引用本文： 何鵬杰, 李楊, 張若天, 任茂賢, 劉和棟, 楊民. p22phox 和 NOX5 在缺氧誘導成骨細胞自噬及凋亡中的作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(7): 855-861. doi: 10.7507/1002-1892.202008039 復制
骨形態發生和重塑需要成骨細胞合成骨基質、破骨細胞協調吸收[1-2]。如骨髓血供下降會觸發缺氧，進而引起成骨細胞內活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）升高，引發細胞自噬以及凋亡，最終導致骨質疏松。ROS 的生成需要 NADPH 氧化酶系統的協助[3]，而 NADPH 氧化酶系統又可通過 ROS 來調節成骨細胞的增殖分化。
NADPH 氧化酶系統包括 p22phox 和 NOX 家族，上述家族可形成二聚體促進 ROS 生成。NOX 家族包括 NOX1～5，研究已明確 p22phox 與 NOX1～4 的生成密切相關，NOX4 基因可以通過 ROS 來調節 BMP-2 表達，進而調節成骨細胞分化[4]；p22phox-Rubicon 軸的高效選擇性抑制劑 TIPTP 可以治療骨關節炎[5]，p47phox-NOX2 依賴的 ROS 信號則可抑制小鼠早期骨骼發育[6]。這些研究表明 p22phox 與 NOX 家族可調節成骨細胞的生物功能，而 p22phox、NOX5 在骨質疏松骨組織中的表達水平以及對缺氧引發的成骨細胞損害作用機制尚未明確。因此，本研究就 p22phox 及 NOX5 在缺氧條件下成骨細胞自噬與凋亡中的作用作進一步研究。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生 SD 大鼠 6 只，雌雄不限，體質量不限，由皖南醫學院弋磯山醫院中心實驗室提供。
p22phox、NOX5 抗體以及二抗（Abcam 公司，美國）；Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bax、Bcl-2 抗體（CST 公司，美國）；熒光探針（DCFH-DA）、細胞凋亡試劑盒、ROS 檢測試劑盒、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、茜素紅染色試劑盒、ALP 染色試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；p22phox 和 NOX5 小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA；廣東銳博生物科技有限公司）；SYBR ExScript Q-PCR 試劑盒（Takara 公司，日本）。
流式細胞儀（Beckman 公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（OSRAM 公司，德國）；三氣培養箱（Abcam 公司，美國）。
1.2 成骨細胞培養及鑒定
取 6 只新生 SD 大鼠斷頭處死后，置于乙醇浸泡 15 min，無菌條件下取顱骨[7]，去除周圍結締組織后剪碎至 2 mm×2 mm，置于胰蛋白酶-Ⅱ型膠原酶混合液消化 2 h，獲得組織塊。采用組織塊貼壁法獲得成骨細胞，差速貼壁法純化成骨細胞。將細胞置于恒溫、恒濕培養箱培養，每 3 天換液 1 次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，待 1 周后細胞達 90% 融合時傳代 1 次，即第 1 代細胞，用于后續實驗。
取第 1 代細胞行 HE 染色觀察細胞形態，流式細胞儀檢測細胞純度，茜素紅染色和 ALP 染色鑒定細胞功能[8-9]。
1.3 成骨細胞缺氧模型制備及最佳缺氧時間選擇
1.3.1 成骨細胞缺氧模型制備
實驗使用三氣培養箱制備成骨細胞缺氧模型。首先以 95%N2 和 5%CO2 混合氣體持續供給三氣培養箱，直至培養箱 O2 濃度降至 1%（缺氧環境），再將成骨細胞置入培養箱[10]。于缺氧培養 0、3、6、12、24 h 后，分別取出細胞行 Western blot 及流式細胞儀檢測。
1.3.2 檢測方法
① Western blot 檢測：將各時間點細胞采用 RIPA buffer 裂解，獲得裂解蛋白，用 BCA 法調整蛋白濃度，每孔加入 5 μL 蛋白混合物，抗體稀釋濃度 p22phox（1∶1 000）、NOX5（1∶500）、LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000），二抗稀釋濃度 1∶500。然后進行電泳實驗，轉膜，曝光，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算與內參蛋白 β-actin 的灰度值比值作為目標蛋白 p22phox、NOX5、LC3 相對表達量。其中，以 LC3Ⅱ/Ⅰ作為 LC3 表達量[11]，觀測細胞自噬水平的改變。實驗重復 3 次。
