引用本文： 裴志偉, 王建忠. 原位3D生物打印技術在骨和軟骨損傷修復中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2022, 36(4): 487-494. doi: 10.7507/1002-1892.202111043 復制
由外傷、疾病或腫瘤切除導致的大段骨和軟骨損傷大多超過骨自身愈合能力，需要手術修復重建[1-4]。臨床常用手術方法包括自體/同種異體骨移植、軟骨移植、帶血管蒂骨移植以及關節置換等[5-8]。上述骨、軟骨移植修復方法存在供區組織有限、額外手術損傷、疾病傳播等問題[9-13]，關節置換只適用于晚期軟骨退變且假體價格昂貴[14]。3D生物打印技術是在體外將生物材料、活細胞及其他生物活性物質層層打印構建移植體，有望代替上述修復方法[5, 14-15]。但由于打印的移植體難以完美匹配缺損形狀，植入前需對缺損部位進行額外的外科清創術以適配移植體形狀，以及存在感染風險等問題，限制了該技術在骨科領域的進一步應用發展[16-18]。
鑒于此，學者們提出了原位3D生物打印技術，即基于缺損部位掃描結果，將患者細胞與生物材料、生物活性因子等直接在該部位進行打印，制成的移植體能精確適應目標缺損部位[2, 19]。該技術主要包括打印設備、生物墨水、打印技術等要素[20]。目前，原位3D生物打印技術的研究主要集中于骨、軟骨和皮膚組織損傷等方面，將其臨床轉化還存在諸多問題。現對該技術在骨和軟骨損傷修復方面的研究進展作一綜述，分析未來發展方向，以期為后續研究提供參考。
1 研究文獻檢索
從CNKI、萬方數據、維普、ScienceDirect、Nature、Springer、PubMed、Web of Science等數據庫檢索，以“原位3D生物打印”、“骨修復”、“軟骨修復”、“組織工程”、“In situ 3D bioprinting”、“Bone repair”、“Cartilage repair”、“Tissue engineering”作為關鍵詞，檢索時間為2021年12月26日。共檢索到11 778篇參考文獻，排除與文章主題相關性較差的10 081篇文獻、內容重復的1 609篇文獻、觀點不明確的14篇文獻及無法獲取文獻全文的6篇文獻，最終獲得68篇文獻。
2 研究結果
2.1 原位3D生物打印技術簡介
2.1.1 打印過程
原位3D生物打印過程主要包括3個階段。首先，采用3D掃描儀、CT、MRI和超聲成像等手段采集圖像[8]。然后，將圖像數據導入計算機輔助設計/制造軟件，獲得生物打印機可讀取和處理的文件[12, 21-22]。最后，將患者細胞和生物材料按照規劃的打印路徑在缺損部位打印移植體[23]。
2.1.2 打印模式
原位3D生物打印模式分為手持式及機器人兩種。前者采用可以直接打印的便攜式打印設備，形狀類似注射器，具有尺寸小、便于在缺損內部和周圍移動、易于消毒、成本相對較低的優勢[17]。但由于設備由術者操縱，打印目標形狀完全依賴于術者控制[24-25]，因此該模式難以設計并打印復雜結構移植體，也難以實現多種生物材料打印，僅適用于位置表淺、結構簡單的小缺損。
機器人模式類似于傳統3D生物打印技術，打印的移植體結構由計算機輔助設計，打印時術者只需操控系統控制臺，生物打印單元的運動由三軸便攜式系統驅動[24]。該模式可以較好地解決缺損解剖定位以及復雜組織結構設計的問題。有學者提出將上述兩種模式結合起來，可以更加靈活、有效地打印復雜組織結構移植體[17]。
2.1.3 打印介質
生物墨水被定義為可生物打印的介質，包括生物材料、細胞、功能因子等[26-27]。理想的生物墨水可打印性強，具有高穩定性、不溶于細胞培養基、無毒、無免疫原性，并能促進細胞黏附等特性[28]。
常用的生物材料為藻酸鹽水凝膠、膠原蛋白和透明質酸等有機溶液[12, 14, 29]。其中，藻酸鹽水凝膠具有良好的生物相容性，在紫外線照射下可調節硬度，能形成有利于細胞再生的多孔結構[14]。透明質酸鈉水凝膠可以刺激軟骨細胞代謝、合成軟骨基質成分、抑制炎癥過程等，常用于修復軟骨缺損[30-31]。目前正在開發的新型多材料生物墨水不僅可打印性提高，機械阻力和剛度等特性也得到增強，同時還能添加對細胞行為和組織形成有顯著影響的生物活性成分[32-34]。例如，由聚乙二醇-二丙烯酸酯和變性纖維蛋白原組成的無細胞水凝膠，具有良好的生物相容性、生物降解性、高度水合微環境等[35-37]。此外，可滲透細胞和可注射的明膠水凝膠可以封裝細胞和藥物，作為水凝膠前體溶液直接輸送至缺損部位，并進行原位凝膠化[38-39]。
