引用本文： 林苗遠, 楊繼濱, 閆文強, 胡寧, 劉子銘, 張莉, 李豫皖. 組織工程技術促進股骨頭壞死骨組織再血管化的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(11): 1479-1485. doi: 10.7507/1002-1892.202105047 復制
股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是由于多種因素致股骨頭血液減少或中斷，造成骨細胞、BMSCs、骨髓造血細胞和脂肪細胞等細胞異常肥大或死亡的病理過程。ONFH 發病機制主要包括脂質代謝異常、血管內凝血、成脂分化、細胞凋亡自噬、骨質疏松、基因多態性等[1]。在 ONFH 病變進程中，多因素及多種機制共同參與、交叉疊加，最終導致股骨頭微循環受損，造成骨組織缺血缺氧，加之無足夠側支循環補給或具有豐富血運的骨組織填補，從而進一步誘發 ONFH。局部微循環重建是保證骨組織再生、修復、愈合的先決條件，有學者認為壞死的股骨頭骨組織經過再血管化，不僅能重建血供，還能促進成骨進程，加速股骨頭修復[2-4]。因此，促進股骨頭再血管化是治療 ONFH 的關鍵。現就國內外文獻報道的利用組織工程技術促進ONFH 骨組織再血管化策略及相關研究進展作一綜述。
1 ONFH 血管化機制
股骨頭血供主要依靠圓韌帶動脈、旋股內動脈和旋股外動脈，動脈之間缺乏側支循環，阻塞后難以代償，導致股骨頭局部骨質及骨髓死亡，壞死病灶超過一定范圍后難以自行修復。雖然 ONFH 發病機制尚不清楚，但是重建或改善股骨頭血供是治療 ONFH 的關鍵已達成共識。血管重建機制主要分為血管生成與血管形成。其中，血管生成是指在已有的血管網絡基礎上，由內皮細胞出芽形成新生血管，涉及細胞外基質降解、增殖、遷移、萌發及形成管狀結構，最后募集周細胞穩定新形成的血管結構及促進其成熟[5]；血管形成則是由內皮細胞或內皮祖細胞自發形成管狀結構，與原有血管網吻合形成新血管的過程。目前，更多學者認為血管重建是一個動態過程，涉及多種因素、多種因子及多種（干）細胞類型的參與和調控，例如內皮細胞、內皮祖細胞、MSCs 等，但組織血管化的具體機制尚未明確。
此外，有學者認為在 ONFH 修復中血管細胞和成骨細胞緊密聯系。在骨組織（如長管狀骨）中血供主要由 3 種類型血管（滋養動脈、干骺端-骺端動脈和骨膜動脈）提供，特別是在哺乳動物骨骼中，血管又分為 H 亞型血管和 L 亞型血管。H 亞型血管主要由 H 亞型血管內皮細胞構成，周圍聚集了大量骨祖細胞及成骨細胞[4]。激活與血管生成相關的 Notch 信號后，長管狀骨的 H 亞型血管內皮細胞增加，分泌的 Noggin 蛋白增多，刺激軟骨細胞成熟、小梁形成以及骨祖細胞增殖，加速骨礦化及血管生成[6]。此外，H 亞型血管內皮細胞還能分泌 VEGF，再次支持血管生成以及激活血管周圍骨祖細胞和成骨細胞。Gao 等[7]通過酶消化和密度梯度離心法成功分離 H 亞型血管內皮細胞，并對其進行純化，證實了 H 亞型血管內皮細胞的存在。
經典信號通路也有促進血管化等作用，如 Akt/Bad/Bcl-2、P13K/Akt、Notch、VEGF/VEGFR、Wnt5a[6, 8-9]。Akt/Bad/Bcl-2 信號通路能夠抑制糖皮質激素相關內質網應激誘導的大鼠股骨頭細胞凋亡，而 Akt 途徑又可以激活血管生成信號通路，在抑制細胞凋亡與促血管化方面起到雙重作用[8]。
2 利用組織工程技術治療 ONFH 的研究進展
大段骨缺損修復困難主要與其解剖部位血供不足有關，而利用組織工程技術體外構建富含血運的骨組織，可以直接修復股骨頭骨缺損區域。目前組織工程技術促進血管化的方法主要基于細胞、生長因子、支架材料三大因素，同時聯合 3D 打印技術、藥物遞送系統等[10]。
2.1 細胞與血管化再生
2.1.1 MSCs 作用與機制
研究表明，MSCs 參與調控機體血管形成，在促進組織修復方面具有一定優勢[11]。不同來源的 MSCs 具有多譜系分化潛能，在一定條件下能夠誘導分化為多種細胞類型，如成骨細胞、內皮細胞等，因此其可能具有成骨和成血管雙重作用，有望同時促進骨修復及血管生成[12-13]。Abudusaimi 等[14]通過移植自體脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）治療激素性 ONFH，結果顯示不僅能增加骨鈣素的表達促進新骨形成，還可改善骨壞死區域血供。Pak[15]從 2 例 ONFH 伴嚴重髖關節疼痛患者的脂肪組織中提取自體 ADSCs，然后經皮注射至患側髖關節內，4 周后患者關節疼痛減輕，MRI 顯示伴新生血管的骨組織再生。Chen 等[16]對 9 例國際骨循環協會（ARCO）Ⅱ～Ⅲa 期 ONFH 患者經動脈注射臍帶 MSCs，采用氧氣輸送指數（oxygen delivery index，ODI）評估組織有效灌注率，結果顯示術后 3 d ODI 增高，12、24 個月 MRI 顯示 ONFH 骨壞死體積明顯減小。Chen 等認為這可能與臍帶 MSCs 遷移至壞死區域，并分化為成骨細胞或內皮細胞有關。此外，MSCs 還可以通過旁分泌途徑分泌多種生長因子來加速壞死區域的血管新生。上述研究結果提示 MSCs 可用于 ONFH 治療，能促進骨修復及血管生成。
