引用本文： 劉歡, 丁其瑞, 馬成, 秦豪男, 魏易凡, 任永信. 兩種小鼠膝關節骨軟骨損傷模型制備方法比較研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(7): 862-867. doi: 10.7507/1002-1892.202101098 復制
骨軟骨損傷是一種臨床常見關節疾病，關節軟骨由于缺乏血管，損傷后軟骨祖細胞無法及時遷移至損傷部位[1]，自身愈合能力較差，最終可能發展為骨關節炎。因此，此類損傷修復是臨床一個重大挑戰，其修復方法及作用機制也成為重要研究課題，而動物模型是重要研究對象。
目前，采用犬、羊、豬和馬等大型動物制備的關節骨軟骨缺損模型已廣泛用于軟骨再生研究，此類模型具有膝關節面較大以及關節結構、組成與特性等與人類相似的優勢，而且造模相對容易。但是，在大型動物中難以進行基因修飾，影響了對軟骨修復機制的深入研究[2-3]。而小鼠可以在其體內進行基因修飾，目前已廣泛應用于各種分子機制研究中。
近年來，有學者采用小鼠制備模型行膝關節骨軟骨損傷研究[4-5]，主要采用注射器針頭在股骨髁間溝縱形劃傷關節軟骨制備模型。該操作較簡單，但是注射器尖端硬度相對較低，接觸軟骨下骨后容易發生變形，且尖端為一坡面，采用不同方向造成的骨軟骨損傷其寬度也不同，導致造模結果不一致、可重復性不高。為此，我們將上述方法中使用的注射器針頭改為電鉆筆配合鎢鋼麻花鉆頭。鎢鋼麻花鉆頭硬度高，鉆頭不易變形，并且鉆頭在高速旋轉時為一個圓柱體，制備的骨軟骨損傷寬度一致，最大程度降低了器械本身對造模結果造成的誤差。本研究將該方法與傳統注射器針頭方法進行比較，進一步探討鎢鋼麻花鉆頭制備小鼠骨軟骨損傷模型的效果，以期為骨軟骨損傷相關研究提供一種較理想的動物模型制備方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2 月齡雄性 C57BL/6 小鼠 75 只，體質量 20～22 g，平均 21 g，飼養于南京醫科大學實驗動物中心。
蘇木素染液、伊紅染液（南京建成生物工程研究所）；甲苯胺藍染液（北京索萊寶科技有限公司）；Ⅱ型膠原抗體（Abcam 公司，英國）。電鉆筆（安徽阿斯珈工具有限公司）；鎢鋼麻花鉆頭（Kuangxia 公司，日本）；1 mL 無菌注射器（上海康德萊醫療器械股份有限公司）；NSZ-608T 手術體視顯微鏡（河南新星光學有限公司）；Image J 軟件（美國國立衛生研究院）；切片機、攤片機（Leica 公司，德國）；光學顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 實驗分組及方法
將 75 只小鼠隨機均分為 3 組（n=25），A 組采用 26G 注射器針頭進行造模；B 組采用鎢鋼麻花鉆頭進行造模；C 組為假手術組。
3 組小鼠腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和賽拉嗪（5 mg/kg）麻醉后，右后肢脫毛、消毒、鋪單。在膝關節內側切開皮膚，暴露關節囊，沿髕骨內側緣切開關節囊，并從股四頭肌內側頭和長頭間隙鈍性分離，將髕骨向外側推移并完全屈曲膝關節，以暴露股骨滑車溝。
