引用本文： 張國婧, 萬子琳, 王小燕, 黃云超, 周友全, 陳穎, 雷玉潔, 喬麗梅. 表皮葡萄球菌胞間黏附素基因操縱子對細菌與真菌混合生物膜相關炎癥作用影響的體內研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(10): 1328-1335. doi: 10.7507/1002-1892.202104061 復制
目前，臨床麻醉常用的氣管導管通常為聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）制成，使用此類氣管導管時可能發生以生物材料為中心形成感染（biomaterial centered infection，BCI）這一嚴重并發癥。PVC 材料觸發的微生物黏附和生物膜形成通常與表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌相關，有研究發現存在白假絲酵母菌生物膜結構是導致患者死亡率增加的危險因素[1-3]。表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌作為共生生物存在于人體中，是免疫功能低下患者體內的機會病原體，能形成具有多細胞結構的混合生物膜，由此引發的 BCI 具有復發性、難治性及耐藥性等特點[4-6]。
表皮葡萄球菌胞間黏附素基因（intercellular adhesion，ica）操縱子是生物膜形成過程中重要的調控基因。體外實驗顯示在細菌與真菌混合生長過程中，ica 操縱子會影響混合生物膜的立體結構，但其對動物或人類宿主體內混合生物膜形成及感染后炎癥等有無影響尚未明確[7-10]。微生物組入侵和宿主免疫系統功能降低是促進表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌等機會病原體從共生狀態轉變為致病狀態的條件，進而介導了體內炎癥的開始。炎癥因子的表達和釋放是 BCI 中重要免疫反應，體內混合生物膜的形成可能會導致細菌及真菌全身播散增加，并引起強烈的免疫反應，局部細胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 等相應升高[11-14]。因此，細胞因子水平變化是臨床早期監測混合生物膜感染的良好指標[15-17]。本研究旨在通過動物實驗，觀察表皮葡萄球菌 ica 操縱子對氣管導管表面的表皮葡萄球菌與白假絲酵母菌混合生物膜炎癥作用的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6 月齡健康新西蘭兔 30 只，雌雄不限，體質量（2.5±0.5）kg，由昆明醫科大學實驗動物學部提供，實驗前適應性飼養 1 周。
表皮葡萄球菌標準株 RP62A（ica 操縱子陽性；美國典型菌種保藏中心）；表皮葡萄球菌標準株 ATCC12228（ica 操縱子陰性）、白假絲酵母菌標準株 ATCC10231（中國科學院微生物研究所）；PVC 氣管導管（杭州坦帕醫療科技有限公司）；MH 瓊脂平板、沙保羅瓊脂平板、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（tryptic soy broth，TSB）、胰酪胨大豆羊血瓊脂平板（廣州環凱生物科技有限公司）；IL-1β、單核細胞趨化蛋白 1（monocytechemotactic protein 1，MCP-1）檢測試劑盒（武漢云克隆科技有限公司）；TNF-α、IL-6 檢測試劑盒（Signalway Antibody 公司，美國）。多功能酶標儀（Thermo 公司，美國）；掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 氣管導管材料表面混合生物膜制備及觀測
① 制備方法：將表皮葡萄球菌標準株 RP62A、ATCC12228 接種于 MH 瓊脂平板，白假絲酵母菌標準株 ATCC10231 接種至沙保羅瓊脂平板，37℃ 隔水式恒溫培養箱培養 24 h。選取平板上單個菌落接種至 TSB 培養基，置于 37℃、90 r/min 恒溫搖床中孵育 12～16 h 至對數生長期，用 TSB 培養基將各菌液濃度調整至 1×106 CFU/mL；按照 1∶1 比例，將表皮葡萄球菌標準株 RP62A（陽性組）、ATCC12228（陰性組）菌液分別與白假絲酵母菌標準株 ATCC10231 菌液混合，制備混合培養菌液，均為臨用前配置。
氣管導管材料片使用打孔器制備成直徑為 1 mm 的圓片，滅菌后置于 24 孔細胞培養板，每孔 1 片；分別加入配制的混合培養菌液，每孔 2 mL；置于 37℃ 溫箱孵育 24 h，獲得兩組氣管導管材料表面混合生物膜模型。
② 掃描電鏡觀察：取兩組孵育 24 h 的氣管導管材料，置于 2.5% 戊二醛中固定 24 h，PBS 沖洗 3 次，1% 鋨酸溶液固定后乙醇梯度脫水處理，醋酸異戊酯置換；叔丁醇 40℃ 滲透處理；CO2 臨界干燥、真空鍍金。掃描電鏡下觀察材料表面混合生物膜結構。
1.2.2 動物體內實驗
