引用本文： 邢飛, 吳岐佑, 者漫, 羅榮, 項舟, 劉明. 無機生物材料在骨修復中的骨免疫調節作用. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(4): 517-522. doi: 10.7507/1002-1892.202112025 復制
創傷、腫瘤、感染等原因導致的大段骨缺損一直是臨床治療難點，自體骨移植修復是治療“金標準”，但是存在取骨量有限、供骨區并發癥等問題。采用組織工程技術構建的生物支架在骨缺損治療方面具有廣闊應用前景[1]。目前，已有大量研究采用各種物理化學手段結合不同來源種子細胞，成功構建了多種骨修復生物材料[2]，根據來源大致分為無機生物材料、有機生物材料以及復合生物材料三類[3]。其中，無機生物材料主要包括生物陶瓷、生物玻璃等，具備良好骨傳導性、生物相容性、骨誘導活性，可以模擬骨礦物相化學成分，直接促進成骨相關細胞表達相關基因、蛋白，已作為基礎材料被廣泛用于骨修復。
隨著對無機生物材料促進骨修復研究的不斷深入，越來越多的研究發現免疫系統在骨修復過程中發揮了重要作用。無機生物材料植入生物體骨缺損內部后，作為機體的“外來物質”，最先接觸并激活機體免疫系統，被激活的免疫系統會與材料一起參與到后續骨修復過程[4]。隨著“骨免疫”概念的提出，越來越多的研究者將免疫與骨修復聯系起來，并確定了免疫調節在骨修復過程中具有重要作用[5]。此外，無機生物材料除了可以直接作用于成骨細胞促進骨修復，還可以通過調控免疫系統間接促進骨修復。本文就無機生物材料在骨修復過程中的免疫調節作用作一綜述，為進一步構建具備良好免疫調節作用的無機生物材料提供思路。
1 骨組織損傷修復
骨組織是骨骼肌肉組織的主要組成部分，由礦物質、有機基質和水組成[6]，對于支撐身體及運動起著十分重要的作用。骨組織損傷后自我修復功能就會啟動[7]。骨愈合是一種復雜、動態的自我修復過程，免疫細胞、成骨細胞、破骨細胞、內皮細胞和軟骨細胞作為重要角色均參與到整個修復過程中。
骨修復過程大致可以分為血腫炎癥機化期、骨痂形成期和骨痂重塑期[8]。① 血腫炎癥機化期是指骨組織受損時，骨組織和周圍軟組織內的微血管網絡破裂，體內凝血系統被激活形成局部血腫，同時伴有炎癥細胞大量募集釋放，進而引起急性炎癥反應[4]。炎癥細胞釋放IL-1、IL-6、TNF等大量促炎因子，進而募集MSCs，促進局部微血管形成，同時多種骨修復相關細胞侵入，血腫逐漸機化并形成肉芽組織，最終演變成纖維結締組織[9]。② 骨痂形成期主要包括相關炎癥因子刺激成骨相關細胞增殖并分化為骨細胞，表達相關成骨基因，分泌成骨相關蛋白。同時血管繼續長入新生骨基質中并形成鈣化結節，進而形成骨小梁。骨折損傷部位的骨痂主要通過膜內化骨和軟骨內化骨形成。③ 骨痂重塑期，局部血管形成減少，巨噬細胞開始與成骨細胞交替進行骨痂重塑，同時受生物力學影響，應力軸線上的骨痂不斷增強，非應力軸線上的多余骨痂不斷被清除，新生的板層骨分布與應力軸線方向一致，最終形成具備完整哈弗系統的新生骨組織[10]。骨修復過程的3個時期不是完全按照先后順序進行，而是交替進行。
2 免疫系統在骨修復中的作用
炎癥是機體復雜防御過程，反映了機體對各種有害刺激的反應。機體的免疫器官、免疫細胞和免疫因子組成了免疫系統，其具有識別和排除抗原性異物，與機體其他系統相互協調，共同維持機體內環境穩定和生理平衡的功能。骨髓中除了存在大量MSCs外，還有大量T細胞、B細胞、單核細胞以及巨噬細胞等免疫細胞[11]，各種免疫細胞約占骨髓中細胞總數的20%[12]。骨骼肌肉系統與免疫系統還共享眾多細胞調節因子。免疫系統不僅參與維持正常骨組織中的骨內穩態，同時在骨損傷后修復中起著重要作用。
巨噬細胞作為免疫系統的重要成員，在發揮免疫調節功能之外，還在骨修復過程中扮演十分重要的角色。在骨折愈合過程中，巨噬細胞可以吞噬細胞碎片以及無序的細胞外基質，并且可以驅動炎癥修復的第1階段[13]。此外，巨噬細胞還可以通過分泌促血管生成因子和促有絲分裂因子，促進骨痂形成和骨痂重塑。目前研究發現巨噬細胞包含具有促炎功能的M1型和抗炎功能的M2型兩個亞型，在不同組織環境中兩種亞型巨噬細胞可以相互極化，參與并調控骨組織的修復與再生[5]。在骨修復早期，M1型巨噬細胞通過釋放VEGF、TNF、FGF等因子誘導血管周圍細胞募集和尖端細胞內皮分化，以啟動毛細血管芽生成[14]。此外，M1型巨噬細胞可以通過抑制成骨細胞分化和促進成骨細胞凋亡來調控成骨細胞，進而阻礙成骨細胞產生膠原蛋白，促進礦化。M2型巨噬細胞可以通過分泌IL-10、TGF、IL-1和BMP-2等因子抑制破骨細胞活動，同時促進成骨細胞分化和新骨形成[15]。M1、M2型巨噬細胞的平衡對于骨組織代謝動態平衡起著十分重要的作用。免疫系統可以通過M1型和M2型的相互轉換實現對不同骨修復階段的動態調控作用。