② 流式細胞儀檢測：使用熒光探針（DCFH-DA）檢測細胞內 ROS 水平[12]。取各時間點細胞，用不含血清培養基清洗 3 次，加入濃度為 10 μmol/L 的 DCFH-DA 孵育 30 min，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化后收集細胞，調整細胞濃度至 1×106個/mL，流式細胞儀測量細胞內 ROS 水平。
取各時間點細胞用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度至 1×106個/mL，使用 Annexin V/碘化丙啶染色[13]后，流式細胞儀測量各組細胞凋亡率。
根據上述檢測結果，選擇細胞內 ROS 水平最高時間作為最佳缺氧時間，進行后續實驗。
1.4 細胞轉染實驗
1.4.1 p22phox 和 NOX5 siRNA 抑制效率觀測
① 分組方法：將成骨細胞分成正常組和 si-p22phox 缺氧處理組、si-NOX5 缺氧處理組。其中，正常組為正常細胞，不作轉染處理；si-p22phox 缺氧處理組、si-NOX5 缺氧處理組：將 p22phox 和 NOX5 的 siRNA 分別按說明書使用脂質體轉染至成骨細胞中 12 h。然后，將 3 組細胞以 5×104個/孔接種于 6 孔板中過夜后，參照 1.3.1 方法進行缺氧處理。
② 抑制效率檢測：取缺氧處理 12 h 后細胞，提取總 RNA，采用 SYBR ExScript Q-PCR 試劑盒行 RT-PCR 檢測細胞抑制效率。
1.4.2 分別抑制成骨細胞 p22phox 或 NOX5 基因表達觀測
① 分組方法：將成骨細胞分成 4 組，正常組、si-NC 缺氧處理組、si-p22phox 缺氧處理組以及 si-NOX5 缺氧處理組。其中，后 3 組先按照 1.4.1 方法采用 si-NC（不含 siRNA 的脂質體）以及含 p22phox 或 NOX5 的 siRNA 轉染成骨細胞后，參照 1.3.1 方法將 4 組細胞缺氧處理 12 h。
② 觀測方法：參照 1.3.2 方法采用 Western blot 及流式細胞儀檢測細胞內 p22phox、NOX5、ROS 水平，與細胞自噬（LC3Ⅱ/Ⅰ和 Beclin）、凋亡（Bax 和 Bcl-2）相關的蛋白表達，以及細胞凋亡率。
1.4.3 同時抑制成骨細胞 p22phox 和 NOX5 基因表達觀測
① 分組方法：將成骨細胞分成 2 組，缺氧 12 h 組（缺氧組）以及同時轉染 si-p22phox 及 si-NOX5 并缺氧 12 h 組（抑制+缺氧組）。抑制+缺氧組成骨細胞同 1.4.1 方法使用脂質體轉染 si-p22phox 及 si-NOX5 后，將 2 組成骨細胞缺氧處理 12 h。
② 觀察方法：采用免疫熒光染色觀察 2 組細胞內 Beclin 及 Bax 表達變化，熒光顯微鏡下見 Beclin 呈綠色熒光，Bax 呈紅色熒光，Beclin、Bax 混合呈黃色熒光。
1.5 統計學方法
采用 R 語言 4.02 版本軟件中 stats 包進行統計分析。數據以均數±標準差表示；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Tukey 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 成骨細胞形態觀察及鑒定
倒置顯微鏡下見第 1 代細胞為梭形并呈鋪路石狀生長，細胞形態一致性較好。流式細胞儀檢測細胞純度達 95% 左右。HE 染色示細胞形態較完整，茜素紅染色可見紅色結節，ALP 染色可見細胞內藍紫色顆粒。見圖 1。經鑒定，培養獲得的細胞為成骨細胞。
圖1
成骨細胞形態觀察及鑒定
a. 第 1 代細胞形態（倒置顯微鏡×40）；b. 流式細胞儀鑒定；c. HE 染色（×100）；d. 茜素紅染色（×100）；e. ALP 染色（×100）
Figure1. Observation and identification of osteoblastsa. The morphology of the first generation cells (Inverted mircoscopy×40); b. Flow cytometry identification; c. HE staining (×100); d. Alizarin red staining (×100); e. ALP staining (×100)
