引用本文： 高潤子, 夏天衛, 劉金柱, 袁兆豐, 環大維, 沈計榮. 基于“三柱結構”的中日友好醫院分型L2型及L3型股骨頭壞死標本骨微結構及病理學研究. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(8): 1003-1010. doi: 10.7507/1002-1892.202203108 復制
股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是骨科常見病與難治病，我國約有812萬15歲以上非創傷ONFH患者且增長速度逐年上升[1-2]。中日友好醫院（CJFH）分型是目前國內較為常用的ONFH分型標準[3]，但該分型基于股骨頭“三柱理論”，主觀性較強，缺乏形態學、病理學等證據支持，且其從單一層面的二維圖像劃分股骨頭，無法反映股骨頭的立體空間狀態。隨著對ONFH病理生理學研究的不斷深入，研究者們發現除了局部組織缺血缺氧的病理狀態以外，骨細胞和成骨細胞數量減少[4-5]、血管內皮細胞損傷[6]、破骨細胞活性增強[7]、BMSCs成骨分化能力降低[8]、內皮祖細胞成血管分化能力限制[9]等病理現象均參與到ONFH的發生發展過程。股骨頸基底部旋轉截骨術旨在將壞死區受累較小的內側柱和/或中間柱旋轉至外側柱部位，替代壞死范圍較大的原外側柱，避免股骨頭進一步塌陷，維持髖關節功能，并為壞死區修復提供相對良好的力學環境，但目前仍缺乏相關基礎研究證據[10-13]。
本研究嘗試通過Micro-CT立體分析CJFH分型L2型及L3型ONFH標本三柱間的骨微結構差異，為股骨頸基底部旋轉截骨術治療ONFH提供形態學證據；同時通過病理學研究比較ONFH標本三柱間骨細胞凋亡的差異，為后期使用股骨頸基底部旋轉截骨術聯合抗細胞凋亡的傳統中醫藥及現代生物醫藥方法治療ONFH提供研究方向。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入標準：① 符合ONFH診斷標準，接受人工全髖關節置換術治療，并知情同意將關節置換產生的股骨頭用于后續Micro-CT掃描及病理學研究。② 影像學檢查提示股骨頭壞死范圍大，軟骨下骨塌陷明顯；或伴有髖關節間隙狹窄，股骨頭及髖臼廣泛增生或囊性變等髖關節骨關節炎表現。③ CJFH分型L2型及L3型，國際骨循環協會（ARCO）分期ⅢC～Ⅳ期。
排除標準：① 伴嚴重心腦血管、消化、呼吸系統疾病，嚴重肝腎功能不全，嚴重營養不良，惡性腫瘤及精神疾病，血壓、血糖控制不佳等手術相對、絕對禁忌證者。② 既往接受包括死骨清理、打壓植骨、髓芯減壓等已對股骨頭內骨小梁結構造成破壞的保髖手術者。
2020年4月—2021年2月共納入20例（20髖）患者，其中4例（4髖）Micro-CT掃描時發現股骨頭三柱結構被取頭器等手術操作破壞，予以剔除。最終16例（16髖）納入后續研究，其中男9例，女7例；年齡24～72歲，平均51.9歲。CJFH分型：L2型7例，L3型9例。ARCO分期：ⅢC期6例，Ⅳ期10例。
1.2 主要試劑及儀器
中性組織固定液（南京化學試劑有限公司）；EDTA脫鈣液（北京雷根生物技術有限公司）；免疫組織化學抗原修復緩沖液（Dako公司，丹麥）；B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）免疫組織化學一抗（福州邁新生物技術開發有限公司）；酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物（北京中杉金橋生物技術有限公司）；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）。顯微鏡載玻片、蓋玻片（海門市神鷹實驗器械廠）；電化黏附載玻片（江蘇匯達醫療器械有限公司）。
Hiscan XM型Micro-CT、Hiscan Analyzer軟件V3.0、Hiscan Reconstruct軟件V3.0（蘇州海斯菲德信息科技有限公司）；STP420ES自動脫水機（Thermo Fisher公司，美國）；PH60病理組織漂烘儀（常州派斯杰醫療設備有限公司）；Tissue-Tek組織包埋機、BM450組織包埋冷凍臺、Tissue-Tek Prisma Plus全自動染色封片機（SAKURA公司，日本）；CR-601ST輪轉式石蠟切片機（金華克拉泰儀器有限公司）；PT200抗原修復儀（Dako公司，丹麥）；DM 4B正置光學顯微鏡（Leica公司，德國）。
1.3 標本處理
手術取得患者股骨頭標本后，及時用5～10倍體積中性組織固定液固定24～48 h；然后用PBS洗30 min×3次，再用純水洗30 min×3次，充分沖洗中性組織固定液，中止標本固定；?80℃冰箱儲存備用。
1.4 骨微結構研究
1.4.1 Micro-CT掃描
取出股骨頭標本固定于Micro-CT載物臺，用海綿泡沫墊高標本。由于人體股骨頭標本體積較大，超過Micro-CT最大掃描窗，因此以膠帶固定股骨頭，使其在載物臺上保持不動，分2～3段不間斷掃描，獲得完整股骨頭掃描數據。掃描參數：分辨率70 μm，電壓80 kV，電流100 μA，單次曝光時間50 ms，掃描角度間隔0.5°。
1.4.2 Micro-CT切割“三柱結構”
將股骨頭掃描后得到的Micro-CT數據導入Hiscan Reconstruct軟件V3.0進行數據重建，再使用Hiscan Analyzer軟件V3.0進行三維模型重建，并在三維立體結構上對股骨頭進行“三柱切割”。調取軟件“free cut”功能，外側立方體框架可實現對股骨頭360° 切割；調整股骨頭方向，將立方體框架調整成正中冠狀位層面，還原CJFH分型所描述的股骨頭“三柱結構”劃分層面；使正中冠狀位矩形與股骨頭內外側骨質呈切線，讀取此時兩切線之間距離，以股骨頭正中冠狀位內側切線為股骨頭寬度0的位置，以股骨頭正中冠狀位外側切線為股骨頭寬度1的位置，按占據股骨頭寬度30%、40%、30%的“三柱結構”定義，計算股骨頭寬度30%、70%所在位置，以此兩點移動內、外側切線，初步切割內側柱、中間柱和外側柱空間結構。見圖1。
圖1
Micro-CT切割股骨頭“三柱結構”