支架是將生物材料經不同打印技術制成的三維結構框架，其需要模擬天然骨、軟骨等組織的結構，創造類似細胞外基質環境，為細胞和組織提供良好的生存環境，進而誘導和調節細胞附著、增殖、遷移和分化[40-41]。基于此，生物相容性好的生物材料是制備支架的理想選擇[42]，學者們進行了大量研究，從最初的純生物材料支架、復合支架，到近期的負載特定功能細胞和蛋白質的支架[43-44]。目前新興的四維支架是指由形狀記憶聚合物構建、能隨時間和刺激因素改變動態模仿組織結構功能的三維混合支架。其中，形狀記憶聚合物是一種可以根據濕度、溫度、電、磁和光等刺激因素改變自身特性的材 [39, 45]。有研究將BMSCs包裹的溫敏性羥丙基甲殼質水凝膠注入3D打印聚己內酯/納米羥基磷灰石支架中，獲得的復合支架顯示出優異的抗壓強度，并能刺激巨噬細胞分泌血管生成和骨誘導生長因子，創造了有利于血管和骨生成的微環境[32，46]。
2.1.4 打印技術
在選擇適合目標組織和器官的原位3D生物打印技術時，打印分辨率、打印速度和兼容生物墨水材料的數量是需要考慮的關鍵因素[26]。根據打印系統所利用的能量和打印方式，目前打印技術可以分為基于擠壓的生物打印、基于液滴/噴墨的生物打印、激光輔助生物打印、基于還原聚合的生物打印[47]、生物電噴霧和細胞電噴霧生物打印。
① 基于擠壓的生物打印：該技術通過氣動或機械擠壓系統將生物墨水從噴嘴中連續擠出，打印成設計的三維結構[12, 17]。其優點包括沉積和打印速度快以及能獲得多孔結構；缺點為由于分辨率有限，降低了打印介質模擬形狀的能力和形成組織的精度[5, 12]。其中，低溫擠壓打印技術在改善支架多孔結構、生物可降解性和生物活性方面具有優勢[41, 46]，有望成為制造高孔隙率支架的一種候選工具[7]。
② 基于液滴/噴墨的生物打印：該技術是通過熱或聲學方式將生物墨水噴灑至組織缺損處以構建移植體，減少了與組織的直接接觸[39]，通常用于打印組織和器官。該打印方式可以在非水平面進行打印，這對將原位3D生物打印技術用于修復復雜組織損傷具有重要意義。該技術主要缺點是生物墨水必須處于液態，并具有適當黏度，以便從噴嘴小孔中噴出[12]。
③ 激光輔助生物打印：該技術是基于激光誘導正向轉移原理，采用高能激光脈沖使生物墨水薄層中產生高壓氣泡，然后將其噴射到指定位置[2, 12]。該技術的優勢在于無需與打印機直接接觸，避免了機械應力；在手術室無菌環境中，醫生可以指導全自動機器人打印機實現微米到毫米級別的細胞植入[48]，具有分辨率和精度高的優勢，生物墨水可以更準確地打印至缺損部位[2, 48]。但是，打印過程中細胞會暴露于紫外線，可能產生一些負面作用[5, 12]。
④ 基于還原聚合的生物打印：該技術包括立體平版印刷、數字光處理和連續數字光處理，是利用光源（激光束、激光投影或雙光子激光）選擇性地交聯載有細胞的可光固化聚合物溶液[26]。基于光的生物打印比基于擠壓的生物打印更快，分辨率更高[49]，但具有與激光輔助生物打印相似的缺點，光固化反應涉及的紫外線通常對封裝細胞有害[17, 50]。考慮到應用于原位打印，紫外線和可見光需要更強的穿透能力，以實現在組織深處固化打印結構，或必須進行逐層連續曝光[17, 48]。Chen等[51]研發了一種基于數字近紅外線聚合的3D生物打印技術，該技術能夠對組織結構進行無創的原位體內3D生物打印。
⑤ 生物電噴霧和細胞電噴霧生物打印：該技術是利用兩個帶電電極之間的電場來連續排出生物墨水[39]。有學者對它能否進行原位3D生物打印持懷疑態度，因為打印過程中需要使用高電壓。然而，有研究顯示打印時其電流很低，不會對生物墨水和患者缺損周圍組織產生危害，支持其可用于原位3D生物打印[12]。
2.2 原位3D生物打印技術在骨損傷領域的應用
原位3D生物打印技術作為一種新興的組織工程技術，可通過使用天然或合成生物材料在缺損部位直接打印移植體刺激骨再生，可作為骨移植的替代選擇[52-54]。Vidal等[13]的研究通過原位打印預血管化合成骨移植體修復15 mm臨界尺寸兔尺骨缺損，8周后CT和組織學檢查顯示，預血管化合成骨移植體的骨再生率明顯高于不帶血管的人工骨。Kérourédan等[2]通過原位打印人臍靜脈內皮細胞改善了小鼠顱骨缺損中的血管化和骨再生，也從一方面驗證了原位打印預血管化移植體促進骨再生的結論。