2.2 成骨細胞最佳缺氧時間選擇
2.2.1 Western blot 檢測
隨著缺氧時間延長，p22phox、NOX5、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量均逐漸增加，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測缺氧后各時間點成骨細胞 p22phox、NOX5 及 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達
a. 電泳圖 1～5 分別為缺氧培養 0、3、6、12、24 hMr：相對分子質量；b. 各目標蛋白相對表達量
Figure2. The expressions of p22phox, NOX5, and LC3Ⅱ/Ⅰ proteins in osteoblasts at each hypoxia time point detected by Western blota. Electrophoresis 1-5 for hypoxia culture for 0, 3, 6, 12, and 24 hours, respectively Mr: Relative molecular mass; b. Relative expression of each target protein
2.2.2 流式細胞儀檢測
隨缺氧時間延長，成骨細胞內 ROS 水平逐漸升高，12 h 達峰值，之后開始下降；各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。細胞凋亡率也隨著缺氧時間延長逐漸升高，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
流式細胞儀檢測缺氧后各時間點成骨細胞內 ROS 水平及細胞凋亡率
a. ROS 水平；b. 細胞凋亡率
Figure3. The level of ROS and apoptosis rate of osteoblasts at each time point after hypoxia detected by flow cytometrya. Level of ROS; b. Apoptosis rate
綜合 Western blot 檢測及流式細胞儀檢測結果，選擇缺氧 12 h 模型進行后續實驗。
2.3 細胞轉染實驗
2.3.1 p22phox 和 NOX5 siRNA 抑制效率觀測
RT-PCR 檢測 p22phox 及 NOX5 的 siRNA 抑制效率均達 98% 以上，其中 si-p22phox 缺氧處理組 p22phox 抑制效率 99.45%，si-NOX5 缺氧處理組 NOX5 抑制效率 98.36%，按照 siRNA 轉染使用說明，抑制效率達 95% 即可用于實驗。
2.3.2 分別抑制成骨細胞 p22phox、NOX5 基因表達觀測
① Western blot 檢測：與 si-NC 缺氧處理組相比，si-p22phox 缺氧處理組 NOX5 蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05），而 p22phox 蛋白相對表達量差異有統計學意義（P<0.05）；si-NOX5 缺氧處理組 p22phox 蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05），NOX5 蛋白相對表達量差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
Western blot 檢測缺氧并轉染處理后各組相關目的蛋白表達
1～4 分別為正常組、si-NC 缺氧處理組、si-p22phox 缺氧處理組、si-NOX5 缺氧處理組 a. 電泳圖 Mr：相對分子質量；b. 各目標蛋白相對表達量 *P<0.05
Figure4. The target protein expression detected by Western blot after hypoxia and transfection treatment1-4 for the normal group, si-NC hypoxia group, si-p22phox hypoxia group, and si-NOX5 hypoxia group, respectively a. Electrophoresis Mr: Relative molecular mass; b. Relative expression of each target protein *P<0.05