3 改變無機生物材料物理特性實現骨修復免疫調控
無機生物材料植入機體后，材料表面與宿主組織直接接觸，必然會引起局部組織的免疫炎癥反應。研究表明可以通過改變無機生物材料孔隙率及孔徑、力學強度、粗糙度和拓撲結構等物理特性，實現骨修復過程中的免疫調控[16]。
3.1 適宜的孔徑和孔隙率調控血管生成
通過調整材料孔隙率和孔徑可調控成骨細胞行為、巨噬細胞極化和免疫反應[17]。無機生物材料具有適宜的微孔徑，可以通過形成內部缺氧微環境，促進巨噬細胞分泌VEGF，進而促進微血管形成[18]。但支架內部孔徑過小會增強局部炎癥反應，導致肉芽組織的形成，完全堵塞微孔，從而在周圍骨細胞和植入物之間形成屏障，阻礙骨修復，最終導致骨組織再生受損和植入失敗[19]。研究顯示無機生物材料孔徑在90～120 μm時，有利于軟骨生成同時抑制血管生成；當孔徑在350 μm時則可以促進成骨和成血管形成[20]。整體而言，在一定范圍內，無機生物材料孔徑越大，越有利于抑制炎癥反應，進而抑制血管生成[21]。此外，較高的孔隙率可以有效促進成骨細胞黏附、生長，形成豐富的細胞外基質，并加強早期生物固定，但同時會降低無機生物材料支架的力學強度[22]。因此，在維持支架適宜力學強度的同時，選用合適的孔隙率以及孔徑可以有效加強支架的免疫調控作用，進而促進骨組織再生。
3.2 表面粗糙度調控巨噬細胞極性轉化
無機生物材料的表面粗糙度直接影響免疫細胞的生物活性因子釋放，進而調控血管新生和干細胞成骨分化。研究發現材料表面粗糙度可以改變附著于表面的免疫細胞形態，進而調節相關促炎因子和趨化因子的產生[22]。Hotchkiss等[17]通過研究不同表面粗糙程度的材料對巨噬細胞活化的影響，發現增加表面粗糙度可以激活整合素-細胞骨架復合體調控巨噬細胞向M2型極化，同時進一步促進IL-4和IL-10的生成；而降低表面粗糙度可以促進巨噬細胞向M1型極化，進而促進IL-1β、IL-6、TNF-α的表達。Zhu等[23]成功利用水熱法制備了具備高表面粗糙度的雙相磷酸鈣生物陶瓷。首先將其修復比格犬長骨骨缺損，結果發現表面粗糙的雙相磷酸鈣生物陶瓷比表面光滑材料具備更好的骨修復能力。然后，將兩種材料與MSCs共培養，體外基因微陣列分析結果表明，表面粗糙的雙相磷酸鈣生物陶瓷能誘導與炎癥相關的基因水平急劇下調，抑制TNF信號通路。上述研究結果均提示增加材料表面粗糙度可以有效調控免疫細胞極化，進而促進骨修復。
3.3 表面拓撲結構調控免疫細胞反應
骨組織的微觀拓撲結構對于骨修復調控起著十分重要的作用。無機生物材料表面拓撲結構可以仿生模擬骨組織天然納米物理結構，實現骨免疫調節作用。通過控制生物材料表面拓撲結構，可以調控局部免疫細胞反應，進而產生局部可控的成骨免疫微環境來調節骨動力學[24]。生物材料的表面拓撲結構排列（無序程度）、尺寸可以對成骨分化產生顯著影響，還可調節免疫細胞延伸、黏附、排列、遷移和分化。越來越多的研究者將選擇具備特定表面拓撲結構的生物材料作為實現骨免疫調節的重要工具之一。隨著生物材料加工技術的不斷發展，研究者通過在生物材料表面構建納米坑、納米柱、納米凹槽、納米管等拓撲結構來調控骨免疫過程，實現骨組織再生[25]。Yang等[26]聯合光熱法和水熱法在羥基磷灰石生物陶瓷表面制備了3種微米級圓形圖案（4、12、36 μm）和納米形貌（納米針、納米片和納米棒），用于研究不同拓撲結構對巨噬細胞的反應。體外研究發現不同的拓撲結構可以減輕或促進巨噬細胞極化，進而影響MSCs成骨分化和臍靜脈內皮細胞的血管生成活性。Neacsu 等[27]研究了納米管在不同條件下對巨噬細胞的體外細胞學行為，發現納米管結構可以通過抑制絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB通路來減少炎癥介質的釋放，減弱巨噬細胞的炎癥反應。不同的表面拓撲結構可以影響不同骨免疫環境，以改善后續成骨活動。因此，在材料表面構建特定的表面拓撲結構，可以為骨修復構建適宜的骨免疫微環境，進而加快骨修復進程。
