引用本文： 陳子翔, 陸海濱, 楊曉楠, 祁佐良. 骨骼肌來源細胞移植早期修復小鼠周圍神經缺損的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(8): 1043-1050. doi: 10.7507/1002-1892.202104019 復制
周圍神經缺損可導致神經支配區域功能障礙，嚴重影響患者生活及心理[1]。目前治療周圍神經缺損的“金標準”是自體神經移植，但此方法存在供區神經損傷、疼痛等不足[2]。因此，尋找有效替代自體神經移植的方法仍然是研究熱點。近年來，有較多研究聚焦于將不同組織來源干細胞作為種子細胞，用于修復周圍神經缺損，以促進周圍神經再生[3]。利用種子細胞修復周圍神經缺損時，其作用機制包括：分化為神經組織細胞參與神經構建，或作為神經斷端傳遞生物信息的媒介，或分泌營養因子促進雪旺細胞遷移或神經軸突再生等[4]。因此，如果可以增加周圍神經受損局部雪旺細胞遷移，將有利于受損神經再生修復。
本課題組既往將骨骼肌來源細胞（muscle-derived cells，MDCs）作為種子細胞結合導管橋接神經斷端，證實 MDCs 可以顯著增加有髓神經纖維數量及髓鞘厚度，有效促進小鼠坐骨神經缺損修復[5]，但其具體作用機制尚未明確。本研究通過體內實驗，將攜帶增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的 MDCs 移植修復小鼠坐骨神經缺損，觀察 MDCs 對周圍神經損傷早期的作用，以探討 MDCs 參與周圍神經修復的作用方式及機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
8 周齡雌性 C57 BL/6 小鼠（以下簡稱 C57 小鼠）32 只，體質量 22～24 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供；攜帶 EGFP 的 8 周齡雌性 C57 小鼠（以下簡稱 EGFP 小鼠）6 只，體質量 22～24 g，由南京大學模式研究中心提供。
4% 多聚甲醛溶液、中性蛋白酶、Triton X-100 溶液（北京索萊寶科技有限公司）；Ⅱ型膠原酶、PBS 溶液（Sigma 公司，德國）；L-DMEM、青-鏈霉素雙抗（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO 公司，美國）；兔抗小鼠 S100β 抗體、兔抗小鼠磷酸化酪氨酸激酶受體（phosphorylated erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，p-ErbB2）抗體、兔抗小鼠磷酸化黏著斑激酶（phosphorylated focal adhesion kinase，p-FAK）抗體、熒光 594 羊抗兔 IgG 抗體（Abcam 公司，英國）。
70 μm 細胞濾篩、UltiCare 胰島素注射器（BD 公司，美國）；10-0 尼龍線（寧波市成和顯微器械廠）；聚氨酯（polyurethane，PUR）醫用靜脈留置針（Braun 公司，德國）；飽和濕度恒溫 CO2 培養箱、Megafuge 離心機（Thermo 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）；冰凍切片機、數碼相機、熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；隔水式恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；眼科剪、顯微外科手術器械（北京手術器械廠）；體視顯微外科鏡（解剖鏡）（鎮江中天光學儀器有限公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞分離培養
參照本課題組前期研究方法[5]對攜帶 EGFP 的 MDCs（EGFP-MDCs）進行分離培養及鑒定。具體方法：取 EGFP 小鼠 6 只，頸椎脫臼處死并消毒，剪開小鼠下背部及后肢皮膚，無菌條件下收集雙后肢骨骼肌，剔除肌肉中的脂肪及神經組織，將骨骼肌剪成大小約 1 mm3的肌肉顆粒。在 50 mL 離心管內加入與肌肉等體積的中性蛋白酶及Ⅱ型膠原酶混合消化酶（兩種酶的比例為 1∶1），37℃ 搖床消化 2 h；細胞混懸液經 70 μm 濾篩過濾后，以 500×g 離心 5 min，移除上清后重新加入完全培養基（含 10%FBS、1% 青-鏈霉素雙抗的 L-DMEM 培養基）重懸，將細胞接種至 10 cm 培養皿，記為 P0 代；移入 37℃、5%CO2 培養箱培養，每 3 天更換培養基，培養皿內細胞生長面積超過 80% 后即可進行細胞傳代；使用 P1 代 EGFP-MDCs 進行后續實驗。
1.2.2 動物模型制備及分組
構建小鼠坐骨神經缺損模型：取 32 只 C57 小鼠，腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉（0.05 mg/g）后，剃除背部及右后肢背側毛發，消毒后于右后肢背側作一長約 1.5 cm 切口，切開皮膚并鈍性分離臀大肌間隙。顯微鏡下鈍性分離并暴露右側坐骨神經，仔細分離坐骨神經約 10 mm 長，顯微剪剪除中間長 5 mm 坐骨神經，將兩側神經斷端各插入 1 mm 至 7 mm 長 PUR 導管內，并用 10-0 單絲線縫合固定，以保證兩神經斷端間存在 5 mm 神經缺損。
實驗分為 PUR 組（空白組）和 MDC 組，每組 16 只。PUR 組的 PUR 導管內用 UltiCare 胰島素注射器注入 L-DMEM 與 Matrigel 混合液（按 1∶1 比例配制）2 μL；MDC 組的 PUR 導管內注入含 EGFP-MDCs（濃度為 1×107 個/mL）的 L-DMEM 與 Matrigel 混合液 2 μL。根據不同分組進行上述處理后關閉術區切口。術后 1、2 周兩組各取 8 只小鼠以頸椎脫臼法處死，取材進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
大體觀察神經斷端早期生長情況。
1.3.2 神經組織內雪旺細胞遷移情況觀測
