引用本文： 李永偉, 周俊鵬, 胡書剛, 王家麟, 王坤正, 王偉. 提高水凝膠機械性能的方法及其在骨組織工程中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(12): 1615-1622. doi: 10.7507/1002-1892.202107053 復制
創傷、感染、腫瘤等導致的骨缺損修復是目前研究熱點，如缺損超過自身愈合能力，則需要填充自體或者同種異體組織，以促進骨愈合[1-3]。自體骨移植是臨床治療骨缺損的金標準，但存在骨來源有限及供骨區并發癥等問題，臨床應用受到限制[4-5]。因此，骨移植替代物成為骨缺損修復的理想選擇。理想的骨移植替代物應具備良好的成骨誘導和血管生成能力、良好的生物相容性、形狀和大小可控、保質期長、成本低等特點[6]。
目前，骨移植替代物主要包括同種異體骨、異種骨、金屬及陶瓷材料等。與其他骨移植替代物相比，水凝膠具有類骨細胞外基質的多孔結構、良好生物相容性的優點，而且形狀、大小可控，能匹配不規則骨缺損，有望成為骨缺損修復材料[7-8]。然而普通水凝膠機械性能較差，對于負重骨而言，如修復材料機械性能較差，修復缺損后容易變形，無法發揮早期支撐作用。而且，研究表明與骨機械性能匹配的生物材料還有利于骨細胞增殖及礦化，發揮良好的骨傳導和骨誘導作用[9]。因此，提高水凝膠機械性能是改善其修復骨缺損效果的關鍵因素。目前，有研究通過構建雙網絡結構、復合納米無機粒子、引入導電材料及增強纖維網絡等方法來提高水凝膠機械性能（表1）。現對上述方法及其制備的水凝膠骨修復效果進行總結，為后續采用高機械性能水凝膠修復骨缺損提供思路。
表1
提高水凝膠機械性能的方法
Table1.
The methods of improving the mechanical properties of hydrogels
1 雙網絡水凝膠
雙網絡水凝膠是由兩種不同性質聚合物形成的互穿網絡[10]，兩個網絡性質存在顯著差異，一種為交聯密度較高的聚電解質網絡結構（剛而脆），另一種為松散交聯的中性網絡結構（軟而韌）。聚電解質網絡結構為雙網絡水凝膠提供了“犧牲鍵”，起到分散外界應力的作用；而柔性的中性網絡結構填補于聚電解質網絡結構中，為雙網絡水凝膠提供了支架，保持水凝膠外形。相比于單一網絡水凝膠，雙網絡水凝膠機械性能和韌性均顯著提高[11]。因此，雙網絡水凝膠被廣泛用于骨組織工程研究。
Zhang等[12]通過對甲基丙烯酰基明膠、硫醇化殼聚糖和改性的多面體低聚倍半硅氧烷納米粒子進行光交聯，然后將活性鎂離子通過鎂的配位鍵引入系統中，成功制備了一種摻入鎂離子的雙網絡水凝膠。該水凝膠的抗壓性能和拉伸性能較單一網絡水凝膠明顯提高，能有效促進BMSCs增殖和成骨分化，促進大鼠顱骨缺損的修復。Li等[13]以陰離子多糖結冷膠為第1網絡，存在交聯劑的可聚合單體作為第2網絡，通過一步混合法制備了雙網絡水凝膠，并將2-甲基丙烯酰胺乙基磷酸二氫的單體引入到第2網絡中。該水凝膠表現出了良好的壓縮性能和流變特性，能有效促進小鼠成骨細胞系MC3T3-E1細胞的骨礦化。Xu等[14]采用雙交聯法制備了結構和機械性能可調的新型多孔聚乙烯醇/海藻酸鈉/羥基磷灰石復合水凝膠，通過調整各成分比例，提高了水凝膠的彈性模量，有效促進MC3T3-E1細胞成骨分化，但是其壓縮模量與動物、人骨組織相比仍存在差距。Bi等[15]將醫用級聚乙烯醇與殼聚糖在氫氧化鉀/尿素溶解體系中進行物理交聯，構建了新型雙網絡水凝膠。該水凝膠顯示出高抗壓性能，有效促進了兔骨缺損修復，具有作為骨修復材料的潛力。
2 納米無機粒子復合水凝膠
Haraguchi等[11]將“新型納米復合材料”概念擴展到水凝膠領域，并于2002年首次報道成功制備具有獨特有機-無機網絡結構的新型“納米復合水凝膠”，其具有優異機械特性，被廣泛應用于骨組織工程。
2.1 納米生物陶瓷復合水凝膠
生物陶瓷在生物降解性、生物相容性和生物力學特性方面有著獨特優勢，是骨再生和骨修復的重要材料[16]，分為無機磷酸鹽類陶瓷和生物活性玻璃兩類，已被廣泛用于骨組織工程研究。加入納米生物陶瓷可以增強水凝膠機械性能，從而增加水凝膠骨修復效果。