2.1.2 內皮細胞調節血管形成功能
血管擴散能力有限，體內細胞與毛細血管網距離不宜超過 100～200 μm，超出此范圍難以保證營養物質的供應[17]。因此植入體內的移植物形成內部毛細血管網或加速與宿主血管吻合，是保證移植物成活的關鍵。內皮細胞是一類血管形成或血管新生的主要細胞，其存在 2 種特定亞型：H 亞型與 L 亞型血管內皮細胞。特別是 H 亞型血管內皮細胞，在調控成骨微環境和骨形成過程中起重要作用，通過產生獨特的代謝和分子微環境，不僅介導骨骼脈管系統的生長，還為血管周圍骨祖細胞提供生態位信號[4]。
內皮祖細胞是一類可定向增殖分化為內皮細胞的前體細胞，可在損傷及缺血缺氧的區域被觀察到，維持血管穩定（如血管修復）和啟動新生血管形成。在正常生理活動中，外源性和內源性因素可刺激骨髓來源的內皮祖細胞增殖并釋放進入外周血，調控新血管形成；而發生 ONFH 后，宿主內循環的內皮祖細胞數量及聚集能力顯著下降，迅速衰老，成血管能力大大受損[18]。
將不同類型細胞共培養能通過細胞間相互調控作用，促進細胞定向分化。有研究提示將內皮細胞或內皮祖細胞單獨或與其他骨細胞共培養后，這些細胞能夠直接參與或以旁分泌形式分泌多種血管活性因子加速血管化，經體外培養后形成初級血管結構，植入動物體內后與宿主成熟血管以吻合方式互相連通[11]。這種體外血管預構形式能實現移植物體內早期血管化，更好地保證植入細胞的成活，對成骨分化也有著積極的影響。Zigdon-Giladi 等[19]將 MSCs 和內皮祖細胞共培養后植入嚴重骨缺損大鼠體內，可以觀察到大量血管生成，MSCs 分化為成骨細胞，還將宿主內皮祖細胞和 MSCs 募集到壞死部位，證實兩種細胞聯合移植具有協同修復骨缺損作用，顯示出良好的骨再生和血管化潛能。上述不同類型細胞聯合移植在骨再生及血管再生方面效果均優于單一細胞[20]。但也有報道提出植入的內皮細胞不能形成廣泛的功能性血管網[21]。
2.1.3 細胞膜片技術的應用
各種類型細胞膜片已用于組織或器官的構建，膜片組織能保留豐富的細胞外基質和表面蛋白，保持細胞間整個信號通訊網絡，也能實現多種細胞的共培養體系。目前，已有將不同類型細胞膜片復合，成功構建組織工程骨并修復骨缺損的報道[22-23]。近年來，利用高細胞密度的細胞膜片技術合成仿生骨膜也是促進股骨頭血管化策略之一。正常股骨頭骨膜是骨組織血供來源之一，支持骨營養及骨再生。Ren 等[22]將人臍靜脈內皮細胞接種在未分化的 BMSCs 細胞膜片上，復合形成預血管化仿生骨膜組織。體外實驗結果表明該復合物改變了人臍靜脈內皮細胞的排列，促進血管樣網絡的形成，且植入體內后快速與宿主血管系統吻合，形成功能性血管。
然而細胞膜片機械性能較弱，可進一步與支架結合，形成可塑性強、機械強度大的三維組織結構。Zhang 等[23]采用兔來源 ADSCs 制備成骨細胞膜片和內皮細胞膜片，組成具有成骨和血管形成潛力的雙細胞膜片復合物后覆蓋于羥基磷灰石支架，然后植入裸鼠皮下，移植 12 周后該復合物出現明顯膠原纖維礦化和血管化，毛細血管生成增多，成骨及成血管能力遠優于單純羥基磷灰石支架。
此外，細胞膜片技術還存在細胞數量需求較大、體外培養周期長等問題，膜片制備技術仍需進一步優化。
2.1.4 細胞外泌體的作用
外泌體是細胞分泌的細胞外囊泡，含有豐富的蛋白質、脂質、微小 RNAs（micro RNAs，miRNAs），傳遞細胞間信號，調節免疫、炎癥反應及促進損傷細胞自我修復等生理過程。血管內皮細胞釋放的外泌體被認為是血管形成的重要介質，是其發揮細胞間和細胞-基質間相互作用以及與外界溝通的關鍵因子，將各種信號級聯傳遞至靶細胞，參與細胞生長、遷移和血管發育的調節[5]。而 MSCs 釋放的外泌體可以直接將 miRNAs 轉移至血管內皮細胞促進血管生成[24]。有學者指出局部缺氧環境能刺激細胞外泌體增加，加速血管新生[4]。Song 等[25]研究發現血管內皮細胞釋放的外泌體能夠高效特異性靶向骨組織，抑制破骨細胞活性，并可通過遞送 miR-15 促進骨再生。張根生等[3]的研究體外構建過表達 miRNA-27a 的人臍靜脈血管內皮細胞來源外泌體，經尾靜脈注射至小鼠體內，可明顯改善激素性 ONFH，在一定程度上促進骨再生。Liu 等[26]將人誘導多能干細胞來源的 MSCs 分泌的外泌體經靜脈注射至激素性 ONFH 大鼠體內，3 周后局部微血管密度增加，體外血管內皮細胞增殖、遷移和成管等實驗表明血管內皮細胞增殖、遷移和成管能力增強，而這與外泌體激活了與血管生成相關的 P13K/Akt 信號通路有關。
2.2 支架材料與血管化
理想的骨支架材料應保持細胞活力，允許細胞附著、增殖和歸巢以及提供機械支撐，此外還應允許宿主微循環流動，宿主血管侵入支架材料中心形成新的脈管系統，從而達到長期血管化并募集 MSCs，以促進骨發育。支架結構形態會影響其植入后血管生成與成骨分化，孔隙率是一個關鍵參數，決定細胞在支架遷移的速度以及支架實現血管化所需時間。支架孔隙過小會限制宿主血管入侵，過大則導致孔隙之間交聯不足。文獻報道 200～500 μm 是支架骨再生和血管形成的最理想孔徑[27]。