3.4 力學強度和晶體顆粒大小調控巨噬細胞極性轉化
材料的力學強度或晶體顆粒大小可以影響并調控各類免疫細胞的生物學反應[13]。在低硬度材料表面，骨髓來源巨噬細胞表面標記物CD86的表達上調，細胞內活性氧增加，同時分泌更多的IL-1β和TNF-α，促進巨噬細胞向M1型極化。在高硬度材料表面，骨髓來源巨噬細胞的CD206表達上調更多，活性氧減少，并分泌更多的IL-4和TGF-β，促進巨噬細胞向M2型極化[28]。
除了自身力學性能之外，無機生物材料可以通過調整晶體顆粒大小改變材料自身比表面積，進而影響巨噬細胞的黏附和極化，調控成骨活動以及成血管分化。早期研究發現當磷酸鈣生物陶瓷晶體顆粒粒徑在1 μm左右時，可以明顯促進異位骨化[29]。Davison等[30]采用比格犬肌肉包埋模型研究磷酸鈣生物陶瓷晶體顆粒大小對免疫細胞的影響，發現與粒徑2～4 μm晶體顆粒相比，粒徑為1 μm的晶體顆粒有更多的多核破骨細胞樣細胞聚集。此外，黏附在晶體顆粒粒徑為2～4 μm的生物陶瓷表面的RAW264.7細胞在核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）誘導下，其增殖和分化為多核破骨細胞樣細胞的能力均受到顯著抑制。Li等[31]對比了兩種微米級和亞微米級磷酸鈣生物陶瓷骨免疫調節功能差異。體外研究發現，亞微米級生物材料可以通過激活PI3K/AKT 信號通路調節巨噬細胞向M2型極化，進而促進MSCs成骨分化；體內研究發現，亞微米級生物材料植入體內之后可以募集更多巨噬細胞，并誘導這些巨噬細胞向M2型極化。
4 改變無機生物材料化學特性實現骨修復免疫調控
對無機生物材料表面進行化學修飾，旨在通過與蛋白質等可溶性分子的相互作用，影響免疫細胞的細胞學行為。無機生物材料的化學特性主要包括表面潤濕性、表面電荷、官能團和材料成分。近年來，越來越多的研究通過改變無機生物材料表面的化學特性，提高支架材料自身骨免疫調控特性，進而促進骨修復。
4.1 表面潤濕性調控免疫因子釋放
生物材料的表面潤濕性與蛋白質吸附、血凝塊形成和纖維蛋白形成密切相關[32]。具備不同表面潤濕性的生物材料可以吸附不同類型及數量的蛋白質，高度親水性生物材料通常具有蛋白質抗性，而疏水性生物材料的疏水部分則具備內在的免疫原性[33]。Vishwakarma等[34]評估了生物材料表面潤濕性對材料表面血清衍生蛋白層形成的作用以及對誘導免疫反應的影響，發現親水性羧基表面有利于白蛋白吸附，而疏水性烴表面有利于IgG2吸附。Kakizawa等[35]利用聚氨基酸包覆的二氧化硅納米顆粒研究生物材料物理粒子特性和刺激條件對免疫細胞中細胞因子產生的影響，結果顯示IL-1β和IFN-γ的分泌與聚氨基酸的疏水性程度相關，疏水顆粒可以上調T細胞中IFN-γ表達水平。但也有研究發現提高生物材料表面親水性會降低巨噬細胞的黏附能力，進而抑制TNF-α、MCP-1和IL-1β等多種促炎因子的分泌[36]。因此，有關無機生物材料表面潤濕性對免疫細胞的調節作用，仍需更多研究來確定。
4.2 表面電荷和官能團調控骨免疫過程
無機生物材料表面電荷對免疫細胞具有調控功能。表面的正電粒子可增強免疫細胞相關炎癥通路的激活，負電粒子可調控巨噬細胞的遷移行為，同時抑制相關炎癥反應，促進調節性T細胞表達。Bartneck等[37]研究了表面電荷修飾對巨噬細胞炎癥特征的影響，發現表面正電荷的氨基修飾可以誘導巨噬細胞向M2型極化，表面負電荷的羧基修飾可以誘導巨噬細胞向M1型極化。此外，Neumann等[38]研究了微粒表面電荷對于NLRP3（NOD-like receptor protein 3）炎癥小體的作用，發現與帶負電荷的粒子相比，帶正電荷的粒子可以促進炎癥小體的激活。
此外，生物骨修復材料的表面官能團可以通過影響表面電荷，調節骨免疫過程。生物材料表面的氨基和羥基可以有效提高免疫細胞的浸潤能力，并在體內誘導生物材料周圍形成較厚的纖維包膜[39]。Barbosa等[40]研究了不同表面官能團的急性炎癥反應。結果發現，與表面帶有其他官能團的生物材料相比，表面帶有羥基和羧基的生物材料在植入體內后可以局部誘導更多的炎癥細胞浸潤。Kamath等[39]使用小鼠皮下植入模型評估不同表面官能團對宿主組織反應的影響，發現含有羥基和氨基的生物材料表面出現更厚的纖維囊并伴隨大量炎癥細胞浸潤，而含有氟甲基和羧基的生物材料表面則表現出較低的炎癥/纖維化反應與炎癥細胞浸潤。此外，羥基、氨基和羧基還可不同程度地增強離子、巨噬細胞極化和細胞局部黏附。Keselowsky等[41]用固定密度的單一黏附配體纖維連接蛋白模型系統研究羥基、羧基、氨基對黏著斑組裝和信號傳導的影響，發現羥基能向黏附結構最高程度地募集踝蛋白、α 肌動蛋白、樁蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白。