A 組：使用自制尖端限深的 26G 注射器針頭，沿滑車溝稍用力劃破關節軟骨（以有阻力感為判定標準）。B 組：采用電鉆筆和尖端限深、直徑為 0.2 mm 的鎢鋼麻花鉆頭，冷生理鹽水沖洗下以 7 000 r/min 速度沿滑車溝劃破軟骨全層，損傷部位有血液滲出提示損傷達軟骨下骨。手術體視顯微鏡下去除殘留軟骨碎片，將脫位的髕骨復位，分別縫合股四頭肌內側頭、關節囊和皮膚。C 組：僅切開皮膚及關節囊，關節軟骨不作處理。見圖 1、2。
圖1
動物模型制備工具
a. 注射器針頭；b. 鎢鋼麻花鉆頭和電鉆筆
Figure1. Equipment for animal model preparationa. Needle; b. Tungsten drill and electronic drill pen
圖2
造模后關節面大體形態
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure2. Morphology of the joint surface after modelinga. Group A; b. Group B; c. Group C
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察小鼠術后存活、切口愈合以及膝關節活動度恢復情況。
1.3.2 組織學觀察
造模后 1 d 及 1、2、4、8 周，每組取 5 只小鼠，以頸椎脫位法處死后分離右后肢，剝離膝關節附著肌肉及其他軟組織，如標本存在明顯感染或者髕骨脫位排除研究。將納入標本置于 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，于 EDTA 螯合劑中脫鈣 21～28 d，梯度脫水、浸蠟、包埋，切片機制作 5 μm 厚切片。
組織切片經脫蠟、梯度乙醇水化后，取造模后 1 d 及 1、2、4、8 周切片常規 HE 染色，光鏡下觀察骨軟骨損傷愈合情況；取 A、B 組造模后 1 d 時切片，采用 Image J 軟件測量骨軟骨損傷部位形態學參數，包括深度、寬度、橫截面積，并計算損傷部位深度占關節軟骨厚度的百分比（深度/厚度）。其中，寬度為骨軟骨損傷部位兩側外緣距離，深度為損傷最低點至軟骨面距離。
取造模后 8 周切片，分別行甲苯胺藍染色以及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，光鏡下分別觀察修復區域組織甲苯胺藍著色及Ⅱ型膠原表達情況。基于切片 HE 染色、甲苯胺藍染色，參照國際軟骨研究協會（ICRS）評分標準[6]，對 A、B 組骨軟骨損傷愈合情況進行評分。
1.4 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
所有小鼠均存活至實驗完成。術后一般情況良好，自由進食、飲水；切口愈合良好，無紅腫、感染征象；膝關節活動度可，無明顯受限。所有標本均納入研究。
2.2 組織學觀察
2.2.1 HE 染色觀察
C 組為正常軟骨形態。造模后 1 d，A 組損傷僅突破軟骨層達軟骨下骨，未進入骨髓腔；B 組損傷已完全突破軟骨和軟骨下骨，到達骨髓腔。A 組損傷部位深度、寬度、橫截面積和深度/厚度均小于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。造模后 1、2、4、8 周，A 組損傷部位均未見明顯組織填充，而 B 組損傷部位已逐漸被組織填充。見圖 3。
表1
A、B 組造模 1 d 骨軟骨損傷部位形態學參數比較（n=5，
）
Table1.