3D 打印技術能夠有效控制支架孔隙率，還允許內部結構相互連通，高精度地形成多層次組織和器官樣結構。Liu 等[28]在多孔三維骨支架接種 BMSCs，培養 3 周后加入人臍靜脈內皮細胞，6 d 后加入纖維蛋白填充孔隙以提供一種水凝膠環境，之后細胞迅速增殖，在支架內部人臍靜脈內皮細胞出芽并形成微血管結構。構建與原位骨組織力學性能相似的支架是骨組織工程研究一直以來的關注點，支架的結構設計與材料選擇非常重要。Maruyama 等[29]利用 3D 打印技術制備多孔聚己內酯-β 磷酸三鈣支架，該支架通過提供機械支撐來改善兔髓芯減壓術后股骨頭骨生長。此外，還可以將天然材料與化學材料進行加工融合制備支架材料，如人或動物的膠原、脫蛋白骨以及聚己內酯等[30]。多孔結構支架雖然保證了血管與骨長入的空間，但也削弱了機械支撐，因此支架還可以進一步融合堅韌的納米材料來提高機械支撐。
目前對支架材料的研究己從動物實驗逐漸轉向臨床應用階段，單一支架材料不能完全滿足骨缺損修復所有要求，特別是血管生成。綜合應用 3D 打印技術、納米技術、細胞膜片技術等新技術，設計多功能生物材料或血管化骨支架是未來研究的方向。
2.3 生長因子與血管化
2.3.1 生長因子類型及作用
多種生長因子參與調控血管新生，在組織工程構建中引入生長因子，可有效刺激內皮細胞、內皮祖細胞、成骨細胞、BMSCs 等細胞遷移與增殖，促進血管形成及成熟。現已知 VEGF、BMP、缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）、IGF、FGF 以及富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）等均具有直接或間接加速 ONFH 血管化的作用。
VEGF 又稱血管通透性因子，是一種血管內皮細胞特異性的促有絲分裂原，能夠調節脈管系統的生長。主要作用機制為通過與血管內皮細胞表面特異性受體相結合，誘導細胞定向移動、分裂以及增殖。此外，VEGF 還具有維持血管周圍骨祖細胞和成骨細胞的功能，在促成骨及血管侵入的骨修復過程中扮演著重要角色。
BMP 為體內成骨及成軟骨誘導主要因子，能夠同時促進骨再生與刺激新血管形成。在 ONFH 壞死區 BMP-4 mRNA 高表達，骨硬化加速，而 BMP-7 則通過促進 BMSCs 的增殖及成骨分化起保護作用，二者維系著成骨平衡[31-32]。
HIF 負責調控細胞對氧氣的感知這一重要生理過程，一旦激活 HIF-1α 通路，多種促血管生長細胞因子包括 VEGF-A、基質細胞衍生因子1、胎盤生長因子和血管生成素表達均增加，這些因子均是生理血管形成所必需的，特別是 VEGF-A 上升，不僅誘導內皮細胞和內皮細胞轉錄物上調，增加了 VEGF mRNA 的表達，還能促進骨祖細胞和成骨細胞標記表達水平增加[4, 33]。馮勇[18]應用 HIF-1α 激活劑二甲基乙二酰基甘氨酸激活內皮祖細胞中 HIF-1α 蛋白表達，結果顯示內皮祖細胞增殖能力以及成血管能力顯著提高，在壞死區觀察到新骨形成與血管密度增加。
脂質代謝紊亂是導致 ONFH 的因素之一，IGF 能夠作用于脂肪細胞促進脂肪分解，降低血液中甘油三酯水平。Song 等[34]研究了中國人群 ONFH 與相關基因變異之間的關系，發現作為成脂分化的中樞調節因子胰島素樣結合蛋白 3（insulin growth factor binding protein 3，IGFBP3），其基因型 IGFBP3rs2132572、IGFBP3rs24538th9、IGFBP3rs3110697 與 ONFH 風險和雙側髖關節病變密切相關，通過干擾脂肪細胞分化依賴的 PPAR-γ 途徑、維持成熟脂肪細胞的基因表達、減少脂質積累，在一定程度上能延緩 ONFH 進展，這與 Wang 等[35]的研究結果一致。
FGF 被認為是體內最有效的血管生長因子之一。Kuroda 等[36]利用水凝明膠混合 rhFGF-2 治療 10 例塌陷前期 ONFH 患者，術后 1 年患者平均臨床評分顯著提高，除 1 例發生股骨頭塌陷外，其他 9 例未發生階段進展或塌陷；Peng等[37]應用經慢病毒轉染 bFGF 的 MSCs 聯合松質骨移植修復兔股骨頭，獲得較好效果。他們發現這與激活 OPG/RANK/RANKL 通路有關，該通路維持促骨生長的成骨細胞及促骨吸收的破骨細胞之間的平衡，被認為是骨代謝重要途徑。
PRP 因富含 FGF、TGF、IGF 和 PDGF 等因子，在刺激新骨和血管組織形成方面具有巨大應用前景[38]。Tong 等[39]采用 PRP 治療小鼠 ONFH，相關炎癥因子如 IL-17A、IL-1β、TNF-α、NK-κB 受體激活劑配體、IL-6 和干擾素-γ 等表達下調，而細胞間黏附分子 1、PDGF、VEGF、IGF、TGF-β 等表達上調。此外，PRP 還能顯著降低血液黏度、血漿黏度及紅細胞聚集性，改善 ONFH 血液流變學指標，在一定程度上改善股骨頭供血動脈的梗阻，修復局部血管[40]。見表 1。
表1
生長因子在促進股骨頭再血管化中的作用
Table1.
