引用本文： 李帥, 斯海波, 沈彬. 四面體框架核酸在骨關節炎治療中的應用前景. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(4): 505-510. doi: 10.7507/1002-1892.202112054 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的關節退行性疾病，除了關節局部癥狀導致患者生活質量下降外，還會顯著升高心血管疾病等多種不良事件發生率[1]。據報道，目前我國40歲以上人群中原發性OA患病率已超過40%，隨著人口老齡化加劇，患病率還將進一步上升[2]。在發展為需要關節置換才能解決的重度OA之前，緩解OA進展是關鍵，然而目前尚缺乏能夠有效緩解甚至逆轉OA進展的治療方案。
四面體框架核酸（tetrahedral framework nucleic acids，tFNA）是一種可以在幾秒內自行組裝的核酸結構，可作為載體運載功能性小分子，目前應用主要集中在調節細胞活動、作為生物傳感器以及疾病靶向治療3個方面[3]。在疾病靶向治療方面，tFNA具有可編輯性和生物相容性，可作為多種疾病治療分子藥物的最佳載體。此外，tFNA可被功能分子修飾，進一步擴展了應用潛能[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種具有莖環結構、平均長度為22 nt的內源性非編碼蛋白單鏈小分子RNA。近年來，隨著高通量測序技術的發展，miRNA在OA治療中的潛能逐漸被發掘，但由于存在結構不穩定、易降解、靶向性差等問題，治療作用尚不能在靶細胞內充分發揮。而作為載體的tFNA可解決miRNA在細胞外傳遞過程中存在的上述問題。本文對tFNA作為載體在疾病治療，尤其是OA治療方面的應用研究進展進行綜述，展望其搭載miRNA在OA治療中的應用前景。
1 tFNA治療潛能
1.1 tFNA用于疾病治療的可行性
作為一種簡單、穩定的三維結構，tFNA是一種具有廣泛應用前景的載體，可用于運輸DNA、RNA、短肽等小分子物質[5]。四面體DNA納米結構（tetrahedral DNA nanostructures，TDNs）屬于新型tFNA[6]，是由4個等距單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）組成的三維四面體結構，四面體的每個面由3個ssDNA短序列與同一條ssDNA的序列配對組成。tFNA具有合成簡單、血清相對穩定性、可編輯性、生物相容性、易通過細胞膜等特性。因tFNA具有豐富修飾位點，可以通過堿基配對方式將藥物或具有功能的小分子物質修飾在其某個頂點的單鏈核酸上，嵌入配對雙鏈DNA之間并懸掛在tFNA邊緣，或者封裝在tFNA籠狀結構中送達目標部位，進而發揮生物學功能[5, 7]。
1.2 tFNA與疾病治療
近年來，tFNA在疾病治療，尤其在提升藥物穩定性、協助藥物通過生物屏障以及調節細胞活動等方面的潛能逐漸被發掘。首先，tFNA可以提高藥物的穩定性以增強藥效。如抗HER-2適配體（anti-HER-2 aptamer，HApt）可以靶向HER-2陽性的乳腺癌細胞，并特異性地誘導膜蛋白HER-2的溶酶體降解，進一步誘導細胞凋亡、抑制細胞生長。Ma等[8]將HApt特異地錨定在tFNA上，從而增強了HApt的穩定性，延長了HApt的血液循環時間。Zhao等[9]構建了tFNA-Apt02和tFNA-AptVEGF，并在體內外實驗中驗證了其促進血管生成的作用，并且與不使用tFNA相比表現出更強的促進血管生成能力。值得注意的是，在體外實驗中單獨使用tFNA也表現出較好的促進血管生成效果，提示了tFNA潛在的治療作用。