4.3 構建復合材料實現骨修復免疫調控
隨著骨免疫相關研究的不斷深入，越來越多的研究將無機生物材料與其他成分混合構建復合材料用于骨免疫調控。相比于單一的無機生物材料，復合材料具備更好的生物學特性，應用范圍也更廣。鎂金屬因具有生物降解、生物相容性和骨傳導特性，被認為是骨科與整形外科的革命性金屬。但高降解率會導致過度炎癥反應，限制了其在骨組織工程中的應用。Chen等[14]使用化學浸沒法將β-磷酸三鈣涂覆在鎂金屬支架表面，用于提高支架的骨免疫調節特性。體內研究結果發現該支架可以通過抑制Toll 樣受體信號通路調控巨噬細胞向M2型極化，同時抑制破骨細胞增殖，降低巨噬細胞集落刺激因子和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）的表達。Hung等[42]構建了硅酸鈣陶瓷，研究其是否具有抗破骨細胞生成作用。結果發現在硅濃度>4 mmol/L時，硅以劑量依賴性方式降低RANKL水平，增強TRAP活性，同時硅還可降低RANKL升高的組織蛋白酶K表達，抑制TRAF6介導的NK-κB信號通路激活，進而抑制破骨細胞生成。Chen等[43]比較了雙相磷酸鈣生物陶瓷、磷酸三鈣、羥基磷灰石的骨免疫調節作用。體外研究發現與其他兩種材料相比，雙相磷酸鈣生物陶瓷可以有效提高CD206陽性表達的M2型巨噬細胞比例，上調M2型標記物的表達；體內研究也發現雙相磷酸鈣生物陶瓷可以有效調節局部炎癥反應，促進局部形成適宜骨修復的免疫微環境。在另一項研究中，Shiwaku等[44]比較了不同含量羥基磷灰石的雙相磷酸鈣生物陶瓷對破骨細胞分化的影響。研究結果發現破骨細胞的活性會因羥基磷灰石含量增加而部分受損，但不會因雙相磷酸鈣生物陶瓷支架內微孔的存在而受損。此外，羥基磷灰石含量低的雙相磷酸鈣生物陶瓷有利于鞘氨醇激酶1等正耦合因子的表達。Li等[45]3D打印IFN-γ/硅酸鈣/β-磷酸三鈣復合支架，實現了巨噬細胞的順序極化。早期（1～3 d）釋放IFN-γ刺激巨噬細胞向M1型極化，然后釋放硅誘導巨噬細胞向M2型極化，并促進血管生成，為加速組織工程支架的血管化和成骨提供了新策略。除此之外，無機生物骨修復材料還可以與脫細胞外基質、質粒DNA、小干擾RNA和微小RNA構建復合體系，用于骨免疫調控[46]。
5 結論
骨組織形成、發育、損傷修復以及骨骼重塑等各個階段都受到一系列生物化學信號以及物理信號的精確調控，目前很難在體外模擬整個骨修復過程。近年來，研究者發現免疫細胞在骨組織的動態平衡中扮演著十分重要的角色。隨著相關研究的不斷深入，巨噬細胞作為一類重要的骨免疫細胞引起越來越多研究者的重視。巨噬細胞可以通過釋放相關因子，激活相關信號通路，促進成骨和成血管，進而實現對不同階段骨修復的調控。因此，將免疫細胞作為骨修復過程中的首要目的細胞，利用生物材料驅動免疫細胞構建局部適宜的骨免疫微環境，可能成為組織工程骨修復領域中一個新理論。
近年來，無機生物材料作為一種最常用于骨修復的材料，其骨免疫調節特性受到了越來越多關注。通過改變無機生物材料表面粗糙度、表面潤濕性等理化特性，可以直接調控機體內的免疫細胞，構建適宜的免疫微環境，進而實現動態調控成骨過程。此外，無機生物材料通過與其他成分混合構建復合材料，可以克服其自身固有局限，有效提高其骨免疫調節能力，實現對骨微環境有序可控的免疫調節。
雖然免疫細胞在骨修復過程中扮演著重要角色，但是利用免疫系統實現對骨修復過程的精準把控依然是該領域的難題。如何利用生物材料自身理化特性調控巨噬細胞極化，維持免疫與骨修復的微妙平衡，仍然需要組織工程研究者不斷探索。充分利用免疫與骨修復的眾多共同分子信號靶點實現精準調控可能是一個突破點。此外，目前關于骨免疫調節的相關研究仍集中于巨噬細胞和生物材料相互作用的體內外現象觀察。如何進一步完善無機生物材料、免疫系統、骨骼肌肉系統三者的內在復雜信號通路以及潛在的分子靶點，仍需不斷研究。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 邢飛、吳岐佑：撰寫文章；者漫、羅榮：參與文獻收集、整理；項舟：指導綜述構思、觀點形成及文章撰寫；劉明：文章審閱、修改