a. 對掃描及重建后的數據進行三維重建；b. 調取軟件“free cut”功能，外側立方體框架可實現對股骨頭360° 切割；c. 調整股骨頭方向，計算股骨頭寬度30%、70%所在位置，以此兩點移動內、外側切線；d～f. 初步切割出內側柱、中間柱和外側柱的空間結構
Figure1. “Three-columns structure” of the femoral head cut by Micro-CTa. Three-dimensional reconstruction of the scanned and reconstructed data; b. By using the “free cut” function of the software, the outer cube frame could realize 360° cutting of the femoral head; c. Adjusted the direction of the femoral head, calculated the position of 30% and 70% of the width of the femoral head, and moved the inner and outer tangents at these two points; d-f. Preliminarily cut out the spatial structure of medial column, middle column, and lateral column
1.4.3 去股骨頸及皮質骨的“三柱結構”數據重建
由于重建時殘余的股骨頸結構會被計算入“三柱結構”中，而股骨距等致密結構會影響對“三柱結構”骨參數的分析，因此通過上述三維層面初步切割股骨頭“三柱結構”后，尚不能直接對股骨頭“三柱結構”進行骨量參數及骨小梁參數分析。同樣，如果將皮質骨結構納入對骨小梁結構相關骨參數的計算，也會影響對“三柱結構”骨小梁的判斷，因此需予以去除。
將初步切割的股骨頭三柱分別以新的數據對象導出，形成新的數據文件；在二維層面去除股骨頸，并在多個二維層面選取不包含皮質骨的區域，達到去除皮質骨的目的。見圖2。
圖2
用于不同骨參數計算的股骨頭“三柱結構”劃分
a～c. 將完成初步切割的外側柱、中間柱、內側柱保存為新的數據對象；d. 去除股骨頸并保存為新的數據對象；e、f. 二維層面去除皮質骨前后，綠色區域為不包括皮質骨的保留骨質；g～i. 去除股骨頸（上）和去除股骨頸及皮質骨（下）的外側柱、中間柱、內側柱
Figure2. Division of “three-columns structure” of femoral head for calculation of different bone parametersa-c. Saved the lateral column, middle column, and medial column after preliminary cutting as new data objects; d. Removed the femoral neck and saved it as a new data object; e, f. Before and after cortical bone removal on the two-dimensional plane, the green area was the reserved bone without cortical bone; g-i. The lateral column, middle column, and medial column after removal of the femoral neck (upper) and removal of the femoral neck and cortical bone (lower)
1.4.4 骨參數指標測量
去除股骨頸部分產生的數據用于分析骨量參數，包括骨體積分數（bone volume to total volume，BV/TV）和骨表面積骨體積比（bone surface area to bone volume ratio，BS/BV）；去除股骨頸和皮質骨部分產生的數據用于分析骨小梁參數，包括骨小梁分離度（trabecular spacing/separation，Tb.Sp）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）。
1.5 股骨頭標本病理學研究
1.5.1 股骨頭標本切割
取完成Micro-CT掃描的股骨頭標本，根據解剖標志物區分內、外側。盡量在最大冠狀位位置使用擺鋸切割股骨頭，形成1塊厚度為5～8 mm的含有股骨頭“三柱結構”的冠狀面骨塊。對剩余股骨頭標本行矢狀位切割，按照占股骨頭寬度30%、40%、30%，分別切割內側柱、中間柱、外側柱骨塊，厚度5～8 mm。見圖3。
圖3
擺鋸切割股骨頭“三柱結構”
a. 完整股骨頭標本；b. 最大冠狀位切割包含股骨頭“三柱結構”的骨塊；c～e. 剩余股骨頭組織切割出內側柱、中間柱、外側柱骨塊
Figure3. Cutting “three-columns structure” of the femoral head with oscillation sawa. Intact femoral head specimen; b. The largest coronal bone block included the “three-columns structure” of the femoral head; c-e. The remaining femoral head tissue was cut into the medial column, middle column, and lateral column bone blocks
1.5.2 組織切片制作
將切割的骨塊以EDTA脫鈣4～5周，每周更換1次脫鈣液；第3周更換脫鈣液時開始檢查骨組織脫鈣情況，以大頭針可輕松穿過骨組織為脫鈣完成，避免脫鈣過度影響組織切片染色。將脫鈣后標本經乙醇梯度脫水過夜、二甲苯透明（30 min～2 h）處理后，石蠟包埋切片，片厚3～5 μm，展片、烘干約20 min備用。
1.5.3 HE染色觀察