Comparison of morphological parameters of osteochondral injury at 1 day after modeling between group A and group B (n=5, 
)
圖3
造模后各組 HE 染色觀察（×100）
從左至右分別為 A、B、C 組 a. 造模后 1 d；b. 造模后 1 周；c. 造模后 2 周；d. 造模后4 周；e. 造模后 8 周
Figure3. HE staining in each group after modeling (×100)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. One day after modeling; b. One week after modeling; c. Two weeks after modeling; d. Four weeks after modeling; e. Eight weeks after modeling
2.2.2 甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察
造模后 8 周，A 組損傷部位未見甲苯胺藍著色以及Ⅱ型膠原表達；而 B 組損傷部位填充組織可見甲苯胺藍著色及Ⅱ型膠原表達。見圖 4、5。A 組 ICRS 評分為（8.2±1.3）分，低于 B 組（13.6±0.9）分，差異有統計學意義（t=?7.637，P=0.000）。
圖4
造模后 8 周各組甲苯胺藍染色觀察（×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. Toluidine blue staining in each group at 8 weeks after modeling (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C
圖5
造模后 8 周各組Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure5. Immunohistochemical staining for collagen typeⅡat 8 weeks after modeling (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 討論
體內動物模型研究在從體外實驗到轉化至臨床治療過程中起著至關重要作用。由于每種動物模型都有優點和缺點，所以在設計動物實驗時需要對每種可用動物模型進行綜合分析，包括成本效益、解剖結構、關節生物力學以及術后方案。理想的動物模型應包括以下特征：① 造模較簡單，穩定性好，變異小，在適當時間內可重現；② 動物易于飼養和處理，價格合理，并且可以評估不同遺傳學、生物化學和影像學標志物；③ 基于動物模型的研究結果可以特異地轉化為人類醫學的病理和治療[7]。但是，目前尚不存在絕對理想動物模型。
在軟骨修復和再生領域，對于體內機制研究、可行性研究和新療法的初步探索，鼠類動物模型是最有效模型[8]。鼠類包括大鼠和小鼠，易于飼養和處理，并且價格低廉，常用于軟骨損傷修復的研究。相對于小鼠，大鼠關節更大，可以提高研究可行性和重復性，且與臨床相關性更大[9]，在既往研究中應用相對較多[10-11]。無胸腺的大鼠品系還可用于包括生物材料在內的異種移植物修復骨軟骨損傷研究[12]。但是目前在大鼠體內尚無法進行基因水平修飾。小鼠在國內外已有嚴格質量控制標準，近年來一直作為生物醫學動物模型的主要動物品種，并且基因組測序表明小鼠 85% 基因序列與人類一致[13]。總的來說，鼠類動物可以獲得免疫豁免和轉基因或基因敲除動物模型，有利于骨軟骨缺損研究，而且藥物干預成本較低。
軟骨修復定義為通過軟骨細胞增殖并合成新的細胞外基質來修復受損軟骨的過程。最近研究表明，軟骨下骨髓腔的 MSCs 是修復損傷關節軟骨的重要細胞來源。MSCs 遷移至損傷部位，在相關因子作用下分化為軟骨細胞，并分泌特定的細胞外基質，包括Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖，最終修復損傷軟骨[14-15]。Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖是軟骨細胞標志物，其表達水平與軟骨細胞數量和活力成正比[16]。軟骨修復在很大程度上取決于損傷深度和寬度。目前多數觀點認為，關節軟骨損傷只有當突破軟骨層和軟骨下骨到達骨髓腔時，才有可能自發性愈合[17-18]。