取材時標記術側坐骨神經起點，術側神經組織用 4% 多聚甲醛溶液固定，經 20% 蔗糖溶液脫水后 OCT 膠包埋。每組每個時間點分別取 4 只小鼠的術側神經標本，分別沿神經長軸切成 8 μm 厚連續縱行冰凍切片，光鏡下觀察并選取再生神經最長的切片及其前后各 1 張切片，進行免疫熒光染色。切片經室溫平衡后 PBS 洗凈，0.3%Triton X-100 破膜，10% 正常山羊血清封閉后，于切片標本處滴加兔抗小鼠 S100β 抗體（1∶200），4℃ 孵育過夜；PBS 洗凈后避光添加熒光 594 羊抗兔 IgG 抗體，37℃ 恒溫培養箱孵育 45 min，室溫平衡后 PBS 洗凈，DAPI 染細胞核，滴加熒光封片劑后蓋玻片封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，Image J 軟件計算每個標本所選 3 張切片圖像中標記點至 S100β 陽性最遠點的垂直距離并取平均數，作為該標本中雪旺細胞遷移的最遠距離。每只小鼠術側神經的近側斷端與遠側斷端內雪旺細胞遷移的最遠距離之和，則為該小鼠再生神經內雪旺細胞遷移的最遠距離總和。
1.3.3 神經斷端 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白表達觀測
術后 1、2 周每組每個時間點分別取 4 只小鼠的術側神經標本，同 1.3.2 方法行組織固定及標本包埋。沿標本橫截面切成 8 μm 厚冰凍切片，同 1.3.2 方法行免疫熒光染色；孵育的一抗分別為兔抗小鼠 p-ErbB2 抗體（1∶100）及兔抗小鼠 p-FAK 抗體（1∶100）；熒光顯微鏡下觀察，每個標本于 400 倍鏡下隨機選取 3 個視野采集圖像，用 Image Pro Plus 6.0 軟件測量圖像中蛋白熒光的積分吸光度（IA）值及整個圖像的 IA 值，計算 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率，公式為：（蛋白熒光的 IA 值/整個圖像的 IA 值）×100%。
1.3.4 MDC 組再生神經內表達 S100β 的雪旺細胞來源鑒定
將 1.3.2 中已進行雪旺細胞標志物 S100β 熒光染色（紅色即為陽性）的 MDC 組術后 1 周近側斷端及術后 2 周的神經縱行冰凍切片用熒光顯微鏡觀察，并采集同一視野內不同熒光通道的圖像。同一視野內，如果紅色熒光（代表雪旺細胞）與綠色熒光（代表 EGFP-MDCs）重疊，說明該雪旺細胞來源于 EGFP-MDCs；如果紅色熒光與綠色熒光不重疊，說明該雪旺細胞來源于神經斷端。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 6.0 統計軟件進行分析。數據符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較及組內兩時間點間比較均采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 神經標本大體觀察
術后 1 周，PUR 組及 MDC 組神經近側斷端和遠側斷端間距離均<5 mm，其中 MDC 組斷端間距離更小；術后 2 周，PUR 組兩側神經斷端尚未相連，而 MDC 組兩側神經斷端已連接。見圖 1。
圖1
兩組術后各時間點神經標本大體觀察
左、右側分別為神經近、遠側斷端（按取材時距離擺放） a. PUR 組術后 1 周；b. MDC 組術后 1 周；c. PUR 組術后 2 周；d. MDC 組術后 2 周
Figure1. General observation of nerve at each time point after operation in both groupsThe left and right sides for the proximal and distal ends of the nerve, respectively (The nerves were placed according to the distance when taking the material)a. PUR group at 1 week after operation; b. MDC group at 1 week after operation; c. PUR group at 2 weeks after operation; d. MDC group at 2 weeks after operation
2.2 神經組織內雪旺細胞遷移情況觀測
術后 1 周，兩組近側和遠側神經斷端內均表達 S100β，但斷端間并未相連；術后 2 周，MDC 組兩側再生神經斷端內表達的 S100β 已相互連接，PUR 組兩側再生神經斷端內表達的 S100β 之間仍未連接。見圖 2。定量分析顯示，術后 2 周，兩組再生神經內雪旺細胞遷移的最遠距離總和較術后 1 周顯著增加，術后 1、2 周 MDC 組顯著高于 PUR 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
圖2
術后各時間點兩組神經 S100β 免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100）
左、右側分別為神經近、遠側斷端 a. PUR 組術后 1 周；b. MDC 組術后 1 周；c. PUR 組術后 2 周；d. MDC 組術后 2 周
Figure2. S100β immunofluorescence staining of nerve in both groups at each time point after operation (Fluorescence microscope×100)The left and right sides for the proximal and distal ends of the nerve, respectively a. PUR group at 1 week after operation; b. MDC group at 1 week after operation; c. PUR group at 2 weeks after operation; d. MDC group at 2 weeks after operation
表1
術后各時間點兩組再生神經內雪旺細胞遷移的最遠距離總和比較（n=4，
，μm）
Table1.