目前，骨組織工程研究最廣泛的無機磷酸鹽類陶瓷為磷酸鈣類，包括羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、β-磷酸三鈣（β-tricalciumphosphate，β-TCP）以及它們的混合物雙向磷酸鈣（biphasic calcium phosphate，BCP）。HA構成了骨骼的無機相（約占無機相的65%），是所有磷酸鹽分子中生物相容性最強的物質之一，因此可以作為骨移植替代物用于骨修復。HA的加入可以有效提高水凝膠機械性能，隨著納米HA逐漸降解，鈣離子和磷酸鹽離子被釋放，這兩種離子能夠在微環境中調節細胞行為，調節骨骼礦化過程并與周圍組織結合，從而促進成骨分化。Wang等[17]利用紫外光交聯技術開發了一種新型明膠甲基丙烯胺-聚（乙二醇）二丙烯酸酯-納米HA復合水凝膠支架，隨著納米HA含量提高，該水凝膠在40%形變情況下，壓縮應力可以達到約300 kPa；同時，該水凝膠表現出良好的生物相容性。Liu等[18]的研究利用多巴胺修飾納米HA，形成聚多巴胺修飾的納米HA，然后將該物質引入氧化海藻酸鈉和明膠的席夫堿反應中，在溫和條件下制備了可注射骨修復水凝膠。由于納米HA的引入，該水凝膠的抗壓強度在80%形變時可達到約0.5 MPa，大大提高了其修復兔股骨髁缺損的能力。β-TCP和BCP也是增強水凝膠機械性能的材料。Nie等[19]將殼聚糖/明膠水凝膠與BCP納米顆粒（BCP-nano-particles，BCP-NPs）結合在一起，制備了復合水凝膠。隨著BCP-NPs含量增加，復合水凝膠的抗壓強度可高達2.5 MPa，非常接近骨組織應力參數；與低BCP-NPs含量復合水凝膠相比，高BCP-NPs含量復合水凝膠更好地促進了BMSCs中ALP的生成，植入兔股骨頭壞死病灶后可見更多新生骨生成。Sen等[20]將瓊脂糖和瓊脂糖-膠原水凝膠與不同比例的β-TCP包埋顆粒相結合，得到不同性能的復合水凝膠；隨著β-TCP比例的增加，復合水凝膠壓力切線模量可達近300 kPa，機械性能較普通水凝膠明顯改善，并在體外有效促進人BMSCs增殖及成骨分化。
與無機磷酸鹽類陶瓷相比，生物活性玻璃無論是在生理溶液中，還是在體內，均表現出較快的磷灰石生成能力，可以有效改善細胞黏附，促進成骨細胞增殖、分化及礦化[21]。研究表明，添加生物活性玻璃可以有效增強水凝膠抗壓性能和楊氏模量，從而促進成骨相關細胞成骨分化[22]。Ye等[21]制備了生物活性玻璃-明膠-海藻酸鹽水凝膠支架用于骨缺損修復，隨著生物活性玻璃比例的增加，該水凝膠支架的抗壓強度從1 MPa增加至2.5 MPa，并有效地促進了大鼠BMSCs的黏附和成骨分化。Killion等[22]通過光聚合開發了生物活性玻璃與聚乙二醇的復合水凝膠，隨著生物活性玻璃含量的增加，復合水凝膠的楊氏模量逐漸增加，可高達8～9 MPa，壓縮應力高達2～3 MPa。但該研究缺乏體內外相關生物學實驗，無法判斷其骨修復效果。Wu等[23]采用熱觸發方式制備的可注射殼聚糖/絲素蛋白/生物活性玻璃納米顆粒水凝膠，能夠顯著促進小鼠 MC3T3-E1細胞成骨和成血管分化，并在體內實驗中顯示出改善骨缺損修復的作用，提示生物活性玻璃的加入提高了水凝膠機械性能，利于BMSCs成骨分化和骨缺損修復。
上述研究表明在水凝膠中加入納米生物陶瓷是增強水凝膠機械性能，提高水凝膠骨修復效果的有效選擇方案。
2.2 納米黏土基水凝膠
納米黏土顆粒及其復合材料為生物材料的設計和再生醫學的發展提供了新思路[24]。與其他納米顆粒材料相比，納米黏土顆粒在較高濃度時仍具有良好的生物相容性[25]；同時降解產物不僅無毒性，而且有利于成骨分化[26]，因此在骨修復領域具有廣闊應用前景。
黏土礦物，也稱為片狀硅酸鹽或層狀硅酸鹽，是一類無機層狀納米材料，基于其制備的納米黏土顆粒能通過剝落或嵌入等作用與水凝膠聚合網絡產生親和力[27]，從而形成納米黏土基水凝膠。與傳統水凝膠相比，納米黏土基水凝膠具有優異的力學性能、流變性能、溶脹能力、生物吸附和生物黏附能力，這些特性使水凝膠具備與骨基質相似力學性能的同時，也不影響其固有的物化性能[28]。目前，納米黏土顆粒已被廣泛應用于骨組織工程，其中鋰皂石（Laponite）占據主導地位。大量研究表明，通過添加Laponite獲得的水凝膠-Laponite復合材料，其楊氏模量與單純水凝膠相比顯著提高，例如聚乙二醇二丙烯酸酯-Laponite復合材料提高了1.9倍，明膠-Laponite復合材料提高了3.3倍[29]，明膠甲基丙烯酸酯-Laponite復合材料提高了4倍，藻酸鹽-Laponite復合材料提高了7.4倍[26]。將聚環氧乙烷中的Laponite濃度從40%提高至70%，可促使小鼠MC3T3-E1細胞成骨相關基因明顯上調，同時促進礦化結構和ALP活性在28 d內提高10倍，大大改善了成骨分化效果[30]。Laponite可以與帶電聚合物形成可逆的靜電鍵，能夠動態形成和斷裂，使Laponite成為設計可注射水凝膠的理想候選材料。Liu等[31]開發了一種可注射的原位成型納米復合水凝膠，由明膠、藻酸鹽和Laponite組成，Laponite硅酸鹽的加入提高了水凝膠機械性能，進而促進顱骨缺損部位新骨生成。