取部分冠狀位大骨塊切片常規行HE染色觀察。200倍光鏡下，于內側柱、中間柱、外側柱部位分別選取5個不同視野，計算空骨陷窩率 ［公式為：空骨陷窩數/（空骨陷窩數+正常骨細胞數）×100%］，取均值。
1.5.4 免疫組織化學染色觀察
取部分三柱小骨塊切片（每例患者選3張切片）脫蠟后行抗原修復，隨后加入Bax、Bcl-2免疫組織化學一抗，4℃孵育過夜；PBS沖洗3 min×3次，加入酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物，37℃溫育20 min；PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明后封片。200倍光鏡下于內側柱、中間柱、外側柱切片分別選取5個不同視野，按以下公式計算Bcl-2及Bax染色陽性細胞率：陽性染色骨細胞數/視野內所有骨細胞數×100%，取均值。
1.6 統計學方法
采用SPSS25.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 骨微結構研究
CJFH分型L2型ONFH股骨頭，三柱間BV/TV、Tb.Th和Tb.N比較差異均有統計學意義（P<0.05），其中內側柱各指標最大，外側柱最小；外側柱BS/BV和Tb.Sp顯著大于內側柱和中間柱，差異有統計學意義（P<0.05）；內側柱和中間柱比較差異無統計學意義（P>0.05）。CJFH分型L3型ONFH股骨頭，三柱間BS/BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N各骨參數指標比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1、2。
表1
CJFH分型L2型ONFH股骨頭“三柱結構”骨參數分析（n=7，
）
Table1.
Bone parameter analysis of “three-columns structure” of CJFH type L2 ONFH femoral head (n=7, 
)
表2
CJFH分型L3型ONFH股骨頭“三柱結構”骨參數分析（n=9，
）
Table2.
Bone parameter analysis of “three-columns structure” of CJFH type L3 ONFH femoral head (n=9, 
)
2.2 股骨頭標本病理學研究
2.2.1 標本大體觀察
CJFH分型L2型ONFH股骨頭標本可見外側柱、中間柱廣泛軟骨下骨折及壞死區，壞死區骨質呈黃色泥沙樣改變，骨小梁結構消失；硬化帶為高密度白色條帶，主要在軟骨下骨折區域及正常骨組織區域與壞死區間隔部位，其骨小梁粗壯，骨小梁間隙狹小。內側柱幾乎為正常骨組織，骨小梁結構清晰。CJFH分型L3型ONFH股骨頭標本軟骨下骨折貫穿整個冠狀位“三柱結構”，壞死區（無骨小梁結構）的范圍波及至內側柱。見圖4。
圖4
ONFH股骨頭冠狀位大體觀察
N：壞死區、軟骨下骨塌陷區 S：硬化帶 H：健康區 a. CJFH分型L2型；b. CJFH分型L3型
Figure4. Coronal observation of ONFH femoral headN: Necrotic area, subchondral bone collapse area S: Sclerotic zone H: Healthy area a. CJFH type L2; b. CJFH type L3
2.2.2 HE染色觀察
CJFH分型L2、L3型ONFH股骨頭冠狀位HE染色示，股骨頭內骨髓大量壞死或發生脂肪變性；骨小梁結構扭曲、變細、斷裂；軟骨下骨骨折，軟骨與軟骨下骨分離；骨小梁上存在大量空骨陷窩，殘存的骨細胞細胞核變扁，被擠壓到細胞質一端。CJFH分型L3型病理改變重于L2型。見圖5。
圖5
CJFH分型L3型ONFH股骨頭冠狀位HE染色觀察
a. 整體觀（×200）；b. 骨髓壞死及脂肪變性（×500）；c. 骨小梁結構扭曲、變細、斷裂（×500）；d. 軟骨下骨折（×500）；e. 骨小梁見大量空骨陷窩（×250）
Figure5. HE staining observation of coronal CJFH type L3 ONFH femoral heada. Overall view (×200); b. Necrosis and steatosis of bone marrow (×500); c. Bone trabecular structure was distorted, thinned, and broken (×500); d. Subchondral fracture (×500); e. A large number of empty bone lacunae were found on the bone trabecula (×250)
CJFH分型L2型ONFH股骨頭，內側柱、中間柱、外側柱空骨陷窩率分別為85.9%±0.5%、87.9%±0.5%、91.5%±0.4%，L3型ONFH股骨頭分別為87.6%±0.4%、87.2%±0.6%、90.9%±0.5%，三柱間比較差異均無統計學意義（F=2.679，P=0.096；F=1.499，P=0.244）。
2.2.3 免疫組織化學染色觀察
CJFH分型L2型和L3型ONFH股骨頭“三柱結構”小骨塊石蠟切片行Bcl-2及Bax免疫組織化學染色后，出現大量組織切片脫片，未脫片的切片僅見少量散在棕色染團，且陽性染色不在細胞質表達，為非特異性染色（圖6），無法進行陽性細胞率計算。
圖6
CJFH分型L3型ONFH股骨頭“三柱結構”小骨塊免疫組織化學染色觀察示均為非特異性染色（×1 000）
a. Bax；b. Bcl-2
Figure6. The “three-column structure” of the small bone masses in the CJFH type L3 ONFH femoral head were observed by immunohistochemical staining showed non-specific staining (×1 000)a. Bax; b. Bcl-2
3 討論