The sum of maximum migration distance of Schwann cells in the nerve stumps of the two groups at each time point after operation (n=4, 
, μm)
2.3 神經斷端 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白表達觀測
近側斷端：術后 2 周兩組 p-ErbB2 蛋白陽性率均顯著高于術后 1 周，p-FAK 蛋白陽性率顯著低于術后 1 周，差異均有統計學意義（P<0.05）。術后 1 周，MDC 組 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率均顯著高于 PUR 組，差異有統計學意義（P<0.05）。術后 2 周，兩組 p-ErbB2 蛋白陽性率差異無統計學意義（t=0.327，P=0.747）；MDC 組 p-FAK 蛋白陽性率顯著高于 PUR 組，差異有統計學意義（t=4.470，P=0.000）。見表 2，圖 3、4。
表2
術后各時間點兩組神經近側斷端 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率比較（n=4，
，%）
Table2.
The positive rate of p-ErbB2 and p-FAK in the proximal nerve stump of the two groups at each time point after operation (n=4, 
, %)
圖3
兩組術后各時間點近、遠側神經斷端 p-ErbB2 免疫熒光染色（熒光顯微鏡×400）
紅色為 p-ErbB2，藍色為 DAPI，上、下分別為近、遠側神經斷端 a. PUR 組術后 1 周；b. MDC 組術后 1 周；c. PUR 組術后 2 周；d. MDC 組術后 2 周
Figure3. Immunofluorescence staining of p-ErbB2 at the proximal and distal nerve stumps in the two groups at each time point after operation (Fluorescence microscope×400)Red for p-ErbB2, blue for DAPI, the upper and lower for the proximal and distal nerve stumps, respectively a. PUR group at 1 week after operation; b. MDC group at 1 week after operation; c. PUR group at 2 weeks after operation; d. MDC group at 2 weeks after operation
遠側斷端：除 PUR 組術后 1、2 周 p-ErbB2 蛋白陽性率差異無統計學意義（t=1.448，P=0.162）外，其他組內兩時間點間各蛋白陽性率差異均有統計學意義（P<0.05）。 術后 1、2 周，MDC 組 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率均顯著高于 PUR 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3，圖 3、4。
表3
術后各時間點兩組神經遠側斷端 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率比較（n=4，
，%）
Table3.
The positive rate of p-ErbB2 and p-FAK in the distal nerve stump of the two groups at each time point after operation (n=4, 
, %)
圖4
兩組術后各時間點近、遠側神經斷端 p-FAK 免疫熒光染色（熒光顯微鏡×400）
紅色為 p-FAK，藍色為 DAPI，上、下分別為近、遠側神經斷端 a. PUR 組術后 1 周；b. MDC 組術后 1 周；c. PUR 組術后 2 周；d. MDC 組術后 2 周
Figure4. Immunofluorescence staining of p-FAK at the proximal and distal nerve stumps in the two groups at each time point after operation (Fluorescence microscope×400)Red for p-FAK, blue for DAPI, the upper and lower for the proximal and distal nerve stumps, respectively a. PUR group at 1 week after operation; b. MDC group at 1 week after operation; c. PUR group at 2 weeks after operation; d. MDC group at 2 weeks after operation
2.4 MDC 組再生神經內雪旺細胞來源鑒定
免疫熒光染色示，術后 1、2 周，MDC 組再生神經內可見綠色熒光與紅色熒光重疊，說明該部分表達 S100β 的雪旺細胞來源于 EGFP-MDCs；此外，部分綠色熒光與紅色熒光未重疊，說明該部分表達 S100β 的雪旺細胞來源于神經斷端，即由神經斷端增殖和/或遷移而出。見圖 5、6。
圖5
術后 1 周 MDC 組近側神經斷端 S100β 免疫熒光染色熒光顯微鏡觀察
紅色為 S100β，綠色為 EGFP，藍色為 DAPI；白箭頭示表達 S100β 的 EGFP-MDCs，藍箭頭示無 EGFP 的雪旺細胞，黃箭頭示未表達 S100β 的 EGFP-MDCs a、b. ×100；c～e. 為圖 a、b 方框處局部放大（×400）；f. 圖 c～e 合并圖（×400）