Effect of growth factors in promoting revascularization of the femoral head
2.3.2 生長因子存在問題及解決方法
生長因子存在生物半衰期過短、局部有效濃度難以控制等問題，可與緩釋系統聯合應用，在特定的骨壞死區域連續遞送血管生成因子與成骨因子。Dailiana 等[2]利用滲透微泵連續輸送 VEGF 治療犬 ONFH，12 周后出現骨壞死逆轉，他認為經過有效的再血管化，能阻止壞死進一步發展。Wang 等[41]將 rhBMP-2 包埋于聚乳酸-羥基磷灰石微球，使其緩慢釋放達 4 周，之后觀察到死骨被大量新生骨組織包裹，在壞死骨內部可見許多新生血管。此外，基因治療技術在生長因子控釋方面也獲得較好效果，攜帶生長因子的基因片段通過載體病毒或脂質體轉染至種子細胞，賦予種子細胞持續穩定表達一種或多種生長因子的能力，使細胞具有更強的促血管化與成骨能力。Liao 等[42]利用腺病毒將 VEGF 和 BMP-6 基因片段轉染至 BMSCs，經過擴增并篩選出高表達的 BMSCs 后，將其與仿生合成支架聚丙交酯-乙交酯復合培養，最后植入裸鼠皮下；4 周后發現 VEGF 和 BMP-6 表達水平顯著增加，毛細血管數量和骨形成明顯高于其他對照組。雖然基因修飾取得一定促血管化結果，但也存在與載體病毒相關的生物安全風險。另外體內血管化往往是多種生長因子共同參與的級聯反應，因此與單用一種因子相比，多種因子聯合應用可達到更快速形成更致密、更成熟血管系統的目的，促血管效果更顯著[43]。
生長因子治療可以在股骨頭塌陷前任意階段進行，無需考慮 ONFH 病因，這可能是在 ONFH 早期一種有用的治療形式。雖然，目前動物實驗結果顯示生長因子能有效促進股骨頭骨組織血管化，但該治療方式缺乏特異性且價格昂貴，也缺乏臨床治療有效性的有力證據，因此仍需進一步系統、有效的臨床研究。
3 3D 打印技術
3D 打印技術是基于數字三維模型，按照增材制造原理定位裝配生物材料或細胞單元，構建具有類似于天然對應物分層結構的生物結構[44]，滿足了支架或無支架組織和器官構建的需求。骨生物打印可替代傳統的自體和同種異體骨移植，避免了與傳統骨移植相關的移植物不適合、供體部位并發癥、免疫原性和疾病傳播風險等問題，有望成為治療 ONFH 的方法。
3D 打印技術制備的三維支架具有相互連接孔隙和較大的體表面積，支持細胞附著、生長、細胞間通訊以及氣體和營養物質的交換，遠遠優于傳統溶劑澆鑄、相分離和熔融成型技術[28-29]。通過 3D 打印技術，還能在構建支架基礎上同時添加促成骨及血管生成的材料。Fielding 等[45]在 3D 打印磷酸三鈣支架基礎上，加入具有成骨誘導及促進血管生成的金屬氧化物二氧化硅和氧化鋅，然后修復小鼠股骨缺損模型，16 周后Ⅰ型膠原和骨鈣素水平上調，提示早期骨形成能力提高，新血管形成數量是單一磷酸三鈣支架的 3 倍。此外，構建具有功能性脈管系統的三維大規模骨組織構建體也是治療 ONFH 策略之一。Byambaa 等[46]利用 3D 打印技術制造包含可灌注血管腔微結構的骨狀組織復合體，首先打印硅酸鹽納米片負載甲基丙烯酰水凝膠圓柱體，內載有 hMSCs 以誘導成骨；同時合成具有 VEGF 的水凝膠制劑，建立生長因子內在梯度，以進一步促進人臍靜脈內皮細胞增殖，促進微毛細管形成。體外試驗表明構建體既能支持成骨，又能支持血管生成。
自然組織再生涉及復雜的三維結構、細胞功能和細胞外基質以及組織結構的動態變化。特別是近年來提出的 4D 生物打印將時間概念作為第四維度與 3D 打印相結合，以期隨著時間推移實現組織功能轉化與成熟[47]。
4 藥物遞送系統
隨著醫學、工學、材料、機械、藥物等領域的快速發展，大量研究對藥物本身、搭載藥物的載體材料等進行物理化學改性、修飾，不僅實現了藥物緩釋，而且能夠對藥物緩釋曲線進行更精確及智能調控、靶向治療瞄準特定的病變部位，局部藥物濃度能夠在較長時間內維持在有效范圍內。藥物遞送系統的快速發展對靶向治療 ONFH 有著積極作用，將組織工程技術與藥物遞送系統結合起來，對增強 ONFH 治療效果有一定意義。
在組織工程中藥物遞送系統主要包括無機材料、高分子材料（如明膠、海藻酸鹽、殼聚糖、滲透微泵、聚乳酸-羥基磷灰石微球、微球、載體病毒或脂質體）等。相關細胞生長因子通過與多種藥物遞送系統聯合應用，能達到持續遞送 VEGF 或成骨因子的目的[2, 41-42]。藥物遞送系統除了能夠遞送藥物外，還能遞送細胞所需的營養物質刺激細胞增殖。Wang 等[48]設計的 CaO2/明膠微球可以持續釋放氧氣達 19 d，通過靶向提供氧氣以促進極端缺氧條件下的細胞增殖，減少局部細胞凋亡并提高移植細胞存活率，增強移植干細胞的血管生成及細胞存活來提高 ONFH 治療效果。
5 總結與展望
如何改善局部血液供應，延緩甚至逆轉 ONFH 進展是臨床治療一大挑戰。利用骨組織工程促使股骨頭再血管化是目前研究熱點，已有研究證實該方法能夠延緩疾病進展，在治療 ONFH 方面取得一定成效[49]。但目前相關研究以動物實驗為主，臨床應用尚在試驗階段，因此仍需多方研究證實療效。基于種子細胞、支架材料以及促血管生成因子等促血管化策略的效果及其差異尚未明確，但聯合重建骨組織所需元素和血管網已被證明有效，能夠較快形成成熟的新血管并維持穩定。未來通過基因技術深入了解并引入成骨遺傳物質，同時聯合骨組織工程技術，有望為治療 ONFH 提供新思路及方法。