創傷、腫瘤、感染等原因導致的大段骨缺損一直是臨床治療難點，自體骨移植修復是治療“金標準”，但是存在取骨量有限、供骨區并發癥等問題。采用組織工程技術構建的生物支架在骨缺損治療方面具有廣闊應用前景[1]。目前，已有大量研究采用各種物理化學手段結合不同來源種子細胞，成功構建了多種骨修復生物材料[2]，根據來源大致分為無機生物材料、有機生物材料以及復合生物材料三類[3]。其中，無機生物材料主要包括生物陶瓷、生物玻璃等，具備良好骨傳導性、生物相容性、骨誘導活性，可以模擬骨礦物相化學成分，直接促進成骨相關細胞表達相關基因、蛋白，已作為基礎材料被廣泛用于骨修復。
隨著對無機生物材料促進骨修復研究的不斷深入，越來越多的研究發現免疫系統在骨修復過程中發揮了重要作用。無機生物材料植入生物體骨缺損內部后，作為機體的“外來物質”，最先接觸并激活機體免疫系統，被激活的免疫系統會與材料一起參與到后續骨修復過程[4]。隨著“骨免疫”概念的提出，越來越多的研究者將免疫與骨修復聯系起來，并確定了免疫調節在骨修復過程中具有重要作用[5]。此外，無機生物材料除了可以直接作用于成骨細胞促進骨修復，還可以通過調控免疫系統間接促進骨修復。本文就無機生物材料在骨修復過程中的免疫調節作用作一綜述，為進一步構建具備良好免疫調節作用的無機生物材料提供思路。
1 骨組織損傷修復
骨組織是骨骼肌肉組織的主要組成部分，由礦物質、有機基質和水組成[6]，對于支撐身體及運動起著十分重要的作用。骨組織損傷后自我修復功能就會啟動[7]。骨愈合是一種復雜、動態的自我修復過程，免疫細胞、成骨細胞、破骨細胞、內皮細胞和軟骨細胞作為重要角色均參與到整個修復過程中。
骨修復過程大致可以分為血腫炎癥機化期、骨痂形成期和骨痂重塑期[8]。① 血腫炎癥機化期是指骨組織受損時，骨組織和周圍軟組織內的微血管網絡破裂，體內凝血系統被激活形成局部血腫，同時伴有炎癥細胞大量募集釋放，進而引起急性炎癥反應[4]。炎癥細胞釋放IL-1、IL-6、TNF等大量促炎因子，進而募集MSCs，促進局部微血管形成，同時多種骨修復相關細胞侵入，血腫逐漸機化并形成肉芽組織，最終演變成纖維結締組織[9]。② 骨痂形成期主要包括相關炎癥因子刺激成骨相關細胞增殖并分化為骨細胞，表達相關成骨基因，分泌成骨相關蛋白。同時血管繼續長入新生骨基質中并形成鈣化結節，進而形成骨小梁。骨折損傷部位的骨痂主要通過膜內化骨和軟骨內化骨形成。③ 骨痂重塑期，局部血管形成減少，巨噬細胞開始與成骨細胞交替進行骨痂重塑，同時受生物力學影響，應力軸線上的骨痂不斷增強，非應力軸線上的多余骨痂不斷被清除，新生的板層骨分布與應力軸線方向一致，最終形成具備完整哈弗系統的新生骨組織[10]。骨修復過程的3個時期不是完全按照先后順序進行，而是交替進行。
2 免疫系統在骨修復中的作用
炎癥是機體復雜防御過程，反映了機體對各種有害刺激的反應。機體的免疫器官、免疫細胞和免疫因子組成了免疫系統，其具有識別和排除抗原性異物，與機體其他系統相互協調，共同維持機體內環境穩定和生理平衡的功能。骨髓中除了存在大量MSCs外，還有大量T細胞、B細胞、單核細胞以及巨噬細胞等免疫細胞[11]，各種免疫細胞約占骨髓中細胞總數的20%[12]。骨骼肌肉系統與免疫系統還共享眾多細胞調節因子。免疫系統不僅參與維持正常骨組織中的骨內穩態，同時在骨損傷后修復中起著重要作用。
巨噬細胞作為免疫系統的重要成員，在發揮免疫調節功能之外，還在骨修復過程中扮演十分重要的角色。在骨折愈合過程中，巨噬細胞可以吞噬細胞碎片以及無序的細胞外基質，并且可以驅動炎癥修復的第1階段[13]。此外，巨噬細胞還可以通過分泌促血管生成因子和促有絲分裂因子，促進骨痂形成和骨痂重塑。目前研究發現巨噬細胞包含具有促炎功能的M1型和抗炎功能的M2型兩個亞型，在不同組織環境中兩種亞型巨噬細胞可以相互極化，參與并調控骨組織的修復與再生[5]。在骨修復早期，M1型巨噬細胞通過釋放VEGF、TNF、FGF等因子誘導血管周圍細胞募集和尖端細胞內皮分化，以啟動毛細血管芽生成[14]。此外，M1型巨噬細胞可以通過抑制成骨細胞分化和促進成骨細胞凋亡來調控成骨細胞，進而阻礙成骨細胞產生膠原蛋白，促進礦化。M2型巨噬細胞可以通過分泌IL-10、TGF、IL-1和BMP-2等因子抑制破骨細胞活動，同時促進成骨細胞分化和新骨形成[15]。M1、M2型巨噬細胞的平衡對于骨組織代謝動態平衡起著十分重要的作用。免疫系統可以通過M1型和M2型的相互轉換實現對不同骨修復階段的動態調控作用。