Figure5. S100β immunofluorescence staining observation in the proximal nerve stump of MDC group at 1 week after operation by fluorescence microscopeRed for S100β, green for EGFP, blue for DAPI; white arrow indicated EGFP-MDCs with S100β expressing, blue arrow indicated Schwann cells without EGFP, yellow arrow indicated EGFP-MDCs without S100β expression a, b. ×100; c-e. Enlargement of boxes in figures a and b (×400); f. Merge of figures c-e (×400)
圖6
術后 2 周 MDC 組神經內 S100β 免疫熒光染色熒光顯微鏡觀察
紅色為 S100β，綠色為 EGFP，藍色為 DAPI；白箭頭示表達 S100β 的 EGFP-MDCs，藍箭頭示無 EGFP 的雪旺細胞，黃箭頭示未表達 S100β 的 EGFP-MDCs a、b. ×100；c-e. 為圖 a、b 方框處局部放大（×400）; f. 圖 c-e 合并圖（×400）
Figure6. S100β immunofluorescence staining observation of nerve in MDC group at 2 weeks after operation by fluorescence microscopeRed for S100β, green for EGFP, blue for DAPI; white arrow indicated EGFP-MDCs with S100β expressing, blue arrow indicated Schwann cells without EGFP, yellow arrow indicated EGFP-MDCs without S100β expression a, b. ×100; c-e. Enlargement of boxes in figures a and b (×400); f. Merge of figures c-e (×400)
3 討論
周圍神經離斷后，為構建有利于軸突再生的微環境，神經斷端出現瓦勒變性，斷端的組織細胞發生凋亡并形成細胞碎片[6]。斷端存活的雪旺細胞發生去分化后發揮吞噬作用，清除局部細胞碎片；同時，雪旺細胞可使巨噬細胞向神經受損部位趨化聚集以吞噬細胞碎片[7-10]。此外，雪旺細胞是神經營養因子的主要來源，可從神經斷端內遷出并形成具有分泌營養因子的結構性通道，誘導軸突再生[11-14]。鑒于雪旺細胞在周圍神經損傷修復過程中的重要作用，將其作為種子細胞移植至受損部位，可以有效促進周圍神經缺損的再生修復[15]。但雪旺細胞供區有限，且雪旺細胞從受損神經斷端遷出往往耗時較長[16]；而通過移植干細胞等種子細胞修復周圍神經損傷，以利用干細胞的分化功能和/或細胞的分泌功能等特點，可以促進雪旺細胞遷移和/或分化為雪旺細胞樣細胞，從而促進周圍神經再生修復[17]。
骨骼肌是人體體積較大的器官，具有強大的分泌功能[18-19]，而 MDCs 作為來源于骨骼肌的細胞群，其成分包括成纖維細胞、肌細胞、肌衛星細胞及骨骼肌來源干細胞（muscle-derived stem cells，MDSCs）[20]。我們課題組在前期研究中證實，將 MDCs 作為種子細胞進行移植可有效促進小鼠坐骨神經再生，并且發現 MDCs 可增加再生神經的有髓神經纖維數量及其髓鞘厚度[5]，說明移植的 MDCs 可能對雪旺細胞產生影響。本次研究通過比較 MDC 組與 PUR 組修復周圍神經缺損的早期神經生長情況，發現 MDC 組再生神經內雪旺細胞遷移的最遠距離總和較 PUR 組顯著增加；同時，MDC 組再生神經內部分雪旺細胞標志物 S100β 染色與 MDCs 的 EGFP 并未重疊，說明此部分雪旺細胞來源于 C57 小鼠神經斷端，而 MDCs 可以促進其遷移。此外，MDC 組神經斷端的 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率高于 PUR 組，說明 MDCs 可以促進神經斷端激活 ErbB2 蛋白及 FAK 蛋白。ErbB2 是位于雪旺細胞膜的活性受體，可被神經調節蛋白 1（neuregulin 1，NRG1）激活，并使其下游控制雪旺細胞黏著及遷移的 FAK 活化，從而促進雪旺細胞遷移[21-22]。因此我們考慮，MDCs 修復周圍神經缺損時可能發揮其旁分泌功能，激活雪旺細胞的 ErbB2 及其下游 FAK，從而促進雪旺細胞遷移。雖然既往研究將骨骼肌填充至靜脈修復周圍神經缺損時，發現肌肉組織內 NRG1 表達增加[23]，但是來源于骨骼肌的 MDCs 是否通過分泌 NRG1，使雪旺細胞 NRG1/ErbB2/3 信號通路活化以促進雪旺細胞遷移，MDCs 是否對雪旺細胞 ErbB2 及 FAK 蛋白表達有影響，仍需進一步研究。
移植干細胞修復周圍神經缺損時，干細胞可分化為神經組織細胞，如雪旺細胞樣細胞等，參與再生神經構建[3]。既往研究證實，MDCs 中的 MDSCs 在體內及體外實驗中均可分化為雪旺細胞樣細胞，形成髓鞘并參與周圍神經構建[24-25]。此外，MDSCs 還可分化為血管內皮細胞等，參與周圍神經構建[25]。本研究中 MDC 組再生神經縱行冰凍切片免疫熒光染色結果顯示，部分 MDCs 的 EGFP 與雪旺細胞表面標志物 S100β 重疊，說明移植的 MDCs 表達 S100β，考慮是由于 MDCs 中的 MDSCs 受局部微環境影響并分化為雪旺細胞樣細胞，從而參與再生神經構建。而部分 MDCs 的 EGFP 并未與 S100β 重疊，說明這部分 MDCs 并未分化為雪旺細胞樣細胞，考慮可能是 MDCs 中的其他細胞成分，或是由 MDSCs 分化而來的血管內皮細胞等細胞。成纖維細胞雖不具備分化功能，但可直接參與構成周圍神經中的束膜結構[26]；同時，成纖維細胞可分泌因子或蛋白，促進周圍神經修復[19，27]。而血管內皮細胞是血管的主要形成細胞，可作為神經組織內血管再生的細胞來源，從而為神經組織供血。這些細胞可通過不同方式參與神經再生修復。
綜上述，本研究將 MDCs 作為種子細胞修復大鼠周圍神經損傷后，可促進神經兩側斷端內雪旺細胞向缺損中心遷移，為神經軸突再生提供了更好的支持和發揮了促進作用；同時，MDCs 可作為周圍神經組織細胞成分，參與周圍神經損傷后早期的修復。而 MDCs 促進雪旺細胞遷移的具體機制有待進一步研究。