作者貢獻：林苗遠、李豫皖負責綜述構思設計；閆文強、胡寧負責文章寫作校對；林苗遠、李豫皖、楊繼濱、劉子銘參與文獻收集、分析總結；張莉、李豫皖負責項目指導。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點及其報道。
股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是由于多種因素致股骨頭血液減少或中斷，造成骨細胞、BMSCs、骨髓造血細胞和脂肪細胞等細胞異常肥大或死亡的病理過程。ONFH 發病機制主要包括脂質代謝異常、血管內凝血、成脂分化、細胞凋亡自噬、骨質疏松、基因多態性等[1]。在 ONFH 病變進程中，多因素及多種機制共同參與、交叉疊加，最終導致股骨頭微循環受損，造成骨組織缺血缺氧，加之無足夠側支循環補給或具有豐富血運的骨組織填補，從而進一步誘發 ONFH。局部微循環重建是保證骨組織再生、修復、愈合的先決條件，有學者認為壞死的股骨頭骨組織經過再血管化，不僅能重建血供，還能促進成骨進程，加速股骨頭修復[2-4]。因此，促進股骨頭再血管化是治療 ONFH 的關鍵。現就國內外文獻報道的利用組織工程技術促進ONFH 骨組織再血管化策略及相關研究進展作一綜述。
1 ONFH 血管化機制
股骨頭血供主要依靠圓韌帶動脈、旋股內動脈和旋股外動脈，動脈之間缺乏側支循環，阻塞后難以代償，導致股骨頭局部骨質及骨髓死亡，壞死病灶超過一定范圍后難以自行修復。雖然 ONFH 發病機制尚不清楚，但是重建或改善股骨頭血供是治療 ONFH 的關鍵已達成共識。血管重建機制主要分為血管生成與血管形成。其中，血管生成是指在已有的血管網絡基礎上，由內皮細胞出芽形成新生血管，涉及細胞外基質降解、增殖、遷移、萌發及形成管狀結構，最后募集周細胞穩定新形成的血管結構及促進其成熟[5]；血管形成則是由內皮細胞或內皮祖細胞自發形成管狀結構，與原有血管網吻合形成新血管的過程。目前，更多學者認為血管重建是一個動態過程，涉及多種因素、多種因子及多種（干）細胞類型的參與和調控，例如內皮細胞、內皮祖細胞、MSCs 等，但組織血管化的具體機制尚未明確。
此外，有學者認為在 ONFH 修復中血管細胞和成骨細胞緊密聯系。在骨組織（如長管狀骨）中血供主要由 3 種類型血管（滋養動脈、干骺端-骺端動脈和骨膜動脈）提供，特別是在哺乳動物骨骼中，血管又分為 H 亞型血管和 L 亞型血管。H 亞型血管主要由 H 亞型血管內皮細胞構成，周圍聚集了大量骨祖細胞及成骨細胞[4]。激活與血管生成相關的 Notch 信號后，長管狀骨的 H 亞型血管內皮細胞增加，分泌的 Noggin 蛋白增多，刺激軟骨細胞成熟、小梁形成以及骨祖細胞增殖，加速骨礦化及血管生成[6]。此外，H 亞型血管內皮細胞還能分泌 VEGF，再次支持血管生成以及激活血管周圍骨祖細胞和成骨細胞。Gao 等[7]通過酶消化和密度梯度離心法成功分離 H 亞型血管內皮細胞，并對其進行純化，證實了 H 亞型血管內皮細胞的存在。
經典信號通路也有促進血管化等作用，如 Akt/Bad/Bcl-2、P13K/Akt、Notch、VEGF/VEGFR、Wnt5a[6, 8-9]。Akt/Bad/Bcl-2 信號通路能夠抑制糖皮質激素相關內質網應激誘導的大鼠股骨頭細胞凋亡，而 Akt 途徑又可以激活血管生成信號通路，在抑制細胞凋亡與促血管化方面起到雙重作用[8]。
2 利用組織工程技術治療 ONFH 的研究進展
大段骨缺損修復困難主要與其解剖部位血供不足有關，而利用組織工程技術體外構建富含血運的骨組織，可以直接修復股骨頭骨缺損區域。目前組織工程技術促進血管化的方法主要基于細胞、生長因子、支架材料三大因素，同時聯合 3D 打印技術、藥物遞送系統等[10]。
2.1 細胞與血管化再生
2.1.1 MSCs 作用與機制
研究表明，MSCs 參與調控機體血管形成，在促進組織修復方面具有一定優勢[11]。不同來源的 MSCs 具有多譜系分化潛能，在一定條件下能夠誘導分化為多種細胞類型，如成骨細胞、內皮細胞等，因此其可能具有成骨和成血管雙重作用，有望同時促進骨修復及血管生成[12-13]。Abudusaimi 等[14]通過移植自體脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）治療激素性 ONFH，結果顯示不僅能增加骨鈣素的表達促進新骨形成，還可改善骨壞死區域血供。Pak[15]從 2 例 ONFH 伴嚴重髖關節疼痛患者的脂肪組織中提取自體 ADSCs，然后經皮注射至患側髖關節內，4 周后患者關節疼痛減輕，MRI 顯示伴新生血管的骨組織再生。Chen 等[16]對 9 例國際骨循環協會（ARCO）Ⅱ～Ⅲa 期 ONFH 患者經動脈注射臍帶 MSCs，采用氧氣輸送指數（oxygen delivery index，ODI）評估組織有效灌注率，結果顯示術后 3 d ODI 增高，12、24 個月 MRI 顯示 ONFH 骨壞死體積明顯減小。Chen 等認為這可能與臍帶 MSCs 遷移至壞死區域，并分化為成骨細胞或內皮細胞有關。此外，MSCs 還可以通過旁分泌途徑分泌多種生長因子來加速壞死區域的血管新生。上述研究結果提示 MSCs 可用于 ONFH 治療，能促進骨修復及血管生成。