此外，用于骨組織工程的納米黏土顆粒還有高嶺土、蒙脫石及海泡石等。Ou等[32]采用光聚合反應制備的納米銀/高嶺土納米管/明膠甲基丙烯酸酯混合水凝膠，較普通水凝膠具有更好的機械性能和生物活性，能有效促進人牙周膜干細胞成骨分化以及大鼠顱骨缺損部位的新骨生成；Pietraszek等[33]將載有ALP的埃洛石混入殼聚糖-膠原水凝膠支架，明顯提高了基礎水凝膠的儲能模量，同時有效促進了人成骨肉瘤細胞MG-63 細胞的增殖和黏附。Cui等[34]制備了甲基丙烯酸二醇殼聚糖-蒙脫石納米基水凝膠，并用于修復骨缺損。研究發現當蒙脫石含量從0.5%增加至4%時，該水凝膠的楊氏模量從10 kPa增加至60 kPa以上；體外實驗表明蒙脫石含量為1.5%時，該水凝膠表現出最佳的生物相容性，并顯著提高BMSCs的成骨分化能力；體內實驗進一步證明該水凝膠能夠有效促進小鼠顱骨缺損部位骨組織生成。
3 導電材料引入水凝膠
骨組織中存在著內源性電場，并在骨組織的生理、病理改變中起著重要作用，而普通水凝膠不具備導電性，研究表明提高水凝膠導電性可以有效提高其骨修復能力[35-36]。導電材料的引入不僅增加了水凝膠導電性，也增加了機械性能，對促進骨修復起到了協同作用。常見的導電材料有金屬納米粒子、導電聚合物、碳基材料及其混合物[37]。
3.1 金屬納米粒子及金屬氧化物顆粒
常用的金屬納米粒子有金、銀、鉑等及其氧化物[38-42]。Ribeiro等[43]制備了含銀和金納米粒子的抗菌絲素蛋白/納米HA水凝膠，水凝膠機械性能增強，并且呈濃度依耐性，同時與成骨細胞共培養顯示出良好的生物相容性；Heo等[44]將金納米粒子引入明膠水凝膠，水凝膠機械性能得到增強，有效促進了MSCs和MC3T3-E1細胞的成骨分化。但是這些金屬納米粒子具有毒性，所負載的濃度往往有限，所以對水凝膠機械性能的改善也很有限。Celikkin等[45]將制備的甲基丙烯酰明膠-金納米粒子水凝膠用于骨組織工程研究，與單純甲基丙烯酰明膠相比，該復合水凝膠壓縮模量仍維持在2～3 kPa，金納米粒子的載入并未使其機械性能得到有效改善。
金屬氧化物具有導電性、磁性及抗菌性，既往研究已經證明了其良好的生物活性[46]。磁性氧化鐵納米顆粒，作為最常用的金屬氧化物顆粒，與生物材料組合可以刺激成骨細胞的增殖和分化[47-48]。Lin等[49]采用3D打印技術制備了氧化鐵水凝膠支架，并將7F2 成骨細胞接種于支架表面進行培養，結果顯示該支架能有效促進細胞增殖及成骨分化。但是這項研究主要關注磁性對于成骨的影響，機械性能改善對成骨的影響有待于進一步研究。Farzaneh等[50]的研究制備了負載鈷鐵氧體納米粒子的水凝膠，隨著該納米粒子含量的增加，水凝膠機械性能逐漸增強，并表現出明顯促進細胞增殖和分化的作用，但是缺乏體內實驗結果。
因此，金屬納米粒子可以在一定程度上改善水凝膠機械性能，但不是增強水凝膠機械性能的第一選擇。而金屬氧化物對水凝膠機械性能的影響及與成骨的關系需要進一步研究。
3.2 碳基材料
石墨烯和碳納米管作為主要的碳基材料，已經被證明具有良好的生物活性及骨修復作用[51-55]，而且具有優異的機械性能。石墨烯可通過氫鍵、靜電、疏水等方式與水凝膠發生相互作用，進而決定水凝膠的結構和復合水凝膠的機械性能，例如彈性模量、韌性和拉伸性能[56]。Zhou等[57]制備了氧化石墨烯/膠原蛋白水凝膠，其彈性模量比單純膠原蛋白凝膠高約4倍，經過與人BMSCs復合培養，發現該水凝膠能促進人BMSCs的成骨分化，這一發現提示氧化石墨烯通過改善水凝膠機械性能，進而促進了細胞的成骨分化。Nosrati等[58]采用3D打印技術制備了明膠/HA/石墨烯支架，石墨烯的加入使支架壓縮模量由0.26 MPa增加到0.43 MPa。Jiao等[59]制備了明膠-還原型石墨烯水凝膠，用于BMSCs雙向分化的研究。隨著石墨烯含量的增加，水凝膠壓縮-形變曲線發生明顯變化，當形變在50%左右時，壓縮模量可達到100 kPa以上，大大改善了水凝膠機械性能；體外實驗提示該水凝膠能有效促進BMSCs成骨和成血管分化，體內實驗證實其通過促進成血管和成骨顯著改善骨缺損修復能力。Li等[60]研究了氧化石墨烯-HA-藻酸鹽水凝膠復合物，氧化石墨烯的含量從0增加到1.2%時，水凝膠復合物壓縮應力由（64.1±4.0）kPa增加至（174.2?±?9.3）?kPa，彈性模量由（80.3±7.4）kPa增加至（158.3±6.9）kPa，氧化石墨烯濃度為1.0%時，在細胞增殖和分化以及體內骨缺損修復方面均表現出了最優效果；與單純HA-藻酸鹽水凝膠相比，氧化石墨烯改善了水凝膠體系的機械性能，從而促進了骨組織修復。Cui等[61]采用3D打印技術制備了聚離子復合物/多壁碳納米管高硬度復合水凝膠，與單純聚離子復合物水凝膠相比，其斷裂性能得到改善，與大鼠BMSCs共培養表現出良好的生物相容性，且能有效促進成骨相關基因上調和礦化結構生成；同時體內實驗證實其可促進大鼠顱骨缺損修復，這些效果可能得益于機械性能的改善。