其次，tFNA可協助藥物通過生物體內的屏障。如Shao等[10]發現在阿爾茨海默病大鼠模型中，tFNA能部分通過血腦屏障并提高大鼠學習記憶能力。Shi等[11]將GMT8、Gint4.T醇與tFNA相結合，構建既可穿過血腦屏障又可靶向膠質瘤細胞的Gint4.T-tFNA-GMT8（GTG）。因紫杉醇能抑制人膠質母細胞瘤細胞系U87MG的增殖、遷移和侵襲，以及誘導細胞凋亡，為此他們進一步構建了負載紫杉醇的GTG，體外實驗證明其抗膠質瘤作用較GTG得到了增強。
特殊序列的tFNA因具有調節作用，其本身便有治療疾病潛能。Gao等[12]發現tFNA可通過調節調節性T細胞和自身反應性T細胞的功能引起免疫耐受，進而保護胰島素的β-細胞并預防非肥胖小鼠Ⅰ型糖尿病的發生。tFNA對免疫細胞的調節作用在視神經脊髓炎患者的T細胞中也得到了驗證[13]。上述研究提示了tFNA在炎癥性疾病（如OA）中的應用價值。
1.3 tFNA與OA
在治療OA方面，作為治療性物質的載體是tFNA發揮作用的主要方式。如Shi等[14]將具有多種生物學特性的天然類黃酮——吳茱萸素負載至tFNA，組裝成搭載吳茱萸素的tFNA（tFNA/wogonin complexes，TWC），發現TWC在體內外均能有效減輕炎癥反應和防止軟骨破壞，明顯抑制OA大鼠膝關節組織中細胞凋亡，增加軟骨形成標記物表達，抑制炎癥介質表達，并且作用效果優于單獨使用tFNA或吳茱萸素。
除了作為載體外，tFNA本身也具有促進軟骨細胞增殖和遷移，以及在體外環境下維持軟骨細胞形態等作用[15]，提示了tFNA在軟骨組織工程中的重要價值。如Li等[16]發現滑膜MSCs（synovial MSCs，SMSCs）能大量吸收tFNA，添加tFNA的環境更有利于誘導SMSCs成軟骨分化，進一步研究表明tFNA能促進經典Wnt/β-catenin信號通路的激活，進而促進SMSCs增殖及軟骨分化，并上調了SMSCs中膠原和蛋白多糖表達。同時動物實驗研究證明了聯合tFNA和SMSCs的軟骨再生策略在OA治療中的價值。IL-1β常用于構建OA細胞模型，Shi等[17]發現tFNA對IL-1β處理后的軟骨細胞有保護作用。tFNA可通過調節與線粒體凋亡密切相關的Bcl-2/Bax/Caspase-3信號通路，并通過激活Nrf2/Ho-1途徑抑制IL-1β誘導的氧化應激，從而減輕IL-1β對軟骨細胞的刺激。此外，tFNA還通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮軟骨保護作用。tFNA對Wnt/β-catenin信號通路產生了相反作用，這可能與IL-1β處理構建的OA模型中Wnt/β-catenin信號通路異常激活，進而導致軟骨分化異常有關。
在軟骨組織工程方面，TDNs展示了極大潛能。調節軟骨細胞的表型和增殖是軟骨組織再生的有效途徑，Shao等[15]發現對大鼠軟骨細胞予以暴露并攝取TDNs處理后，Wnt/β-catenin信號通路相關的基因和蛋白表達均上調，軟骨細胞表型也通過調節Notch信號通路以升高Ⅱ型膠原表達等方式被調節，且當TDNs濃度為250 nmol/L時更適合維持軟骨細胞的形態和增殖。在使用軟骨碎片修復軟骨的OA治療策略中，軟骨細胞的遷移在軟骨損傷部位愈合和支架軟骨種植體的構建中起著重要作用[18]。Shi等[19]發現了4種特異性ssDNA自組裝的TDNs，其能增強遷移相關基因如RhoA、ROCK2（RhoA的主要下游效應器）和組蛋白的表達，從而促進軟骨細胞遷移。
2 miRNA及其對OA的治療作用