此外，原位骨再生迫切需要具有均勻互連孔結構、合適的機械性能、優異的生物相容性，以及更強刺激成骨能力的可生物降解聚合物支架[53]。Ma等[44]采用空氣驅動擠壓3D生物打印技術，開發了一系列具有不同含量聚丙烯的可生物降解哌嗪基聚氨酯尿素支架。首次證實小分子哌嗪具有以劑量依賴方式調節成骨細胞的能力，并且與聚氨酯尿素結合后具有更好的生物相容性和骨傳導性，共同增強了哌嗪基聚氨酯尿素支架的新骨形成能力。Wu等[55]模擬具有高孔隙率的天然木材微/納米結構層次，將3D生物打印技術與水熱工藝相結合，制備了具有微/納米晶須涂層的層次化多孔磷酸鈣陶瓷骨組織工程支架。Zhang等[41]采用低溫原位3D生物打印技術構建負載氧化石墨烯和成骨肽的新型多孔支架修復臨界尺寸骨缺損。體外實驗以及動物體內實驗表明，層次化多孔結構界面是細胞活性和分化的重要調節因素[53]。以上研究中的多層仿生支架展現了良好的骨誘導活性，有利于支架中細胞的存活，是一種具有臨床應用前景的支架生物材料。
然而，臨床上還有很多伴有多種病理改變的骨組織損傷，需要支架負載相應治療藥物，以達到修復缺損同時進行支持治療的目的。為此，Feng等[38]開發了一種獨特的可注射明膠水凝膠，在激素性股骨頭壞死動物模型中，通過原位注射包裹BMSCs和淫羊藿素的可注射水凝膠，有效地防止了骨密度降低并促進了骨形成。該研究首次證明了應用可注射水凝膠作為治療藥物載體的可行性，為后續臨床應用提供了新方向，如可攜帶不同治療藥物和細胞，通過在深層和封閉的解剖位置進行微創手術治療各種臨床疾病。
總的來說，骨再生高度依賴于充足的血管系統，支架植入體內后早期新生的血管能促進細胞增殖、組織向內生長[56]，隨后是骨礦化和再生，而血管浸潤稀少和缺氧常導致移植體中心壞死或表現為纖維包裹的骨整合失敗[57]。上述研究嘗試了預血管化、多層仿生以及負載生物活性成分等多種方法來提高支架生物活性，以抵消合成聚合物所具有的惰性，并創造一個微環境試圖招募、調節局部干細胞，以實現原位血管化骨再生和提高移植體骨整合能力。究其根本，血管內皮細胞和骨形成相關細胞之間交互的微環境可能在血管化骨再生中扮演著重要角色，為此有待進一步構建一種具有生物指導意義的微環境，以促進原位血管化骨再生，從而增強移植體骨整合能力。介導H型血管形成、負載富含生物活性成分的囊泡[58]等可作為研究方向。原位3D生物打印技術在骨損傷領域的應用研究詳見表1。
表1
原位3D生物打印技術在骨損傷領域的應用
Table1.
Application of in-situ 3D bio-printing technology in the field of bone injury
2.3 原位3D生物打印技術在軟骨損傷領域的應用
骨關節炎、衰老和關節創傷導致的軟骨損傷，是關節疼痛和慢性致殘的主要原因[30, 59]。而成熟軟骨損傷相較于骨損傷因缺乏血管、神經和淋巴管供應，常難以自然愈合[60-62]。目前，關節鏡手術、軟骨細胞移植、自體骨軟骨移植和鑲嵌成形術是治療國際軟骨修復協會軟骨損傷分級系統（ICRS）Ⅲ～Ⅳ級軟骨缺損的常用方法[49, 59]。然而對于晚期軟骨退變，由于受到供區并發癥發生率高、宿主結合不良，以及再生組織為纖維軟骨而不是透明軟骨等限制[63]，關節置換術是主要治療方法[35]，但存在高度侵入性、手術復雜和費用較高等不足[14]。
軟骨組織工程為骨關節炎或創傷損傷的關節軟骨再生提供了新的選擇[59-60, 62]。如Gatenholm等[64]通過3D掃描儀掃描人工全膝關節置換術中取出的有軟骨缺損的骨關節炎脛骨平臺，使用含人軟骨細胞的打印介質對缺損部位進行原位打印，觀察到良好的軟骨細胞分化現象，為軟骨組織工程用于軟骨缺損或早期骨關節炎的治療提供了有力證據。不過軟骨功能的發揮依賴于細胞外基質的雙相性質[15, 35]，結構復雜難以模擬。為此，3D打印混合軟骨結構多采用疏水聚己內酯（用于結構支持）和高度親水的浸漬細胞海藻酸鹽水凝膠（水合和生物功能）模擬關節軟骨細胞外基質的雙相性質，動物實驗證明該3D打印混合軟骨結構移植體能維持細胞活力始終在70%以上，軟骨特異性細胞外基質分泌隨時間延長顯著增加[22]。