作者貢獻：陳子翔參與實驗設計、操作，標本采集，數據收集及統計分析，文章撰寫；陸海濱參與實驗設計、操作及統計分析；楊曉楠參與實驗設計、數據收集及文章修改；祁佐良參與實驗指導、設計，并對文章的知識性內容作批評性審閱及支持性貢獻。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：本研究經中國醫學科學院整形外科醫院實驗動物福利倫理委員會批準（2016-40）。實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2015-0009。
周圍神經缺損可導致神經支配區域功能障礙，嚴重影響患者生活及心理[1]。目前治療周圍神經缺損的“金標準”是自體神經移植，但此方法存在供區神經損傷、疼痛等不足[2]。因此，尋找有效替代自體神經移植的方法仍然是研究熱點。近年來，有較多研究聚焦于將不同組織來源干細胞作為種子細胞，用于修復周圍神經缺損，以促進周圍神經再生[3]。利用種子細胞修復周圍神經缺損時，其作用機制包括：分化為神經組織細胞參與神經構建，或作為神經斷端傳遞生物信息的媒介，或分泌營養因子促進雪旺細胞遷移或神經軸突再生等[4]。因此，如果可以增加周圍神經受損局部雪旺細胞遷移，將有利于受損神經再生修復。
本課題組既往將骨骼肌來源細胞（muscle-derived cells，MDCs）作為種子細胞結合導管橋接神經斷端，證實 MDCs 可以顯著增加有髓神經纖維數量及髓鞘厚度，有效促進小鼠坐骨神經缺損修復[5]，但其具體作用機制尚未明確。本研究通過體內實驗，將攜帶增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的 MDCs 移植修復小鼠坐骨神經缺損，觀察 MDCs 對周圍神經損傷早期的作用，以探討 MDCs 參與周圍神經修復的作用方式及機制。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
8 周齡雌性 C57 BL/6 小鼠（以下簡稱 C57 小鼠）32 只，體質量 22～24 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供；攜帶 EGFP 的 8 周齡雌性 C57 小鼠（以下簡稱 EGFP 小鼠）6 只，體質量 22～24 g，由南京大學模式研究中心提供。
4% 多聚甲醛溶液、中性蛋白酶、Triton X-100 溶液（北京索萊寶科技有限公司）；Ⅱ型膠原酶、PBS 溶液（Sigma 公司，德國）；L-DMEM、青-鏈霉素雙抗（HyClone 公司，美國）；FBS（GIBCO 公司，美國）；兔抗小鼠 S100β 抗體、兔抗小鼠磷酸化酪氨酸激酶受體（phosphorylated erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，p-ErbB2）抗體、兔抗小鼠磷酸化黏著斑激酶（phosphorylated focal adhesion kinase，p-FAK）抗體、熒光 594 羊抗兔 IgG 抗體（Abcam 公司，英國）。
70 μm 細胞濾篩、UltiCare 胰島素注射器（BD 公司，美國）；10-0 尼龍線（寧波市成和顯微器械廠）；聚氨酯（polyurethane，PUR）醫用靜脈留置針（Braun 公司，德國）；飽和濕度恒溫 CO2 培養箱、Megafuge 離心機（Thermo 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）；冰凍切片機、數碼相機、熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；隔水式恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；眼科剪、顯微外科手術器械（北京手術器械廠）；體視顯微外科鏡（解剖鏡）（鎮江中天光學儀器有限公司）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞分離培養
參照本課題組前期研究方法[5]對攜帶 EGFP 的 MDCs（EGFP-MDCs）進行分離培養及鑒定。具體方法：取 EGFP 小鼠 6 只，頸椎脫臼處死并消毒，剪開小鼠下背部及后肢皮膚，無菌條件下收集雙后肢骨骼肌，剔除肌肉中的脂肪及神經組織，將骨骼肌剪成大小約 1 mm3的肌肉顆粒。在 50 mL 離心管內加入與肌肉等體積的中性蛋白酶及Ⅱ型膠原酶混合消化酶（兩種酶的比例為 1∶1），37℃ 搖床消化 2 h；細胞混懸液經 70 μm 濾篩過濾后，以 500×g 離心 5 min，移除上清后重新加入完全培養基（含 10%FBS、1% 青-鏈霉素雙抗的 L-DMEM 培養基）重懸，將細胞接種至 10 cm 培養皿，記為 P0 代；移入 37℃、5%CO2 培養箱培養，每 3 天更換培養基，培養皿內細胞生長面積超過 80% 后即可進行細胞傳代；使用 P1 代 EGFP-MDCs 進行后續實驗。
1.2.2 動物模型制備及分組
構建小鼠坐骨神經缺損模型：取 32 只 C57 小鼠，腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉（0.05 mg/g）后，剃除背部及右后肢背側毛發，消毒后于右后肢背側作一長約 1.5 cm 切口，切開皮膚并鈍性分離臀大肌間隙。顯微鏡下鈍性分離并暴露右側坐骨神經，仔細分離坐骨神經約 10 mm 長，顯微剪剪除中間長 5 mm 坐骨神經，將兩側神經斷端各插入 1 mm 至 7 mm 長 PUR 導管內，并用 10-0 單絲線縫合固定，以保證兩神經斷端間存在 5 mm 神經缺損。
實驗分為 PUR 組（空白組）和 MDC 組，每組 16 只。PUR 組的 PUR 導管內用 UltiCare 胰島素注射器注入 L-DMEM 與 Matrigel 混合液（按 1∶1 比例配制）2 μL；MDC 組的 PUR 導管內注入含 EGFP-MDCs（濃度為 1×107 個/mL）的 L-DMEM 與 Matrigel 混合液 2 μL。根據不同分組進行上述處理后關閉術區切口。術后 1、2 周兩組各取 8 只小鼠以頸椎脫臼法處死，取材進行以下觀測。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