miRNA是一種廣泛分布于細胞的短鏈RNA，參與RNA沉默和轉錄后基因表達調控，可通過與靶mRNA 3’ 端的非翻譯區結合，并經mRNA切割或翻譯抑制這兩種不同的轉錄后機制，阻止蛋白質合成[20]，其對OA的治療作用已通過體內外實驗證實。與其他基因治療相比，miRNA不需要被傳送到細胞核即可發揮作用，簡化了傳遞過程[21]。多種miRNA在OA患者膝關節軟骨細胞或膝關節周圍滑液中表達異常。miRNA 可通過調節OA狀態下異常表達的靶基因，對軟骨細胞產生保護作用。如在軟骨細胞中特異性表達的miR-140，可通過抑制帶有血小板反應蛋白結構域單元的裂解素、金屬蛋白酶5和基質金屬蛋白酶13表達，減少軟骨細胞基質分解代謝，從而發揮對軟骨細胞的保護作用。在動物實驗中，將miR-140包裹在含軟骨細胞親和肽（chondrocyte-affinity peptide，CAP）的外泌體的靶向運輸策略，提升了miR-140在關節軟骨內的濃度，更好地達到對OA模型大鼠關節軟骨的保護以及緩解OA進展的目的[22]。與之類似，包含miR-9-5p[23]、miR-142-3p[24]和miR-21-5p[25]在內的多種miRNA均可通過作用其相應靶基因，在體內外實驗中對OA發揮治療作用。
miRNA對OA具有治療作用，即可使用外源性miRNA或使用調節細胞內miRNA的藥物[26]，通過抑制其靶基因使軟骨細胞正常化而調節OA進程。然而，將miRNA應用到人體OA治療時也存在如何控制周圍正常組織內相應miRNA水平不改變或在安全水平內改變、保護miRNA在細胞外環境運輸過程中保持穩定不被過快降解[27]、促進miRNA被軟骨細胞更多地吸收等問題。想要充分發揮miRNA的治療作用，必須有某種具有靶向傳遞且對miRNA有保護作用等功能的載體來彌補局限性[28]。實際上，多項研究已證實了tFNA可作為搭載miRNA的功能化載體，且較其他載體具有優勢。
3 tFNA搭載miRNA的優勢
為了更好地維持結構的穩定性，tFNA更適合搭載小分子，而miRNA具有低含量、短序列等特點。目前有大量研究將tFNA應用于檢測細胞或體液中某些特定miRNA的水平，以達到早期診斷疾病的目的。通過攜帶特定miRNA的結合位點，tFNA具有識別環境中某種或多種微量miRNA的能力，并通過一系列反應擴大陽性結果。Miao等[29]將具有識別miRNA功能的莖環添加在構成TDNs的某一條DNA單鏈上，TDNs支架支撐著垂直方向的莖環，并通過多種修飾將TDNs固定在金電極上。當在血液樣本中存在目標miRNA時，TDNs中具有識別miRNA功能的莖環通過與miRNA雜交后打開，釋放出與信號探針中的序列互補的單鏈莖部，進而通過AgNPs標記信號探針轉化為電化學信號，提高了分子識別效率，即構建了基于TDNs與miRNA催化循環相結合的超靈敏檢測miRNA的電化學生物傳感器。此外，通過識別miRNA，tFNA對癌癥[30-31]以及心肌梗死[32]等疾病也具有超早期診斷作用。
tFNA不僅可以作為診斷工具識別miRNA，還可以作為miRNA載體治療疾病，從而達到充分利用tNFA易進入細胞的特性和良好生物相容性、克服miRNA不穩定性、提高治療效果的目的。目前，雖然關于tFNA與miRNA結合方面的研究多集中在腫瘤治療方面，但其在腫瘤治療方面的修飾策略對用于OA治療存在可借鑒之處。Li等[33]將一種經miR-214-3p修飾的ssDNA與另外3種ssDNA配對，合成tFNA-miR-214-3p，并選擇高表達存活蛋白（Survivin）基因（miR-214-3p靶向作用對象）的非小細胞肺癌細胞A549作為實驗對象。結果表明在體外實驗中tFNA-miR-214-3p可以進入A549細胞，與Survivin基因的mRNA結合并破壞mRNA的穩定性，從而導致Survivin基因表達減少，最終通過激活線粒體凋亡途徑導致腫瘤細胞凋亡，并且基于tFNA良好的可編輯性，在tFNA的不同頂點修飾多種miRNA可能會達到更好的調控效果。胰腺癌細胞內銅水平通常超載，通過沉默編碼銅轉運蛋白1（copper transporter 1，CTR1）的SLC31A1基因，從而降低細胞銅水平，是降低胰腺癌惡性程度的有效手段。有研究以tFNA為載體，將具有靶向并抑制CTR1基因表達功能的siCTR1和miR-124轉移到胰腺癌細胞中，減少細胞對銅的攝入，從而顯著抑制了胰腺癌細胞的生長[34]。
