/α-CSH/β-TCP復合材料中，α-CSH/β-TCP可有效調控材料的降解速率、凝固時間、力學強度等性能，加入HA能提高材料的抗潰散性、可注射性等。
掃描電鏡結果顯示復合材料表面粗糙，孔徑主要在5～15 μm之間，理論上該微孔結構適合細胞黏附生長和新生毛細血管長入[24]。自固化性及合理的固化時間是人工骨修復材料的一個重要特性，本研究HA/α-CSH/β-TCP復合材料初凝時間為3.4～8.9 min，終凝時間為7.7～17.5 min；與α-CSH/β-TCP復合材料相比，HA溶液的加入對材料凝固時間無明顯影響，該時間可滿足臨床創傷性、感染性、腫瘤性等骨缺損術中操作。不同比例的α-CSH/β-TCP復合材料降解率為35.6%～53.4%，且降解隨著β-TCP含量增加逐漸減慢，提示改變β-TCP含量可調控該復合材料的降解速率，有望與新骨形成速率相匹配。
生物力學測試顯示隨著β-TCP含量增加，復合材料抗壓強度呈先增大再減小趨勢。當β-TCP含量≤20%時，材料抗壓強度逐漸增加，分析可能固化后CSD表面有微孔結構，β-TCP粒徑較小，正好填充CSD空隙，并通過硫酸鈣基質的作用，形成致密穩固的固化產物。當β-TCP含量>20%時，材料抗壓強度逐漸降低，分析可能是β-TCP影響CSH向CSD水化的過程，α-CSH轉化為CSD的晶體度降低，導致復合材料的力學性能降低。本研究制備的復合材料抗壓強度達人體松質骨抗壓強度0.4～11.0 MPa[25-26]，可滿足臨床骨缺損修復需求。
綜上述，本研究制備的HA/α-CSH/β-TCP復合材料無細胞毒性，有望成為一種新的骨缺損修復材料。但有待進一步明確HA濃度以及液固比最佳范圍，同時還需進一步進行動物實驗以驗證復合材料的體內、外性能差別，是否具備成骨能力，以及降解過程、降解產物對機體的影響等。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 葛建華、段可、段鑫、閆吉元：研究設計；賈樂、巫桂兵、李洋：研究實施；賈樂、馬月、李洋：數據收集整理及統計分析；葛建華、賈樂：文章撰寫；葛建華、巫桂兵、段鑫：經費支持
臨床上常見因骨髓炎、骨不連、骨腫瘤及人工關節翻修等疾病造成的骨缺損，據統計我國每年約400萬患者因骨缺損需手術治療[1]。自體骨移植是臨床骨缺損修復的“金標準”，但來源有限。因此，尋找理想的自體骨替代材料成為骨科研究重點之一。
磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）是目前臨床使用較廣泛的骨移植替代材料，其鈣磷比與人體骨組織相似，具有良好生物相容性及骨傳導性。但TCP制備的生物陶瓷抗壓強度較低，且不具備自固化性，臨床應用存在凝固時間長、降解慢的問題，應用范圍有限[2-3]。硫酸鈣具有自固化性，且初期抗壓強度較高，可用作可注射骨填充材料，但其體內降解過快，對后期骨再生缺乏引導作用[4-5]。 本研究擬結合上述兩種材料特點，制備一種新型復合人工骨材料（以下簡稱復合材料），通過調整兩種材料比例，實現性能互補；進一步加入透明質酸（hyaluronic acid，HA），提升該復合材料的生物相容性、機械強度、降解速率及可注射性等性能，以期為臨床提供一種新的骨缺損修復材料。
1 材料與方法
1.1 實驗試劑及儀器
二水硫酸鈣（calcium sulfate dihydrate，CSD）、磷酸氫二銨 ［（NH4）2HPO4，分析純］（成都市科隆化學品有限公司）；硝酸鈣 ［Ca（NO4）2，分析純；廣州化學試劑廠］；低分子量HA（40×103；華熙生物科技股份有限公司）；L929細胞（北京綠源大德生物科技有限公司）；FBS培養基（北京普利智誠生物技術有限公司）；MTT比色劑、PBS溶液、DMSO（上海吉至生化科技有限公司）。
DGL-508高壓蒸汽滅菌器（江蘇登冠醫療器械有限公司）；101-2BS電熱鼓風干燥箱（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；SX2-4-13高溫實驗爐（重慶觀致科技有限公司）；KYKY-EM6900掃描電鏡（北京中科科儀股份有限公司）；TD-3500 X射線衍射儀（丹東通達科技有限公司）；E10000電子動靜態萬能材料試驗機 ［英斯特朗（上海）試驗設備貿易有限公司］；酶標儀（上海邁瑞爾生化科技有限公司）。