與正常組比較，si-NC 缺氧處理組 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、Bax 蛋白相對表達量上升，Bcl-2 蛋白相對表達量表達下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 si-NC 缺氧處理組比較，si-p22phox 缺氧處理組以及 si-NOX5 缺氧處理組的 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、Bax 蛋白相對表達量下降，而 Bcl-2 蛋白相對表達量上升，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖 4。
② 流式細胞儀檢測：與正常組比較，si-NC 缺氧組 ROS 水平及細胞凋亡率上升，差異有統計學意義（P<0.05）；與 si-NC 缺氧組比較，si-p22phox 缺氧處理組以及 si-NOX5 缺氧處理組 ROS 水平及細胞凋亡率下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
流式細胞儀檢測缺氧并轉染處理后各組 ROS 水平及細胞凋亡情況
1～4 分別為正常組、si-NC 缺氧處理組、si-p22phox 缺氧處理組、si-NOX5 缺氧處理組 *P<0.05 a. ROS 水平；b. 細胞凋亡率
Figure5. The level of ROS and apoptosis rate of osteoblasts at each time point after hypoxia and transfection treatment detected by flow cytometry1-4 for the normal group, si-NC hypoxia group, si-p22phox hypoxia group, and si-NOX5 hypoxia group, respectively *P<0.05 a. Level of ROS; b. Apoptosis rate
2.3.3 同時抑制成骨細胞 p22phox 和 NOX5 基因表達觀察
免疫熒光染色顯示缺氧組細胞中與自噬相關基因 Beclin 以及與凋亡相關基因 Bax 呈強熒光，抑制+缺氧組上述基因熒光均較弱，見圖 6。
圖6
免疫熒光染色觀察同時抑制 p22phox、NOX5 基因表達后細胞內 Beclin、Bax 表達情況（熒光顯微鏡×100）
從左至右分別為 DAPI、Beclin、Bax 及重疊圖片 a. 缺氧組；b. 抑制+缺氧組
Figure6. The expressions of Beclin and Bax after simultaneously inhibiting the expressions of p22phox and NOX5 genes by immunofluorescence staining (Fluorescent microscope×100)From left to right for DAPI, Beclin, Bax, and merge images, respectively a. Hypoxia group; b. Inhibition+hypoxia group
3 討論
研究表明體內骨質疏松區域內的成骨細胞會長期處于缺血缺氧環境[14]，而缺血缺氧又會引發成骨細胞自噬和凋亡[15]。本研究在體外實驗中初步觀察到抑制 p22phox、NOX5 基因表達，可以降低成骨細胞在缺氧環境中自噬和凋亡。自噬和凋亡對于成骨細胞的增殖和礦化具有重要意義。凋亡勢必降低成骨細胞的礦化以及增殖能力；輕度自噬利于細胞維持正常生理狀態，包括增殖、分化等，而過度自噬對原細胞生理環境破壞較大。
研究表明 ROS 在細胞周期以及細胞增殖、凋亡、自噬中具有重要作用[16]，多項研究均表明抗骨質疏松藥物具有清除細胞內 ROS 的作用，并且在骨質疏松模型中檢測到 ROS 表達升高[17]。本研究也觀察到缺氧可導致細胞內 ROS 水平上升，而缺氧是骨質疏松發生的重要一環[18]。本研究將成骨細胞置于缺氧培養箱中培養，發現在一定時間內，隨著缺氧時間增加，細胞中 ROS 水平增加，當缺氧時間超過一定時間閾值，細胞內 ROS 水平開始下降。與此同時，對上述不同缺氧時間點 p22phox 和 NOX5 蛋白表達變化進行檢測，發現與細胞內 ROS 水平具有相同變化趨勢，這說明 p22phox、NOX5 和成骨細胞 ROS 的產生可能存在上、下游分子作用關系，p22phox、NOX5 可以影響細胞內 ROS 水平，同時也初步驗證了 p22phox、NOX5 是 ROS 產生的重要輔酶。