最新研究發現在促進骨缺損修復方面，TDNs也展現了其應用潛能。Li等[35]使用TDNs作為miR335-5p的基因載體并將miR335-5p成功導入BMSCs中，并在體外實驗和動物模型中驗證了其增強miR335-5p促進骨再生的能力。
4 tFNA搭載miRNA在OA治療中的應用前景
如何讓miRNA通過軟骨致密、無血管的細胞外基質進入軟骨細胞，至今仍然是一個重大挑戰。體內條件下miRNA很難直接精準傳遞到軟骨細胞，并且細胞外裸露的miRNA較不穩定。因此想要充分發揮其治療作用，需有載體協助轉移，以保護其不被胞外核糖核酸酶降解。雖然包括病毒載體、脂質體、肽結合劑和聚乙二醇等合成納米粒子[36]在內的天然或人工合成載體都能搭載miRNA， 但它們在臨床上的應用仍存在一些不足，如病毒載體作用目標隨機[37]、對免疫反應具有刺激作用以及增加致癌風險[38-39]，脂質體在體內會被快速清除[40]、潛在生物毒性[41]以及轉染效率較低等。與之相比，tFNA存在靶向性好、可通過血腦屏障、潛在生物毒性較低等優勢（表1）。
表1
tFNA與常見載體效果比較
Table1.
Comparison of the effects of tFNA and common vectors
與傳統載體相比，tFNA存在結構上的優勢。首先，tFNA的4個頂點和6條邊均可以和具有相應結構的核酸以堿基互補方式進行配對。如Zhang等[42]將構成tFNA四面體結構的特定ssDNA中一段長度為12個堿基序列替換為具有功能且與DNA高度親和的肽核酸，然后將修飾后的tFNA有效地轉運到耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中，并達到抑制細菌生長的目的。
同時，某些作用于特殊堿基序列的非核酸類藥物可以與tFNA內的堿基對相互作用。如Xie等[43]利用紫杉醇對含有特殊堿基對的DNA或RNA具有較強的結合能力，且不干擾螺旋結構穩定性的特點，構建搭載紫杉醇的TDNs載體并將其成功轉運至A549細胞中，并逆轉了其對紫杉醇的耐藥性。某些研究甚至利用藥物之間的相互作用實現裝載，如Liu等[44]使用生物素修飾tFNA，利用生物素與親和素強大的相互作用力攜帶鏈霉親和素，同時用佐劑修飾了tFNA的4個頂點，構建了抗原-佐劑復合物，該復合物在體內引發強而特異的抗體反應，同時不會引發針對支架本身的不良反應。這為多種miRNA聯合作用以及miRNA與藥物聯合作用共同調節OA提供了可能。
最后，某些特殊的tFNA本身對OA有一定調節作用，如前文中提及的特定序列tFNA可誘導SMSCs的軟骨分化[16]。其與miRNA的聯合應用可能會產生治療效果的疊加，并且tFNA的可編輯性允許通過添加靶向裝置進而控制miRNA的空間分布，如前文已提及裝配HApt后的tFNA可以靶向HER-2陽性的乳腺癌細胞[8]，通過對tFNA修飾對軟骨組織有特殊親和力的功能性分子達到miRNA的精準治療，也應是OA治療中需要重視的部分。
當然，將tFNA應用于疾病治療中也存在一些問題，如經tFNA修飾后可能會對miRNA等治療藥物的藥效產生影響[45]。此外，盡管在細胞實驗及動物實驗中tFNA表現出較低的生物毒性，但將其應用于人體時的治療精準性及安全性要求更高。
5 總結與展望
tFNA作為一種新型載體，因具有生物學特性優勢，迅速在OA治療中得到應用。目前，關于miR-tFNA功能化復合體在腫瘤治療以及骨再生方面的研究已取得了有意義的成果，對miR-tFNA功能化復合體在OA治療方面的應用有指導意義。以tFNA為載體，miRNA為主要功能性分子，輔以其他功能性分子以提升功能化復合體的靶向性及治療作用，可能為未來研究的熱點。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 斯海波、沈彬：綜述設計、構思及修改；李帥：收集資料、查閱文獻和撰寫文章