3 改變無機生物材料物理特性實現骨修復免疫調控
無機生物材料植入機體后，材料表面與宿主組織直接接觸，必然會引起局部組織的免疫炎癥反應。研究表明可以通過改變無機生物材料孔隙率及孔徑、力學強度、粗糙度和拓撲結構等物理特性，實現骨修復過程中的免疫調控[16]。
3.1 適宜的孔徑和孔隙率調控血管生成
通過調整材料孔隙率和孔徑可調控成骨細胞行為、巨噬細胞極化和免疫反應[17]。無機生物材料具有適宜的微孔徑，可以通過形成內部缺氧微環境，促進巨噬細胞分泌VEGF，進而促進微血管形成[18]。但支架內部孔徑過小會增強局部炎癥反應，導致肉芽組織的形成，完全堵塞微孔，從而在周圍骨細胞和植入物之間形成屏障，阻礙骨修復，最終導致骨組織再生受損和植入失敗[19]。研究顯示無機生物材料孔徑在90～120 μm時，有利于軟骨生成同時抑制血管生成；當孔徑在350 μm時則可以促進成骨和成血管形成[20]。整體而言，在一定范圍內，無機生物材料孔徑越大，越有利于抑制炎癥反應，進而抑制血管生成[21]。此外，較高的孔隙率可以有效促進成骨細胞黏附、生長，形成豐富的細胞外基質，并加強早期生物固定，但同時會降低無機生物材料支架的力學強度[22]。因此，在維持支架適宜力學強度的同時，選用合適的孔隙率以及孔徑可以有效加強支架的免疫調控作用，進而促進骨組織再生。
3.2 表面粗糙度調控巨噬細胞極性轉化
無機生物材料的表面粗糙度直接影響免疫細胞的生物活性因子釋放，進而調控血管新生和干細胞成骨分化。研究發現材料表面粗糙度可以改變附著于表面的免疫細胞形態，進而調節相關促炎因子和趨化因子的產生[22]。Hotchkiss等[17]通過研究不同表面粗糙程度的材料對巨噬細胞活化的影響，發現增加表面粗糙度可以激活整合素-細胞骨架復合體調控巨噬細胞向M2型極化，同時進一步促進IL-4和IL-10的生成；而降低表面粗糙度可以促進巨噬細胞向M1型極化，進而促進IL-1β、IL-6、TNF-α的表達。Zhu等[23]成功利用水熱法制備了具備高表面粗糙度的雙相磷酸鈣生物陶瓷。首先將其修復比格犬長骨骨缺損，結果發現表面粗糙的雙相磷酸鈣生物陶瓷比表面光滑材料具備更好的骨修復能力。然后，將兩種材料與MSCs共培養，體外基因微陣列分析結果表明，表面粗糙的雙相磷酸鈣生物陶瓷能誘導與炎癥相關的基因水平急劇下調，抑制TNF信號通路。上述研究結果均提示增加材料表面粗糙度可以有效調控免疫細胞極化，進而促進骨修復。
3.3 表面拓撲結構調控免疫細胞反應
骨組織的微觀拓撲結構對于骨修復調控起著十分重要的作用。無機生物材料表面拓撲結構可以仿生模擬骨組織天然納米物理結構，實現骨免疫調節作用。通過控制生物材料表面拓撲結構，可以調控局部免疫細胞反應，進而產生局部可控的成骨免疫微環境來調節骨動力學[24]。生物材料的表面拓撲結構排列（無序程度）、尺寸可以對成骨分化產生顯著影響，還可調節免疫細胞延伸、黏附、排列、遷移和分化。越來越多的研究者將選擇具備特定表面拓撲結構的生物材料作為實現骨免疫調節的重要工具之一。隨著生物材料加工技術的不斷發展，研究者通過在生物材料表面構建納米坑、納米柱、納米凹槽、納米管等拓撲結構來調控骨免疫過程，實現骨組織再生[25]。Yang等[26]聯合光熱法和水熱法在羥基磷灰石生物陶瓷表面制備了3種微米級圓形圖案（4、12、36 μm）和納米形貌（納米針、納米片和納米棒），用于研究不同拓撲結構對巨噬細胞的反應。體外研究發現不同的拓撲結構可以減輕或促進巨噬細胞極化，進而影響MSCs成骨分化和臍靜脈內皮細胞的血管生成活性。Neacsu 等[27]研究了納米管在不同條件下對巨噬細胞的體外細胞學行為，發現納米管結構可以通過抑制絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB通路來減少炎癥介質的釋放，減弱巨噬細胞的炎癥反應。不同的表面拓撲結構可以影響不同骨免疫環境，以改善后續成骨活動。因此，在材料表面構建特定的表面拓撲結構，可以為骨修復構建適宜的骨免疫微環境，進而加快骨修復進程。
3.4 力學強度和晶體顆粒大小調控巨噬細胞極性轉化
