引用本文： 林三福, 陳守勃, 方凱彬, 施勁楠, 吳文華, 王文懷. miR-26a-5p/環腺苷酸反應元件結合蛋白1分子軸調控脂肪來源干細胞成骨分化的機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2023, 37(5): 615-621. doi: 10.7507/1002-1892.202211037 復制
脂肪來源干細胞（adipose-derived mesechymal stem cells，ADSCs）是能自我更新和分化為成骨細胞、破骨細胞以及軟骨細胞的多能細胞[1]，具有來源豐富、容易獲得、免疫原性較低等優點[2]，在再生醫學方面具有廣闊應用前景。然而，有限的成骨分化能力以及分化成脂肪細胞的天然傾向限制了ADSCs在臨床骨修復中的應用，因此研究ADSCs成骨分化的調控機制具有重要意義。
微小RNA（microRNA，miRNA）是短鏈非編碼RNA，通過與靶mRNA的3’UTR結合，抑制其翻譯或降解靶RNA，并參與轉錄后水平的調控[3]。研究發現，miR-26a-5p參與調節人ADSCs成骨分化[4-9]，但具體調控機制尚不清楚。環腺苷酸反應元件結合蛋白1（cAMP response element binding protein 1，CREB1）是CREB家族的成員，在腫瘤細胞增殖和轉移[10]以及MSCs成骨分化[11]中發揮重要作用。我們通過數據庫預測發現，CREB1是miR-26a-5p的潛在靶基因，擬通過實驗進一步研究miR-26a-5p通過CREB1對ADSCs成骨分化的調控作用，以期為ADSCs在臨床骨修復中的應用提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3～4周齡雌性C57BL/6小鼠4只，體質量約13 g，購自中國科學院昆明動物研究所。HEK-293T細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。胰蛋白酶、DMEM培養基、小鼠ADSCs成骨分化誘導培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；PrimeScriptTM RT Master Mix反轉錄試劑盒（Takara公司，日本）；TRIzol試劑、RIPA試劑、雙熒光素酶報告基因試劑盒、茜素紅染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；ALP試劑盒、FBS（上海酶聯生物科技有限公司）；CREB1野生型（wild type，WT）載體（CREB1-WT）、CREB1突變體型（mutant，MUT）載體（CREB1-MUT）以及miR-26a-5p mimic載體、NC mimic載體（上海吉瑪生物科技有限公司）；Lipofectamine 2000試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；miR-26a-5p抑制劑（miR-26a-5p inhibitor）及對應陰性對照（NC inhibitor；廣州銳博生物科技有限公司）。
超凈工作臺（北京半導體設備一廠）；倒置相差顯微鏡（上海永科光學儀器有限公司）；酶標儀 ［安諾倫（北京）生物科技有限公司］；離心機（上海安亭科學儀器廠）；微量加樣槍（Ependorff公司，德國）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 ADSCs分離培養及鑒定
參照文獻 ［12］ 方法分離培養小鼠ADSCs。將4只C57BL/6小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（200 mg/kg）麻醉后，切取腋窩及腹股溝皮下脂肪組織，去除血凝塊、結締組織和皮膚。以含青霉素/鏈霉素的PBS緩沖溶液沖洗3次，0.075%Ⅰ型膠原酶水解脂肪組織30 min后加入DMEM培養基；以離心半徑14 cm、1 000 r/min離心5 min。將細胞重懸至DMEM培養基中，通過100 mm過濾器去除細胞碎片；同上法再次離心5 min后，將細胞接種至完全培養基（含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基），于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養，待細胞融合至80%左右進行傳代。取第3代細胞進行實驗。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，流式細胞儀對培養細胞進行表征分析（CD31、CD45、CD29、CD90、CD105）鑒定。