Micro-CT是一種非破壞性三維成像技術，可在不破壞樣本情況下清楚顯示樣本內部顯微結構，空間分辨率極高，可達微米級。與臨床CT普遍采用的扇形X線束不同，Micro-CT通常采用錐形X線束，以提高射線利用率和空間分辨率，且在采集相同三維圖像時速度遠快于扇形X線束。其通過計算機軟件將矢狀面、冠狀面、橫截面進行三維重建，以便對感興趣區域進行二維和三維分析。使用Micro-CT微米級空間分辨率以及三維重建功能下的三維骨參數分析，可對ONFH骨小梁的空間結構進行測評[14]。
既往研究發現ONFH股骨頭內壞死區、硬化帶、正常區中骨小梁的結構存在顯著差異。Wang等[11]發現壞死區BV/TV、Tb.N較正常區顯著減小、Tb.Sp顯著增大，壞死區骨小梁抗應力能力下降，最終變薄、斷裂，導致股骨頭塌陷。而股骨頸基底部旋轉截骨術治療CJFH分型L2型及L3型ONFH的原理尚缺乏直接證據支持。本研究通過Micro-CT掃描 CJFH分型L2型及L3型ONFH 患者股骨頭標本后，三維層面分割出內側柱、中間柱、外側柱結構，骨參數分析提示CJFH分型L2型ONFH股骨頭標本外側柱BV/TV、Tb.Th、Tb.N較內側柱及中間柱均明顯減小，BS/BV、Tb.Sp較內側柱及中間柱均明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；CJFH分型L3型ONFH股骨頭外側柱的各骨參數指標與內側柱及中間柱比較差異均無統計學意義（P>0.05）。因此，從骨小梁空間結構變弱導致股骨頭塌陷的理由出發，采用股骨頸基底部旋轉截骨術治療CJFH分型L2型ONFH可為患者提供一個骨量更多、骨小梁結構更好的外側負重區域[13，15]；而治療L3型ONFH患者則不能改變外側負重區的骨小梁情況。所以股骨頸基底部旋轉截骨術更適用于治療CJFH分型L2型ONFH患者，治療L3型ONFH患者時需謹慎，可能需要通過其他保髖手術進行外側柱重建。
本研究中HE染色發現ONFH股骨頭內骨髓大量壞死，骨小梁結構扭曲，軟骨下骨骨折且軟骨與軟骨下骨分離；骨小梁存在大量空骨陷窩，殘存骨細胞的細胞核變扁，被擠壓到細胞質一端。且CJFH分型L3型的病理改變重于L2型，與CJFH分型理論較為吻合。故也驗證了上述結論，即CJFH分型L3型ONFH無法通過旋轉截骨構建更好的外側柱。
另外，本研究行免疫組織化學染色時，骨組織石蠟切片出現脫片、非特異性染色的情況。除了骨組織行免疫組織化學染色難度較大之外，本研究在標本處理過程中也存在許多有損蛋白及抗原的不良因素：① 多數標本固定是在手術完成后進行，間隔數小時，此過程中可能存在骨組織溶解、蛋白物質丟失。② Micro-CT掃描需要完整股骨頭標本，因此在標本固定時未能取出大小、厚度適宜的骨組織進行固定，完整的股骨頭樣本可能存在固定液滲透困難、固定不充分的情況。③ 由于實驗安排無法一次完成骨組織Micro-CT掃描和骨組織切割，期間數次將標本放置于?80℃，可能在多次凍融過程中存在蛋白和抗原丟失。④ 擺鋸切割骨組織時，高速震動產生的高溫可能導致骨組織中蛋白丟失。為解決這些可能的問題，后續在標本研究過程中，可單獨進行ONFH骨組織免疫組織化學的研究，及時將股骨頭標本切割成小組織塊，在切割過程中滴水防止擺鋸溫度過高，對完成切割的小骨塊立刻進行固定。
綜上述，本研究通過Micro-CT 微米級空間分辨率和三維重建功能下的三維骨參數分析以及HE染色和免疫組織化學染色結果分析，得出了以下結論：① CJFH分型L2型ONFH的股骨頭擁有骨小梁結構更好的內側柱和中間柱，通過股骨頸基底部旋轉截骨術可重建骨小梁結構更好、骨量更大的外側柱。而CJFH分型L3型ONFH患者，股骨頭內側柱和中間柱與外側柱相比，骨小梁結構均遭到廣泛破壞，股骨頸基底部旋轉截骨術可能無法幫助其重建較原先更好的外側柱結構。因此對于年輕的L3型患者，需謹慎選擇股骨頸基底部旋轉截骨術進行保髖干預。② CJFH分型L2及L3型ONFH股骨頭標本中，“三柱結構”空骨陷窩率均在85%以上。盡管CJFH分型L2型ONFH的內側柱及中間柱骨小梁破壞較外側柱小，但三柱之間空骨陷窩率比較差異無統計學意義，提示終末期ONFH“三柱結構”中骨小梁破壞雖有差異，但共同的病理過程與骨細胞凋亡有關[16-17]，且該過程應較骨小梁結構破壞發生更早。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經南京中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準（2020NL-162-02）；患者均知情同意
作者貢獻聲明 高潤子：研究設計、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；夏天衛、劉金柱、袁兆豐、環大維：病例收集、標本處理；沈計榮：研究指導、行政及經費支持
股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是骨科常見病與難治病，我國約有812萬15歲以上非創傷ONFH患者且增長速度逐年上升[1-2]。中日友好醫院（CJFH）分型是目前國內較為常用的ONFH分型標準[3]，但該分型基于股骨頭“三柱理論”，主觀性較強，缺乏形態學、病理學等證據支持，且其從單一層面的二維圖像劃分股骨頭，無法反映股骨頭的立體空間狀態。隨著對ONFH病理生理學研究的不斷深入，研究者們發現除了局部組織缺血缺氧的病理狀態以外，骨細胞和成骨細胞數量減少[4-5]、血管內皮細胞損傷[6]、破骨細胞活性增強[7]、BMSCs成骨分化能力降低[8]、內皮祖細胞成血管分化能力限制[9]等病理現象均參與到ONFH的發生發展過程。股骨頸基底部旋轉截骨術旨在將壞死區受累較小的內側柱和/或中間柱旋轉至外側柱部位，替代壞死范圍較大的原外側柱，避免股骨頭進一步塌陷，維持髖關節功能，并為壞死區修復提供相對良好的力學環境，但目前仍缺乏相關基礎研究證據[10-13]。