因此，碳基材料不僅能增強水凝膠導電性，還能提高水凝膠機械強度，從而促進骨缺損修復。
3.3 導電聚合物
添加導電聚合物也是增強水凝膠機械性能的有效方法，常見的導電聚合物包括聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩、聚（3，4-亞乙基二氧噻吩）等。既往研究表明，導電聚合物可促進細胞增殖、成骨分化，有助于骨缺損修復[62-63]。Yang等[64]設計了透明質酸和聚吡咯的導電水凝膠，該復合水凝膠的楊氏模量是普通透明質酸水凝膠的5倍，機械性能明顯改善，同時具有良好的細胞相容性，但缺少用于骨缺損修復的研究結果。其他導電聚合物雖已被證實可以促進組織修復，但是由于本身機械性能較差，故不能有效改善水凝膠機械性能。Sawyer等[65]構建的甲基丙烯酸明膠-聚苯胺水凝膠雖然表現出良好的細胞相容性，但是隨著聚苯胺濃度的增加，該水凝膠壓縮模量反而逐漸下降，因此有待進一步研究導電性增加和機械性能下降對于骨修復的影響。
通過添加兩種或者多種導電材料，不僅可以提高水凝膠導電率，也能改善機械性能，解決了單一導電材料對水凝膠機械性能改善有限的問題。Liu等[66]使用兩種導電材料碳納米管和黑磷開發了一種復合導電水凝膠，該水凝膠在具有良好導電率的同時，表現出了較高機械性能，進一步體外實驗證明其能促進MC3T3-E1細胞增殖、黏附和分化，同時植入體內后促進兔股骨缺損的修復和脊柱融合。添加兩種或多種導電材料為增加水凝膠的機械性能和改善骨修復效果提供了新思路，在水凝膠促進骨修復方面具有廣闊研究前景。
4 纖維網絡增強水凝膠
與傳統組織工程材料相比，水凝膠的應力-形變表現為非線性彈性或非彈性行為。而且，水凝膠的剛度很大程度上受纖維定向和水運動的影響[67]。具有比各向同性基體更高剛度的纖維可以增強水凝膠的機械性能，同時與普通水凝膠相比，纖維網絡增強水凝膠的結構更接近細胞外基質，從而改善細胞功能，因此具有廣闊應用前景。
Lin等[68]將物理交聯與化學交聯制備的水凝膠注入到3D打印的熱塑性彈性纖維網絡中，高強度而有彈性的纖維加入使復合材料在適度形變時具有很高的模量；Illeperuma等[69]采用鋼絲絨纖維增強所制備的海藻酸鹽-聚丙烯酰胺水凝膠、Agrawal等[70]采用聚氨酯混合彈性纖維增強所構建的環氧胺水凝膠，與普通水凝膠相比均表現出了較高的機械性能，證明了纖維網絡增強是制備高強度水凝膠的有效方法。越來越多的纖維網絡增強水凝膠被應用于骨組織工程研究。Xu等[71]將聚（丙交酯-共-環氧乙烷）水凝膠前體溶液涂于電紡聚（L-丙交酯）纖維網，并將其層層堆疊，通過交聯產生層壓纖維增強復合水凝膠。該復合水凝膠與普通水凝膠相比，機械性能得到明顯增強，并且體外實驗證實其可以促進BMSCs成骨分化。Dubey等[72]將采用熔體電寫技術制造的聚己內酯網集成到甲基丙烯酰明膠中，構建了聚己內酯增強的甲基丙烯酰明膠水凝膠。聚己內酯的加入使該復合水凝膠在20%以內的形變下，應力可達到近70 kPa，大大改善了水凝膠的機械性能；并且該纖維網絡水凝膠能夠促進人MSCs的增殖、黏附及分化，同時體內實驗表現出明顯的骨缺損修復效果。因此，纖維網絡增強能夠改善水凝膠機械性能，從而進一步提高水凝膠修復骨缺損的能力。
5 展望
通過改變水凝膠成膠的體系、組分以及纖維結構，可以不同程度改善水凝膠機械性能，如楊氏模量、壓縮應力、壓縮形變、抗壓強度等指標，并且在體外和體內實驗均表現出了良好的骨修復效果。不同增強水凝膠機械性能方法各有局限，兩種或以上方法聯合使用可以一定程度彌補不足。
但是目前關于提高水凝膠機械性能用于骨再生的研究仍存在一些問題：① 部分水凝膠用于骨修復的研究中，缺乏水凝膠機械性能相關參數結果或者機械性能相關參數單一。應力-壓縮曲線是反映材料機械性能的重要參數，但是進行相關檢測的研究較少；單純壓縮應力、彈性模量等指標不能有效反映水凝膠的機械特性，無法作為骨修復材料的參考。同時，相關研究選擇的參數各異，不同的機械性能參數無法作橫向比較，從而無法明確機械性能在促進骨修復方面的真正作用。② 經上述方法改善的水凝膠雖然表現出一定骨修復效果，但是其機械性能仍無法達到人或動物骨組織水平，尚不能將研究結果轉化用于臨床。③ 添加無機顆粒雖然能增強水凝膠機械性能，提高其骨修復效果，但是骨修復的作用是因為無機粒子本身、體系機械性能增加或是二者皆有尚未明確。因此需要更多、更規范的關于提高水凝膠機械性能并用于骨修復的研究。