原位3D生物打印技術的一個重要挑戰是維持活細胞活力、生長因子敏感性和生物活性物質的活性[61- 62]。Ma等[24]發明了一種手持式3D打印設備（Biopen），它可以將生物支架和培養細胞同時直接擠壓至軟骨缺損處。Biopen允許以手動、直寫方式同時同軸沉積活細胞和生物材料[39]。同軸策略是指在空間上劃分了一個有利于適當硬度要求的固相和一個黏性液相，通過將在固相內發生交聯反應的細胞毒性化學副產物與來自液相的細胞分離，提高細胞的生存能力[40, 61]。同時，Duchi等[19]研究表明，同軸擠出有利于在高強度紫外線照射下快速光交聯，從而沉積出含活細胞的明膠微球/羥基磷灰石水凝膠，進而原位打印出可行生物合成的軟骨修復結構。此外，該研究首次將核/殼沉積原理與原位打印應用于臨床肌肉骨骼組織如軟骨的修復，從而減少手術前基于實驗室生物制造的耗時步驟[50]。
然而當使用單一支架時，隨著水凝膠降解，結構完整性喪失，這可能損害包裹的細胞，并損傷周圍軟骨組織，不利于將原位打印用于治療局部組織缺損[61, 65]。為了克服上述缺點，Zhu等[61]研究了一種基于混合支架的微創方法，該支架包含一種緩慢降解并能提供支撐的臨時結構，填充在該結構中的軟骨細胞負載水凝膠促進新組織形成。Aisenbrey等[49]的研究選擇立體平版印刷3D打印制造三維支撐結構，選擇由光聚合反應制備的聚乙二醇水凝膠作為負載細胞的水凝膠，選取豬膝關節軟骨缺損模型進行實驗，4周后用混合支架處理的軟骨缺損附近區域硫酸化糖胺聚糖保留率高。
多項研究表明，軟骨下骨同時再生對于骨軟骨缺損修復非常重要，因為它可以為軟骨提供機械支撐[63]。然而，到目前為止，實現兩種不同組織同時再生仍然是一個挑戰。Shen等[59]提出了一種結合大孔纖維蛋白和硅灰石（含8%氧化鎂）的雙相支架，分別用于軟骨和軟骨下骨的再生，而不涉及其他生物活性分子。體外及動物體內實驗證明，無論是否加載BMSCs都可以在很大程度上誘導軟骨和軟骨下骨的再生。因此，雙相支架具有很好的應用前景，特別是通過進一步優化結構，如在兩層之間構建梯度層，以及通過一些生物活性肽或細胞生長因子對其進行功能化處理，以誘導細胞侵襲和在支架內優先分化，從而在骨軟骨再生中發揮更加積極的作用。
相較于骨組織而言，軟骨損傷因缺乏血管、神經和淋巴管供應，往往對修復材料的特性要求更復雜。既往研究中將同軸沉積打印和負載生物活性因子的混合、雙相支架用于軟骨損傷修復，展現出了可喜的結果[66-67]。近年來，研究表明多孔結構支架表面能增強營養運輸、細胞滲透、細胞黏附和支持細胞增殖，進而支持軟骨組織形成[68]。因此，有必要進一步將多孔結構支架進行適當表面修飾，通過促進營養供應、細胞黏附、細胞擴散和軟骨形成分化來增強支架的生物活性。上述所涉及到的原位3D生物打印技術在軟骨損傷領域的具體應用研究詳見表2。
表2
原位3D生物打印技術在軟骨損傷領域的應用
Table2.
Application of in-situ 3D bio-printing technology in the field of cartilage injury
3 總結與展望
作為一種新興的組織工程技術，憑借體內微環境比體外含有更多信號分子，原位3D生物打印移植體的成熟性、功能和整合性比體外構建組織更好。當前研究主要通過預血管化，調整生物墨水組成，改善支架結構、打印方式，負載藥物、細胞和生物活性因子等方式來促進骨和軟骨組織損傷修復。上述方法的有效性在體外及動物實驗中得到證實，但臨床轉化應用有待進一步研究。
迄今為止，相關研究已驗證了原位3D生物打印技術的可行性和實用性，采用該技術構建的移植體有望解決移植組織和器官短缺問題，以及患者對實時設計的新組織和器官的特定需求，其在臨床上的應用可能會提高預后、縮短恢復時間和住院時間，減少感染發生。未來需要不斷開發和優化適應于原位打印的生物墨水和生物打印機，進一步驗證其生物相容性、裝置的安全性和無菌性，以及盡可能減少需術者控制的打印參數，以增強打印單元的穩定性、一致性和打印結構的可重復性，確保打印精度和手術質量。并且在原位3D生物打印中使用刺激響應生物墨水，可能會再現組織的自然形態和結構變化。此外，機器人技術、融合成像和計算機輔助醫療干預也可用于臨床原位3D生物打印過程，以進一步提升打印效果。