1.2 材料制備方法
1.2.1 α-半水硫酸鈣（α-calcium sulfate hemihydrate，α-CSH）制備
采用水熱法制備α-CSH。具體步驟：將CSD粉末和去離子水按照2 g∶5 mL比例混合攪拌，再加入檸檬酸鈉等晶型轉化劑后，置于高壓蒸汽滅菌器中，設置溫度為120～140℃，反應時間2 h。在飽和蒸汽介質中，CSD經過溶解再結晶，形成α-CSH結晶體。取出后移入110℃電熱鼓風干燥箱中，在熱狀態下過濾、沸水洗滌、干燥、磨碎，得到高純度α-CSH粉末。
1.2.2 β-TCP制備
采用可溶性鈣鹽和磷酸鹽反應法制備β-TCP。將Ca（NO4）2和（NH4）2HPO4按照鈣磷比1.50混合后，加入去離子水配制溶液，混合過程中使用氨水調節反應溶液pH值約為12。充分反應后，可見乳白色絮狀沉淀生成，將沉淀物進行過濾、多次洗滌、干燥后，在高溫實驗爐中以1 100℃煅燒，可得到β-TCP粉末。
1.2.3 HA溶液制備
將HA與去離子水混合，充分攪拌、溶解，制備成濃度為0.1%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%的HA溶液。
1.2.4 復合材料制備
將α-CSH、β-TCP粉末按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合，即為固相；去離子水及0.1%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0% HA溶液為液相。于25℃、空氣濕度80%條件下，將不同比例混合粉末以及不同濃度HA溶液、去離子水分別按照液固比0.30、0.35混合，制備不同組分的HA/α-CSH/β-TCP、α-CSH/β-TCP復合材料。
1.3 觀測方法
1.3.1 掃描電鏡觀察
將α-CSH、β-TCP以及HA/α-CSH/β-TCP復合材料（固相粉末比例7∶3、液相1.0%HA溶液、液固比0.30）樣品黏于導電膠樣品臺上，對樣品斷面進行噴金，掃描電鏡觀察樣品表面形貌。
1.3.2 X射線衍射分析
取α-CSH、β-TCP、HA/α-CSH/β-TCP復合材料（固相粉末比例7∶3、液相1.0%HA溶液、液固比0.30）研磨成粉末，使用X射線衍射儀對樣品進行物相分析。X射線掃描角度為10°～90°，掃描速度為4°/min。
1.3.3 材料凝固時間測定
將1.2.4中按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合的α-CSH/β-TCP粉末，以液固比0.30分別與去離子水、1.0%HA溶液混合，制備成HA/α-CSH/β-TCP、α-CSH/β-TCP復合材料。于25℃干燥條件下，采用Gillmore雙針法[6]測定樣品凝固時間。輕針質量（113.0±0.5）g，直徑（2.12±0.05）mm，施加靜壓0.3 MPa，樣品承受輕針壓力而不留壓痕的時間為初凝時間；重針質量（453.6±0.5）g，直徑（1.06±0.05）mm，施加靜壓5 MPa，樣品承受重針而不留壓痕的時間為終凝時間。實驗重復5次。
1.3.4 材料降解實驗
實驗分為6組，將1.2.4中按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合的α-CSH/β-TCP粉末，分別與1.0%HA溶液以液固比0.30混合后，置于硅膠模具，制備成直徑5 mm、厚4 mm片狀樣品。各組樣品稱重（m1）后置于含4 mL模擬體液的離心管內，于37℃電熱鼓風干燥箱中，每3天更換1次模擬體液，2周后取出樣品，烘干后稱重（m2）。每組取5個樣品進行測試，按照以下公式計算降解率，公式：（m1–m2）/m1×100%。
1.3.5 材料抗壓強度測試
實驗分為6組，將1.2.4中按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合的α-CSH/β-TCP粉末，分別與1.0%HA溶液以液固比0.35混合后，填充至自制硅膠模具（直徑5 mm、高10 mm），制備成HA/α-CSH/β-TCP復合材料圓柱狀樣品。將樣品置于電子動靜態萬能材料試驗機平臺上，以壓縮速率為1 mm/min進行力學性能測試。按照以下公式計算抗壓強度：抗壓強度=壓縮樣品至碎裂時的最大壓力（N）/樣品底面積（mm2）。每組取5個樣品測試。