我們進一步研究在缺氧成骨細胞中 p22phox、NOX5 基因是否相互影響表達，結果發現缺氧誘導的成骨細胞 p22phox、NOX5 可能互不干擾。與 si-NC 缺氧處理組相比，當抑制 p22phox 基因表達時，NOX5 表達變化無統計學意義；而抑制 NOX5 基因表達時，p22phox 表達變化無統計學意義。由于細胞實驗存在抑制效率問題，該結論還需進一步驗證。
和 p22phox、NOX5 相似，p47phox、NOX2 協同產生的 ROS 在成骨細胞增殖和礦化方面也具有重要作用[6]。抑制 p47phox、NOX2 基因表達可導致骨質疏松模型皮質區成骨細胞增多、骨量增加，并促進和成骨密切相關的基因轉換生長因子 RUNX-2[19]的表達，而 p22phox、p47phox、NOX2 和 NOX5 具有同源性，因此我們分析抑制 p22phox、NOX5 基因表達時，成骨細胞 ROS 降至接近生理水平，有利于成骨細胞增殖和礦化。實驗結果證明抑制 p22phox 和 NOX5 基因表達后，可將缺氧成骨細胞內 ROS 控制在較低水平，進而降低細胞自噬，減少細胞凋亡，從而提高細胞增殖和礦化能力。
LC3 反映細胞自噬能力，細胞自噬增強時會促進 LC3 前體 LC3Ⅰ向 LC3Ⅱ轉化[20]。本研究發現隨著成骨細胞缺氧時間增加，自噬蛋白 LC3Ⅰ轉化為 LC3Ⅱ增加，說明細胞內自噬水平增強。同時，我們發現細胞凋亡也持續增加，并未出現下降或者穩定情況，而這種變化與 ROS 累積量變化趨勢有所不同。根據既往研究[21-22]，我們分析這可能是隨著成骨細胞缺氧程度加重，細胞自噬進一步加強，由于細胞內大量 ROS 積累，細胞損傷進一步加強，使得自噬抑制 ROS 生成以降低細胞損傷，但由于外在缺氧條件沒有改變，p22phox、NOX5 可能通過其他途徑進一步促進細胞凋亡所致。另外，流式細胞儀檢測發現，缺氧所引起的成骨細胞凋亡大部分在早期以及晚期，抑制 p22phox、NOX5 基因表達可以降低成骨細胞在早期以及晚期凋亡，提示缺氧極易引起成骨細胞從早期凋亡直接過渡到晚期凋亡，并且 p22phox、NOX5 可有效減弱這一環節。
為了進一步探究 p22phox、NOX5 與成骨細胞 ROS 產生的上、下游分子關系，本研究通過抑制 p22phox 和 NOX5 基因表達，觀察 p22phox 和 NOX5 基因對缺氧條件下成骨細胞 ROS 形成的影響。成骨細胞 p22phox 和 NOX5 基因表達被抑制后，其 ROS 水平較 si-NC 缺氧處理組明顯下降，我們分析可能是通過抑制成骨細胞內 p22phox、NOX5 的生成，從而進一步抑制了 ROS 形成中重要輔酶 NADPH 氧化酶的形成，進而影響成骨細胞內 ROS 形成。最后，我們檢測了和細胞自噬相關蛋白 LC3Ⅱ/Ⅰ以及 Beclin 表達變化，發現抑制 p22phox、NOX5 基因表達后，Beclin 蛋白表達下降，而 LC3Ⅰ轉化成 LC3Ⅱ的進程受到部分抑制[23]。與此同時，還檢測了和細胞凋亡相關蛋白 Bcl-2、Bax 表達變化，發現 Bax 表達下降，Bcl-2 表達上升。免疫熒光染色發現在單個細胞內，同時抑制 p22phox、NOX5 基因表達后，相對于缺氧組，Beclin 和 Bax 表達下降。另外，Bcl-2 雖然和凋亡相關，但其反映的是細胞增殖能力，Bcl-2 表達上升則表示細胞增殖能力升高。另外我們發現抑制 p22phox 和 NOX5 基因表達能明顯降低成骨細胞晚期凋亡，提示抑制 p22phox 和 NOX5 的表達可降低成骨細胞內 ROS 水平，從而促進細胞內環境穩態，降低細胞凋亡，而 Bcl-2 表達上升從側面證明這種抑制作用。
綜上述，本研究初步觀察到抑制 p22phox、NOX5 基因表達可以降低缺氧條件下成骨細胞自噬和凋亡，從而促進成骨細胞增殖。然而，隨著缺氧時間延長，成骨細胞內 ROS 水平出現下降趨勢，其原因有待進一步研究。而且本研究僅在體外驗證了 p22phox、NOX5 在缺氧成骨細胞中的作用，還需要進一步進行體內實驗。另外，成骨細胞缺氧自噬與 ROS 之間的具體分子作用關系也有待進一步研究。
作者貢獻：何鵬杰負責實驗、數據收集、圖片處理及撰稿；李楊、張若天、任茂賢、劉和棟負責部分實驗數據收集；楊民負責實驗經費、實驗思路、文章構架及校稿。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經皖南醫學院附屬弋磯山醫院動物實驗倫理委員會批準。實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2018-004。