利益沖突 在文章撰寫過程中不存在利益沖突
作者貢獻聲明 裴志偉：查閱文獻、整理數據和論文撰寫；王建忠：文章審閱并參與觀點形成，對文章修改提出建設性意見
由外傷、疾病或腫瘤切除導致的大段骨和軟骨損傷大多超過骨自身愈合能力，需要手術修復重建[1-4]。臨床常用手術方法包括自體/同種異體骨移植、軟骨移植、帶血管蒂骨移植以及關節置換等[5-8]。上述骨、軟骨移植修復方法存在供區組織有限、額外手術損傷、疾病傳播等問題[9-13]，關節置換只適用于晚期軟骨退變且假體價格昂貴[14]。3D生物打印技術是在體外將生物材料、活細胞及其他生物活性物質層層打印構建移植體，有望代替上述修復方法[5, 14-15]。但由于打印的移植體難以完美匹配缺損形狀，植入前需對缺損部位進行額外的外科清創術以適配移植體形狀，以及存在感染風險等問題，限制了該技術在骨科領域的進一步應用發展[16-18]。
鑒于此，學者們提出了原位3D生物打印技術，即基于缺損部位掃描結果，將患者細胞與生物材料、生物活性因子等直接在該部位進行打印，制成的移植體能精確適應目標缺損部位[2, 19]。該技術主要包括打印設備、生物墨水、打印技術等要素[20]。目前，原位3D生物打印技術的研究主要集中于骨、軟骨和皮膚組織損傷等方面，將其臨床轉化還存在諸多問題。現對該技術在骨和軟骨損傷修復方面的研究進展作一綜述，分析未來發展方向，以期為后續研究提供參考。
1 研究文獻檢索
從CNKI、萬方數據、維普、ScienceDirect、Nature、Springer、PubMed、Web of Science等數據庫檢索，以“原位3D生物打印”、“骨修復”、“軟骨修復”、“組織工程”、“In situ 3D bioprinting”、“Bone repair”、“Cartilage repair”、“Tissue engineering”作為關鍵詞，檢索時間為2021年12月26日。共檢索到11 778篇參考文獻，排除與文章主題相關性較差的10 081篇文獻、內容重復的1 609篇文獻、觀點不明確的14篇文獻及無法獲取文獻全文的6篇文獻，最終獲得68篇文獻。
2 研究結果
2.1 原位3D生物打印技術簡介
2.1.1 打印過程
原位3D生物打印過程主要包括3個階段。首先，采用3D掃描儀、CT、MRI和超聲成像等手段采集圖像[8]。然后，將圖像數據導入計算機輔助設計/制造軟件，獲得生物打印機可讀取和處理的文件[12, 21-22]。最后，將患者細胞和生物材料按照規劃的打印路徑在缺損部位打印移植體[23]。
2.1.2 打印模式
原位3D生物打印模式分為手持式及機器人兩種。前者采用可以直接打印的便攜式打印設備，形狀類似注射器，具有尺寸小、便于在缺損內部和周圍移動、易于消毒、成本相對較低的優勢[17]。但由于設備由術者操縱，打印目標形狀完全依賴于術者控制[24-25]，因此該模式難以設計并打印復雜結構移植體，也難以實現多種生物材料打印，僅適用于位置表淺、結構簡單的小缺損。
機器人模式類似于傳統3D生物打印技術，打印的移植體結構由計算機輔助設計，打印時術者只需操控系統控制臺，生物打印單元的運動由三軸便攜式系統驅動[24]。該模式可以較好地解決缺損解剖定位以及復雜組織結構設計的問題。有學者提出將上述兩種模式結合起來，可以更加靈活、有效地打印復雜組織結構移植體[17]。
2.1.3 打印介質
生物墨水被定義為可生物打印的介質，包括生物材料、細胞、功能因子等[26-27]。理想的生物墨水可打印性強，具有高穩定性、不溶于細胞培養基、無毒、無免疫原性，并能促進細胞黏附等特性[28]。
常用的生物材料為藻酸鹽水凝膠、膠原蛋白和透明質酸等有機溶液[12, 14, 29]。其中，藻酸鹽水凝膠具有良好的生物相容性，在紫外線照射下可調節硬度，能形成有利于細胞再生的多孔結構[14]。透明質酸鈉水凝膠可以刺激軟骨細胞代謝、合成軟骨基質成分、抑制炎癥過程等，常用于修復軟骨缺損[30-31]。目前正在開發的新型多材料生物墨水不僅可打印性提高，機械阻力和剛度等特性也得到增強，同時還能添加對細胞行為和組織形成有顯著影響的生物活性成分[32-34]。例如，由聚乙二醇-二丙烯酸酯和變性纖維蛋白原組成的無細胞水凝膠，具有良好的生物相容性、生物降解性、高度水合微環境等[35-37]。此外，可滲透細胞和可注射的明膠水凝膠可以封裝細胞和藥物，作為水凝膠前體溶液直接輸送至缺損部位，并進行原位凝膠化[38-39]。