大體觀察神經斷端早期生長情況。
1.3.2 神經組織內雪旺細胞遷移情況觀測
取材時標記術側坐骨神經起點，術側神經組織用 4% 多聚甲醛溶液固定，經 20% 蔗糖溶液脫水后 OCT 膠包埋。每組每個時間點分別取 4 只小鼠的術側神經標本，分別沿神經長軸切成 8 μm 厚連續縱行冰凍切片，光鏡下觀察并選取再生神經最長的切片及其前后各 1 張切片，進行免疫熒光染色。切片經室溫平衡后 PBS 洗凈，0.3%Triton X-100 破膜，10% 正常山羊血清封閉后，于切片標本處滴加兔抗小鼠 S100β 抗體（1∶200），4℃ 孵育過夜；PBS 洗凈后避光添加熒光 594 羊抗兔 IgG 抗體，37℃ 恒溫培養箱孵育 45 min，室溫平衡后 PBS 洗凈，DAPI 染細胞核，滴加熒光封片劑后蓋玻片封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，Image J 軟件計算每個標本所選 3 張切片圖像中標記點至 S100β 陽性最遠點的垂直距離并取平均數，作為該標本中雪旺細胞遷移的最遠距離。每只小鼠術側神經的近側斷端與遠側斷端內雪旺細胞遷移的最遠距離之和，則為該小鼠再生神經內雪旺細胞遷移的最遠距離總和。
1.3.3 神經斷端 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白表達觀測
術后 1、2 周每組每個時間點分別取 4 只小鼠的術側神經標本，同 1.3.2 方法行組織固定及標本包埋。沿標本橫截面切成 8 μm 厚冰凍切片，同 1.3.2 方法行免疫熒光染色；孵育的一抗分別為兔抗小鼠 p-ErbB2 抗體（1∶100）及兔抗小鼠 p-FAK 抗體（1∶100）；熒光顯微鏡下觀察，每個標本于 400 倍鏡下隨機選取 3 個視野采集圖像，用 Image Pro Plus 6.0 軟件測量圖像中蛋白熒光的積分吸光度（IA）值及整個圖像的 IA 值，計算 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率，公式為：（蛋白熒光的 IA 值/整個圖像的 IA 值）×100%。
1.3.4 MDC 組再生神經內表達 S100β 的雪旺細胞來源鑒定
將 1.3.2 中已進行雪旺細胞標志物 S100β 熒光染色（紅色即為陽性）的 MDC 組術后 1 周近側斷端及術后 2 周的神經縱行冰凍切片用熒光顯微鏡觀察，并采集同一視野內不同熒光通道的圖像。同一視野內，如果紅色熒光（代表雪旺細胞）與綠色熒光（代表 EGFP-MDCs）重疊，說明該雪旺細胞來源于 EGFP-MDCs；如果紅色熒光與綠色熒光不重疊，說明該雪旺細胞來源于神經斷端。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 6.0 統計軟件進行分析。數據符合正態分布，以均數±標準差表示，組間比較及組內兩時間點間比較均采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 神經標本大體觀察
術后 1 周，PUR 組及 MDC 組神經近側斷端和遠側斷端間距離均<5 mm，其中 MDC 組斷端間距離更小；術后 2 周，PUR 組兩側神經斷端尚未相連，而 MDC 組兩側神經斷端已連接。見圖 1。
圖1
兩組術后各時間點神經標本大體觀察
左、右側分別為神經近、遠側斷端（按取材時距離擺放） a. PUR 組術后 1 周；b. MDC 組術后 1 周；c. PUR 組術后 2 周；d. MDC 組術后 2 周
Figure1. General observation of nerve at each time point after operation in both groupsThe left and right sides for the proximal and distal ends of the nerve, respectively (The nerves were placed according to the distance when taking the material)a. PUR group at 1 week after operation; b. MDC group at 1 week after operation; c. PUR group at 2 weeks after operation; d. MDC group at 2 weeks after operation
2.2 神經組織內雪旺細胞遷移情況觀測
術后 1 周，兩組近側和遠側神經斷端內均表達 S100β，但斷端間并未相連；術后 2 周，MDC 組兩側再生神經斷端內表達的 S100β 已相互連接，PUR 組兩側再生神經斷端內表達的 S100β 之間仍未連接。見圖 2。定量分析顯示，術后 2 周，兩組再生神經內雪旺細胞遷移的最遠距離總和較術后 1 周顯著增加，術后 1、2 周 MDC 組顯著高于 PUR 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
圖2
術后各時間點兩組神經 S100β 免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100）
左、右側分別為神經近、遠側斷端 a. PUR 組術后 1 周；b. MDC 組術后 1 周；c. PUR 組術后 2 周；d. MDC 組術后 2 周
Figure2. S100β immunofluorescence staining of nerve in both groups at each time point after operation (Fluorescence microscope×100)The left and right sides for the proximal and distal ends of the nerve, respectively a. PUR group at 1 week after operation; b. MDC group at 1 week after operation; c. PUR group at 2 weeks after operation; d. MDC group at 2 weeks after operation
表1
術后各時間點兩組再生神經內雪旺細胞遷移的最遠距離總和比較（n=4，，μm）
Table1.