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種常見的關節退行性疾病，除了關節局部癥狀導致患者生活質量下降外，還會顯著升高心血管疾病等多種不良事件發生率[1]。據報道，目前我國40歲以上人群中原發性OA患病率已超過40%，隨著人口老齡化加劇，患病率還將進一步上升[2]。在發展為需要關節置換才能解決的重度OA之前，緩解OA進展是關鍵，然而目前尚缺乏能夠有效緩解甚至逆轉OA進展的治療方案。
四面體框架核酸（tetrahedral framework nucleic acids，tFNA）是一種可以在幾秒內自行組裝的核酸結構，可作為載體運載功能性小分子，目前應用主要集中在調節細胞活動、作為生物傳感器以及疾病靶向治療3個方面[3]。在疾病靶向治療方面，tFNA具有可編輯性和生物相容性，可作為多種疾病治療分子藥物的最佳載體。此外，tFNA可被功能分子修飾，進一步擴展了應用潛能[4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種具有莖環結構、平均長度為22 nt的內源性非編碼蛋白單鏈小分子RNA。近年來，隨著高通量測序技術的發展，miRNA在OA治療中的潛能逐漸被發掘，但由于存在結構不穩定、易降解、靶向性差等問題，治療作用尚不能在靶細胞內充分發揮。而作為載體的tFNA可解決miRNA在細胞外傳遞過程中存在的上述問題。本文對tFNA作為載體在疾病治療，尤其是OA治療方面的應用研究進展進行綜述，展望其搭載miRNA在OA治療中的應用前景。
1 tFNA治療潛能
1.1 tFNA用于疾病治療的可行性
作為一種簡單、穩定的三維結構，tFNA是一種具有廣泛應用前景的載體，可用于運輸DNA、RNA、短肽等小分子物質[5]。四面體DNA納米結構（tetrahedral DNA nanostructures，TDNs）屬于新型tFNA[6]，是由4個等距單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）組成的三維四面體結構，四面體的每個面由3個ssDNA短序列與同一條ssDNA的序列配對組成。tFNA具有合成簡單、血清相對穩定性、可編輯性、生物相容性、易通過細胞膜等特性。因tFNA具有豐富修飾位點，可以通過堿基配對方式將藥物或具有功能的小分子物質修飾在其某個頂點的單鏈核酸上，嵌入配對雙鏈DNA之間并懸掛在tFNA邊緣，或者封裝在tFNA籠狀結構中送達目標部位，進而發揮生物學功能[5, 7]。
1.2 tFNA與疾病治療
近年來，tFNA在疾病治療，尤其在提升藥物穩定性、協助藥物通過生物屏障以及調節細胞活動等方面的潛能逐漸被發掘。首先，tFNA可以提高藥物的穩定性以增強藥效。如抗HER-2適配體（anti-HER-2 aptamer，HApt）可以靶向HER-2陽性的乳腺癌細胞，并特異性地誘導膜蛋白HER-2的溶酶體降解，進一步誘導細胞凋亡、抑制細胞生長。Ma等[8]將HApt特異地錨定在tFNA上，從而增強了HApt的穩定性，延長了HApt的血液循環時間。Zhao等[9]構建了tFNA-Apt02和tFNA-AptVEGF，并在體內外實驗中驗證了其促進血管生成的作用，并且與不使用tFNA相比表現出更強的促進血管生成能力。值得注意的是，在體外實驗中單獨使用tFNA也表現出較好的促進血管生成效果，提示了tFNA潛在的治療作用。