2.1.2 內皮細胞調節血管形成功能
血管擴散能力有限，體內細胞與毛細血管網距離不宜超過 100～200 μm，超出此范圍難以保證營養物質的供應[17]。因此植入體內的移植物形成內部毛細血管網或加速與宿主血管吻合，是保證移植物成活的關鍵。內皮細胞是一類血管形成或血管新生的主要細胞，其存在 2 種特定亞型：H 亞型與 L 亞型血管內皮細胞。特別是 H 亞型血管內皮細胞，在調控成骨微環境和骨形成過程中起重要作用，通過產生獨特的代謝和分子微環境，不僅介導骨骼脈管系統的生長，還為血管周圍骨祖細胞提供生態位信號[4]。
內皮祖細胞是一類可定向增殖分化為內皮細胞的前體細胞，可在損傷及缺血缺氧的區域被觀察到，維持血管穩定（如血管修復）和啟動新生血管形成。在正常生理活動中，外源性和內源性因素可刺激骨髓來源的內皮祖細胞增殖并釋放進入外周血，調控新血管形成；而發生 ONFH 后，宿主內循環的內皮祖細胞數量及聚集能力顯著下降，迅速衰老，成血管能力大大受損[18]。
將不同類型細胞共培養能通過細胞間相互調控作用，促進細胞定向分化。有研究提示將內皮細胞或內皮祖細胞單獨或與其他骨細胞共培養后，這些細胞能夠直接參與或以旁分泌形式分泌多種血管活性因子加速血管化，經體外培養后形成初級血管結構，植入動物體內后與宿主成熟血管以吻合方式互相連通[11]。這種體外血管預構形式能實現移植物體內早期血管化，更好地保證植入細胞的成活，對成骨分化也有著積極的影響。Zigdon-Giladi 等[19]將 MSCs 和內皮祖細胞共培養后植入嚴重骨缺損大鼠體內，可以觀察到大量血管生成，MSCs 分化為成骨細胞，還將宿主內皮祖細胞和 MSCs 募集到壞死部位，證實兩種細胞聯合移植具有協同修復骨缺損作用，顯示出良好的骨再生和血管化潛能。上述不同類型細胞聯合移植在骨再生及血管再生方面效果均優于單一細胞[20]。但也有報道提出植入的內皮細胞不能形成廣泛的功能性血管網[21]。
2.1.3 細胞膜片技術的應用
各種類型細胞膜片已用于組織或器官的構建，膜片組織能保留豐富的細胞外基質和表面蛋白，保持細胞間整個信號通訊網絡，也能實現多種細胞的共培養體系。目前，已有將不同類型細胞膜片復合，成功構建組織工程骨并修復骨缺損的報道[22-23]。近年來，利用高細胞密度的細胞膜片技術合成仿生骨膜也是促進股骨頭血管化策略之一。正常股骨頭骨膜是骨組織血供來源之一，支持骨營養及骨再生。Ren 等[22]將人臍靜脈內皮細胞接種在未分化的 BMSCs 細胞膜片上，復合形成預血管化仿生骨膜組織。體外實驗結果表明該復合物改變了人臍靜脈內皮細胞的排列，促進血管樣網絡的形成，且植入體內后快速與宿主血管系統吻合，形成功能性血管。
然而細胞膜片機械性能較弱，可進一步與支架結合，形成可塑性強、機械強度大的三維組織結構。Zhang 等[23]采用兔來源 ADSCs 制備成骨細胞膜片和內皮細胞膜片，組成具有成骨和血管形成潛力的雙細胞膜片復合物后覆蓋于羥基磷灰石支架，然后植入裸鼠皮下，移植 12 周后該復合物出現明顯膠原纖維礦化和血管化，毛細血管生成增多，成骨及成血管能力遠優于單純羥基磷灰石支架。
此外，細胞膜片技術還存在細胞數量需求較大、體外培養周期長等問題，膜片制備技術仍需進一步優化。
2.1.4 細胞外泌體的作用
外泌體是細胞分泌的細胞外囊泡，含有豐富的蛋白質、脂質、微小 RNAs（micro RNAs，miRNAs），傳遞細胞間信號，調節免疫、炎癥反應及促進損傷細胞自我修復等生理過程。血管內皮細胞釋放的外泌體被認為是血管形成的重要介質，是其發揮細胞間和細胞-基質間相互作用以及與外界溝通的關鍵因子，將各種信號級聯傳遞至靶細胞，參與細胞生長、遷移和血管發育的調節[5]。而 MSCs 釋放的外泌體可以直接將 miRNAs 轉移至血管內皮細胞促進血管生成[24]。有學者指出局部缺氧環境能刺激細胞外泌體增加，加速血管新生[4]。Song 等[25]研究發現血管內皮細胞釋放的外泌體能夠高效特異性靶向骨組織，抑制破骨細胞活性，并可通過遞送 miR-15 促進骨再生。張根生等[3]的研究體外構建過表達 miRNA-27a 的人臍靜脈血管內皮細胞來源外泌體，經尾靜脈注射至小鼠體內，可明顯改善激素性 ONFH，在一定程度上促進骨再生。Liu 等[26]將人誘導多能干細胞來源的 MSCs 分泌的外泌體經靜脈注射至激素性 ONFH 大鼠體內，3 周后局部微血管密度增加，體外血管內皮細胞增殖、遷移和成管等實驗表明血管內皮細胞增殖、遷移和成管能力增強，而這與外泌體激活了與血管生成相關的 P13K/Akt 信號通路有關。
2.2 支架材料與血管化
理想的骨支架材料應保持細胞活力，允許細胞附著、增殖和歸巢以及提供機械支撐，此外還應允許宿主微循環流動，宿主血管侵入支架材料中心形成新的脈管系統，從而達到長期血管化并募集 MSCs，以促進骨發育。支架結構形態會影響其植入后血管生成與成骨分化，孔隙率是一個關鍵參數，決定細胞在支架遷移的速度以及支架實現血管化所需時間。支架孔隙過小會限制宿主血管入侵，過大則導致孔隙之間交聯不足。文獻報道 200～500 μm 是支架骨再生和血管形成的最理想孔徑[27]。