取 30 只兔耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后，取仰臥位固定四肢，頸部備皮，0.5% 聚維酮碘消毒，鋪無菌洞巾。作頸部正中切口 2 cm，切開皮膚筋膜，分離組織肌肉，于氣管旁植入孵育 24 h 的陽性組或陰性組氣管導管材料，每組 15 只兔，每只植入 2 片氣管導管材料。縫合頸部切口。術后正常飲食。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察兩組兔存活情況，于術前（0 d）及術后 1、3、7 d 采用電子稱測量體質量。
1.3.2 ELISA 檢測血漿炎癥因子
術后 1、3、7 d，兩組兔耳緣靜脈采血 3 mL，采用 ELISA 檢測試劑盒檢測血漿中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MCP-1 水平。
1.3.3 掃描電鏡觀察
術后 7 d，兩組兔經注射過量麻醉藥物處死后，按照原切口入路，取出氣管導管材料，同 1.2.1 方法處理后掃描電鏡觀察材料表面混合細菌膜形成。
1.3.4 組織學觀察
術后 7 d，取兩組氣管導管材料周圍組織置于甲醛中固定，石蠟包埋，切片（片厚 5 μm），常規 HE 染色后光鏡下觀察組織炎癥細胞浸潤情況。
1.3.5 器官細菌感染檢測
術后 7 d，取兩組兔心臟、肺、肝臟、腎臟組織各 1 g，組織勻漿后接種于胰酪胨大豆羊血瓊脂平板，采用平板菌落計數法觀察器官細菌感染情況。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。計量資料符合正態分布時，以均數±標準差表示，兩組比較采用重復測量方差分析，若不滿足球形檢驗，采用 Greenhouse-Geisser 法進行校正，同一組別不同時間點比較采用 Bonferroni 法，同一時間點不同組別間比較采用多因素方差分析；不符合正態分布時，以中位數（四分位數間距）表示，組間比較采用 Wilcoxon 秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 氣管導管材料表面混合生物膜形成觀察
體外孵育 24 h 后，掃描電鏡下陽性組可見表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌菌絲及孢子混雜生長，形成具有復雜多層次結構的混合生物膜；陰性組表皮葡萄球菌呈團狀生長，未見立體結構的混合生物膜形成。見圖 1。
圖1
體外孵育 24 h 后掃描電鏡觀察兩組氣管導管材料表面混合生物膜形成
紅色箭頭示表皮葡萄球菌 綠色箭頭示白假絲酵母菌 a. 陽性組（×2 000）；b. 陽性組（×4 000）；c. 陰性組（×2 000）；d. 陰性組（×4 000）
Figure1. Scanning electron microscope observation of the mixed biofilm formation on the surface of the endotracheal tube materials of the two groups after 24 hours in vitro incubationRed arrows indicated Staphylococcus epidermidis Green arrows indicated Candida albicans a. Positive group (×2 000); b. Positive group (×4 000); c. Negative group (×2 000); d. Negative group (×4 000)
2.2 動物體內實驗觀測
2.2.1 一般情況
實驗過程中因麻醉意外死亡 2 只、靜脈栓塞死亡 1 只，均相應補充。兩組術前及術后 1、3、7 d 體質量比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見圖 2、表 1。
圖2
兩組體質量變化趨勢
Figure2.
Changes in body mass of the two groups
表1
兩組手術前后體質量比較（n=15，
，g）
Table1.
Comparison of the body mass of the two groups before and after operation (n=15, 
, g)
2.2.2 ELISA 檢測血漿炎癥因子
與陰性組相比，陽性組術后 1 d MCP-1 及 IL-1β 水平，術后 3、7 d IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α 水平均升高，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。其余時間點組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2、圖 3。
表2
兩組術后各時間點血漿炎癥因子水平比較（n=15，
）
Table2.