1.3.6 材料潰散情況觀察
實驗分為6組，將1.2.4中按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合的α-CSH/β-TCP粉末，分別與1.0%HA溶液以液固比0.30混合后，注入PBS溶液中，于37℃電熱鼓風干燥箱靜置，分別于0、1、2、12 h肉眼觀察材料崩解潰散、脫粉情況。
1.3.7 材料可注射性檢測
取5 mL注射器稱重記為m0。將α-CSH、β-TCP 粉末按照7∶3比例混合后，分別與去離子水以及0.1%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%HA溶液，按照液固比0.30混合后裝入注射器，稱重記為m1；擠壓注射器推桿至漿料不能擠出為止，剩余漿料及注射器稱重記為m2。按照以下公式計算注射能力系數：注射能力系數=（m1–m2）/（m1–m0）×100%。
1.3.8 材料細胞毒性實驗
將1.2.4中按照不同比例（10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7）混合的α-CSH/β-TCP 粉末，分別與1.0%HA溶液以液固比0.35混合，固化后用聚乙烯塑料袋雙層密封，γ射線（25 kGy）滅菌。樣品按照0.2 g/mL比例加入FBS培養基，于37℃恒溫振蕩箱中動態浸提24 h，制備樣品浸提液。
將L929細胞密度調整為1×104個/mL后接種于96孔板中，每孔200 μL；置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。將細胞隨機分為7組（實驗1～6組及對照組），每組5孔。實驗1～6組加入上述制備的不同復合材料浸提液進行培養，對照組為FBS培養基。繼續培養24 h后各組棄培養液，每孔加入25 μL MTT比色劑，37℃培養4 h。吸棄培養液，PBS液沖洗后，每孔加入150 μL DMSO，搖晃震蕩15 min。用酶標儀在450 nm波長處讀取吸光度（A）值，按照以下公式計算細胞相對生長率（cell relative growth rate，RGR）：RGR=實驗組A值/對照組A值×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS26.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均服從正態分布，數據以均數±標準差表示；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 掃描電鏡觀察
α-CSH呈六方短柱狀，粒徑集中在30～50 μm之間。β-TCP呈塊狀結構，粒徑在200～400 nm之間。HA/α-CSH/β-TCP復合材料固化后表面粗糙，可見較大不規則片塊狀顆粒與較小片狀、條狀顆粒密集堆積，且表面呈微孔結構，孔徑主要在5～15 μm之間。見圖1。
圖1
材料掃描電鏡觀察
a. α-CSH（×200）；b. β-TCP（×3 000）；c. HA/α-CSH/β-TCP復合材料（×2 000）
Figure1. Scanning electron microscope observation of materialsa. α-CSH (×200); b. β-TCP (×3 000); c. HA/α-CSH/β-TCP composite material (×2 000)
2.2 X射線衍射分析
α-CSH、β-TCP的X射線衍射特征峰與標準卡片中的特征衍射峰峰值無明顯偏移，說明實驗制備原料無誤。
HA/α-CSH/β-TCP復合材料中，α-CSH特征衍射峰與CSD特征衍射峰重合（2θ=12°、21°、39°、31°、33°）；β-TCP特征衍射峰與羥基磷灰石特征衍射峰重合（主峰2θ=31.8°，次強峰2θ=31.2°、 31.9°、25.9°、49.5° ）。見圖2。
圖2
材料X射線衍射圖譜
Figure2.