3D 打印技術能夠有效控制支架孔隙率，還允許內部結構相互連通，高精度地形成多層次組織和器官樣結構。Liu 等[28]在多孔三維骨支架接種 BMSCs，培養 3 周后加入人臍靜脈內皮細胞，6 d 后加入纖維蛋白填充孔隙以提供一種水凝膠環境，之后細胞迅速增殖，在支架內部人臍靜脈內皮細胞出芽并形成微血管結構。構建與原位骨組織力學性能相似的支架是骨組織工程研究一直以來的關注點，支架的結構設計與材料選擇非常重要。Maruyama 等[29]利用 3D 打印技術制備多孔聚己內酯-β 磷酸三鈣支架，該支架通過提供機械支撐來改善兔髓芯減壓術后股骨頭骨生長。此外，還可以將天然材料與化學材料進行加工融合制備支架材料，如人或動物的膠原、脫蛋白骨以及聚己內酯等[30]。多孔結構支架雖然保證了血管與骨長入的空間，但也削弱了機械支撐，因此支架還可以進一步融合堅韌的納米材料來提高機械支撐。
目前對支架材料的研究己從動物實驗逐漸轉向臨床應用階段，單一支架材料不能完全滿足骨缺損修復所有要求，特別是血管生成。綜合應用 3D 打印技術、納米技術、細胞膜片技術等新技術，設計多功能生物材料或血管化骨支架是未來研究的方向。
2.3 生長因子與血管化
2.3.1 生長因子類型及作用
多種生長因子參與調控血管新生，在組織工程構建中引入生長因子，可有效刺激內皮細胞、內皮祖細胞、成骨細胞、BMSCs 等細胞遷移與增殖，促進血管形成及成熟。現已知 VEGF、BMP、缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）、IGF、FGF 以及富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）等均具有直接或間接加速 ONFH 血管化的作用。
VEGF 又稱血管通透性因子，是一種血管內皮細胞特異性的促有絲分裂原，能夠調節脈管系統的生長。主要作用機制為通過與血管內皮細胞表面特異性受體相結合，誘導細胞定向移動、分裂以及增殖。此外，VEGF 還具有維持血管周圍骨祖細胞和成骨細胞的功能，在促成骨及血管侵入的骨修復過程中扮演著重要角色。
BMP 為體內成骨及成軟骨誘導主要因子，能夠同時促進骨再生與刺激新血管形成。在 ONFH 壞死區 BMP-4 mRNA 高表達，骨硬化加速，而 BMP-7 則通過促進 BMSCs 的增殖及成骨分化起保護作用，二者維系著成骨平衡[31-32]。
HIF 負責調控細胞對氧氣的感知這一重要生理過程，一旦激活 HIF-1α 通路，多種促血管生長細胞因子包括 VEGF-A、基質細胞衍生因子1、胎盤生長因子和血管生成素表達均增加，這些因子均是生理血管形成所必需的，特別是 VEGF-A 上升，不僅誘導內皮細胞和內皮細胞轉錄物上調，增加了 VEGF mRNA 的表達，還能促進骨祖細胞和成骨細胞標記表達水平增加[4, 33]。馮勇[18]應用 HIF-1α 激活劑二甲基乙二酰基甘氨酸激活內皮祖細胞中 HIF-1α 蛋白表達，結果顯示內皮祖細胞增殖能力以及成血管能力顯著提高，在壞死區觀察到新骨形成與血管密度增加。
脂質代謝紊亂是導致 ONFH 的因素之一，IGF 能夠作用于脂肪細胞促進脂肪分解，降低血液中甘油三酯水平。Song 等[34]研究了中國人群 ONFH 與相關基因變異之間的關系，發現作為成脂分化的中樞調節因子胰島素樣結合蛋白 3（insulin growth factor binding protein 3，IGFBP3），其基因型 IGFBP3rs2132572、IGFBP3rs24538th9、IGFBP3rs3110697 與 ONFH 風險和雙側髖關節病變密切相關，通過干擾脂肪細胞分化依賴的 PPAR-γ 途徑、維持成熟脂肪細胞的基因表達、減少脂質積累，在一定程度上能延緩 ONFH 進展，這與 Wang 等[35]的研究結果一致。
FGF 被認為是體內最有效的血管生長因子之一。Kuroda 等[36]利用水凝明膠混合 rhFGF-2 治療 10 例塌陷前期 ONFH 患者，術后 1 年患者平均臨床評分顯著提高，除 1 例發生股骨頭塌陷外，其他 9 例未發生階段進展或塌陷；Peng等[37]應用經慢病毒轉染 bFGF 的 MSCs 聯合松質骨移植修復兔股骨頭，獲得較好效果。他們發現這與激活 OPG/RANK/RANKL 通路有關，該通路維持促骨生長的成骨細胞及促骨吸收的破骨細胞之間的平衡，被認為是骨代謝重要途徑。
PRP 因富含 FGF、TGF、IGF 和 PDGF 等因子，在刺激新骨和血管組織形成方面具有巨大應用前景[38]。Tong 等[39]采用 PRP 治療小鼠 ONFH，相關炎癥因子如 IL-17A、IL-1β、TNF-α、NK-κB 受體激活劑配體、IL-6 和干擾素-γ 等表達下調，而細胞間黏附分子 1、PDGF、VEGF、IGF、TGF-β 等表達上調。此外，PRP 還能顯著降低血液黏度、血漿黏度及紅細胞聚集性，改善 ONFH 血液流變學指標，在一定程度上改善股骨頭供血動脈的梗阻，修復局部血管[40]。見表 1。
表1
生長因子在促進股骨頭再血管化中的作用
Table1.