1.3 ADSCs成骨誘導培養及觀測
1.3.1 細胞成骨誘導培養
當ADSCs生長融合達90%時，將細胞培養基更換為小鼠ADSCs成骨分化誘導培養基，每3天換液1次，分別在誘導培養0、3、7、14 d對細胞進行觀測。
1.3.2 觀測指標
① 茜素紅染色：參照試劑盒說明書，將細胞置于4%中性甲醛溶液固定30 min，PBS清洗后加入茜素紅溶液染色20 min，光鏡下觀察細胞鈣沉積情況，鈣化結節呈紅色染色。酶標儀檢測570 nm處吸光度（A）值，表示鈣沉積量。實驗重復3次。
② ALP活性檢測：參照試劑盒說明書，將連續稀釋的標準樣品100 μL和ADSCs連續稀釋的裂解樣品分別加至微孔板中。置于37℃環境中孵育2 h后，100 μL ALP抗體染色1 h；洗滌后將細胞與100 μL二抗在37℃條件下孵育；30 min后將細胞接種至100 μL底物15 min，使用酶標儀測定405 nm處A值，表示ALP活性。實驗重復3次。
③ 實時熒光定量PCR檢測：采用TRIzol試劑從細胞中提取總RNA，PrimeScriptTM RT Master Mix反轉錄試劑盒用于反轉錄合成互補DNA。利用SYBR Green Ⅰ PCR master mix和實時PCR系統進行qPCR反應。引物序列見表1。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s；60℃延伸30 s；共進行40個循環。分別以U6作為miR-26a-5p內參、GAPDH作為CREB1內參，采用2–ΔΔCt法計算目的基因相對表達水平。
表1
實時熒光定量PCR引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR (5′→3′)
④ Western blot檢測：取細胞檢測CREB1蛋白及其磷酸化（phospho-CREB1，p-CREB1）水平。RIPA溶液提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對提取的總蛋白進行定量；PBS稀釋蛋白樣品，經10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉移至聚偏氟乙烯膜，與含5%脫脂牛奶的Tris緩沖鹽水Tween-20溶液室溫孵育2 h，與稀釋后的一抗（p-CREB1 1∶1 000、CREB1 1∶1 000、β-actin 1∶1 000）于4℃過夜孵育；加入稀釋后的二抗避光孵育2 h。以β-actin作為內參，采用Image J軟件計算目的蛋白相對表達量以及p-CREB1/CREB1。實驗重復3次。
1.4 miR-26a-5p與CREB1靶向關系驗證
1.4.1 雙熒光素酶報告基因實驗
經starBase數據庫預測miR-26a-5p和CREB1存在靶向結合位點后，進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗進行靶向關系驗證。將HEK-293T細胞接種于完全培養基，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后，使用Lipofectamine 2000試劑盒將CREB1-WT、CREB1-MUT與miR-26a-5p mimic、NC mimic（對照）分別轉染至細胞中，繼續培養48 h后用酶標儀進行檢測。以海腎熒光素酶活性作為內部參照，計算熒光素酶活性。
1.4.2 miR-26a-5p轉染觀測
根據Lipofectamine 2000試劑盒說明書，分別將miR-26a-5p inhibitor（實驗組）及對應NC inhibitor（對照組）轉染至ADSCs后，將細胞置于完全培養基中常規培養，48 h后行實時熒光定量PCR檢測miR-26a-5p相對表達量。以未轉染細胞作為空白對照組。
將成功轉染的細胞接種至小鼠ADSCs成骨分化誘導培養基，于培養7、14 d收集細胞同上法行茜素紅染色觀察、ALP活性檢測，Western blot檢測CREB1、p-CREB1及成骨標志物Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）蛋白表達。實驗重復3次。
1.5 統計學方法
采用GraphPadPrism8.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均服從正態分布，數據以均數±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ADSCs細胞形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下見，隨著培養時間增加，分離細胞逐漸從圓形變成長絲狀，貼壁生長；培養7 d后細胞以成纖維細胞樣鋪展，呈旋渦狀增殖。流式細胞儀檢測示細胞CD31、CD45陰性，CD29、CD90、CD105陽性，提示分離培養細胞為ADSCs。見圖1。