作者貢獻：王偉、王坤正負責綜述設計和構思；李永偉負責撰寫文章；王偉負責文章修改；周俊鵬、胡書剛、王家麟負責收集資料和查閱文獻，對文章結構、邏輯提供建議。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。項目經費支持沒有影響文章觀點及其報道。
創傷、感染、腫瘤等導致的骨缺損修復是目前研究熱點，如缺損超過自身愈合能力，則需要填充自體或者同種異體組織，以促進骨愈合[1-3]。自體骨移植是臨床治療骨缺損的金標準，但存在骨來源有限及供骨區并發癥等問題，臨床應用受到限制[4-5]。因此，骨移植替代物成為骨缺損修復的理想選擇。理想的骨移植替代物應具備良好的成骨誘導和血管生成能力、良好的生物相容性、形狀和大小可控、保質期長、成本低等特點[6]。
目前，骨移植替代物主要包括同種異體骨、異種骨、金屬及陶瓷材料等。與其他骨移植替代物相比，水凝膠具有類骨細胞外基質的多孔結構、良好生物相容性的優點，而且形狀、大小可控，能匹配不規則骨缺損，有望成為骨缺損修復材料[7-8]。然而普通水凝膠機械性能較差，對于負重骨而言，如修復材料機械性能較差，修復缺損后容易變形，無法發揮早期支撐作用。而且，研究表明與骨機械性能匹配的生物材料還有利于骨細胞增殖及礦化，發揮良好的骨傳導和骨誘導作用[9]。因此，提高水凝膠機械性能是改善其修復骨缺損效果的關鍵因素。目前，有研究通過構建雙網絡結構、復合納米無機粒子、引入導電材料及增強纖維網絡等方法來提高水凝膠機械性能（表1）。現對上述方法及其制備的水凝膠骨修復效果進行總結，為后續采用高機械性能水凝膠修復骨缺損提供思路。
表1
提高水凝膠機械性能的方法
Table1.
The methods of improving the mechanical properties of hydrogels
1 雙網絡水凝膠
雙網絡水凝膠是由兩種不同性質聚合物形成的互穿網絡[10]，兩個網絡性質存在顯著差異，一種為交聯密度較高的聚電解質網絡結構（剛而脆），另一種為松散交聯的中性網絡結構（軟而韌）。聚電解質網絡結構為雙網絡水凝膠提供了“犧牲鍵”，起到分散外界應力的作用；而柔性的中性網絡結構填補于聚電解質網絡結構中，為雙網絡水凝膠提供了支架，保持水凝膠外形。相比于單一網絡水凝膠，雙網絡水凝膠機械性能和韌性均顯著提高[11]。因此，雙網絡水凝膠被廣泛用于骨組織工程研究。
Zhang等[12]通過對甲基丙烯酰基明膠、硫醇化殼聚糖和改性的多面體低聚倍半硅氧烷納米粒子進行光交聯，然后將活性鎂離子通過鎂的配位鍵引入系統中，成功制備了一種摻入鎂離子的雙網絡水凝膠。該水凝膠的抗壓性能和拉伸性能較單一網絡水凝膠明顯提高，能有效促進BMSCs增殖和成骨分化，促進大鼠顱骨缺損的修復。Li等[13]以陰離子多糖結冷膠為第1網絡，存在交聯劑的可聚合單體作為第2網絡，通過一步混合法制備了雙網絡水凝膠，并將2-甲基丙烯酰胺乙基磷酸二氫的單體引入到第2網絡中。該水凝膠表現出了良好的壓縮性能和流變特性，能有效促進小鼠成骨細胞系MC3T3-E1細胞的骨礦化。Xu等[14]采用雙交聯法制備了結構和機械性能可調的新型多孔聚乙烯醇/海藻酸鈉/羥基磷灰石復合水凝膠，通過調整各成分比例，提高了水凝膠的彈性模量，有效促進MC3T3-E1細胞成骨分化，但是其壓縮模量與動物、人骨組織相比仍存在差距。Bi等[15]將醫用級聚乙烯醇與殼聚糖在氫氧化鉀/尿素溶解體系中進行物理交聯，構建了新型雙網絡水凝膠。該水凝膠顯示出高抗壓性能，有效促進了兔骨缺損修復，具有作為骨修復材料的潛力。
2 納米無機粒子復合水凝膠
Haraguchi等[11]將“新型納米復合材料”概念擴展到水凝膠領域，并于2002年首次報道成功制備具有獨特有機-無機網絡結構的新型“納米復合水凝膠”，其具有優異機械特性，被廣泛應用于骨組織工程。
2.1 納米生物陶瓷復合水凝膠
生物陶瓷在生物降解性、生物相容性和生物力學特性方面有著獨特優勢，是骨再生和骨修復的重要材料[16]，分為無機磷酸鹽類陶瓷和生物活性玻璃兩類，已被廣泛用于骨組織工程研究。加入納米生物陶瓷可以增強水凝膠機械性能，從而增加水凝膠骨修復效果。
目前，骨組織工程研究最廣泛的無機磷酸鹽類陶瓷為磷酸鈣類，包括羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）、β-磷酸三鈣（β-tricalciumphosphate，β-TCP）以及它們的混合物雙向磷酸鈣（biphasic calcium phosphate，BCP）。HA構成了骨骼的無機相（約占無機相的65%），是所有磷酸鹽分子中生物相容性最強的物質之一，因此可以作為骨移植替代物用于骨修復。HA的加入可以有效提高水凝膠機械性能，隨著納米HA逐漸降解，鈣離子和磷酸鹽離子被釋放，這兩種離子能夠在微環境中調節細胞行為，調節骨骼礦化過程并與周圍組織結合，從而促進成骨分化。