X-ray diffraction patterns of materials
2.3 材料凝固時間測定
同一復合材料隨β-TCP含量增加，初凝、終凝時間逐漸延長（P<0.05）；但當α-CSH/β-TCP比例達3∶7時，樣品凝固時間超過30 min，無臨床應用價值，故統計分析排除該比例材料。
同一α-CSH/β-TCP比例，HA/α-CSH/β-TCP、α-CSH/β-TCP復合材料間初凝時間、終凝時間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。
表1
各復合材料凝固時間比較（n=5，，min）
Table1.
Comparison of setting time between composite materials of different ratios of α-CSH/β-TCP (n=5, , min)
2.4 材料降解性及抗壓強度測試
隨著β-TCP含量增大，HA/α-CSH/β-TCP復合材料降解率呈下降趨勢（P<0.05）；而抗壓強度呈先增大，至β-TCP含量達20%時達峰值，之后逐漸降低趨勢（P<0.05）。見表2。
表2
復合材料降解率及抗壓強度比較（n=5，）
Table2.
Comparison of degradation rate and compressive strength between composite materials of different ratios of α-CSH/β-TCP (n=5, )
2.5 材料潰散情況觀察
各組材料均能固化成形，隨著靜置時間增加，固化產物邊緣開始出現粉末沉著，斷端出現膨大、松散，即發生潰散現象，且靜置時間越長，潰散越明顯。同一時間點，隨著HA/α-CSH/β-TCP復合材料中β-TCP含量增加，潰散現象越明顯。見圖3。
圖3
復合材料潰散情況觀察
從上至下分別為靜置0、1、2、12 h，從左至右分別為α-CSH/β-TCP比例為10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7
Figure3. Dispersion observation of composite materialsFrom top to bottom for 0, 1, 2, and 12 hours, respectively; from left to right for the ratio of α-CSH/β-TCP of 10∶0, 9∶1, 8∶2, 7∶3, 5∶5, and 3∶7, respectively
2.6 材料可注射性檢測
添加去離子水及0.1%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%HA溶液后，各復合材料注射性能逐漸提高，注射能力系數分別為31.9%±1.1%、32.3%±1.0%、35.38%±1.2%、65.9%±2.0%、92.9%±1.2%、95.0%±1.4%，組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.7 材料細胞毒性檢測
實驗1～6組RGR分別為92.4%、93.9%、92.8%、92.3%、93.3%、90.9%，均高于75%，細胞毒性等級為0～1級[7]，提示制備的樣品均無細胞毒性。
3 討論
3.1 復合材料組分選擇
理想的人工骨修復材料需要滿足以下特性[8-10]：① 良好生物相容性；② 合適的生物降解性；③ 骨傳導性及骨誘導性；④ 一定機械強度；⑤ 可塑形性、可注射性；⑥ 自凝且凝固時間合適；⑦ 具有表面微孔結構；⑧ 原料廣泛，生產成本低；⑨ 易消毒、滅菌。為了滿足以上要求，本研究選擇制備復合材料，保留不同材料的優點，互補其缺點。