Comparison of plasma inflammatory factor levels between the two groups at various time points after operation (n=15, 
)
圖3
兩組術后血漿炎癥因子變化趨勢
a. IL-1β；b. MCP-1；c. IL-6；d. TNF-α
Figure3. Changes of plasma inflammatory factors in the two groups after operationa. IL-1β; b. MCP-1; c. IL-6; d. TNF-α
2.2.3 掃描電鏡觀察
術后 7 d 陽性組可見大量炎癥細胞浸潤吞噬細菌及真菌，大片殘留表皮葡萄球菌，且觀察到混合生物膜結構。陰性組可見炎癥細胞浸潤，與陽性組相比只殘余極少量表皮葡萄球菌，未觀察到混合生物膜結構。見圖 4。
圖4
術后 7 d 兩組氣管導管材料掃描電鏡觀察
紅色箭頭示表皮葡萄球菌 綠色箭頭示白假絲酵母菌 藍色箭頭示炎癥細胞 a. 陽性組（×2 000）；b. 陽性組（×4 000）；c. 陰性組（×2 000）；d. 陰性組（×4 000）
Figure4. Scanning electron microscope observation of endotracheal tube materials in the two groups at 7 days after operationRed arrows indicated Staphylococcus epidermidis Green arrows indicated Candida albicans Blue arrows indicated inflammatory cells a. Positive group (×2 000); b. Positive group (×4 000); c. Negative group (×2 000); d. Negative group (×4 000)
2.2.4 組織學觀察
術后 7 d 兩組氣管導管材料周圍組織均可見明顯炎癥細胞浸潤。與陰性組相比，陽性組周圍組織中中性粒細胞與淋巴細胞浸潤更嚴重，且有壞死組織。見圖 5。
圖5
術后 7 d 兩組氣管導管材料周圍組織 HE 染色觀察
從左至右分別為放大 40、200、400 倍 a. 陽性組；b. 陰性組
Figure5. HE staining observation of tissues surrounding endotracheal tube materials in the two groups at 7 days after operationFrom left to right for magnifications of 40, 200, and 400 times, respectively a. Positive group; b. Negative group
2.2.5 器官細菌感染檢測
兩組心臟、肝臟細菌感染數量差異無統計學意義（P>0.05）；陽性組肺、腎臟細菌感染數量高于陰性組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
術后 7 d 兩組器官細菌感染情況比較 ［n=15，M（P25，P75），CFU/g］
Table3.
Comparison of bacterial infections in organs at 7 days after operation [n=15，M (P25, P75), CFU/g]
3 討論
凝固酶陰性葡萄球菌與念珠菌屬形成的混合微生物感染是重要的醫院內感染類型，其中約 25% 患者由于念珠菌屬感染而引發菌血癥，故與混合微生物相關的 BCI 日益受到臨床關注[18]。BCI 發生的重要機制是機體細菌與真菌感染后形成混合生物膜，以往研究多集中于探討 ica 操縱子在單一微生物感染或體外生物膜中的作用，但在多種微生物感染背景下，了解種間相互作用及其對宿主的具體影響至關重要，因此進行符合人類宿主因素的體內研究成為新的挑戰[19]。在體內環境中，抵抗細菌與真菌感染的第一道防線是由先天免疫應答介導的，免疫細胞表面表達的模式識別受體（pattern-recognition receptor，PRR）可以識別病原體中相關的分子模式，PRR 包括巨噬細胞和樹突狀細胞中存在的 Toll 樣受體（toll like receptor，TLR）和 C 型凝集素受體[20]，大多數真菌的細胞壁組成成分可以通過 TLR-2、TLR-4 和 TLR-9 觸發炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 等的表達[21]。其中 IL-6 釋放與宿主體內微生物的感染密切相關，其水平升高會導致患者并發癥發生率和死亡率增加[22]。