材料的力學強度或晶體顆粒大小可以影響并調控各類免疫細胞的生物學反應[13]。在低硬度材料表面，骨髓來源巨噬細胞表面標記物CD86的表達上調，細胞內活性氧增加，同時分泌更多的IL-1β和TNF-α，促進巨噬細胞向M1型極化。在高硬度材料表面，骨髓來源巨噬細胞的CD206表達上調更多，活性氧減少，并分泌更多的IL-4和TGF-β，促進巨噬細胞向M2型極化[28]。
除了自身力學性能之外，無機生物材料可以通過調整晶體顆粒大小改變材料自身比表面積，進而影響巨噬細胞的黏附和極化，調控成骨活動以及成血管分化。早期研究發現當磷酸鈣生物陶瓷晶體顆粒粒徑在1 μm左右時，可以明顯促進異位骨化[29]。Davison等[30]采用比格犬肌肉包埋模型研究磷酸鈣生物陶瓷晶體顆粒大小對免疫細胞的影響，發現與粒徑2～4 μm晶體顆粒相比，粒徑為1 μm的晶體顆粒有更多的多核破骨細胞樣細胞聚集。此外，黏附在晶體顆粒粒徑為2～4 μm的生物陶瓷表面的RAW264.7細胞在核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）誘導下，其增殖和分化為多核破骨細胞樣細胞的能力均受到顯著抑制。Li等[31]對比了兩種微米級和亞微米級磷酸鈣生物陶瓷骨免疫調節功能差異。體外研究發現，亞微米級生物材料可以通過激活PI3K/AKT 信號通路調節巨噬細胞向M2型極化，進而促進MSCs成骨分化；體內研究發現，亞微米級生物材料植入體內之后可以募集更多巨噬細胞，并誘導這些巨噬細胞向M2型極化。
4 改變無機生物材料化學特性實現骨修復免疫調控
對無機生物材料表面進行化學修飾，旨在通過與蛋白質等可溶性分子的相互作用，影響免疫細胞的細胞學行為。無機生物材料的化學特性主要包括表面潤濕性、表面電荷、官能團和材料成分。近年來，越來越多的研究通過改變無機生物材料表面的化學特性，提高支架材料自身骨免疫調控特性，進而促進骨修復。
4.1 表面潤濕性調控免疫因子釋放
生物材料的表面潤濕性與蛋白質吸附、血凝塊形成和纖維蛋白形成密切相關[32]。具備不同表面潤濕性的生物材料可以吸附不同類型及數量的蛋白質，高度親水性生物材料通常具有蛋白質抗性，而疏水性生物材料的疏水部分則具備內在的免疫原性[33]。Vishwakarma等[34]評估了生物材料表面潤濕性對材料表面血清衍生蛋白層形成的作用以及對誘導免疫反應的影響，發現親水性羧基表面有利于白蛋白吸附，而疏水性烴表面有利于IgG2吸附。Kakizawa等[35]利用聚氨基酸包覆的二氧化硅納米顆粒研究生物材料物理粒子特性和刺激條件對免疫細胞中細胞因子產生的影響，結果顯示IL-1β和IFN-γ的分泌與聚氨基酸的疏水性程度相關，疏水顆粒可以上調T細胞中IFN-γ表達水平。但也有研究發現提高生物材料表面親水性會降低巨噬細胞的黏附能力，進而抑制TNF-α、MCP-1和IL-1β等多種促炎因子的分泌[36]。因此，有關無機生物材料表面潤濕性對免疫細胞的調節作用，仍需更多研究來確定。
4.2 表面電荷和官能團調控骨免疫過程
無機生物材料表面電荷對免疫細胞具有調控功能。表面的正電粒子可增強免疫細胞相關炎癥通路的激活，負電粒子可調控巨噬細胞的遷移行為，同時抑制相關炎癥反應，促進調節性T細胞表達。Bartneck等[37]研究了表面電荷修飾對巨噬細胞炎癥特征的影響，發現表面正電荷的氨基修飾可以誘導巨噬細胞向M2型極化，表面負電荷的羧基修飾可以誘導巨噬細胞向M1型極化。此外，Neumann等[38]研究了微粒表面電荷對于NLRP3（NOD-like receptor protein 3）炎癥小體的作用，發現與帶負電荷的粒子相比，帶正電荷的粒子可以促進炎癥小體的激活。
此外，生物骨修復材料的表面官能團可以通過影響表面電荷，調節骨免疫過程。生物材料表面的氨基和羥基可以有效提高免疫細胞的浸潤能力，并在體內誘導生物材料周圍形成較厚的纖維包膜[39]。Barbosa等[40]研究了不同表面官能團的急性炎癥反應。結果發現，與表面帶有其他官能團的生物材料相比，表面帶有羥基和羧基的生物材料在植入體內后可以局部誘導更多的炎癥細胞浸潤。Kamath等[39]使用小鼠皮下植入模型評估不同表面官能團對宿主組織反應的影響，發現含有羥基和氨基的生物材料表面出現更厚的纖維囊并伴隨大量炎癥細胞浸潤，而含有氟甲基和羧基的生物材料表面則表現出較低的炎癥/纖維化反應與炎癥細胞浸潤。此外，羥基、氨基和羧基還可不同程度地增強離子、巨噬細胞極化和細胞局部黏附。Keselowsky等[41]用固定密度的單一黏附配體纖維連接蛋白模型系統研究羥基、羧基、氨基對黏著斑組裝和信號傳導的影響，發現羥基能向黏附結構最高程度地募集踝蛋白、α 肌動蛋白、樁蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白。