圖1
ADSCs細胞形態觀察及鑒定
a. 倒置相差顯微鏡下觀察（×100） 從左至右分別為原代培養2、7 d及第3代細胞；b. 流式細胞儀鑒定
Figure1. Morphological observation and identification of ADSCsa. Observation under an inverted phase contrast microscope (×100) From left to right for the cells primarily cultured for 2, 7 days, and the 3rd-generation cells, respectively; b. Identification by flow cytometry
2.2 ADSCs成骨誘導培養觀測
鏡下見成骨誘導培養3 d后ADSCs茜素紅染色呈陽性，且隨誘導培養時間延長，鈣化結節逐漸增多，0、3、7、14 d A值分別為1.00±0.22、1.05±0.17、3.11±0.48、5.18±0.65，3、7、14 d A值與0 d比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。ALP活性逐漸增加，其中7、14 d與0 d比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2a、b。
圖2
ADSCs成骨誘導培養后觀測
a. 茜素紅染色觀察（×200） 從左至右分別為誘導培養0、3、7、14 d；b. ALP活性檢測 *與0 d組比較
a. Alizarin red staining observation (×200) From left to right for 0, 3, 7, and 14 days after osteogenic induction, respectively; b. ALP activity detection *Compared with 0 day,
實時熒光定量PCR檢測示，隨誘導培養時間延長，細胞中miR-26a-5p相對表達量逐漸降低，而CREB1 mRNA相對表達量升高，其中7、14 d與0 d比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2c、d。
Western blot檢測示，隨誘導培養時間延長，CREB1及p-CREB1蛋白相對表達量明顯升高，其中7、14 d與0 d差異有統計學意義（P<0.05）；p-CREB1/CREB1于3 d時降低，之后逐漸升高，但各時間點間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖2e～h。
2.3 miR-26a-5p與CREB1靶向關系驗證
2.3.1 雙熒光素酶報告基因實驗
通過starBase數據庫預測發現miR-26a-5p和CREB1具有靶向結合序列（圖3a）。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，與對應對照（NC mimic）相比，過表達miR-26a-5p可明顯抑制CREB1-WT熒光素酶活性（P<0.05）；而CREB1-MUT熒光素酶活性無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3b。
圖3
miR-26-5p與CREB1靶向關系驗證
a. 數據庫預測miR-26a-5p和CREB1的靶向結合位點；b. 雙熒光素酶報告基因實驗結果 *與對應 NC mimic 比較
a. The binding sites between miR-26a-5p and CREB1 predicted by database; b. Results of dual-luciferase reporter gene experiment *Compared with NC mimic group,
2.3.2 miR-26a-5p通過CREB1調控ADSCs成骨分化
實時熒光定量PCR檢查示，空白組、對照組以及實驗組 miR-26a-5p 相對表達量分別為1.02±0.10、0.90±0.06、0.54±0.08。其中，空白組與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05），實驗組較對照組降低且差異有統計學意義（P<0.05），提示細胞轉染有效，且空白組與對照組無顯著差異，故后續誘導分化時僅用對照組與實驗組進行觀測。