本課題組前期體外研究將濃度為 1×106 CFU/mL 的 ica 操縱子陽性表皮葡萄球菌與白假絲酵母菌混合培養 24 h，在氣管導管材料表面能形成結構成熟的混合生物膜[23]，故本次研究按照此方法制備氣管導管材料混合生物膜后放置于兔體內。術后 7 d 陽性組 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平均明顯高于陰性組，說明 ica 操縱子介導的混合生物膜導致炎癥因子持續升高。有研究表明，在與白假絲酵母菌相關的混合生物膜體內模型中，炎癥因子水平明顯上調，分析可能與混合生物膜誘導炎癥因子表達增加有關[2, 24]。Holt 等[4]的研究同樣表明，在線蟲宿主體內，白假絲酵母菌與表皮葡萄球菌形成的混合生物膜陽性組感染水平較未形成混合生物膜的陰性組升高，真菌細胞外基質可能是造成生物膜感染毒力增強的原因。本研究結果顯示，術后 7 d 陽性組肺、腎臟細菌數量多于陰性組，提示 ica 操縱子介導了陽性組混合生物膜的形成，導致體內細菌在肺以及腎臟的傳播增強。Pammi 等[18]的研究也證實了混合生物膜相關的導管感染可導致表皮葡萄球菌向全身播散程度增加。另外，掃描電鏡觀察顯示陽性組氣管導管材料殘余大量細菌，并存在混合生物膜結構，而陰性組清除情況良好。結合上述檢測指標結果分析，ica 操縱子可能加強了混合生物膜結構，導致細菌感染持續存在。
表皮葡萄球菌 ica 操縱子介導的四基因產物多糖細胞間黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）是細菌黏附生物材料過程中的重要因素，在細菌黏附后期聚集階段，可能起到保護細菌免受宿主吞噬、改善局部營養環境的作用[25]。與白假絲酵母菌相關的混合感染研究顯示，PIA 加強了感染，提高了宿主死亡率。PIA 可以在宿主體內大量產生并大量消耗機體能量，這需要表達 ica 操縱子來進行嚴格調控。而研究表明 PIA 的產生和 ica 操縱子的表達取決于環境條件，這可能是 PIA 在不同葡萄球菌菌株以及不同類型感染中差異性表達的基礎[26]。在與白假絲酵母菌共生的環境中，ica 操縱子可能在增加細菌總體毒力方面發揮了作用，使共生的表皮葡萄球菌菌株更具有侵襲性，增強了混合生物膜結構和播散能力，導致細菌在宿主體內感染擴散增強且難以清除[27]。既往研究已經確定了 Sar 蛋白家族、TcaR、σB、生物膜調節劑 Rbf、LuxS 等調節蛋白可直接作用于 ica 操縱子 DNA，而 ica 操縱子也可能通過改變調節蛋白的表達或活性與調節蛋白產生相互作用[26]。即使在調節蛋白已被證明與 ica 操縱子 DNA 相結合的情況下，這些因子是如何調節轉錄仍不完全清楚[28]。有研究認為多種調節因子在感染期間很可能共表達，但缺少關于這些因子如何與 DNA 或其他大分子相互作用來調節 ica 操縱子表達的信息。在與白假絲酵母菌的混合體內感染中，真菌也可以產生細胞外聚合物質（extracellular polymeric substances，EPS）調節生物膜和感染毒力，其他物種的 EPS 與 ica 操縱子調節的蛋白質是否也能發生相互作用并共同調節基因表達的信息，有待深入探究。
ica 操縱子介導的混合物感染可能導致臨床治療效果不理想，增加了患者感染發生率和死亡率[29]。此外，從臨床 BCI 患者氣管導管裝置表面獲得的表皮葡萄球菌分離株，其 ica 操縱子基因座陽性率比常見的表皮葡萄球菌分離株更高，更具耐藥性[30]。本研究結果提示，ica 操縱子可能導致了氣管導管材料表面細菌與真菌混合生物膜的加強及傳播，造成感染的難治性，炎癥遷延不愈。由于植入的氣管導管周圍環境復雜，這些條件很難在體外或動物模型中復制，且與 ica 操縱子作用產物相關的調節機制仍不清楚。因此，本研究僅對 ica 操縱子對混合生物膜相關炎癥作用影響進行了初步體內探索，將進一步研究與 ica 操縱子調節多種微生物相關感染機制。
作者貢獻：張國婧負責實驗規劃及實施、數據收集整理及統計學分析、文章撰寫；萬子琳參與實驗實施、協助數據收集整理；周友全、陳穎、雷玉潔、喬麗梅協助數據收集整理、細菌復蘇轉板及生物材料制備；黃云超、王小燕負責實驗設計、指導實驗實施及文章撰寫，對文章內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中無利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經昆明醫科大學動物實驗倫理審查委員會批準（KMMU2021007）。實驗動物使用許可證號：SYXK（滇）2020-0006。