Wang等[17]利用紫外光交聯技術開發了一種新型明膠甲基丙烯胺-聚（乙二醇）二丙烯酸酯-納米HA復合水凝膠支架，隨著納米HA含量提高，該水凝膠在40%形變情況下，壓縮應力可以達到約300 kPa；同時，該水凝膠表現出良好的生物相容性。Liu等[18]的研究利用多巴胺修飾納米HA，形成聚多巴胺修飾的納米HA，然后將該物質引入氧化海藻酸鈉和明膠的席夫堿反應中，在溫和條件下制備了可注射骨修復水凝膠。由于納米HA的引入，該水凝膠的抗壓強度在80%形變時可達到約0.5 MPa，大大提高了其修復兔股骨髁缺損的能力。β-TCP和BCP也是增強水凝膠機械性能的材料。Nie等[19]將殼聚糖/明膠水凝膠與BCP納米顆粒（BCP-nano-particles，BCP-NPs）結合在一起，制備了復合水凝膠。隨著BCP-NPs含量增加，復合水凝膠的抗壓強度可高達2.5 MPa，非常接近骨組織應力參數；與低BCP-NPs含量復合水凝膠相比，高BCP-NPs含量復合水凝膠更好地促進了BMSCs中ALP的生成，植入兔股骨頭壞死病灶后可見更多新生骨生成。Sen等[20]將瓊脂糖和瓊脂糖-膠原水凝膠與不同比例的β-TCP包埋顆粒相結合，得到不同性能的復合水凝膠；隨著β-TCP比例的增加，復合水凝膠壓力切線模量可達近300 kPa，機械性能較普通水凝膠明顯改善，并在體外有效促進人BMSCs增殖及成骨分化。
與無機磷酸鹽類陶瓷相比，生物活性玻璃無論是在生理溶液中，還是在體內，均表現出較快的磷灰石生成能力，可以有效改善細胞黏附，促進成骨細胞增殖、分化及礦化[21]。研究表明，添加生物活性玻璃可以有效增強水凝膠抗壓性能和楊氏模量，從而促進成骨相關細胞成骨分化[22]。Ye等[21]制備了生物活性玻璃-明膠-海藻酸鹽水凝膠支架用于骨缺損修復，隨著生物活性玻璃比例的增加，該水凝膠支架的抗壓強度從1 MPa增加至2.5 MPa，并有效地促進了大鼠BMSCs的黏附和成骨分化。Killion等[22]通過光聚合開發了生物活性玻璃與聚乙二醇的復合水凝膠，隨著生物活性玻璃含量的增加，復合水凝膠的楊氏模量逐漸增加，可高達8～9 MPa，壓縮應力高達2～3 MPa。但該研究缺乏體內外相關生物學實驗，無法判斷其骨修復效果。Wu等[23]采用熱觸發方式制備的可注射殼聚糖/絲素蛋白/生物活性玻璃納米顆粒水凝膠，能夠顯著促進小鼠 MC3T3-E1細胞成骨和成血管分化，并在體內實驗中顯示出改善骨缺損修復的作用，提示生物活性玻璃的加入提高了水凝膠機械性能，利于BMSCs成骨分化和骨缺損修復。
上述研究表明在水凝膠中加入納米生物陶瓷是增強水凝膠機械性能，提高水凝膠骨修復效果的有效選擇方案。
2.2 納米黏土基水凝膠
納米黏土顆粒及其復合材料為生物材料的設計和再生醫學的發展提供了新思路[24]。與其他納米顆粒材料相比，納米黏土顆粒在較高濃度時仍具有良好的生物相容性[25]；同時降解產物不僅無毒性，而且有利于成骨分化[26]，因此在骨修復領域具有廣闊應用前景。
黏土礦物，也稱為片狀硅酸鹽或層狀硅酸鹽，是一類無機層狀納米材料，基于其制備的納米黏土顆粒能通過剝落或嵌入等作用與水凝膠聚合網絡產生親和力[27]，從而形成納米黏土基水凝膠。與傳統水凝膠相比，納米黏土基水凝膠具有優異的力學性能、流變性能、溶脹能力、生物吸附和生物黏附能力，這些特性使水凝膠具備與骨基質相似力學性能的同時，也不影響其固有的物化性能[28]。目前，納米黏土顆粒已被廣泛應用于骨組織工程，其中鋰皂石（Laponite）占據主導地位。大量研究表明，通過添加Laponite獲得的水凝膠-Laponite復合材料，其楊氏模量與單純水凝膠相比顯著提高，例如聚乙二醇二丙烯酸酯-Laponite復合材料提高了1.9倍，明膠-Laponite復合材料提高了3.3倍[29]，明膠甲基丙烯酸酯-Laponite復合材料提高了4倍，藻酸鹽-Laponite復合材料提高了7.4倍[26]。將聚環氧乙烷中的Laponite濃度從40%提高至70%，可促使小鼠MC3T3-E1細胞成骨相關基因明顯上調，同時促進礦化結構和ALP活性在28 d內提高10倍，大大改善了成骨分化效果[30]。Laponite可以與帶電聚合物形成可逆的靜電鍵，能夠動態形成和斷裂，使Laponite成為設計可注射水凝膠的理想候選材料。Liu等[31]開發了一種可注射的原位成型納米復合水凝膠，由明膠、藻酸鹽和Laponite組成，Laponite硅酸鹽的加入提高了水凝膠機械性能，進而促進顱骨缺損部位新骨生成。