α-CSH具有良好生物相容性、可塑形性、可降解性、抗壓強度、骨傳導性及成骨能力，作為一種較理想的骨移植替代材料已廣泛應用于臨床[11-12]。但α-CSH吸水形成CSD后，降解過快，同時降解后的酸性環境不利于新骨生成，限制其單獨用于臨床骨缺損修復。但固化的CSD是一種良好黏合劑，復合磷酸鈣、羧甲基殼聚糖鋅、羥基磷灰石等材料能獲得穩固結構的復合材料，還能添加BMP、自體骨、抗生素等[4-5, 13]，有利于骨缺損修復。β-TCP也具有與α-CSH類似的生物相容性及優良理化性能[2-3]，但其脆性大，缺乏骨誘導性，降解速率與凝固時間不可控，也限制了其臨床單獨使用。而且β-TCP降解較慢，且體內降解比體外降解更慢[14-15]，目前研究均通過復合其他材料，以期改善其生物學性能，調控降解速率、增加抗壓強度等，從而滿足臨床骨缺損修復需求[16-17]。HA是哺乳動物結締組織細胞外基質的重要組分，具有高親水性、高滲透性、高黏彈性以及誘導血管生成活性，無毒性和免疫原性，具備抑菌、抗炎、抗水腫以及減小排斥反應等優點[18-20]。基于此，本研究選擇上述3種材料制備復合材料。
關于各材料復合比例，本課題組在參考相關文獻 ［13，21］ 基礎上進行了一系列預實驗。結果顯示α-CSH、β-TCP以10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、5∶5、3∶7比例混合制備的復合材料，掃描電鏡觀察結果相似，但預實驗抗壓強度、降解性能、凝固時間、細胞生長情況等項目以7∶3比例制備的復合材料最佳，能較好地滿足臨床需求，故本次研究掃描電鏡、X射線衍射分析均取該比例材料進行觀測。
對于HA溶液濃度的篩選，我們在復合材料可注射性能研究時發現2.0%HA黏稠度太高，不易與粉體混合均勻，結合復合材料注射能力系數隨HA溶液濃度增加而增大以及既往相關研究結論 ［22-23］，為最大程度滿足臨床應用需要，最終除材料注射性能外，其余實驗均選擇1.0%HA溶液。
另外，在預實驗中液固比低于0.3時，復合材料成形困難；高于0.4時，凝固時間明顯延長，不滿足臨床需求，且液固比越高，材料強度越低。因此，本研究首先確定材料制備液固比在0.3～0.4之間（0.30、0.35）。但當進行抗壓強度、細胞毒性實驗時，本研究需要將材料制備成圓柱狀，按照液固比0.35混合形成的漿料流動性更佳，更利于模具澆注成形，因此上述實驗選擇該液固比，其余觀測指標采用液固比0.30。
3.2 研究結果分析
本研究結果顯示制備的HA/α-CSH/β-TCP復合材料中，α-CSH/β-TCP可有效調控材料的降解速率、凝固時間、力學強度等性能，加入HA能提高材料的抗潰散性、可注射性等。
掃描電鏡結果顯示復合材料表面粗糙，孔徑主要在5～15 μm之間，理論上該微孔結構適合細胞黏附生長和新生毛細血管長入[24]。自固化性及合理的固化時間是人工骨修復材料的一個重要特性，本研究HA/α-CSH/β-TCP復合材料初凝時間為3.4～8.9 min，終凝時間為7.7～17.5 min；與α-CSH/β-TCP復合材料相比，HA溶液的加入對材料凝固時間無明顯影響，該時間可滿足臨床創傷性、感染性、腫瘤性等骨缺損術中操作。不同比例的α-CSH/β-TCP復合材料降解率為35.6%～53.4%，且降解隨著β-TCP含量增加逐漸減慢，提示改變β-TCP含量可調控該復合材料的降解速率，有望與新骨形成速率相匹配。
生物力學測試顯示隨著β-TCP含量增加，復合材料抗壓強度呈先增大再減小趨勢。當β-TCP含量≤20%時，材料抗壓強度逐漸增加，分析可能固化后CSD表面有微孔結構，β-TCP粒徑較小，正好填充CSD空隙，并通過硫酸鈣基質的作用，形成致密穩固的固化產物。當β-TCP含量>20%時，材料抗壓強度逐漸降低，分析可能是β-TCP影響CSH向CSD水化的過程，α-CSH轉化為CSD的晶體度降低，導致復合材料的力學性能降低。本研究制備的復合材料抗壓強度達人體松質骨抗壓強度0.4～11.0 MPa[25-26]，可滿足臨床骨缺損修復需求。
綜上述，本研究制備的HA/α-CSH/β-TCP復合材料無細胞毒性，有望成為一種新的骨缺損修復材料。但有待進一步明確HA濃度以及液固比最佳范圍，同時還需進一步進行動物實驗以驗證復合材料的體內、外性能差別，是否具備成骨能力，以及降解過程、降解產物對機體的影響等。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
作者貢獻聲明 葛建華、段可、段鑫、閆吉元：研究設計；賈樂、巫桂兵、李洋：研究實施；賈樂、馬月、李洋：數據收集整理及統計分析；葛建華、賈樂：文章撰寫；葛建華、巫桂兵、段鑫：經費支持