本研究 B 組采用鎢鋼麻花鉆頭穿透軟骨下骨到達骨髓腔，通過有血液從損傷部位滲出予以確認，組織學染色進一步確認軟骨下骨損傷，骨髓腔與關節腔相通。采用注射器針頭突破關節軟骨全層觸及軟骨下骨時，其尖端很容易變鈍，難以保證針頭突破軟骨下骨，A 組造模過程中均未見到明顯血液滲出，組織學染色顯示軟骨下骨僅有表層被損傷，軟骨下骨全層沒有被突破。美國材料試驗學會（ASTM）建議軟骨損傷大小不應超過關節表面的 15%～20%，或髁間寬度的 50%～60%[19]。我們使用的鎢鋼麻花鉆頭直徑為 0.2 mm，約為髁間寬度的 25%（髁間寬度約為 0.8 mm），而注射器針頭損傷寬度約為髁間寬度的 15%。雖然，與注射器針頭相比，鎢鋼麻花鉆頭對軟骨及軟骨下骨造成的損傷寬度和橫截面積均更大，但是損傷部位可以更快地被修復組織填充，并且修復組織甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性，表明其為再生的軟骨組織。而注射器針頭造成的損傷雖然較小，但是由于未突破軟骨下骨到達骨髓腔，其愈合較差。因此，在軟骨損傷寬度較小的情況下，損傷深度對是否自發愈合至關重要。另外，本研究采用的鎢鋼麻花鉆頭還有其他直徑（0.1～1.0 mm），未來我們將探究不同損傷寬度對骨軟骨損傷愈合的影響，也為組織工程修復骨軟骨損傷等相關研究提供合適的動物模型和研究基礎。
采用鎢鋼麻花鉆頭制備骨軟骨損傷模型時，需注意以下事項：第一，小鼠膝關節需充分屈曲，暴露股骨遠端，并牢固固定；第二，鉆頭使用時處于高速運轉狀態，操作者應將其牢固握住，且鉆頭應垂直于髁間軟骨最低點勻速前進，切忌左右晃動；第三，高速運轉鉆頭與軟骨下骨摩擦會產生大量熱量，容易對周圍正常軟骨造成額外熱力損傷，操作時予以冷生理鹽水持續沖洗降溫；第四，鉆頭損傷軟骨后不能完全將碎片帶出，操作者需在體視顯微鏡下將殘留的軟骨碎片完全清除，排除損傷部位殘留軟骨組織對結果的影響；第五，需明確損傷部位血液滲出，提示鉆頭突破軟骨下骨進入骨髓腔；第六，采用鉆頭造模難度大于注射器針頭，需要操作者多練習。
綜上述，我們建立的小鼠膝關節骨軟骨損傷模型制備方法可行，采用該方法得到控制良好、一致且可重復的關節骨軟骨損傷結果。相對于注射器針頭，鎢鋼麻花鉆頭可輕松突破軟骨下骨，還可以更改鉆頭直徑模擬不同大小骨軟骨損傷。
作者貢獻：劉歡、任永信負責實驗設計；劉歡、丁其瑞負責實驗操作、論文撰寫；馬成、秦豪男、魏易凡負責數據整理及統計分析；任永信負責論文審核。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。
機構倫理問題：研究經南京醫科大學實驗動物倫理委員會批準（IACUC-1903009）。實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2016-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2016-0015。
骨軟骨損傷是一種臨床常見關節疾病，關節軟骨由于缺乏血管，損傷后軟骨祖細胞無法及時遷移至損傷部位[1]，自身愈合能力較差，最終可能發展為骨關節炎。因此，此類損傷修復是臨床一個重大挑戰，其修復方法及作用機制也成為重要研究課題，而動物模型是重要研究對象。
目前，采用犬、羊、豬和馬等大型動物制備的關節骨軟骨缺損模型已廣泛用于軟骨再生研究，此類模型具有膝關節面較大以及關節結構、組成與特性等與人類相似的優勢，而且造模相對容易。但是，在大型動物中難以進行基因修飾，影響了對軟骨修復機制的深入研究[2-3]。而小鼠可以在其體內進行基因修飾，目前已廣泛應用于各種分子機制研究中。
近年來，有學者采用小鼠制備模型行膝關節骨軟骨損傷研究[4-5]，主要采用注射器針頭在股骨髁間溝縱形劃傷關節軟骨制備模型。該操作較簡單，但是注射器尖端硬度相對較低，接觸軟骨下骨后容易發生變形，且尖端為一坡面，采用不同方向造成的骨軟骨損傷其寬度也不同，導致造模結果不一致、可重復性不高。為此，我們將上述方法中使用的注射器針頭改為電鉆筆配合鎢鋼麻花鉆頭。鎢鋼麻花鉆頭硬度高，鉆頭不易變形，并且鉆頭在高速旋轉時為一個圓柱體，制備的骨軟骨損傷寬度一致，最大程度降低了器械本身對造模結果造成的誤差。本研究將該方法與傳統注射器針頭方法進行比較，進一步探討鎢鋼麻花鉆頭制備小鼠骨軟骨損傷模型的效果，以期為骨軟骨損傷相關研究提供一種較理想的動物模型制備方法。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2 月齡雄性 C57BL/6 小鼠 75 只，體質量 20～22 g，平均 21 g，飼養于南京醫科大學實驗動物中心。