此外，用于骨組織工程的納米黏土顆粒還有高嶺土、蒙脫石及海泡石等。Ou等[32]采用光聚合反應制備的納米銀/高嶺土納米管/明膠甲基丙烯酸酯混合水凝膠，較普通水凝膠具有更好的機械性能和生物活性，能有效促進人牙周膜干細胞成骨分化以及大鼠顱骨缺損部位的新骨生成；Pietraszek等[33]將載有ALP的埃洛石混入殼聚糖-膠原水凝膠支架，明顯提高了基礎水凝膠的儲能模量，同時有效促進了人成骨肉瘤細胞MG-63 細胞的增殖和黏附。Cui等[34]制備了甲基丙烯酸二醇殼聚糖-蒙脫石納米基水凝膠，并用于修復骨缺損。研究發現當蒙脫石含量從0.5%增加至4%時，該水凝膠的楊氏模量從10 kPa增加至60 kPa以上；體外實驗表明蒙脫石含量為1.5%時，該水凝膠表現出最佳的生物相容性，并顯著提高BMSCs的成骨分化能力；體內實驗進一步證明該水凝膠能夠有效促進小鼠顱骨缺損部位骨組織生成。
3 導電材料引入水凝膠
骨組織中存在著內源性電場，并在骨組織的生理、病理改變中起著重要作用，而普通水凝膠不具備導電性，研究表明提高水凝膠導電性可以有效提高其骨修復能力[35-36]。導電材料的引入不僅增加了水凝膠導電性，也增加了機械性能，對促進骨修復起到了協同作用。常見的導電材料有金屬納米粒子、導電聚合物、碳基材料及其混合物[37]。
3.1 金屬納米粒子及金屬氧化物顆粒
常用的金屬納米粒子有金、銀、鉑等及其氧化物[38-42]。Ribeiro等[43]制備了含銀和金納米粒子的抗菌絲素蛋白/納米HA水凝膠，水凝膠機械性能增強，并且呈濃度依耐性，同時與成骨細胞共培養顯示出良好的生物相容性；Heo等[44]將金納米粒子引入明膠水凝膠，水凝膠機械性能得到增強，有效促進了MSCs和MC3T3-E1細胞的成骨分化。但是這些金屬納米粒子具有毒性，所負載的濃度往往有限，所以對水凝膠機械性能的改善也很有限。Celikkin等[45]將制備的甲基丙烯酰明膠-金納米粒子水凝膠用于骨組織工程研究，與單純甲基丙烯酰明膠相比，該復合水凝膠壓縮模量仍維持在2～3 kPa，金納米粒子的載入并未使其機械性能得到有效改善。
金屬氧化物具有導電性、磁性及抗菌性，既往研究已經證明了其良好的生物活性[46]。磁性氧化鐵納米顆粒，作為最常用的金屬氧化物顆粒，與生物材料組合可以刺激成骨細胞的增殖和分化[47-48]。Lin等[49]采用3D打印技術制備了氧化鐵水凝膠支架，并將7F2 成骨細胞接種于支架表面進行培養，結果顯示該支架能有效促進細胞增殖及成骨分化。但是這項研究主要關注磁性對于成骨的影響，機械性能改善對成骨的影響有待于進一步研究。Farzaneh等[50]的研究制備了負載鈷鐵氧體納米粒子的水凝膠，隨著該納米粒子含量的增加，水凝膠機械性能逐漸增強，并表現出明顯促進細胞增殖和分化的作用，但是缺乏體內實驗結果。
因此，金屬納米粒子可以在一定程度上改善水凝膠機械性能，但不是增強水凝膠機械性能的第一選擇。而金屬氧化物對水凝膠機械性能的影響及與成骨的關系需要進一步研究。
3.2 碳基材料
石墨烯和碳納米管作為主要的碳基材料，已經被證明具有良好的生物活性及骨修復作用[51-55]，而且具有優異的機械性能。石墨烯可通過氫鍵、靜電、疏水等方式與水凝膠發生相互作用，進而決定水凝膠的結構和復合水凝膠的機械性能，例如彈性模量、韌性和拉伸性能[56]。Zhou等[57]制備了氧化石墨烯/膠原蛋白水凝膠，其彈性模量比單純膠原蛋白凝膠高約4倍，經過與人BMSCs復合培養，發現該水凝膠能促進人BMSCs的成骨分化，這一發現提示氧化石墨烯通過改善水凝膠機械性能，進而促進了細胞的成骨分化。Nosrati等[58]采用3D打印技術制備了明膠/HA/石墨烯支架，石墨烯的加入使支架壓縮模量由0.26 MPa增加到0.43 MPa。Jiao等[59]制備了明膠-還原型石墨烯水凝膠，用于BMSCs雙向分化的研究。隨著石墨烯含量的增加，水凝膠壓縮-形變曲線發生明顯變化，當形變在50%左右時，壓縮模量可達到100 kPa以上，大大改善了水凝膠機械性能；體外實驗提示該水凝膠能有效促進BMSCs成骨和成血管分化，體內實驗證實其通過促進成血管和成骨顯著改善骨缺損修復能力。Li等[60]研究了氧化石墨烯-HA-藻酸鹽水凝膠復合物，氧化石墨烯的含量從0增加到1.2%時，水凝膠復合物壓縮應力由（64.1±4.0）kPa增加至（174.2?±?9.3）?kPa，彈性模量由（80.3±7.4）kPa增加至（158.3±6.9）kPa，氧化石墨烯濃度為1.0%時，在細胞增殖和分化以及體內骨缺損修復方面均表現出了最優效果；與單純HA-藻酸鹽水凝膠相比，氧化石墨烯改善了水凝膠體系的機械性能，從而促進了骨組織修復。Cui等[61]采用3D打印技術制備了聚離子復合物/多壁碳納米管高硬度復合水凝膠，與單純聚離子復合物水凝膠相比，其斷裂性能得到改善，與大鼠BMSCs共培養表現出良好的生物相容性，且能有效促進成骨相關基因上調和礦化結構生成；同時體內實驗證實其可促進大鼠顱骨缺損修復，這些效果可能得益于機械性能的改善。