本研究嘗試通過Micro-CT立體分析CJFH分型L2型及L3型ONFH標本三柱間的骨微結構差異，為股骨頸基底部旋轉截骨術治療ONFH提供形態學證據；同時通過病理學研究比較ONFH標本三柱間骨細胞凋亡的差異，為后期使用股骨頸基底部旋轉截骨術聯合抗細胞凋亡的傳統中醫藥及現代生物醫藥方法治療ONFH提供研究方向。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入標準：① 符合ONFH診斷標準，接受人工全髖關節置換術治療，并知情同意將關節置換產生的股骨頭用于后續Micro-CT掃描及病理學研究。② 影像學檢查提示股骨頭壞死范圍大，軟骨下骨塌陷明顯；或伴有髖關節間隙狹窄，股骨頭及髖臼廣泛增生或囊性變等髖關節骨關節炎表現。③ CJFH分型L2型及L3型，國際骨循環協會（ARCO）分期ⅢC～Ⅳ期。
排除標準：① 伴嚴重心腦血管、消化、呼吸系統疾病，嚴重肝腎功能不全，嚴重營養不良，惡性腫瘤及精神疾病，血壓、血糖控制不佳等手術相對、絕對禁忌證者。② 既往接受包括死骨清理、打壓植骨、髓芯減壓等已對股骨頭內骨小梁結構造成破壞的保髖手術者。
2020年4月—2021年2月共納入20例（20髖）患者，其中4例（4髖）Micro-CT掃描時發現股骨頭三柱結構被取頭器等手術操作破壞，予以剔除。最終16例（16髖）納入后續研究，其中男9例，女7例；年齡24～72歲，平均51.9歲。CJFH分型：L2型7例，L3型9例。ARCO分期：ⅢC期6例，Ⅳ期10例。
1.2 主要試劑及儀器
中性組織固定液（南京化學試劑有限公司）；EDTA脫鈣液（北京雷根生物技術有限公司）；免疫組織化學抗原修復緩沖液（Dako公司，丹麥）；B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）免疫組織化學一抗（福州邁新生物技術開發有限公司）；酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物（北京中杉金橋生物技術有限公司）；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）。顯微鏡載玻片、蓋玻片（海門市神鷹實驗器械廠）；電化黏附載玻片（江蘇匯達醫療器械有限公司）。
Hiscan XM型Micro-CT、Hiscan Analyzer軟件V3.0、Hiscan Reconstruct軟件V3.0（蘇州海斯菲德信息科技有限公司）；STP420ES自動脫水機（Thermo Fisher公司，美國）；PH60病理組織漂烘儀（常州派斯杰醫療設備有限公司）；Tissue-Tek組織包埋機、BM450組織包埋冷凍臺、Tissue-Tek Prisma Plus全自動染色封片機（SAKURA公司，日本）；CR-601ST輪轉式石蠟切片機（金華克拉泰儀器有限公司）；PT200抗原修復儀（Dako公司，丹麥）；DM 4B正置光學顯微鏡（Leica公司，德國）。
1.3 標本處理
手術取得患者股骨頭標本后，及時用5～10倍體積中性組織固定液固定24～48 h；然后用PBS洗30 min×3次，再用純水洗30 min×3次，充分沖洗中性組織固定液，中止標本固定；?80℃冰箱儲存備用。
1.4 骨微結構研究
1.4.1 Micro-CT掃描
取出股骨頭標本固定于Micro-CT載物臺，用海綿泡沫墊高標本。由于人體股骨頭標本體積較大，超過Micro-CT最大掃描窗，因此以膠帶固定股骨頭，使其在載物臺上保持不動，分2～3段不間斷掃描，獲得完整股骨頭掃描數據。掃描參數：分辨率70 μm，電壓80 kV，電流100 μA，單次曝光時間50 ms，掃描角度間隔0.5°。
1.4.2 Micro-CT切割“三柱結構”
將股骨頭掃描后得到的Micro-CT數據導入Hiscan Reconstruct軟件V3.0進行數據重建，再使用Hiscan Analyzer軟件V3.0進行三維模型重建，并在三維立體結構上對股骨頭進行“三柱切割”。調取軟件“free cut”功能，外側立方體框架可實現對股骨頭360° 切割；調整股骨頭方向，將立方體框架調整成正中冠狀位層面，還原CJFH分型所描述的股骨頭“三柱結構”劃分層面；使正中冠狀位矩形與股骨頭內外側骨質呈切線，讀取此時兩切線之間距離，以股骨頭正中冠狀位內側切線為股骨頭寬度0的位置，以股骨頭正中冠狀位外側切線為股骨頭寬度1的位置，按占據股骨頭寬度30%、40%、30%的“三柱結構”定義，計算股骨頭寬度30%、70%所在位置，以此兩點移動內、外側切線，初步切割內側柱、中間柱和外側柱空間結構。見圖1。
圖1
Micro-CT切割股骨頭“三柱結構”
a. 對掃描及重建后的數據進行三維重建；b. 調取軟件“free cut”功能，外側立方體框架可實現對股骨頭360° 切割；c. 調整股骨頭方向，計算股骨頭寬度30%、70%所在位置，以此兩點移動內、外側切線；d～f. 初步切割出內側柱、中間柱和外側柱的空間結構
Figure1. “Three-columns structure” of the femoral head cut by Micro-CTa. Three-dimensional reconstruction of the scanned and reconstructed data; b. By using the “free cut” function of the software, the outer cube frame could realize 360° cutting of the femoral head; c. Adjusted the direction of the femoral head, calculated the position of 30% and 70% of the width of the femoral head, and moved the inner and outer tangents at these two points; d-f. Preliminarily cut out the spatial structure of medial column, middle column, and lateral column
1.4.3 去股骨頸及皮質骨的“三柱結構”數據重建
由于重建時殘余的股骨頸結構會被計算入“三柱結構”中，而股骨距等致密結構會影響對“三柱結構”骨參數的分析，因此通過上述三維層面初步切割股骨頭“三柱結構”后，尚不能直接對股骨頭“三柱結構”進行骨量參數及骨小梁參數分析。同樣，如果將皮質骨結構納入對骨小梁結構相關骨參數的計算，也會影響對“三柱結構”骨小梁的判斷，因此需予以去除。