目前，臨床麻醉常用的氣管導管通常為聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）制成，使用此類氣管導管時可能發生以生物材料為中心形成感染（biomaterial centered infection，BCI）這一嚴重并發癥。PVC 材料觸發的微生物黏附和生物膜形成通常與表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌相關，有研究發現存在白假絲酵母菌生物膜結構是導致患者死亡率增加的危險因素[1-3]。表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌作為共生生物存在于人體中，是免疫功能低下患者體內的機會病原體，能形成具有多細胞結構的混合生物膜，由此引發的 BCI 具有復發性、難治性及耐藥性等特點[4-6]。
表皮葡萄球菌胞間黏附素基因（intercellular adhesion，ica）操縱子是生物膜形成過程中重要的調控基因。體外實驗顯示在細菌與真菌混合生長過程中，ica 操縱子會影響混合生物膜的立體結構，但其對動物或人類宿主體內混合生物膜形成及感染后炎癥等有無影響尚未明確[7-10]。微生物組入侵和宿主免疫系統功能降低是促進表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌等機會病原體從共生狀態轉變為致病狀態的條件，進而介導了體內炎癥的開始。炎癥因子的表達和釋放是 BCI 中重要免疫反應，體內混合生物膜的形成可能會導致細菌及真菌全身播散增加，并引起強烈的免疫反應，局部細胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 等相應升高[11-14]。因此，細胞因子水平變化是臨床早期監測混合生物膜感染的良好指標[15-17]。本研究旨在通過動物實驗，觀察表皮葡萄球菌 ica 操縱子對氣管導管表面的表皮葡萄球菌與白假絲酵母菌混合生物膜炎癥作用的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4～6 月齡健康新西蘭兔 30 只，雌雄不限，體質量（2.5±0.5）kg，由昆明醫科大學實驗動物學部提供，實驗前適應性飼養 1 周。
表皮葡萄球菌標準株 RP62A（ica 操縱子陽性；美國典型菌種保藏中心）；表皮葡萄球菌標準株 ATCC12228（ica 操縱子陰性）、白假絲酵母菌標準株 ATCC10231（中國科學院微生物研究所）；PVC 氣管導管（杭州坦帕醫療科技有限公司）；MH 瓊脂平板、沙保羅瓊脂平板、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（tryptic soy broth，TSB）、胰酪胨大豆羊血瓊脂平板（廣州環凱生物科技有限公司）；IL-1β、單核細胞趨化蛋白 1（monocytechemotactic protein 1，MCP-1）檢測試劑盒（武漢云克隆科技有限公司）；TNF-α、IL-6 檢測試劑盒（Signalway Antibody 公司，美國）。多功能酶標儀（Thermo 公司，美國）；掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）。
1.2 實驗方法
1.2.1 氣管導管材料表面混合生物膜制備及觀測
① 制備方法：將表皮葡萄球菌標準株 RP62A、ATCC12228 接種于 MH 瓊脂平板，白假絲酵母菌標準株 ATCC10231 接種至沙保羅瓊脂平板，37℃ 隔水式恒溫培養箱培養 24 h。選取平板上單個菌落接種至 TSB 培養基，置于 37℃、90 r/min 恒溫搖床中孵育 12～16 h 至對數生長期，用 TSB 培養基將各菌液濃度調整至 1×106 CFU/mL；按照 1∶1 比例，將表皮葡萄球菌標準株 RP62A（陽性組）、ATCC12228（陰性組）菌液分別與白假絲酵母菌標準株 ATCC10231 菌液混合，制備混合培養菌液，均為臨用前配置。
氣管導管材料片使用打孔器制備成直徑為 1 mm 的圓片，滅菌后置于 24 孔細胞培養板，每孔 1 片；分別加入配制的混合培養菌液，每孔 2 mL；置于 37℃ 溫箱孵育 24 h，獲得兩組氣管導管材料表面混合生物膜模型。
② 掃描電鏡觀察：取兩組孵育 24 h 的氣管導管材料，置于 2.5% 戊二醛中固定 24 h，PBS 沖洗 3 次，1% 鋨酸溶液固定后乙醇梯度脫水處理，醋酸異戊酯置換；叔丁醇 40℃ 滲透處理；CO2 臨界干燥、真空鍍金。掃描電鏡下觀察材料表面混合生物膜結構。
1.2.2 動物體內實驗