因此，碳基材料不僅能增強水凝膠導電性，還能提高水凝膠機械強度，從而促進骨缺損修復。
3.3 導電聚合物
添加導電聚合物也是增強水凝膠機械性能的有效方法，常見的導電聚合物包括聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩、聚（3，4-亞乙基二氧噻吩）等。既往研究表明，導電聚合物可促進細胞增殖、成骨分化，有助于骨缺損修復[62-63]。Yang等[64]設計了透明質酸和聚吡咯的導電水凝膠，該復合水凝膠的楊氏模量是普通透明質酸水凝膠的5倍，機械性能明顯改善，同時具有良好的細胞相容性，但缺少用于骨缺損修復的研究結果。其他導電聚合物雖已被證實可以促進組織修復，但是由于本身機械性能較差，故不能有效改善水凝膠機械性能。Sawyer等[65]構建的甲基丙烯酸明膠-聚苯胺水凝膠雖然表現出良好的細胞相容性，但是隨著聚苯胺濃度的增加，該水凝膠壓縮模量反而逐漸下降，因此有待進一步研究導電性增加和機械性能下降對于骨修復的影響。
通過添加兩種或者多種導電材料，不僅可以提高水凝膠導電率，也能改善機械性能，解決了單一導電材料對水凝膠機械性能改善有限的問題。Liu等[66]使用兩種導電材料碳納米管和黑磷開發了一種復合導電水凝膠，該水凝膠在具有良好導電率的同時，表現出了較高機械性能，進一步體外實驗證明其能促進MC3T3-E1細胞增殖、黏附和分化，同時植入體內后促進兔股骨缺損的修復和脊柱融合。添加兩種或多種導電材料為增加水凝膠的機械性能和改善骨修復效果提供了新思路，在水凝膠促進骨修復方面具有廣闊研究前景。
4 纖維網絡增強水凝膠
與傳統組織工程材料相比，水凝膠的應力-形變表現為非線性彈性或非彈性行為。而且，水凝膠的剛度很大程度上受纖維定向和水運動的影響[67]。具有比各向同性基體更高剛度的纖維可以增強水凝膠的機械性能，同時與普通水凝膠相比，纖維網絡增強水凝膠的結構更接近細胞外基質，從而改善細胞功能，因此具有廣闊應用前景。
Lin等[68]將物理交聯與化學交聯制備的水凝膠注入到3D打印的熱塑性彈性纖維網絡中，高強度而有彈性的纖維加入使復合材料在適度形變時具有很高的模量；Illeperuma等[69]采用鋼絲絨纖維增強所制備的海藻酸鹽-聚丙烯酰胺水凝膠、Agrawal等[70]采用聚氨酯混合彈性纖維增強所構建的環氧胺水凝膠，與普通水凝膠相比均表現出了較高的機械性能，證明了纖維網絡增強是制備高強度水凝膠的有效方法。越來越多的纖維網絡增強水凝膠被應用于骨組織工程研究。Xu等[71]將聚（丙交酯-共-環氧乙烷）水凝膠前體溶液涂于電紡聚（L-丙交酯）纖維網，并將其層層堆疊，通過交聯產生層壓纖維增強復合水凝膠。該復合水凝膠與普通水凝膠相比，機械性能得到明顯增強，并且體外實驗證實其可以促進BMSCs成骨分化。Dubey等[72]將采用熔體電寫技術制造的聚己內酯網集成到甲基丙烯酰明膠中，構建了聚己內酯增強的甲基丙烯酰明膠水凝膠。聚己內酯的加入使該復合水凝膠在20%以內的形變下，應力可達到近70 kPa，大大改善了水凝膠的機械性能；并且該纖維網絡水凝膠能夠促進人MSCs的增殖、黏附及分化，同時體內實驗表現出明顯的骨缺損修復效果。因此，纖維網絡增強能夠改善水凝膠機械性能，從而進一步提高水凝膠修復骨缺損的能力。
5 展望
通過改變水凝膠成膠的體系、組分以及纖維結構，可以不同程度改善水凝膠機械性能，如楊氏模量、壓縮應力、壓縮形變、抗壓強度等指標，并且在體外和體內實驗均表現出了良好的骨修復效果。不同增強水凝膠機械性能方法各有局限，兩種或以上方法聯合使用可以一定程度彌補不足。
但是目前關于提高水凝膠機械性能用于骨再生的研究仍存在一些問題：① 部分水凝膠用于骨修復的研究中，缺乏水凝膠機械性能相關參數結果或者機械性能相關參數單一。應力-壓縮曲線是反映材料機械性能的重要參數，但是進行相關檢測的研究較少；單純壓縮應力、彈性模量等指標不能有效反映水凝膠的機械特性，無法作為骨修復材料的參考。同時，相關研究選擇的參數各異，不同的機械性能參數無法作橫向比較，從而無法明確機械性能在促進骨修復方面的真正作用。② 經上述方法改善的水凝膠雖然表現出一定骨修復效果，但是其機械性能仍無法達到人或動物骨組織水平，尚不能將研究結果轉化用于臨床。③ 添加無機顆粒雖然能增強水凝膠機械性能，提高其骨修復效果，但是骨修復的作用是因為無機粒子本身、體系機械性能增加或是二者皆有尚未明確。因此需要更多、更規范的關于提高水凝膠機械性能并用于骨修復的研究。
作者貢獻：王偉、王坤正負責綜述設計和構思；李永偉負責撰寫文章；王偉負責文章修改；周俊鵬、胡書剛、王家麟負責收集資料和查閱文獻，對文章結構、邏輯提供建議。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。項目經費支持沒有影響文章觀點及其報道。