支架是將生物材料經不同打印技術制成的三維結構框架，其需要模擬天然骨、軟骨等組織的結構，創造類似細胞外基質環境，為細胞和組織提供良好的生存環境，進而誘導和調節細胞附著、增殖、遷移和分化[40-41]。基于此，生物相容性好的生物材料是制備支架的理想選擇[42]，學者們進行了大量研究，從最初的純生物材料支架、復合支架，到近期的負載特定功能細胞和蛋白質的支架[43-44]。目前新興的四維支架是指由形狀記憶聚合物構建、能隨時間和刺激因素改變動態模仿組織結構功能的三維混合支架。其中，形狀記憶聚合物是一種可以根據濕度、溫度、電、磁和光等刺激因素改變自身特性的材 [39, 45]。有研究將BMSCs包裹的溫敏性羥丙基甲殼質水凝膠注入3D打印聚己內酯/納米羥基磷灰石支架中，獲得的復合支架顯示出優異的抗壓強度，并能刺激巨噬細胞分泌血管生成和骨誘導生長因子，創造了有利于血管和骨生成的微環境[32，46]。
2.1.4 打印技術
在選擇適合目標組織和器官的原位3D生物打印技術時，打印分辨率、打印速度和兼容生物墨水材料的數量是需要考慮的關鍵因素[26]。根據打印系統所利用的能量和打印方式，目前打印技術可以分為基于擠壓的生物打印、基于液滴/噴墨的生物打印、激光輔助生物打印、基于還原聚合的生物打印[47]、生物電噴霧和細胞電噴霧生物打印。
① 基于擠壓的生物打印：該技術通過氣動或機械擠壓系統將生物墨水從噴嘴中連續擠出，打印成設計的三維結構[12, 17]。其優點包括沉積和打印速度快以及能獲得多孔結構；缺點為由于分辨率有限，降低了打印介質模擬形狀的能力和形成組織的精度[5, 12]。其中，低溫擠壓打印技術在改善支架多孔結構、生物可降解性和生物活性方面具有優勢[41, 46]，有望成為制造高孔隙率支架的一種候選工具[7]。
② 基于液滴/噴墨的生物打印：該技術是通過熱或聲學方式將生物墨水噴灑至組織缺損處以構建移植體，減少了與組織的直接接觸[39]，通常用于打印組織和器官。該打印方式可以在非水平面進行打印，這對將原位3D生物打印技術用于修復復雜組織損傷具有重要意義。該技術主要缺點是生物墨水必須處于液態，并具有適當黏度，以便從噴嘴小孔中噴出[12]。
③ 激光輔助生物打印：該技術是基于激光誘導正向轉移原理，采用高能激光脈沖使生物墨水薄層中產生高壓氣泡，然后將其噴射到指定位置[2, 12]。該技術的優勢在于無需與打印機直接接觸，避免了機械應力；在手術室無菌環境中，醫生可以指導全自動機器人打印機實現微米到毫米級別的細胞植入[48]，具有分辨率和精度高的優勢，生物墨水可以更準確地打印至缺損部位[2, 48]。但是，打印過程中細胞會暴露于紫外線，可能產生一些負面作用[5, 12]。
④ 基于還原聚合的生物打印：該技術包括立體平版印刷、數字光處理和連續數字光處理，是利用光源（激光束、激光投影或雙光子激光）選擇性地交聯載有細胞的可光固化聚合物溶液[26]。基于光的生物打印比基于擠壓的生物打印更快，分辨率更高[49]，但具有與激光輔助生物打印相似的缺點，光固化反應涉及的紫外線通常對封裝細胞有害[17, 50]。考慮到應用于原位打印，紫外線和可見光需要更強的穿透能力，以實現在組織深處固化打印結構，或必須進行逐層連續曝光[17, 48]。Chen等[51]研發了一種基于數字近紅外線聚合的3D生物打印技術，該技術能夠對組織結構進行無創的原位體內3D生物打印。
⑤ 生物電噴霧和細胞電噴霧生物打印：該技術是利用兩個帶電電極之間的電場來連續排出生物墨水[39]。有學者對它能否進行原位3D生物打印持懷疑態度，因為打印過程中需要使用高電壓。然而，有研究顯示打印時其電流很低，不會對生物墨水和患者缺損周圍組織產生危害，支持其可用于原位3D生物打印[12]。
2.2 原位3D生物打印技術在骨損傷領域的應用
原位3D生物打印技術作為一種新興的組織工程技術，可通過使用天然或合成生物材料在缺損部位直接打印移植體刺激骨再生，可作為骨移植的替代選擇[52-54]。Vidal等[13]的研究通過原位打印預血管化合成骨移植體修復15 mm臨界尺寸兔尺骨缺損，8周后CT和組織學檢查顯示，預血管化合成骨移植體的骨再生率明顯高于不帶血管的人工骨。Kérourédan等[2]通過原位打印人臍靜脈內皮細胞改善了小鼠顱骨缺損中的血管化和骨再生，也從一方面驗證了原位打印預血管化移植體促進骨再生的結論。