取 30 只兔耳緣靜脈注射 3% 戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉后，取仰臥位固定四肢，頸部備皮，0.5% 聚維酮碘消毒，鋪無菌洞巾。作頸部正中切口 2 cm，切開皮膚筋膜，分離組織肌肉，于氣管旁植入孵育 24 h 的陽性組或陰性組氣管導管材料，每組 15 只兔，每只植入 2 片氣管導管材料。縫合頸部切口。術后正常飲食。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察兩組兔存活情況，于術前（0 d）及術后 1、3、7 d 采用電子稱測量體質量。
1.3.2 ELISA 檢測血漿炎癥因子
術后 1、3、7 d，兩組兔耳緣靜脈采血 3 mL，采用 ELISA 檢測試劑盒檢測血漿中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和 MCP-1 水平。
1.3.3 掃描電鏡觀察
術后 7 d，兩組兔經注射過量麻醉藥物處死后，按照原切口入路，取出氣管導管材料，同 1.2.1 方法處理后掃描電鏡觀察材料表面混合細菌膜形成。
1.3.4 組織學觀察
術后 7 d，取兩組氣管導管材料周圍組織置于甲醛中固定，石蠟包埋，切片（片厚 5 μm），常規 HE 染色后光鏡下觀察組織炎癥細胞浸潤情況。
1.3.5 器官細菌感染檢測
術后 7 d，取兩組兔心臟、肺、肝臟、腎臟組織各 1 g，組織勻漿后接種于胰酪胨大豆羊血瓊脂平板，采用平板菌落計數法觀察器官細菌感染情況。
1.4 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。計量資料符合正態分布時，以均數±標準差表示，兩組比較采用重復測量方差分析，若不滿足球形檢驗，采用 Greenhouse-Geisser 法進行校正，同一組別不同時間點比較采用 Bonferroni 法，同一時間點不同組別間比較采用多因素方差分析；不符合正態分布時，以中位數（四分位數間距）表示，組間比較采用 Wilcoxon 秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 氣管導管材料表面混合生物膜形成觀察
體外孵育 24 h 后，掃描電鏡下陽性組可見表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌菌絲及孢子混雜生長，形成具有復雜多層次結構的混合生物膜；陰性組表皮葡萄球菌呈團狀生長，未見立體結構的混合生物膜形成。見圖 1。
圖1
體外孵育 24 h 后掃描電鏡觀察兩組氣管導管材料表面混合生物膜形成
紅色箭頭示表皮葡萄球菌 綠色箭頭示白假絲酵母菌 a. 陽性組（×2 000）；b. 陽性組（×4 000）；c. 陰性組（×2 000）；d. 陰性組（×4 000）
Figure1. Scanning electron microscope observation of the mixed biofilm formation on the surface of the endotracheal tube materials of the two groups after 24 hours in vitro incubationRed arrows indicated Staphylococcus epidermidis Green arrows indicated Candida albicans a. Positive group (×2 000); b. Positive group (×4 000); c. Negative group (×2 000); d. Negative group (×4 000)
2.2 動物體內實驗觀測
2.2.1 一般情況
實驗過程中因麻醉意外死亡 2 只、靜脈栓塞死亡 1 只，均相應補充。兩組術前及術后 1、3、7 d 體質量比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見圖 2、表 1。
圖2
兩組體質量變化趨勢
Figure2.
Changes in body mass of the two groups
表1
兩組手術前后體質量比較（n=15，，g）
Table1.
Comparison of the body mass of the two groups before and after operation (n=15, , g)
2.2.2 ELISA 檢測血漿炎癥因子
與陰性組相比，陽性組術后 1 d MCP-1 及 IL-1β 水平，術后 3、7 d IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α 水平均升高，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。其余時間點組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表 2、圖 3。
表2
兩組術后各時間點血漿炎癥因子水平比較（n=15，）
Table2.