將初步切割的股骨頭三柱分別以新的數據對象導出，形成新的數據文件；在二維層面去除股骨頸，并在多個二維層面選取不包含皮質骨的區域，達到去除皮質骨的目的。見圖2。
圖2
用于不同骨參數計算的股骨頭“三柱結構”劃分
a～c. 將完成初步切割的外側柱、中間柱、內側柱保存為新的數據對象；d. 去除股骨頸并保存為新的數據對象；e、f. 二維層面去除皮質骨前后，綠色區域為不包括皮質骨的保留骨質；g～i. 去除股骨頸（上）和去除股骨頸及皮質骨（下）的外側柱、中間柱、內側柱
Figure2. Division of “three-columns structure” of femoral head for calculation of different bone parametersa-c. Saved the lateral column, middle column, and medial column after preliminary cutting as new data objects; d. Removed the femoral neck and saved it as a new data object; e, f. Before and after cortical bone removal on the two-dimensional plane, the green area was the reserved bone without cortical bone; g-i. The lateral column, middle column, and medial column after removal of the femoral neck (upper) and removal of the femoral neck and cortical bone (lower)
1.4.4 骨參數指標測量
去除股骨頸部分產生的數據用于分析骨量參數，包括骨體積分數（bone volume to total volume，BV/TV）和骨表面積骨體積比（bone surface area to bone volume ratio，BS/BV）；去除股骨頸和皮質骨部分產生的數據用于分析骨小梁參數，包括骨小梁分離度（trabecular spacing/separation，Tb.Sp）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）。
1.5 股骨頭標本病理學研究
1.5.1 股骨頭標本切割
取完成Micro-CT掃描的股骨頭標本，根據解剖標志物區分內、外側。盡量在最大冠狀位位置使用擺鋸切割股骨頭，形成1塊厚度為5～8 mm的含有股骨頭“三柱結構”的冠狀面骨塊。對剩余股骨頭標本行矢狀位切割，按照占股骨頭寬度30%、40%、30%，分別切割內側柱、中間柱、外側柱骨塊，厚度5～8 mm。見圖3。
圖3
擺鋸切割股骨頭“三柱結構”
a. 完整股骨頭標本；b. 最大冠狀位切割包含股骨頭“三柱結構”的骨塊；c～e. 剩余股骨頭組織切割出內側柱、中間柱、外側柱骨塊
Figure3. Cutting “three-columns structure” of the femoral head with oscillation sawa. Intact femoral head specimen; b. The largest coronal bone block included the “three-columns structure” of the femoral head; c-e. The remaining femoral head tissue was cut into the medial column, middle column, and lateral column bone blocks
1.5.2 組織切片制作
將切割的骨塊以EDTA脫鈣4～5周，每周更換1次脫鈣液；第3周更換脫鈣液時開始檢查骨組織脫鈣情況，以大頭針可輕松穿過骨組織為脫鈣完成，避免脫鈣過度影響組織切片染色。將脫鈣后標本經乙醇梯度脫水過夜、二甲苯透明（30 min～2 h）處理后，石蠟包埋切片，片厚3～5 μm，展片、烘干約20 min備用。
1.5.3 HE染色觀察
取部分冠狀位大骨塊切片常規行HE染色觀察。200倍光鏡下，于內側柱、中間柱、外側柱部位分別選取5個不同視野，計算空骨陷窩率 ［公式為：空骨陷窩數/（空骨陷窩數+正常骨細胞數）×100%］，取均值。
1.5.4 免疫組織化學染色觀察
取部分三柱小骨塊切片（每例患者選3張切片）脫蠟后行抗原修復，隨后加入Bax、Bcl-2免疫組織化學一抗，4℃孵育過夜；PBS沖洗3 min×3次，加入酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物，37℃溫育20 min；PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明后封片。200倍光鏡下于內側柱、中間柱、外側柱切片分別選取5個不同視野，按以下公式計算Bcl-2及Bax染色陽性細胞率：陽性染色骨細胞數/視野內所有骨細胞數×100%，取均值。
1.6 統計學方法
采用SPSS25.0統計軟件進行分析。計量資料行正態性檢驗均符合正態分布，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 骨微結構研究
CJFH分型L2型ONFH股骨頭，三柱間BV/TV、Tb.Th和Tb.N比較差異均有統計學意義（P<0.05），其中內側柱各指標最大，外側柱最小；外側柱BS/BV和Tb.Sp顯著大于內側柱和中間柱，差異有統計學意義（P<0.05）；內側柱和中間柱比較差異無統計學意義（P>0.05）。CJFH分型L3型ONFH股骨頭，三柱間BS/BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.Sp、Tb.N各骨參數指標比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1、2。
表1
CJFH分型L2型ONFH股骨頭“三柱結構”骨參數分析（n=7，）
Table1.