成骨誘導培養7、14 d，與對照組相比，實驗組細胞鈣化結節數量、ALP活性以及CREB1、p-CREB1、OCN、RUNX2蛋白相對表達量均增加，差異均有統計學意義（P<0.05）；兩組p-CREB1/CREB1差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3c～k。
3 討論
干細胞定向成骨分化是骨再生關鍵，誘導因子在這一過程中起著十分重要的作用，尋找誘導干細胞成骨分化的有效調節因子是骨再生領域急需解決的問題。目前研究已明確miRNA參與調節干細胞成骨分化[13]，在骨骼發育中具有重要作用。Ye等[14]報道在氧化應激條件下miR-125a-5p表達升高，通過靶向抑制VEGF表達，抑制ADSCs成骨分化。過表達ADSCs外泌體來源的miR-130a-3p可通過降低SIRT7表達激活Wnt/β-catenin信號通路，促進ADSCs的成骨分化[15]。本研究結果表明miR-26a-5p在成骨誘導的ADSCs中表達降低，敲降miR-26a-5p可促進細胞鈣結節形成、增加ALP活性以及成骨標志物RUNX2和OCN蛋白表達。此外，miR-26a-5p可作為多種疾病的調控因子參與調控疾病的發生與發展，比如通過靶向抑制ADAM17的表達，緩解小鼠心臟肥大和功能障礙[16]；過表達miR-26a-5p可顯著抑制肝細胞癌增殖，促進肝細胞癌阿霉素敏感性[17]，顯著抑制Tau磷酸化和Aβ積累，緩解小鼠認知障礙[18]。
CREB1是堿性亮氨酸拉鏈家族的關鍵轉錄因子，參與DNA的修復和新陳代謝，已發現通過磷酸化激活在腫瘤中發揮促癌作用。CREB1蛋白磷酸化水平在腎透明細胞癌中表達升高，與患者預后不良相關，可作為腎透明細胞癌的預后生物標志物[19]。在人乳腺癌中下調CREB的磷酸化水平可促進乳腺癌細胞凋亡[20]。本研究中CREB1及其磷酸化水平在成骨誘導的ADSCs中表達升高，CREB1是miR-26a-5p的潛在靶基因，敲降miR-26a-5p靶向上調CREB1的蛋白表達及其磷酸化水平，進而促進ADSCs的成骨分化。這與既往報道的CREB1可促進成骨樣細胞分化結果一致[11]。然而，Zhang等[21]研究發現CREB1作為成骨分化的抑制因子，能抑制細胞成骨分化。此外，CREB1也作為轉錄因子在轉錄上調節miRNA。比如CREB1通過與miR-186的啟動子結合，抑制miR-186的轉錄，沉默CERB1通過上調miR-186的表達，進而抑制膠質瘤細胞的生長、侵襲和轉移[22]。
綜上述，miR-26a-5p在成骨誘導的ADSCs中低表達，通過靶向調控CREB1及其磷酸化水平，敲降miR-26a-5p促進ADSCs的成骨分化，可作為臨床骨修復的潛在靶點，為骨再生、骨折愈合的診療提供新途徑。
利益沖突 在課題研究及文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持不影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經福建醫科大學附屬第二醫院醫學倫理委員會批準（［2022］福醫附二倫理審字第473號）；實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2016-0001
作者貢獻聲明 林三福：研究設計及實施，數據收集及統計分析，論文撰寫；王文懷、吳文華：研究設計，對文章的知識性內容作批評性審閱；吳文華、施勁楠：協助實驗操作、數據收集、統計分析；陳守勃、方凱彬：協助數據收集整理、理論支持
脂肪來源干細胞（adipose-derived mesechymal stem cells，ADSCs）是能自我更新和分化為成骨細胞、破骨細胞以及軟骨細胞的多能細胞[1]，具有來源豐富、容易獲得、免疫原性較低等優點[2]，在再生醫學方面具有廣闊應用前景。然而，有限的成骨分化能力以及分化成脂肪細胞的天然傾向限制了ADSCs在臨床骨修復中的應用，因此研究ADSCs成骨分化的調控機制具有重要意義。
微小RNA（microRNA，miRNA）是短鏈非編碼RNA，通過與靶mRNA的3’UTR結合，抑制其翻譯或降解靶RNA，并參與轉錄后水平的調控[3]。研究發現，miR-26a-5p參與調節人ADSCs成骨分化[4-9]，但具體調控機制尚不清楚。環腺苷酸反應元件結合蛋白1（cAMP response element binding protein 1，CREB1）是CREB家族的成員，在腫瘤細胞增殖和轉移[10]以及MSCs成骨分化[11]中發揮重要作用。我們通過數據庫預測發現，CREB1是miR-26a-5p的潛在靶基因，擬通過實驗進一步研究miR-26a-5p通過CREB1對ADSCs成骨分化的調控作用，以期為ADSCs在臨床骨修復中的應用提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3～4周齡雌性C57BL/6小鼠4只，體質量約13 g，購自中國科學院昆明動物研究所。