Comparison of plasma inflammatory factor levels between the two groups at various time points after operation (n=15, )
圖3
兩組術后血漿炎癥因子變化趨勢
a. IL-1β；b. MCP-1；c. IL-6；d. TNF-α
Figure3. Changes of plasma inflammatory factors in the two groups after operationa. IL-1β; b. MCP-1; c. IL-6; d. TNF-α
2.2.3 掃描電鏡觀察
術后 7 d 陽性組可見大量炎癥細胞浸潤吞噬細菌及真菌，大片殘留表皮葡萄球菌，且觀察到混合生物膜結構。陰性組可見炎癥細胞浸潤，與陽性組相比只殘余極少量表皮葡萄球菌，未觀察到混合生物膜結構。見圖 4。
圖4
術后 7 d 兩組氣管導管材料掃描電鏡觀察
紅色箭頭示表皮葡萄球菌 綠色箭頭示白假絲酵母菌 藍色箭頭示炎癥細胞 a. 陽性組（×2 000）；b. 陽性組（×4 000）；c. 陰性組（×2 000）；d. 陰性組（×4 000）
Figure4. Scanning electron microscope observation of endotracheal tube materials in the two groups at 7 days after operationRed arrows indicated Staphylococcus epidermidis Green arrows indicated Candida albicans Blue arrows indicated inflammatory cells a. Positive group (×2 000); b. Positive group (×4 000); c. Negative group (×2 000); d. Negative group (×4 000)
2.2.4 組織學觀察
術后 7 d 兩組氣管導管材料周圍組織均可見明顯炎癥細胞浸潤。與陰性組相比，陽性組周圍組織中中性粒細胞與淋巴細胞浸潤更嚴重，且有壞死組織。見圖 5。
圖5
術后 7 d 兩組氣管導管材料周圍組織 HE 染色觀察
從左至右分別為放大 40、200、400 倍 a. 陽性組；b. 陰性組
Figure5. HE staining observation of tissues surrounding endotracheal tube materials in the two groups at 7 days after operationFrom left to right for magnifications of 40, 200, and 400 times, respectively a. Positive group; b. Negative group
2.2.5 器官細菌感染檢測
兩組心臟、肝臟細菌感染數量差異無統計學意義（P>0.05）；陽性組肺、腎臟細菌感染數量高于陰性組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3。
表3
術后 7 d 兩組器官細菌感染情況比較 ［n=15，M（P25，P75），CFU/g］
Table3.
Comparison of bacterial infections in organs at 7 days after operation [n=15，M (P25, P75), CFU/g]
3 討論
凝固酶陰性葡萄球菌與念珠菌屬形成的混合微生物感染是重要的醫院內感染類型，其中約 25% 患者由于念珠菌屬感染而引發菌血癥，故與混合微生物相關的 BCI 日益受到臨床關注[18]。BCI 發生的重要機制是機體細菌與真菌感染后形成混合生物膜，以往研究多集中于探討 ica 操縱子在單一微生物感染或體外生物膜中的作用，但在多種微生物感染背景下，了解種間相互作用及其對宿主的具體影響至關重要，因此進行符合人類宿主因素的體內研究成為新的挑戰[19]。在體內環境中，抵抗細菌與真菌感染的第一道防線是由先天免疫應答介導的，免疫細胞表面表達的模式識別受體（pattern-recognition receptor，PRR）可以識別病原體中相關的分子模式，PRR 包括巨噬細胞和樹突狀細胞中存在的 Toll 樣受體（toll like receptor，TLR）和 C 型凝集素受體[20]，大多數真菌的細胞壁組成成分可以通過 TLR-2、TLR-4 和 TLR-9 觸發炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 等的表達[21]。其中 IL-6 釋放與宿主體內微生物的感染密切相關，其水平升高會導致患者并發癥發生率和死亡率增加[22]。