The sum of maximum migration distance of Schwann cells in the nerve stumps of the two groups at each time point after operation (n=4, , μm)
2.3 神經斷端 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白表達觀測
近側斷端：術后 2 周兩組 p-ErbB2 蛋白陽性率均顯著高于術后 1 周，p-FAK 蛋白陽性率顯著低于術后 1 周，差異均有統計學意義（P<0.05）。術后 1 周，MDC 組 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率均顯著高于 PUR 組，差異有統計學意義（P<0.05）。術后 2 周，兩組 p-ErbB2 蛋白陽性率差異無統計學意義（t=0.327，P=0.747）；MDC 組 p-FAK 蛋白陽性率顯著高于 PUR 組，差異有統計學意義（t=4.470，P=0.000）。見表 2，圖 3、4。
表2
術后各時間點兩組神經近側斷端 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率比較（n=4，，%）
Table2.
The positive rate of p-ErbB2 and p-FAK in the proximal nerve stump of the two groups at each time point after operation (n=4, , %)
圖3
兩組術后各時間點近、遠側神經斷端 p-ErbB2 免疫熒光染色（熒光顯微鏡×400）
紅色為 p-ErbB2，藍色為 DAPI，上、下分別為近、遠側神經斷端 a. PUR 組術后 1 周；b. MDC 組術后 1 周；c. PUR 組術后 2 周；d. MDC 組術后 2 周
Figure3. Immunofluorescence staining of p-ErbB2 at the proximal and distal nerve stumps in the two groups at each time point after operation (Fluorescence microscope×400)Red for p-ErbB2, blue for DAPI, the upper and lower for the proximal and distal nerve stumps, respectively a. PUR group at 1 week after operation; b. MDC group at 1 week after operation; c. PUR group at 2 weeks after operation; d. MDC group at 2 weeks after operation
遠側斷端：除 PUR 組術后 1、2 周 p-ErbB2 蛋白陽性率差異無統計學意義（t=1.448，P=0.162）外，其他組內兩時間點間各蛋白陽性率差異均有統計學意義（P<0.05）。 術后 1、2 周，MDC 組 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率均顯著高于 PUR 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 3，圖 3、4。
表3
術后各時間點兩組神經遠側斷端 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率比較（n=4，，%）
Table3.
The positive rate of p-ErbB2 and p-FAK in the distal nerve stump of the two groups at each time point after operation (n=4, , %)
圖4
兩組術后各時間點近、遠側神經斷端 p-FAK 免疫熒光染色（熒光顯微鏡×400）
紅色為 p-FAK，藍色為 DAPI，上、下分別為近、遠側神經斷端 a. PUR 組術后 1 周；b. MDC 組術后 1 周；c. PUR 組術后 2 周；d. MDC 組術后 2 周
Figure4. Immunofluorescence staining of p-FAK at the proximal and distal nerve stumps in the two groups at each time point after operation (Fluorescence microscope×400)Red for p-FAK, blue for DAPI, the upper and lower for the proximal and distal nerve stumps, respectively a. PUR group at 1 week after operation; b. MDC group at 1 week after operation; c. PUR group at 2 weeks after operation; d. MDC group at 2 weeks after operation
2.4 MDC 組再生神經內雪旺細胞來源鑒定
免疫熒光染色示，術后 1、2 周，MDC 組再生神經內可見綠色熒光與紅色熒光重疊，說明該部分表達 S100β 的雪旺細胞來源于 EGFP-MDCs；此外，部分綠色熒光與紅色熒光未重疊，說明該部分表達 S100β 的雪旺細胞來源于神經斷端，即由神經斷端增殖和/或遷移而出。見圖 5、6。
圖5
術后 1 周 MDC 組近側神經斷端 S100β 免疫熒光染色熒光顯微鏡觀察
紅色為 S100β，綠色為 EGFP，藍色為 DAPI；白箭頭示表達 S100β 的 EGFP-MDCs，藍箭頭示無 EGFP 的雪旺細胞，黃箭頭示未表達 S100β 的 EGFP-MDCs a、b. ×100；c～e. 為圖 a、b 方框處局部放大（×400）；f. 圖 c～e 合并圖（×400）
Figure5. S100β immunofluorescence staining observation in the proximal nerve stump of MDC group at 1 week after operation by fluorescence microscopeRed for S100β, green for EGFP, blue for DAPI; white arrow indicated EGFP-MDCs with S100β expressing, blue arrow indicated Schwann cells without EGFP, yellow arrow indicated EGFP-MDCs without S100β expression a, b. ×100; c-e. Enlargement of boxes in figures a and b (×400); f. Merge of figures c-e (×400)