此外，原位骨再生迫切需要具有均勻互連孔結構、合適的機械性能、優異的生物相容性，以及更強刺激成骨能力的可生物降解聚合物支架[53]。Ma等[44]采用空氣驅動擠壓3D生物打印技術，開發了一系列具有不同含量聚丙烯的可生物降解哌嗪基聚氨酯尿素支架。首次證實小分子哌嗪具有以劑量依賴方式調節成骨細胞的能力，并且與聚氨酯尿素結合后具有更好的生物相容性和骨傳導性，共同增強了哌嗪基聚氨酯尿素支架的新骨形成能力。Wu等[55]模擬具有高孔隙率的天然木材微/納米結構層次，將3D生物打印技術與水熱工藝相結合，制備了具有微/納米晶須涂層的層次化多孔磷酸鈣陶瓷骨組織工程支架。Zhang等[41]采用低溫原位3D生物打印技術構建負載氧化石墨烯和成骨肽的新型多孔支架修復臨界尺寸骨缺損。體外實驗以及動物體內實驗表明，層次化多孔結構界面是細胞活性和分化的重要調節因素[53]。以上研究中的多層仿生支架展現了良好的骨誘導活性，有利于支架中細胞的存活，是一種具有臨床應用前景的支架生物材料。
然而，臨床上還有很多伴有多種病理改變的骨組織損傷，需要支架負載相應治療藥物，以達到修復缺損同時進行支持治療的目的。為此，Feng等[38]開發了一種獨特的可注射明膠水凝膠，在激素性股骨頭壞死動物模型中，通過原位注射包裹BMSCs和淫羊藿素的可注射水凝膠，有效地防止了骨密度降低并促進了骨形成。該研究首次證明了應用可注射水凝膠作為治療藥物載體的可行性，為后續臨床應用提供了新方向，如可攜帶不同治療藥物和細胞，通過在深層和封閉的解剖位置進行微創手術治療各種臨床疾病。
總的來說，骨再生高度依賴于充足的血管系統，支架植入體內后早期新生的血管能促進細胞增殖、組織向內生長[56]，隨后是骨礦化和再生，而血管浸潤稀少和缺氧常導致移植體中心壞死或表現為纖維包裹的骨整合失敗[57]。上述研究嘗試了預血管化、多層仿生以及負載生物活性成分等多種方法來提高支架生物活性，以抵消合成聚合物所具有的惰性，并創造一個微環境試圖招募、調節局部干細胞，以實現原位血管化骨再生和提高移植體骨整合能力。究其根本，血管內皮細胞和骨形成相關細胞之間交互的微環境可能在血管化骨再生中扮演著重要角色，為此有待進一步構建一種具有生物指導意義的微環境，以促進原位血管化骨再生，從而增強移植體骨整合能力。介導H型血管形成、負載富含生物活性成分的囊泡[58]等可作為研究方向。原位3D生物打印技術在骨損傷領域的應用研究詳見表1。
表1
原位3D生物打印技術在骨損傷領域的應用
Table1.
Application of in-situ 3D bio-printing technology in the field of bone injury
2.3 原位3D生物打印技術在軟骨損傷領域的應用
骨關節炎、衰老和關節創傷導致的軟骨損傷，是關節疼痛和慢性致殘的主要原因[30, 59]。而成熟軟骨損傷相較于骨損傷因缺乏血管、神經和淋巴管供應，常難以自然愈合[60-62]。目前，關節鏡手術、軟骨細胞移植、自體骨軟骨移植和鑲嵌成形術是治療國際軟骨修復協會軟骨損傷分級系統（ICRS）Ⅲ～Ⅳ級軟骨缺損的常用方法[49, 59]。然而對于晚期軟骨退變，由于受到供區并發癥發生率高、宿主結合不良，以及再生組織為纖維軟骨而不是透明軟骨等限制[63]，關節置換術是主要治療方法[35]，但存在高度侵入性、手術復雜和費用較高等不足[14]。
軟骨組織工程為骨關節炎或創傷損傷的關節軟骨再生提供了新的選擇[59-60, 62]。如Gatenholm等[64]通過3D掃描儀掃描人工全膝關節置換術中取出的有軟骨缺損的骨關節炎脛骨平臺，使用含人軟骨細胞的打印介質對缺損部位進行原位打印，觀察到良好的軟骨細胞分化現象，為軟骨組織工程用于軟骨缺損或早期骨關節炎的治療提供了有力證據。不過軟骨功能的發揮依賴于細胞外基質的雙相性質[15, 35]，結構復雜難以模擬。為此，3D打印混合軟骨結構多采用疏水聚己內酯（用于結構支持）和高度親水的浸漬細胞海藻酸鹽水凝膠（水合和生物功能）模擬關節軟骨細胞外基質的雙相性質，動物實驗證明該3D打印混合軟骨結構移植體能維持細胞活力始終在70%以上，軟骨特異性細胞外基質分泌隨時間延長顯著增加[22]。