蘇木素染液、伊紅染液（南京建成生物工程研究所）；甲苯胺藍染液（北京索萊寶科技有限公司）；Ⅱ型膠原抗體（Abcam 公司，英國）。電鉆筆（安徽阿斯珈工具有限公司）；鎢鋼麻花鉆頭（Kuangxia 公司，日本）；1 mL 無菌注射器（上海康德萊醫療器械股份有限公司）；NSZ-608T 手術體視顯微鏡（河南新星光學有限公司）；Image J 軟件（美國國立衛生研究院）；切片機、攤片機（Leica 公司，德國）；光學顯微鏡（Nikon 公司，日本）。
1.2 實驗分組及方法
將 75 只小鼠隨機均分為 3 組（n=25），A 組采用 26G 注射器針頭進行造模；B 組采用鎢鋼麻花鉆頭進行造模；C 組為假手術組。
3 組小鼠腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和賽拉嗪（5 mg/kg）麻醉后，右后肢脫毛、消毒、鋪單。在膝關節內側切開皮膚，暴露關節囊，沿髕骨內側緣切開關節囊，并從股四頭肌內側頭和長頭間隙鈍性分離，將髕骨向外側推移并完全屈曲膝關節，以暴露股骨滑車溝。
A 組：使用自制尖端限深的 26G 注射器針頭，沿滑車溝稍用力劃破關節軟骨（以有阻力感為判定標準）。B 組：采用電鉆筆和尖端限深、直徑為 0.2 mm 的鎢鋼麻花鉆頭，冷生理鹽水沖洗下以 7 000 r/min 速度沿滑車溝劃破軟骨全層，損傷部位有血液滲出提示損傷達軟骨下骨。手術體視顯微鏡下去除殘留軟骨碎片，將脫位的髕骨復位，分別縫合股四頭肌內側頭、關節囊和皮膚。C 組：僅切開皮膚及關節囊，關節軟骨不作處理。見圖 1、2。
圖1
動物模型制備工具
a. 注射器針頭；b. 鎢鋼麻花鉆頭和電鉆筆
Figure1. Equipment for animal model preparationa. Needle; b. Tungsten drill and electronic drill pen
圖2
造模后關節面大體形態
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure2. Morphology of the joint surface after modelinga. Group A; b. Group B; c. Group C
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察小鼠術后存活、切口愈合以及膝關節活動度恢復情況。
1.3.2 組織學觀察
造模后 1 d 及 1、2、4、8 周，每組取 5 只小鼠，以頸椎脫位法處死后分離右后肢，剝離膝關節附著肌肉及其他軟組織，如標本存在明顯感染或者髕骨脫位排除研究。將納入標本置于 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，于 EDTA 螯合劑中脫鈣 21～28 d，梯度脫水、浸蠟、包埋，切片機制作 5 μm 厚切片。
組織切片經脫蠟、梯度乙醇水化后，取造模后 1 d 及 1、2、4、8 周切片常規 HE 染色，光鏡下觀察骨軟骨損傷愈合情況；取 A、B 組造模后 1 d 時切片，采用 Image J 軟件測量骨軟骨損傷部位形態學參數，包括深度、寬度、橫截面積，并計算損傷部位深度占關節軟骨厚度的百分比（深度/厚度）。其中，寬度為骨軟骨損傷部位兩側外緣距離，深度為損傷最低點至軟骨面距離。
取造模后 8 周切片，分別行甲苯胺藍染色以及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，光鏡下分別觀察修復區域組織甲苯胺藍著色及Ⅱ型膠原表達情況。基于切片 HE 染色、甲苯胺藍染色，參照國際軟骨研究協會（ICRS）評分標準[6]，對 A、B 組骨軟骨損傷愈合情況進行評分。
1.4 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
所有小鼠均存活至實驗完成。術后一般情況良好，自由進食、飲水；切口愈合良好，無紅腫、感染征象；膝關節活動度可，無明顯受限。所有標本均納入研究。
2.2 組織學觀察
2.2.1 HE 染色觀察
C 組為正常軟骨形態。造模后 1 d，A 組損傷僅突破軟骨層達軟骨下骨，未進入骨髓腔；B 組損傷已完全突破軟骨和軟骨下骨，到達骨髓腔。A 組損傷部位深度、寬度、橫截面積和深度/厚度均小于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。造模后 1、2、4、8 周，A 組損傷部位均未見明顯組織填充，而 B 組損傷部位已逐漸被組織填充。見圖 3。
表1
A、B 組造模 1 d 骨軟骨損傷部位形態學參數比較（n=5，）
Table1.