Bone parameter analysis of “three-columns structure” of CJFH type L2 ONFH femoral head (n=7, )
表2
CJFH分型L3型ONFH股骨頭“三柱結構”骨參數分析（n=9，）
Table2.
Bone parameter analysis of “three-columns structure” of CJFH type L3 ONFH femoral head (n=9, )
2.2 股骨頭標本病理學研究
2.2.1 標本大體觀察
CJFH分型L2型ONFH股骨頭標本可見外側柱、中間柱廣泛軟骨下骨折及壞死區，壞死區骨質呈黃色泥沙樣改變，骨小梁結構消失；硬化帶為高密度白色條帶，主要在軟骨下骨折區域及正常骨組織區域與壞死區間隔部位，其骨小梁粗壯，骨小梁間隙狹小。內側柱幾乎為正常骨組織，骨小梁結構清晰。CJFH分型L3型ONFH股骨頭標本軟骨下骨折貫穿整個冠狀位“三柱結構”，壞死區（無骨小梁結構）的范圍波及至內側柱。見圖4。
圖4
ONFH股骨頭冠狀位大體觀察
N：壞死區、軟骨下骨塌陷區 S：硬化帶 H：健康區 a. CJFH分型L2型；b. CJFH分型L3型
Figure4. Coronal observation of ONFH femoral headN: Necrotic area, subchondral bone collapse area S: Sclerotic zone H: Healthy area a. CJFH type L2; b. CJFH type L3
2.2.2 HE染色觀察
CJFH分型L2、L3型ONFH股骨頭冠狀位HE染色示，股骨頭內骨髓大量壞死或發生脂肪變性；骨小梁結構扭曲、變細、斷裂；軟骨下骨骨折，軟骨與軟骨下骨分離；骨小梁上存在大量空骨陷窩，殘存的骨細胞細胞核變扁，被擠壓到細胞質一端。CJFH分型L3型病理改變重于L2型。見圖5。
圖5
CJFH分型L3型ONFH股骨頭冠狀位HE染色觀察
a. 整體觀（×200）；b. 骨髓壞死及脂肪變性（×500）；c. 骨小梁結構扭曲、變細、斷裂（×500）；d. 軟骨下骨折（×500）；e. 骨小梁見大量空骨陷窩（×250）
Figure5. HE staining observation of coronal CJFH type L3 ONFH femoral heada. Overall view (×200); b. Necrosis and steatosis of bone marrow (×500); c. Bone trabecular structure was distorted, thinned, and broken (×500); d. Subchondral fracture (×500); e. A large number of empty bone lacunae were found on the bone trabecula (×250)
CJFH分型L2型ONFH股骨頭，內側柱、中間柱、外側柱空骨陷窩率分別為85.9%±0.5%、87.9%±0.5%、91.5%±0.4%，L3型ONFH股骨頭分別為87.6%±0.4%、87.2%±0.6%、90.9%±0.5%，三柱間比較差異均無統計學意義（F=2.679，P=0.096；F=1.499，P=0.244）。
2.2.3 免疫組織化學染色觀察
CJFH分型L2型和L3型ONFH股骨頭“三柱結構”小骨塊石蠟切片行Bcl-2及Bax免疫組織化學染色后，出現大量組織切片脫片，未脫片的切片僅見少量散在棕色染團，且陽性染色不在細胞質表達，為非特異性染色（圖6），無法進行陽性細胞率計算。
圖6
CJFH分型L3型ONFH股骨頭“三柱結構”小骨塊免疫組織化學染色觀察示均為非特異性染色（×1 000）
a. Bax；b. Bcl-2
Figure6. The “three-column structure” of the small bone masses in the CJFH type L3 ONFH femoral head were observed by immunohistochemical staining showed non-specific staining (×1 000)a. Bax; b. Bcl-2
3 討論