其次，tFNA可協助藥物通過生物體內的屏障。如Shao等[10]發現在阿爾茨海默病大鼠模型中，tFNA能部分通過血腦屏障并提高大鼠學習記憶能力。Shi等[11]將GMT8、Gint4.T醇與tFNA相結合，構建既可穿過血腦屏障又可靶向膠質瘤細胞的Gint4.T-tFNA-GMT8（GTG）。因紫杉醇能抑制人膠質母細胞瘤細胞系U87MG的增殖、遷移和侵襲，以及誘導細胞凋亡，為此他們進一步構建了負載紫杉醇的GTG，體外實驗證明其抗膠質瘤作用較GTG得到了增強。
特殊序列的tFNA因具有調節作用，其本身便有治療疾病潛能。Gao等[12]發現tFNA可通過調節調節性T細胞和自身反應性T細胞的功能引起免疫耐受，進而保護胰島素的β-細胞并預防非肥胖小鼠Ⅰ型糖尿病的發生。tFNA對免疫細胞的調節作用在視神經脊髓炎患者的T細胞中也得到了驗證[13]。上述研究提示了tFNA在炎癥性疾病（如OA）中的應用價值。
1.3 tFNA與OA
在治療OA方面，作為治療性物質的載體是tFNA發揮作用的主要方式。如Shi等[14]將具有多種生物學特性的天然類黃酮——吳茱萸素負載至tFNA，組裝成搭載吳茱萸素的tFNA（tFNA/wogonin complexes，TWC），發現TWC在體內外均能有效減輕炎癥反應和防止軟骨破壞，明顯抑制OA大鼠膝關節組織中細胞凋亡，增加軟骨形成標記物表達，抑制炎癥介質表達，并且作用效果優于單獨使用tFNA或吳茱萸素。
除了作為載體外，tFNA本身也具有促進軟骨細胞增殖和遷移，以及在體外環境下維持軟骨細胞形態等作用[15]，提示了tFNA在軟骨組織工程中的重要價值。如Li等[16]發現滑膜MSCs（synovial MSCs，SMSCs）能大量吸收tFNA，添加tFNA的環境更有利于誘導SMSCs成軟骨分化，進一步研究表明tFNA能促進經典Wnt/β-catenin信號通路的激活，進而促進SMSCs增殖及軟骨分化，并上調了SMSCs中膠原和蛋白多糖表達。同時動物實驗研究證明了聯合tFNA和SMSCs的軟骨再生策略在OA治療中的價值。IL-1β常用于構建OA細胞模型，Shi等[17]發現tFNA對IL-1β處理后的軟骨細胞有保護作用。tFNA可通過調節與線粒體凋亡密切相關的Bcl-2/Bax/Caspase-3信號通路，并通過激活Nrf2/Ho-1途徑抑制IL-1β誘導的氧化應激，從而減輕IL-1β對軟骨細胞的刺激。此外，tFNA還通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮軟骨保護作用。tFNA對Wnt/β-catenin信號通路產生了相反作用，這可能與IL-1β處理構建的OA模型中Wnt/β-catenin信號通路異常激活，進而導致軟骨分化異常有關。
在軟骨組織工程方面，TDNs展示了極大潛能。調節軟骨細胞的表型和增殖是軟骨組織再生的有效途徑，Shao等[15]發現對大鼠軟骨細胞予以暴露并攝取TDNs處理后，Wnt/β-catenin信號通路相關的基因和蛋白表達均上調，軟骨細胞表型也通過調節Notch信號通路以升高Ⅱ型膠原表達等方式被調節，且當TDNs濃度為250 nmol/L時更適合維持軟骨細胞的形態和增殖。在使用軟骨碎片修復軟骨的OA治療策略中，軟骨細胞的遷移在軟骨損傷部位愈合和支架軟骨種植體的構建中起著重要作用[18]。Shi等[19]發現了4種特異性ssDNA自組裝的TDNs，其能增強遷移相關基因如RhoA、ROCK2（RhoA的主要下游效應器）和組蛋白的表達，從而促進軟骨細胞遷移。
2 miRNA及其對OA的治療作用