Comparison of morphological parameters of osteochondral injury at 1 day after modeling between group A and group B (n=5, )
圖3
造模后各組 HE 染色觀察（×100）
從左至右分別為 A、B、C 組 a. 造模后 1 d；b. 造模后 1 周；c. 造模后 2 周；d. 造模后4 周；e. 造模后 8 周
Figure3. HE staining in each group after modeling (×100)From left to right for groups A, B, and C, respectively a. One day after modeling; b. One week after modeling; c. Two weeks after modeling; d. Four weeks after modeling; e. Eight weeks after modeling
2.2.2 甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察
造模后 8 周，A 組損傷部位未見甲苯胺藍著色以及Ⅱ型膠原表達；而 B 組損傷部位填充組織可見甲苯胺藍著色及Ⅱ型膠原表達。見圖 4、5。A 組 ICRS 評分為（8.2±1.3）分，低于 B 組（13.6±0.9）分，差異有統計學意義（t=?7.637，P=0.000）。
圖4
造模后 8 周各組甲苯胺藍染色觀察（×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure4. Toluidine blue staining in each group at 8 weeks after modeling (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C
圖5
造模后 8 周各組Ⅱ型膠原免疫組織化學染色觀察（×100）
a. A 組；b. B 組；c. C 組
Figure5. Immunohistochemical staining for collagen typeⅡat 8 weeks after modeling (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 討論
體內動物模型研究在從體外實驗到轉化至臨床治療過程中起著至關重要作用。由于每種動物模型都有優點和缺點，所以在設計動物實驗時需要對每種可用動物模型進行綜合分析，包括成本效益、解剖結構、關節生物力學以及術后方案。理想的動物模型應包括以下特征：① 造模較簡單，穩定性好，變異小，在適當時間內可重現；② 動物易于飼養和處理，價格合理，并且可以評估不同遺傳學、生物化學和影像學標志物；③ 基于動物模型的研究結果可以特異地轉化為人類醫學的病理和治療[7]。但是，目前尚不存在絕對理想動物模型。
在軟骨修復和再生領域，對于體內機制研究、可行性研究和新療法的初步探索，鼠類動物模型是最有效模型[8]。鼠類包括大鼠和小鼠，易于飼養和處理，并且價格低廉，常用于軟骨損傷修復的研究。相對于小鼠，大鼠關節更大，可以提高研究可行性和重復性，且與臨床相關性更大[9]，在既往研究中應用相對較多[10-11]。無胸腺的大鼠品系還可用于包括生物材料在內的異種移植物修復骨軟骨損傷研究[12]。但是目前在大鼠體內尚無法進行基因水平修飾。小鼠在國內外已有嚴格質量控制標準，近年來一直作為生物醫學動物模型的主要動物品種，并且基因組測序表明小鼠 85% 基因序列與人類一致[13]。總的來說，鼠類動物可以獲得免疫豁免和轉基因或基因敲除動物模型，有利于骨軟骨缺損研究，而且藥物干預成本較低。