HEK-293T細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。胰蛋白酶、DMEM培養基、小鼠ADSCs成骨分化誘導培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；PrimeScriptTM RT Master Mix反轉錄試劑盒（Takara公司，日本）；TRIzol試劑、RIPA試劑、雙熒光素酶報告基因試劑盒、茜素紅染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；ALP試劑盒、FBS（上海酶聯生物科技有限公司）；CREB1野生型（wild type，WT）載體（CREB1-WT）、CREB1突變體型（mutant，MUT）載體（CREB1-MUT）以及miR-26a-5p mimic載體、NC mimic載體（上海吉瑪生物科技有限公司）；Lipofectamine 2000試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；miR-26a-5p抑制劑（miR-26a-5p inhibitor）及對應陰性對照（NC inhibitor；廣州銳博生物科技有限公司）。
超凈工作臺（北京半導體設備一廠）；倒置相差顯微鏡（上海永科光學儀器有限公司）；酶標儀 ［安諾倫（北京）生物科技有限公司］；離心機（上海安亭科學儀器廠）；微量加樣槍（Ependorff公司，德國）；熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 ADSCs分離培養及鑒定
參照文獻 ［12］ 方法分離培養小鼠ADSCs。將4只C57BL/6小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（200 mg/kg）麻醉后，切取腋窩及腹股溝皮下脂肪組織，去除血凝塊、結締組織和皮膚。以含青霉素/鏈霉素的PBS緩沖溶液沖洗3次，0.075%Ⅰ型膠原酶水解脂肪組織30 min后加入DMEM培養基；以離心半徑14 cm、1 000 r/min離心5 min。將細胞重懸至DMEM培養基中，通過100 mm過濾器去除細胞碎片；同上法再次離心5 min后，將細胞接種至完全培養基（含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基），于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養，待細胞融合至80%左右進行傳代。取第3代細胞進行實驗。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，流式細胞儀對培養細胞進行表征分析（CD31、CD45、CD29、CD90、CD105）鑒定。
1.3 ADSCs成骨誘導培養及觀測
1.3.1 細胞成骨誘導培養
當ADSCs生長融合達90%時，將細胞培養基更換為小鼠ADSCs成骨分化誘導培養基，每3天換液1次，分別在誘導培養0、3、7、14 d對細胞進行觀測。
1.3.2 觀測指標
① 茜素紅染色：參照試劑盒說明書，將細胞置于4%中性甲醛溶液固定30 min，PBS清洗后加入茜素紅溶液染色20 min，光鏡下觀察細胞鈣沉積情況，鈣化結節呈紅色染色。酶標儀檢測570 nm處吸光度（A）值，表示鈣沉積量。實驗重復3次。
② ALP活性檢測：參照試劑盒說明書，將連續稀釋的標準樣品100 μL和ADSCs連續稀釋的裂解樣品分別加至微孔板中。置于37℃環境中孵育2 h后，100 μL ALP抗體染色1 h；洗滌后將細胞與100 μL二抗在37℃條件下孵育；30 min后將細胞接種至100 μL底物15 min，使用酶標儀測定405 nm處A值，表示ALP活性。實驗重復3次。
③ 實時熒光定量PCR檢測：采用TRIzol試劑從細胞中提取總RNA，PrimeScriptTM RT Master Mix反轉錄試劑盒用于反轉錄合成互補DNA。利用SYBR Green Ⅰ PCR master mix和實時PCR系統進行qPCR反應。引物序列見表1。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s；60℃延伸30 s；共進行40個循環。分別以U6作為miR-26a-5p內參、GAPDH作為CREB1內參，采用2–ΔΔCt法計算目的基因相對表達水平。
表1
實時熒光定量PCR引物序列（5′→3′）
Table1.
Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR (5′→3′)
④ Western blot檢測：取細胞檢測CREB1蛋白及其磷酸化（phospho-CREB1，p-CREB1）水平。RIPA溶液提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對提取的總蛋白進行定量；PBS稀釋蛋白樣品，經10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉移至聚偏氟乙烯膜，與含5%脫脂牛奶的Tris緩沖鹽水Tween-20溶液室溫孵育2 h，與稀釋后的一抗（p-CREB1 1∶1 000、CREB1 1∶1 000、β-actin 1∶1 000）于4℃過夜孵育；加入稀釋后的二抗避光孵育2 h。以β-actin作為內參，采用Image J軟件計算目的蛋白相對表達量以及p-CREB1/CREB1。實驗重復3次。
1.4 miR-26a-5p與CREB1靶向關系驗證
1.4.1 雙熒光素酶報告基因實驗
經starBase數據庫預測miR-26a-5p和CREB1存在靶向結合位點后，進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗進行靶向關系驗證。將HEK-293T細胞接種于完全培養基，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h后，使用Lipofectamine 2000試劑盒將CREB1-WT、CREB1-MUT與miR-26a-5p mimic、NC mimic（對照）分別轉染至細胞中，繼續培養48 h后用酶標儀進行檢測。以海腎熒光素酶活性作為內部參照，計算熒光素酶活性。
1.4.2 miR-26a-5p轉染觀測
根據Lipofectamine 2000試劑盒說明書，分別將miR-26a-5p inhibitor（實驗組）及對應NC inhibitor（對照組）轉染至ADSCs后，將細胞置于完全培養基中常規培養，48 h后行實時熒光定量PCR檢測miR-26a-5p相對表達量。以未轉染細胞作為空白對照組。
將成功轉染的細胞接種至小鼠ADSCs成骨分化誘導培養基，于培養7、14 d收集細胞同上法行茜素紅染色觀察、ALP活性檢測，Western blot檢測CREB1、p-CREB1及成骨標志物Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）蛋白表達。實驗重復3次。
1.5 統計學方法
采用GraphPadPrism8.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗，均服從正態分布，數據以均數±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ADSCs細胞形態觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下見，隨著培養時間增加，分離細胞逐漸從圓形變成長絲狀，貼壁生長；培養7 d后細胞以成纖維細胞樣鋪展，呈旋渦狀增殖。流式細胞儀檢測示細胞CD31、CD45陰性，CD29、CD90、CD105陽性，提示分離培養細胞為ADSCs。見圖1。
圖1
ADSCs細胞形態觀察及鑒定
a. 倒置相差顯微鏡下觀察（×100） 從左至右分別為原代培養2、7 d及第3代細胞；b. 流式細胞儀鑒定
Figure1. Morphological observation and identification of ADSCsa. Observation under an inverted phase contrast microscope (×100) From left to right for the cells primarily cultured for 2, 7 days, and the 3rd-generation cells, respectively; b. Identification by flow cytometry
2.2 ADSCs成骨誘導培養觀測
鏡下見成骨誘導培養3 d后ADSCs茜素紅染色呈陽性，且隨誘導培養時間延長，鈣化結節逐漸增多，0、3、7、14 d A值分別為1.00±0.22、1.05±0.17、3.11±0.48、5.18±0.65，3、7、14 d A值與0 d比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。ALP活性逐漸增加，其中7、14 d與0 d比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2a、b。
圖2
ADSCs成骨誘導培養后觀測
a. 茜素紅染色觀察（×200） 從左至右分別為誘導培養0、3、7、14 d；b. ALP活性檢測 *與0 d組比較
a. Alizarin red staining observation (×200) From left to right for 0, 3, 7, and 14 days after osteogenic induction, respectively; b. ALP activity detection *Compared with 0 day,
實時熒光定量PCR檢測示，隨誘導培養時間延長，細胞中miR-26a-5p相對表達量逐漸降低，而CREB1 mRNA相對表達量升高，其中7、14 d與0 d比較差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2c、d。