Effect of growth factors in promoting revascularization of the femoral head
2.3.2 生長因子存在問題及解決方法
生長因子存在生物半衰期過短、局部有效濃度難以控制等問題，可與緩釋系統聯合應用，在特定的骨壞死區域連續遞送血管生成因子與成骨因子。Dailiana 等[2]利用滲透微泵連續輸送 VEGF 治療犬 ONFH，12 周后出現骨壞死逆轉，他認為經過有效的再血管化，能阻止壞死進一步發展。Wang 等[41]將 rhBMP-2 包埋于聚乳酸-羥基磷灰石微球，使其緩慢釋放達 4 周，之后觀察到死骨被大量新生骨組織包裹，在壞死骨內部可見許多新生血管。此外，基因治療技術在生長因子控釋方面也獲得較好效果，攜帶生長因子的基因片段通過載體病毒或脂質體轉染至種子細胞，賦予種子細胞持續穩定表達一種或多種生長因子的能力，使細胞具有更強的促血管化與成骨能力。Liao 等[42]利用腺病毒將 VEGF 和 BMP-6 基因片段轉染至 BMSCs，經過擴增并篩選出高表達的 BMSCs 后，將其與仿生合成支架聚丙交酯-乙交酯復合培養，最后植入裸鼠皮下；4 周后發現 VEGF 和 BMP-6 表達水平顯著增加，毛細血管數量和骨形成明顯高于其他對照組。雖然基因修飾取得一定促血管化結果，但也存在與載體病毒相關的生物安全風險。另外體內血管化往往是多種生長因子共同參與的級聯反應，因此與單用一種因子相比，多種因子聯合應用可達到更快速形成更致密、更成熟血管系統的目的，促血管效果更顯著[43]。
生長因子治療可以在股骨頭塌陷前任意階段進行，無需考慮 ONFH 病因，這可能是在 ONFH 早期一種有用的治療形式。雖然，目前動物實驗結果顯示生長因子能有效促進股骨頭骨組織血管化，但該治療方式缺乏特異性且價格昂貴，也缺乏臨床治療有效性的有力證據，因此仍需進一步系統、有效的臨床研究。
3 3D 打印技術
3D 打印技術是基于數字三維模型，按照增材制造原理定位裝配生物材料或細胞單元，構建具有類似于天然對應物分層結構的生物結構[44]，滿足了支架或無支架組織和器官構建的需求。骨生物打印可替代傳統的自體和同種異體骨移植，避免了與傳統骨移植相關的移植物不適合、供體部位并發癥、免疫原性和疾病傳播風險等問題，有望成為治療 ONFH 的方法。
3D 打印技術制備的三維支架具有相互連接孔隙和較大的體表面積，支持細胞附著、生長、細胞間通訊以及氣體和營養物質的交換，遠遠優于傳統溶劑澆鑄、相分離和熔融成型技術[28-29]。通過 3D 打印技術，還能在構建支架基礎上同時添加促成骨及血管生成的材料。Fielding 等[45]在 3D 打印磷酸三鈣支架基礎上，加入具有成骨誘導及促進血管生成的金屬氧化物二氧化硅和氧化鋅，然后修復小鼠股骨缺損模型，16 周后Ⅰ型膠原和骨鈣素水平上調，提示早期骨形成能力提高，新血管形成數量是單一磷酸三鈣支架的 3 倍。此外，構建具有功能性脈管系統的三維大規模骨組織構建體也是治療 ONFH 策略之一。Byambaa 等[46]利用 3D 打印技術制造包含可灌注血管腔微結構的骨狀組織復合體，首先打印硅酸鹽納米片負載甲基丙烯酰水凝膠圓柱體，內載有 hMSCs 以誘導成骨；同時合成具有 VEGF 的水凝膠制劑，建立生長因子內在梯度，以進一步促進人臍靜脈內皮細胞增殖，促進微毛細管形成。體外試驗表明構建體既能支持成骨，又能支持血管生成。
自然組織再生涉及復雜的三維結構、細胞功能和細胞外基質以及組織結構的動態變化。特別是近年來提出的 4D 生物打印將時間概念作為第四維度與 3D 打印相結合，以期隨著時間推移實現組織功能轉化與成熟[47]。
4 藥物遞送系統
隨著醫學、工學、材料、機械、藥物等領域的快速發展，大量研究對藥物本身、搭載藥物的載體材料等進行物理化學改性、修飾，不僅實現了藥物緩釋，而且能夠對藥物緩釋曲線進行更精確及智能調控、靶向治療瞄準特定的病變部位，局部藥物濃度能夠在較長時間內維持在有效范圍內。藥物遞送系統的快速發展對靶向治療 ONFH 有著積極作用，將組織工程技術與藥物遞送系統結合起來，對增強 ONFH 治療效果有一定意義。
在組織工程中藥物遞送系統主要包括無機材料、高分子材料（如明膠、海藻酸鹽、殼聚糖、滲透微泵、聚乳酸-羥基磷灰石微球、微球、載體病毒或脂質體）等。相關細胞生長因子通過與多種藥物遞送系統聯合應用，能達到持續遞送 VEGF 或成骨因子的目的[2, 41-42]。藥物遞送系統除了能夠遞送藥物外，還能遞送細胞所需的營養物質刺激細胞增殖。Wang 等[48]設計的 CaO2/明膠微球可以持續釋放氧氣達 19 d，通過靶向提供氧氣以促進極端缺氧條件下的細胞增殖，減少局部細胞凋亡并提高移植細胞存活率，增強移植干細胞的血管生成及細胞存活來提高 ONFH 治療效果。
5 總結與展望
如何改善局部血液供應，延緩甚至逆轉 ONFH 進展是臨床治療一大挑戰。利用骨組織工程促使股骨頭再血管化是目前研究熱點，已有研究證實該方法能夠延緩疾病進展，在治療 ONFH 方面取得一定成效[49]。但目前相關研究以動物實驗為主，臨床應用尚在試驗階段，因此仍需多方研究證實療效。基于種子細胞、支架材料以及促血管生成因子等促血管化策略的效果及其差異尚未明確，但聯合重建骨組織所需元素和血管網已被證明有效，能夠較快形成成熟的新血管并維持穩定。未來通過基因技術深入了解并引入成骨遺傳物質，同時聯合骨組織工程技術，有望為治療 ONFH 提供新思路及方法。
作者貢獻：林苗遠、李豫皖負責綜述構思設計；閆文強、胡寧負責文章寫作校對；林苗遠、李豫皖、楊繼濱、劉子銘參與文獻收集、分析總結；張莉、李豫皖負責項目指導。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點及其報道。