miRNA是一種廣泛分布于細胞的短鏈RNA，參與RNA沉默和轉錄后基因表達調控，可通過與靶mRNA 3’ 端的非翻譯區結合，并經mRNA切割或翻譯抑制這兩種不同的轉錄后機制，阻止蛋白質合成[20]，其對OA的治療作用已通過體內外實驗證實。與其他基因治療相比，miRNA不需要被傳送到細胞核即可發揮作用，簡化了傳遞過程[21]。多種miRNA在OA患者膝關節軟骨細胞或膝關節周圍滑液中表達異常。miRNA 可通過調節OA狀態下異常表達的靶基因，對軟骨細胞產生保護作用。如在軟骨細胞中特異性表達的miR-140，可通過抑制帶有血小板反應蛋白結構域單元的裂解素、金屬蛋白酶5和基質金屬蛋白酶13表達，減少軟骨細胞基質分解代謝，從而發揮對軟骨細胞的保護作用。在動物實驗中，將miR-140包裹在含軟骨細胞親和肽（chondrocyte-affinity peptide，CAP）的外泌體的靶向運輸策略，提升了miR-140在關節軟骨內的濃度，更好地達到對OA模型大鼠關節軟骨的保護以及緩解OA進展的目的[22]。與之類似，包含miR-9-5p[23]、miR-142-3p[24]和miR-21-5p[25]在內的多種miRNA均可通過作用其相應靶基因，在體內外實驗中對OA發揮治療作用。
miRNA對OA具有治療作用，即可使用外源性miRNA或使用調節細胞內miRNA的藥物[26]，通過抑制其靶基因使軟骨細胞正常化而調節OA進程。然而，將miRNA應用到人體OA治療時也存在如何控制周圍正常組織內相應miRNA水平不改變或在安全水平內改變、保護miRNA在細胞外環境運輸過程中保持穩定不被過快降解[27]、促進miRNA被軟骨細胞更多地吸收等問題。想要充分發揮miRNA的治療作用，必須有某種具有靶向傳遞且對miRNA有保護作用等功能的載體來彌補局限性[28]。實際上，多項研究已證實了tFNA可作為搭載miRNA的功能化載體，且較其他載體具有優勢。
3 tFNA搭載miRNA的優勢
為了更好地維持結構的穩定性，tFNA更適合搭載小分子，而miRNA具有低含量、短序列等特點。目前有大量研究將tFNA應用于檢測細胞或體液中某些特定miRNA的水平，以達到早期診斷疾病的目的。通過攜帶特定miRNA的結合位點，tFNA具有識別環境中某種或多種微量miRNA的能力，并通過一系列反應擴大陽性結果。Miao等[29]將具有識別miRNA功能的莖環添加在構成TDNs的某一條DNA單鏈上，TDNs支架支撐著垂直方向的莖環，并通過多種修飾將TDNs固定在金電極上。當在血液樣本中存在目標miRNA時，TDNs中具有識別miRNA功能的莖環通過與miRNA雜交后打開，釋放出與信號探針中的序列互補的單鏈莖部，進而通過AgNPs標記信號探針轉化為電化學信號，提高了分子識別效率，即構建了基于TDNs與miRNA催化循環相結合的超靈敏檢測miRNA的電化學生物傳感器。此外，通過識別miRNA，tFNA對癌癥[30-31]以及心肌梗死[32]等疾病也具有超早期診斷作用。
tFNA不僅可以作為診斷工具識別miRNA，還可以作為miRNA載體治療疾病，從而達到充分利用tNFA易進入細胞的特性和良好生物相容性、克服miRNA不穩定性、提高治療效果的目的。目前，雖然關于tFNA與miRNA結合方面的研究多集中在腫瘤治療方面，但其在腫瘤治療方面的修飾策略對用于OA治療存在可借鑒之處。Li等[33]將一種經miR-214-3p修飾的ssDNA與另外3種ssDNA配對，合成tFNA-miR-214-3p，并選擇高表達存活蛋白（Survivin）基因（miR-214-3p靶向作用對象）的非小細胞肺癌細胞A549作為實驗對象。結果表明在體外實驗中tFNA-miR-214-3p可以進入A549細胞，與Survivin基因的mRNA結合并破壞mRNA的穩定性，從而導致Survivin基因表達減少，最終通過激活線粒體凋亡途徑導致腫瘤細胞凋亡，并且基于tFNA良好的可編輯性，在tFNA的不同頂點修飾多種miRNA可能會達到更好的調控效果。胰腺癌細胞內銅水平通常超載，通過沉默編碼銅轉運蛋白1（copper transporter 1，CTR1）的SLC31A1基因，從而降低細胞銅水平，是降低胰腺癌惡性程度的有效手段。有研究以tFNA為載體，將具有靶向并抑制CTR1基因表達功能的siCTR1和miR-124轉移到胰腺癌細胞中，減少細胞對銅的攝入，從而顯著抑制了胰腺癌細胞的生長[34]。