Western blot檢測示，隨誘導培養時間延長，CREB1及p-CREB1蛋白相對表達量明顯升高，其中7、14 d與0 d差異有統計學意義（P<0.05）；p-CREB1/CREB1于3 d時降低，之后逐漸升高，但各時間點間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖2e～h。
2.3 miR-26a-5p與CREB1靶向關系驗證
2.3.1 雙熒光素酶報告基因實驗
通過starBase數據庫預測發現miR-26a-5p和CREB1具有靶向結合序列（圖3a）。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，與對應對照（NC mimic）相比，過表達miR-26a-5p可明顯抑制CREB1-WT熒光素酶活性（P<0.05）；而CREB1-MUT熒光素酶活性無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3b。
圖3
miR-26-5p與CREB1靶向關系驗證
a. 數據庫預測miR-26a-5p和CREB1的靶向結合位點；b. 雙熒光素酶報告基因實驗結果 *與對應 NC mimic 比較
a. The binding sites between miR-26a-5p and CREB1 predicted by database; b. Results of dual-luciferase reporter gene experiment *Compared with NC mimic group,
2.3.2 miR-26a-5p通過CREB1調控ADSCs成骨分化
實時熒光定量PCR檢查示，空白組、對照組以及實驗組 miR-26a-5p 相對表達量分別為1.02±0.10、0.90±0.06、0.54±0.08。其中，空白組與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05），實驗組較對照組降低且差異有統計學意義（P<0.05），提示細胞轉染有效，且空白組與對照組無顯著差異，故后續誘導分化時僅用對照組與實驗組進行觀測。
成骨誘導培養7、14 d，與對照組相比，實驗組細胞鈣化結節數量、ALP活性以及CREB1、p-CREB1、OCN、RUNX2蛋白相對表達量均增加，差異均有統計學意義（P<0.05）；兩組p-CREB1/CREB1差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3c～k。
3 討論
干細胞定向成骨分化是骨再生關鍵，誘導因子在這一過程中起著十分重要的作用，尋找誘導干細胞成骨分化的有效調節因子是骨再生領域急需解決的問題。目前研究已明確miRNA參與調節干細胞成骨分化[13]，在骨骼發育中具有重要作用。Ye等[14]報道在氧化應激條件下miR-125a-5p表達升高，通過靶向抑制VEGF表達，抑制ADSCs成骨分化。過表達ADSCs外泌體來源的miR-130a-3p可通過降低SIRT7表達激活Wnt/β-catenin信號通路，促進ADSCs的成骨分化[15]。本研究結果表明miR-26a-5p在成骨誘導的ADSCs中表達降低，敲降miR-26a-5p可促進細胞鈣結節形成、增加ALP活性以及成骨標志物RUNX2和OCN蛋白表達。此外，miR-26a-5p可作為多種疾病的調控因子參與調控疾病的發生與發展，比如通過靶向抑制ADAM17的表達，緩解小鼠心臟肥大和功能障礙[16]；過表達miR-26a-5p可顯著抑制肝細胞癌增殖，促進肝細胞癌阿霉素敏感性[17]，顯著抑制Tau磷酸化和Aβ積累，緩解小鼠認知障礙[18]。
CREB1是堿性亮氨酸拉鏈家族的關鍵轉錄因子，參與DNA的修復和新陳代謝，已發現通過磷酸化激活在腫瘤中發揮促癌作用。CREB1蛋白磷酸化水平在腎透明細胞癌中表達升高，與患者預后不良相關，可作為腎透明細胞癌的預后生物標志物[19]。在人乳腺癌中下調CREB的磷酸化水平可促進乳腺癌細胞凋亡[20]。本研究中CREB1及其磷酸化水平在成骨誘導的ADSCs中表達升高，CREB1是miR-26a-5p的潛在靶基因，敲降miR-26a-5p靶向上調CREB1的蛋白表達及其磷酸化水平，進而促進ADSCs的成骨分化。這與既往報道的CREB1可促進成骨樣細胞分化結果一致[11]。然而，Zhang等[21]研究發現CREB1作為成骨分化的抑制因子，能抑制細胞成骨分化。此外，CREB1也作為轉錄因子在轉錄上調節miRNA。比如CREB1通過與miR-186的啟動子結合，抑制miR-186的轉錄，沉默CERB1通過上調miR-186的表達，進而抑制膠質瘤細胞的生長、侵襲和轉移[22]。
綜上述，miR-26a-5p在成骨誘導的ADSCs中低表達，通過靶向調控CREB1及其磷酸化水平，敲降miR-26a-5p促進ADSCs的成骨分化，可作為臨床骨修復的潛在靶點，為骨再生、骨折愈合的診療提供新途徑。
利益沖突 在課題研究及文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持不影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經福建醫科大學附屬第二醫院醫學倫理委員會批準（［2022］福醫附二倫理審字第473號）；實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2016-0001
作者貢獻聲明 林三福：研究設計及實施，數據收集及統計分析，論文撰寫；王文懷、吳文華：研究設計，對文章的知識性內容作批評性審閱；吳文華、施勁楠：協助實驗操作、數據收集、統計分析；陳守勃、方凱彬：協助數據收集整理、理論支持