軟骨修復定義為通過軟骨細胞增殖并合成新的細胞外基質來修復受損軟骨的過程。最近研究表明，軟骨下骨髓腔的 MSCs 是修復損傷關節軟骨的重要細胞來源。MSCs 遷移至損傷部位，在相關因子作用下分化為軟骨細胞，并分泌特定的細胞外基質，包括Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖，最終修復損傷軟骨[14-15]。Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖是軟骨細胞標志物，其表達水平與軟骨細胞數量和活力成正比[16]。軟骨修復在很大程度上取決于損傷深度和寬度。目前多數觀點認為，關節軟骨損傷只有當突破軟骨層和軟骨下骨到達骨髓腔時，才有可能自發性愈合[17-18]。本研究 B 組采用鎢鋼麻花鉆頭穿透軟骨下骨到達骨髓腔，通過有血液從損傷部位滲出予以確認，組織學染色進一步確認軟骨下骨損傷，骨髓腔與關節腔相通。采用注射器針頭突破關節軟骨全層觸及軟骨下骨時，其尖端很容易變鈍，難以保證針頭突破軟骨下骨，A 組造模過程中均未見到明顯血液滲出，組織學染色顯示軟骨下骨僅有表層被損傷，軟骨下骨全層沒有被突破。美國材料試驗學會（ASTM）建議軟骨損傷大小不應超過關節表面的 15%～20%，或髁間寬度的 50%～60%[19]。我們使用的鎢鋼麻花鉆頭直徑為 0.2 mm，約為髁間寬度的 25%（髁間寬度約為 0.8 mm），而注射器針頭損傷寬度約為髁間寬度的 15%。雖然，與注射器針頭相比，鎢鋼麻花鉆頭對軟骨及軟骨下骨造成的損傷寬度和橫截面積均更大，但是損傷部位可以更快地被修復組織填充，并且修復組織甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性，表明其為再生的軟骨組織。而注射器針頭造成的損傷雖然較小，但是由于未突破軟骨下骨到達骨髓腔，其愈合較差。因此，在軟骨損傷寬度較小的情況下，損傷深度對是否自發愈合至關重要。另外，本研究采用的鎢鋼麻花鉆頭還有其他直徑（0.1～1.0 mm），未來我們將探究不同損傷寬度對骨軟骨損傷愈合的影響，也為組織工程修復骨軟骨損傷等相關研究提供合適的動物模型和研究基礎。
采用鎢鋼麻花鉆頭制備骨軟骨損傷模型時，需注意以下事項：第一，小鼠膝關節需充分屈曲，暴露股骨遠端，并牢固固定；第二，鉆頭使用時處于高速運轉狀態，操作者應將其牢固握住，且鉆頭應垂直于髁間軟骨最低點勻速前進，切忌左右晃動；第三，高速運轉鉆頭與軟骨下骨摩擦會產生大量熱量，容易對周圍正常軟骨造成額外熱力損傷，操作時予以冷生理鹽水持續沖洗降溫；第四，鉆頭損傷軟骨后不能完全將碎片帶出，操作者需在體視顯微鏡下將殘留的軟骨碎片完全清除，排除損傷部位殘留軟骨組織對結果的影響；第五，需明確損傷部位血液滲出，提示鉆頭突破軟骨下骨進入骨髓腔；第六，采用鉆頭造模難度大于注射器針頭，需要操作者多練習。
綜上述，我們建立的小鼠膝關節骨軟骨損傷模型制備方法可行，采用該方法得到控制良好、一致且可重復的關節骨軟骨損傷結果。相對于注射器針頭，鎢鋼麻花鉆頭可輕松突破軟骨下骨，還可以更改鉆頭直徑模擬不同大小骨軟骨損傷。
作者貢獻：劉歡、任永信負責實驗設計；劉歡、丁其瑞負責實驗操作、論文撰寫；馬成、秦豪男、魏易凡負責數據整理及統計分析；任永信負責論文審核。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。
機構倫理問題：研究經南京醫科大學實驗動物倫理委員會批準（IACUC-1903009）。實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2016-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2016-0015。