原位3D生物打印技術的一個重要挑戰是維持活細胞活力、生長因子敏感性和生物活性物質的活性[61- 62]。Ma等[24]發明了一種手持式3D打印設備（Biopen），它可以將生物支架和培養細胞同時直接擠壓至軟骨缺損處。Biopen允許以手動、直寫方式同時同軸沉積活細胞和生物材料[39]。同軸策略是指在空間上劃分了一個有利于適當硬度要求的固相和一個黏性液相，通過將在固相內發生交聯反應的細胞毒性化學副產物與來自液相的細胞分離，提高細胞的生存能力[40, 61]。同時，Duchi等[19]研究表明，同軸擠出有利于在高強度紫外線照射下快速光交聯，從而沉積出含活細胞的明膠微球/羥基磷灰石水凝膠，進而原位打印出可行生物合成的軟骨修復結構。此外，該研究首次將核/殼沉積原理與原位打印應用于臨床肌肉骨骼組織如軟骨的修復，從而減少手術前基于實驗室生物制造的耗時步驟[50]。
然而當使用單一支架時，隨著水凝膠降解，結構完整性喪失，這可能損害包裹的細胞，并損傷周圍軟骨組織，不利于將原位打印用于治療局部組織缺損[61, 65]。為了克服上述缺點，Zhu等[61]研究了一種基于混合支架的微創方法，該支架包含一種緩慢降解并能提供支撐的臨時結構，填充在該結構中的軟骨細胞負載水凝膠促進新組織形成。Aisenbrey等[49]的研究選擇立體平版印刷3D打印制造三維支撐結構，選擇由光聚合反應制備的聚乙二醇水凝膠作為負載細胞的水凝膠，選取豬膝關節軟骨缺損模型進行實驗，4周后用混合支架處理的軟骨缺損附近區域硫酸化糖胺聚糖保留率高。
多項研究表明，軟骨下骨同時再生對于骨軟骨缺損修復非常重要，因為它可以為軟骨提供機械支撐[63]。然而，到目前為止，實現兩種不同組織同時再生仍然是一個挑戰。Shen等[59]提出了一種結合大孔纖維蛋白和硅灰石（含8%氧化鎂）的雙相支架，分別用于軟骨和軟骨下骨的再生，而不涉及其他生物活性分子。體外及動物體內實驗證明，無論是否加載BMSCs都可以在很大程度上誘導軟骨和軟骨下骨的再生。因此，雙相支架具有很好的應用前景，特別是通過進一步優化結構，如在兩層之間構建梯度層，以及通過一些生物活性肽或細胞生長因子對其進行功能化處理，以誘導細胞侵襲和在支架內優先分化，從而在骨軟骨再生中發揮更加積極的作用。
相較于骨組織而言，軟骨損傷因缺乏血管、神經和淋巴管供應，往往對修復材料的特性要求更復雜。既往研究中將同軸沉積打印和負載生物活性因子的混合、雙相支架用于軟骨損傷修復，展現出了可喜的結果[66-67]。近年來，研究表明多孔結構支架表面能增強營養運輸、細胞滲透、細胞黏附和支持細胞增殖，進而支持軟骨組織形成[68]。因此，有必要進一步將多孔結構支架進行適當表面修飾，通過促進營養供應、細胞黏附、細胞擴散和軟骨形成分化來增強支架的生物活性。上述所涉及到的原位3D生物打印技術在軟骨損傷領域的具體應用研究詳見表2。
表2
原位3D生物打印技術在軟骨損傷領域的應用
Table2.
Application of in-situ 3D bio-printing technology in the field of cartilage injury
3 總結與展望
作為一種新興的組織工程技術，憑借體內微環境比體外含有更多信號分子，原位3D生物打印移植體的成熟性、功能和整合性比體外構建組織更好。當前研究主要通過預血管化，調整生物墨水組成，改善支架結構、打印方式，負載藥物、細胞和生物活性因子等方式來促進骨和軟骨組織損傷修復。上述方法的有效性在體外及動物實驗中得到證實，但臨床轉化應用有待進一步研究。
迄今為止，相關研究已驗證了原位3D生物打印技術的可行性和實用性，采用該技術構建的移植體有望解決移植組織和器官短缺問題，以及患者對實時設計的新組織和器官的特定需求，其在臨床上的應用可能會提高預后、縮短恢復時間和住院時間，減少感染發生。未來需要不斷開發和優化適應于原位打印的生物墨水和生物打印機，進一步驗證其生物相容性、裝置的安全性和無菌性，以及盡可能減少需術者控制的打印參數，以增強打印單元的穩定性、一致性和打印結構的可重復性，確保打印精度和手術質量。并且在原位3D生物打印中使用刺激響應生物墨水，可能會再現組織的自然形態和結構變化。此外，機器人技術、融合成像和計算機輔助醫療干預也可用于臨床原位3D生物打印過程，以進一步提升打印效果。
利益沖突 在文章撰寫過程中不存在利益沖突
作者貢獻聲明 裴志偉：查閱文獻、整理數據和論文撰寫；王建忠：文章審閱并參與觀點形成，對文章修改提出建設性意見