Micro-CT是一種非破壞性三維成像技術，可在不破壞樣本情況下清楚顯示樣本內部顯微結構，空間分辨率極高，可達微米級。與臨床CT普遍采用的扇形X線束不同，Micro-CT通常采用錐形X線束，以提高射線利用率和空間分辨率，且在采集相同三維圖像時速度遠快于扇形X線束。其通過計算機軟件將矢狀面、冠狀面、橫截面進行三維重建，以便對感興趣區域進行二維和三維分析。使用Micro-CT微米級空間分辨率以及三維重建功能下的三維骨參數分析，可對ONFH骨小梁的空間結構進行測評[14]。
既往研究發現ONFH股骨頭內壞死區、硬化帶、正常區中骨小梁的結構存在顯著差異。Wang等[11]發現壞死區BV/TV、Tb.N較正常區顯著減小、Tb.Sp顯著增大，壞死區骨小梁抗應力能力下降，最終變薄、斷裂，導致股骨頭塌陷。而股骨頸基底部旋轉截骨術治療CJFH分型L2型及L3型ONFH的原理尚缺乏直接證據支持。本研究通過Micro-CT掃描 CJFH分型L2型及L3型ONFH 患者股骨頭標本后，三維層面分割出內側柱、中間柱、外側柱結構，骨參數分析提示CJFH分型L2型ONFH股骨頭標本外側柱BV/TV、Tb.Th、Tb.N較內側柱及中間柱均明顯減小，BS/BV、Tb.Sp較內側柱及中間柱均明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）；CJFH分型L3型ONFH股骨頭外側柱的各骨參數指標與內側柱及中間柱比較差異均無統計學意義（P>0.05）。因此，從骨小梁空間結構變弱導致股骨頭塌陷的理由出發，采用股骨頸基底部旋轉截骨術治療CJFH分型L2型ONFH可為患者提供一個骨量更多、骨小梁結構更好的外側負重區域[13，15]；而治療L3型ONFH患者則不能改變外側負重區的骨小梁情況。所以股骨頸基底部旋轉截骨術更適用于治療CJFH分型L2型ONFH患者，治療L3型ONFH患者時需謹慎，可能需要通過其他保髖手術進行外側柱重建。
本研究中HE染色發現ONFH股骨頭內骨髓大量壞死，骨小梁結構扭曲，軟骨下骨骨折且軟骨與軟骨下骨分離；骨小梁存在大量空骨陷窩，殘存骨細胞的細胞核變扁，被擠壓到細胞質一端。且CJFH分型L3型的病理改變重于L2型，與CJFH分型理論較為吻合。故也驗證了上述結論，即CJFH分型L3型ONFH無法通過旋轉截骨構建更好的外側柱。
另外，本研究行免疫組織化學染色時，骨組織石蠟切片出現脫片、非特異性染色的情況。除了骨組織行免疫組織化學染色難度較大之外，本研究在標本處理過程中也存在許多有損蛋白及抗原的不良因素：① 多數標本固定是在手術完成后進行，間隔數小時，此過程中可能存在骨組織溶解、蛋白物質丟失。② Micro-CT掃描需要完整股骨頭標本，因此在標本固定時未能取出大小、厚度適宜的骨組織進行固定，完整的股骨頭樣本可能存在固定液滲透困難、固定不充分的情況。③ 由于實驗安排無法一次完成骨組織Micro-CT掃描和骨組織切割，期間數次將標本放置于?80℃，可能在多次凍融過程中存在蛋白和抗原丟失。④ 擺鋸切割骨組織時，高速震動產生的高溫可能導致骨組織中蛋白丟失。為解決這些可能的問題，后續在標本研究過程中，可單獨進行ONFH骨組織免疫組織化學的研究，及時將股骨頭標本切割成小組織塊，在切割過程中滴水防止擺鋸溫度過高，對完成切割的小骨塊立刻進行固定。
綜上述，本研究通過Micro-CT 微米級空間分辨率和三維重建功能下的三維骨參數分析以及HE染色和免疫組織化學染色結果分析，得出了以下結論：① CJFH分型L2型ONFH的股骨頭擁有骨小梁結構更好的內側柱和中間柱，通過股骨頸基底部旋轉截骨術可重建骨小梁結構更好、骨量更大的外側柱。而CJFH分型L3型ONFH患者，股骨頭內側柱和中間柱與外側柱相比，骨小梁結構均遭到廣泛破壞，股骨頸基底部旋轉截骨術可能無法幫助其重建較原先更好的外側柱結構。因此對于年輕的L3型患者，需謹慎選擇股骨頸基底部旋轉截骨術進行保髖干預。② CJFH分型L2及L3型ONFH股骨頭標本中，“三柱結構”空骨陷窩率均在85%以上。盡管CJFH分型L2型ONFH的內側柱及中間柱骨小梁破壞較外側柱小，但三柱之間空骨陷窩率比較差異無統計學意義，提示終末期ONFH“三柱結構”中骨小梁破壞雖有差異，但共同的病理過程與骨細胞凋亡有關[16-17]，且該過程應較骨小梁結構破壞發生更早。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道
倫理聲明 研究方案經南京中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準（2020NL-162-02）；患者均知情同意
作者貢獻聲明 高潤子：研究設計、數據收集整理及統計分析、文章撰寫；夏天衛、劉金柱、袁兆豐、環大維：病例收集、標本處理；沈計榮：研究指導、行政及經費支持