本課題組前期體外研究將濃度為 1×106 CFU/mL 的 ica 操縱子陽性表皮葡萄球菌與白假絲酵母菌混合培養 24 h，在氣管導管材料表面能形成結構成熟的混合生物膜[23]，故本次研究按照此方法制備氣管導管材料混合生物膜后放置于兔體內。術后 7 d 陽性組 IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1 水平均明顯高于陰性組，說明 ica 操縱子介導的混合生物膜導致炎癥因子持續升高。有研究表明，在與白假絲酵母菌相關的混合生物膜體內模型中，炎癥因子水平明顯上調，分析可能與混合生物膜誘導炎癥因子表達增加有關[2, 24]。Holt 等[4]的研究同樣表明，在線蟲宿主體內，白假絲酵母菌與表皮葡萄球菌形成的混合生物膜陽性組感染水平較未形成混合生物膜的陰性組升高，真菌細胞外基質可能是造成生物膜感染毒力增強的原因。本研究結果顯示，術后 7 d 陽性組肺、腎臟細菌數量多于陰性組，提示 ica 操縱子介導了陽性組混合生物膜的形成，導致體內細菌在肺以及腎臟的傳播增強。Pammi 等[18]的研究也證實了混合生物膜相關的導管感染可導致表皮葡萄球菌向全身播散程度增加。另外，掃描電鏡觀察顯示陽性組氣管導管材料殘余大量細菌，并存在混合生物膜結構，而陰性組清除情況良好。結合上述檢測指標結果分析，ica 操縱子可能加強了混合生物膜結構，導致細菌感染持續存在。
表皮葡萄球菌 ica 操縱子介導的四基因產物多糖細胞間黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）是細菌黏附生物材料過程中的重要因素，在細菌黏附后期聚集階段，可能起到保護細菌免受宿主吞噬、改善局部營養環境的作用[25]。與白假絲酵母菌相關的混合感染研究顯示，PIA 加強了感染，提高了宿主死亡率。PIA 可以在宿主體內大量產生并大量消耗機體能量，這需要表達 ica 操縱子來進行嚴格調控。而研究表明 PIA 的產生和 ica 操縱子的表達取決于環境條件，這可能是 PIA 在不同葡萄球菌菌株以及不同類型感染中差異性表達的基礎[26]。在與白假絲酵母菌共生的環境中，ica 操縱子可能在增加細菌總體毒力方面發揮了作用，使共生的表皮葡萄球菌菌株更具有侵襲性，增強了混合生物膜結構和播散能力，導致細菌在宿主體內感染擴散增強且難以清除[27]。既往研究已經確定了 Sar 蛋白家族、TcaR、σB、生物膜調節劑 Rbf、LuxS 等調節蛋白可直接作用于 ica 操縱子 DNA，而 ica 操縱子也可能通過改變調節蛋白的表達或活性與調節蛋白產生相互作用[26]。即使在調節蛋白已被證明與 ica 操縱子 DNA 相結合的情況下，這些因子是如何調節轉錄仍不完全清楚[28]。有研究認為多種調節因子在感染期間很可能共表達，但缺少關于這些因子如何與 DNA 或其他大分子相互作用來調節 ica 操縱子表達的信息。在與白假絲酵母菌的混合體內感染中，真菌也可以產生細胞外聚合物質（extracellular polymeric substances，EPS）調節生物膜和感染毒力，其他物種的 EPS 與 ica 操縱子調節的蛋白質是否也能發生相互作用并共同調節基因表達的信息，有待深入探究。
ica 操縱子介導的混合物感染可能導致臨床治療效果不理想，增加了患者感染發生率和死亡率[29]。此外，從臨床 BCI 患者氣管導管裝置表面獲得的表皮葡萄球菌分離株，其 ica 操縱子基因座陽性率比常見的表皮葡萄球菌分離株更高，更具耐藥性[30]。本研究結果提示，ica 操縱子可能導致了氣管導管材料表面細菌與真菌混合生物膜的加強及傳播，造成感染的難治性，炎癥遷延不愈。由于植入的氣管導管周圍環境復雜，這些條件很難在體外或動物模型中復制，且與 ica 操縱子作用產物相關的調節機制仍不清楚。因此，本研究僅對 ica 操縱子對混合生物膜相關炎癥作用影響進行了初步體內探索，將進一步研究與 ica 操縱子調節多種微生物相關感染機制。
作者貢獻：張國婧負責實驗規劃及實施、數據收集整理及統計學分析、文章撰寫；萬子琳參與實驗實施、協助數據收集整理；周友全、陳穎、雷玉潔、喬麗梅協助數據收集整理、細菌復蘇轉板及生物材料制備；黃云超、王小燕負責實驗設計、指導實驗實施及文章撰寫，對文章內容作批評性審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中無利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經昆明醫科大學動物實驗倫理審查委員會批準（KMMU2021007）。實驗動物使用許可證號：SYXK（滇）2020-0006。