4.3 構建復合材料實現骨修復免疫調控
隨著骨免疫相關研究的不斷深入，越來越多的研究將無機生物材料與其他成分混合構建復合材料用于骨免疫調控。相比于單一的無機生物材料，復合材料具備更好的生物學特性，應用范圍也更廣。鎂金屬因具有生物降解、生物相容性和骨傳導特性，被認為是骨科與整形外科的革命性金屬。但高降解率會導致過度炎癥反應，限制了其在骨組織工程中的應用。Chen等[14]使用化學浸沒法將β-磷酸三鈣涂覆在鎂金屬支架表面，用于提高支架的骨免疫調節特性。體內研究結果發現該支架可以通過抑制Toll 樣受體信號通路調控巨噬細胞向M2型極化，同時抑制破骨細胞增殖，降低巨噬細胞集落刺激因子和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）的表達。Hung等[42]構建了硅酸鈣陶瓷，研究其是否具有抗破骨細胞生成作用。結果發現在硅濃度>4 mmol/L時，硅以劑量依賴性方式降低RANKL水平，增強TRAP活性，同時硅還可降低RANKL升高的組織蛋白酶K表達，抑制TRAF6介導的NK-κB信號通路激活，進而抑制破骨細胞生成。Chen等[43]比較了雙相磷酸鈣生物陶瓷、磷酸三鈣、羥基磷灰石的骨免疫調節作用。體外研究發現與其他兩種材料相比，雙相磷酸鈣生物陶瓷可以有效提高CD206陽性表達的M2型巨噬細胞比例，上調M2型標記物的表達；體內研究也發現雙相磷酸鈣生物陶瓷可以有效調節局部炎癥反應，促進局部形成適宜骨修復的免疫微環境。在另一項研究中，Shiwaku等[44]比較了不同含量羥基磷灰石的雙相磷酸鈣生物陶瓷對破骨細胞分化的影響。研究結果發現破骨細胞的活性會因羥基磷灰石含量增加而部分受損，但不會因雙相磷酸鈣生物陶瓷支架內微孔的存在而受損。此外，羥基磷灰石含量低的雙相磷酸鈣生物陶瓷有利于鞘氨醇激酶1等正耦合因子的表達。Li等[45]3D打印IFN-γ/硅酸鈣/β-磷酸三鈣復合支架，實現了巨噬細胞的順序極化。早期（1～3 d）釋放IFN-γ刺激巨噬細胞向M1型極化，然后釋放硅誘導巨噬細胞向M2型極化，并促進血管生成，為加速組織工程支架的血管化和成骨提供了新策略。除此之外，無機生物骨修復材料還可以與脫細胞外基質、質粒DNA、小干擾RNA和微小RNA構建復合體系，用于骨免疫調控[46]。
5 結論
骨組織形成、發育、損傷修復以及骨骼重塑等各個階段都受到一系列生物化學信號以及物理信號的精確調控，目前很難在體外模擬整個骨修復過程。近年來，研究者發現免疫細胞在骨組織的動態平衡中扮演著十分重要的角色。隨著相關研究的不斷深入，巨噬細胞作為一類重要的骨免疫細胞引起越來越多研究者的重視。巨噬細胞可以通過釋放相關因子，激活相關信號通路，促進成骨和成血管，進而實現對不同階段骨修復的調控。因此，將免疫細胞作為骨修復過程中的首要目的細胞，利用生物材料驅動免疫細胞構建局部適宜的骨免疫微環境，可能成為組織工程骨修復領域中一個新理論。
近年來，無機生物材料作為一種最常用于骨修復的材料，其骨免疫調節特性受到了越來越多關注。通過改變無機生物材料表面粗糙度、表面潤濕性等理化特性，可以直接調控機體內的免疫細胞，構建適宜的免疫微環境，進而實現動態調控成骨過程。此外，無機生物材料通過與其他成分混合構建復合材料，可以克服其自身固有局限，有效提高其骨免疫調節能力，實現對骨微環境有序可控的免疫調節。
雖然免疫細胞在骨修復過程中扮演著重要角色，但是利用免疫系統實現對骨修復過程的精準把控依然是該領域的難題。如何利用生物材料自身理化特性調控巨噬細胞極化，維持免疫與骨修復的微妙平衡，仍然需要組織工程研究者不斷探索。充分利用免疫與骨修復的眾多共同分子信號靶點實現精準調控可能是一個突破點。此外，目前關于骨免疫調節的相關研究仍集中于巨噬細胞和生物材料相互作用的體內外現象觀察。如何進一步完善無機生物材料、免疫系統、骨骼肌肉系統三者的內在復雜信號通路以及潛在的分子靶點，仍需不斷研究。
利益沖突 在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突；經費支持沒有影響文章觀點及其報道
作者貢獻聲明 邢飛、吳岐佑：撰寫文章；者漫、羅榮：參與文獻收集、整理；項舟：指導綜述構思、觀點形成及文章撰寫；劉明：文章審閱、修改