圖6
術后 2 周 MDC 組神經內 S100β 免疫熒光染色熒光顯微鏡觀察
紅色為 S100β，綠色為 EGFP，藍色為 DAPI；白箭頭示表達 S100β 的 EGFP-MDCs，藍箭頭示無 EGFP 的雪旺細胞，黃箭頭示未表達 S100β 的 EGFP-MDCs a、b. ×100；c-e. 為圖 a、b 方框處局部放大（×400）; f. 圖 c-e 合并圖（×400）
Figure6. S100β immunofluorescence staining observation of nerve in MDC group at 2 weeks after operation by fluorescence microscopeRed for S100β, green for EGFP, blue for DAPI; white arrow indicated EGFP-MDCs with S100β expressing, blue arrow indicated Schwann cells without EGFP, yellow arrow indicated EGFP-MDCs without S100β expression a, b. ×100; c-e. Enlargement of boxes in figures a and b (×400); f. Merge of figures c-e (×400)
3 討論
周圍神經離斷后，為構建有利于軸突再生的微環境，神經斷端出現瓦勒變性，斷端的組織細胞發生凋亡并形成細胞碎片[6]。斷端存活的雪旺細胞發生去分化后發揮吞噬作用，清除局部細胞碎片；同時，雪旺細胞可使巨噬細胞向神經受損部位趨化聚集以吞噬細胞碎片[7-10]。此外，雪旺細胞是神經營養因子的主要來源，可從神經斷端內遷出并形成具有分泌營養因子的結構性通道，誘導軸突再生[11-14]。鑒于雪旺細胞在周圍神經損傷修復過程中的重要作用，將其作為種子細胞移植至受損部位，可以有效促進周圍神經缺損的再生修復[15]。但雪旺細胞供區有限，且雪旺細胞從受損神經斷端遷出往往耗時較長[16]；而通過移植干細胞等種子細胞修復周圍神經損傷，以利用干細胞的分化功能和/或細胞的分泌功能等特點，可以促進雪旺細胞遷移和/或分化為雪旺細胞樣細胞，從而促進周圍神經再生修復[17]。
骨骼肌是人體體積較大的器官，具有強大的分泌功能[18-19]，而 MDCs 作為來源于骨骼肌的細胞群，其成分包括成纖維細胞、肌細胞、肌衛星細胞及骨骼肌來源干細胞（muscle-derived stem cells，MDSCs）[20]。我們課題組在前期研究中證實，將 MDCs 作為種子細胞進行移植可有效促進小鼠坐骨神經再生，并且發現 MDCs 可增加再生神經的有髓神經纖維數量及其髓鞘厚度[5]，說明移植的 MDCs 可能對雪旺細胞產生影響。本次研究通過比較 MDC 組與 PUR 組修復周圍神經缺損的早期神經生長情況，發現 MDC 組再生神經內雪旺細胞遷移的最遠距離總和較 PUR 組顯著增加；同時，MDC 組再生神經內部分雪旺細胞標志物 S100β 染色與 MDCs 的 EGFP 并未重疊，說明此部分雪旺細胞來源于 C57 小鼠神經斷端，而 MDCs 可以促進其遷移。此外，MDC 組神經斷端的 p-ErbB2 及 p-FAK 蛋白陽性率高于 PUR 組，說明 MDCs 可以促進神經斷端激活 ErbB2 蛋白及 FAK 蛋白。ErbB2 是位于雪旺細胞膜的活性受體，可被神經調節蛋白 1（neuregulin 1，NRG1）激活，并使其下游控制雪旺細胞黏著及遷移的 FAK 活化，從而促進雪旺細胞遷移[21-22]。因此我們考慮，MDCs 修復周圍神經缺損時可能發揮其旁分泌功能，激活雪旺細胞的 ErbB2 及其下游 FAK，從而促進雪旺細胞遷移。雖然既往研究將骨骼肌填充至靜脈修復周圍神經缺損時，發現肌肉組織內 NRG1 表達增加[23]，但是來源于骨骼肌的 MDCs 是否通過分泌 NRG1，使雪旺細胞 NRG1/ErbB2/3 信號通路活化以促進雪旺細胞遷移，MDCs 是否對雪旺細胞 ErbB2 及 FAK 蛋白表達有影響，仍需進一步研究。
移植干細胞修復周圍神經缺損時，干細胞可分化為神經組織細胞，如雪旺細胞樣細胞等，參與再生神經構建[3]。既往研究證實，MDCs 中的 MDSCs 在體內及體外實驗中均可分化為雪旺細胞樣細胞，形成髓鞘并參與周圍神經構建[24-25]。此外，MDSCs 還可分化為血管內皮細胞等，參與周圍神經構建[25]。本研究中 MDC 組再生神經縱行冰凍切片免疫熒光染色結果顯示，部分 MDCs 的 EGFP 與雪旺細胞表面標志物 S100β 重疊，說明移植的 MDCs 表達 S100β，考慮是由于 MDCs 中的 MDSCs 受局部微環境影響并分化為雪旺細胞樣細胞，從而參與再生神經構建。而部分 MDCs 的 EGFP 并未與 S100β 重疊，說明這部分 MDCs 并未分化為雪旺細胞樣細胞，考慮可能是 MDCs 中的其他細胞成分，或是由 MDSCs 分化而來的血管內皮細胞等細胞。成纖維細胞雖不具備分化功能，但可直接參與構成周圍神經中的束膜結構[26]；同時，成纖維細胞可分泌因子或蛋白，促進周圍神經修復[19，27]。而血管內皮細胞是血管的主要形成細胞，可作為神經組織內血管再生的細胞來源，從而為神經組織供血。這些細胞可通過不同方式參與神經再生修復。
綜上述，本研究將 MDCs 作為種子細胞修復大鼠周圍神經損傷后，可促進神經兩側斷端內雪旺細胞向缺損中心遷移，為神經軸突再生提供了更好的支持和發揮了促進作用；同時，MDCs 可作為周圍神經組織細胞成分，參與周圍神經損傷后早期的修復。而 MDCs 促進雪旺細胞遷移的具體機制有待進一步研究。
作者貢獻：陳子翔參與實驗設計、操作，標本采集，數據收集及統計分析，文章撰寫；陸海濱參與實驗設計、操作及統計分析；楊曉楠參與實驗設計、數據收集及文章修改；祁佐良參與實驗指導、設計，并對文章的知識性內容作批評性審閱及支持性貢獻。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：本研究經中國醫學科學院整形外科醫院實驗動物福利倫理委員會批準（2016-40）。實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2015-0009。