最新研究發現在促進骨缺損修復方面，TDNs也展現了其應用潛能。Li等[35]使用TDNs作為miR335-5p的基因載體并將miR335-5p成功導入BMSCs中，并在體外實驗和動物模型中驗證了其增強miR335-5p促進骨再生的能力。
4 tFNA搭載miRNA在OA治療中的應用前景
如何讓miRNA通過軟骨致密、無血管的細胞外基質進入軟骨細胞，至今仍然是一個重大挑戰。體內條件下miRNA很難直接精準傳遞到軟骨細胞，并且細胞外裸露的miRNA較不穩定。因此想要充分發揮其治療作用，需有載體協助轉移，以保護其不被胞外核糖核酸酶降解。雖然包括病毒載體、脂質體、肽結合劑和聚乙二醇等合成納米粒子[36]在內的天然或人工合成載體都能搭載miRNA， 但它們在臨床上的應用仍存在一些不足，如病毒載體作用目標隨機[37]、對免疫反應具有刺激作用以及增加致癌風險[38-39]，脂質體在體內會被快速清除[40]、潛在生物毒性[41]以及轉染效率較低等。與之相比，tFNA存在靶向性好、可通過血腦屏障、潛在生物毒性較低等優勢（表1）。
表1
tFNA與常見載體效果比較
Table1.
Comparison of the effects of tFNA and common vectors
與傳統載體相比，tFNA存在結構上的優勢。首先，tFNA的4個頂點和6條邊均可以和具有相應結構的核酸以堿基互補方式進行配對。如Zhang等[42]將構成tFNA四面體結構的特定ssDNA中一段長度為12個堿基序列替換為具有功能且與DNA高度親和的肽核酸，然后將修飾后的tFNA有效地轉運到耐甲氧西林金黃色葡萄球菌中，并達到抑制細菌生長的目的。
同時，某些作用于特殊堿基序列的非核酸類藥物可以與tFNA內的堿基對相互作用。如Xie等[43]利用紫杉醇對含有特殊堿基對的DNA或RNA具有較強的結合能力，且不干擾螺旋結構穩定性的特點，構建搭載紫杉醇的TDNs載體并將其成功轉運至A549細胞中，并逆轉了其對紫杉醇的耐藥性。某些研究甚至利用藥物之間的相互作用實現裝載，如Liu等[44]使用生物素修飾tFNA，利用生物素與親和素強大的相互作用力攜帶鏈霉親和素，同時用佐劑修飾了tFNA的4個頂點，構建了抗原-佐劑復合物，該復合物在體內引發強而特異的抗體反應，同時不會引發針對支架本身的不良反應。這為多種miRNA聯合作用以及miRNA與藥物聯合作用共同調節OA提供了可能。
最后，某些特殊的tFNA本身對OA有一定調節作用，如前文中提及的特定序列tFNA可誘導SMSCs的軟骨分化[16]。其與miRNA的聯合應用可能會產生治療效果的疊加，并且tFNA的可編輯性允許通過添加靶向裝置進而控制miRNA的空間分布，如前文已提及裝配HApt后的tFNA可以靶向HER-2陽性的乳腺癌細胞[8]，通過對tFNA修飾對軟骨組織有特殊親和力的功能性分子達到miRNA的精準治療，也應是OA治療中需要重視的部分。
當然，將tFNA應用于疾病治療中也存在一些問題，如經tFNA修飾后可能會對miRNA等治療藥物的藥效產生影響[45]。此外，盡管在細胞實驗及動物實驗中tFNA表現出較低的生物毒性，但將其應用于人體時的治療精準性及安全性要求更高。
5 總結與展望
tFNA作為一種新型載體，因具有生物學特性優勢，迅速在OA治療中得到應用。目前，關于miR-tFNA功能化復合體在腫瘤治療以及骨再生方面的研究已取得了有意義的成果，對miR-tFNA功能化復合體在OA治療方面的應用有指導意義。以tFNA為載體，miRNA為主要功能性分子，輔以其他功能性分子以提升功能化復合體的靶向性及治療作用，可能為未來研究的熱點。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 斯海波、沈彬：綜述設計、構思及修改；李帥：收集資料、查閱文獻和撰寫文章