骨形態發生和重塑需要成骨細胞合成骨基質、破骨細胞協調吸收[1-2]。如骨髓血供下降會觸發缺氧，進而引起成骨細胞內活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）升高，引發細胞自噬以及凋亡，最終導致骨質疏松。ROS 的生成需要 NADPH 氧化酶系統的協助[3]，而 NADPH 氧化酶系統又可通過 ROS 來調節成骨細胞的增殖分化。
NADPH 氧化酶系統包括 p22phox 和 NOX 家族，上述家族可形成二聚體促進 ROS 生成。NOX 家族包括 NOX1～5，研究已明確 p22phox 與 NOX1～4 的生成密切相關，NOX4 基因可以通過 ROS 來調節 BMP-2 表達，進而調節成骨細胞分化[4]；p22phox-Rubicon 軸的高效選擇性抑制劑 TIPTP 可以治療骨關節炎[5]，p47phox-NOX2 依賴的 ROS 信號則可抑制小鼠早期骨骼發育[6]。這些研究表明 p22phox 與 NOX 家族可調節成骨細胞的生物功能，而 p22phox、NOX5 在骨質疏松骨組織中的表達水平以及對缺氧引發的成骨細胞損害作用機制尚未明確。因此，本研究就 p22phox 及 NOX5 在缺氧條件下成骨細胞自噬與凋亡中的作用作進一步研究。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生 SD 大鼠 6 只，雌雄不限，體質量不限，由皖南醫學院弋磯山醫院中心實驗室提供。
p22phox、NOX5 抗體以及二抗（Abcam 公司，美國）；Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bax、Bcl-2 抗體（CST 公司，美國）；熒光探針（DCFH-DA）、細胞凋亡試劑盒、ROS 檢測試劑盒、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、茜素紅染色試劑盒、ALP 染色試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；p22phox 和 NOX5 小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA；廣東銳博生物科技有限公司）；SYBR ExScript Q-PCR 試劑盒（Takara 公司，日本）。
流式細胞儀（Beckman 公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（OSRAM 公司，德國）；三氣培養箱（Abcam 公司，美國）。
1.2 成骨細胞培養及鑒定
取 6 只新生 SD 大鼠斷頭處死后，置于乙醇浸泡 15 min，無菌條件下取顱骨[7]，去除周圍結締組織后剪碎至 2 mm×2 mm，置于胰蛋白酶-Ⅱ型膠原酶混合液消化 2 h，獲得組織塊。采用組織塊貼壁法獲得成骨細胞，差速貼壁法純化成骨細胞。將細胞置于恒溫、恒濕培養箱培養，每 3 天換液 1 次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，待 1 周后細胞達 90% 融合時傳代 1 次，即第 1 代細胞，用于后續實驗。
取第 1 代細胞行 HE 染色觀察細胞形態，流式細胞儀檢測細胞純度，茜素紅染色和 ALP 染色鑒定細胞功能[8-9]。
1.3 成骨細胞缺氧模型制備及最佳缺氧時間選擇
1.3.1 成骨細胞缺氧模型制備
實驗使用三氣培養箱制備成骨細胞缺氧模型。首先以 95%N2 和 5%CO2 混合氣體持續供給三氣培養箱，直至培養箱 O2 濃度降至 1%（缺氧環境），再將成骨細胞置入培養箱[10]。于缺氧培養 0、3、6、12、24 h 后，分別取出細胞行 Western blot 及流式細胞儀檢測。
1.3.2 檢測方法
① Western blot 檢測：將各時間點細胞采用 RIPA buffer 裂解，獲得裂解蛋白，用 BCA 法調整蛋白濃度，每孔加入 5 μL 蛋白混合物，抗體稀釋濃度 p22phox（1∶1 000）、NOX5（1∶500）、LC3Ⅱ/Ⅰ（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000），二抗稀釋濃度 1∶500。然后進行電泳實驗，轉膜，曝光，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算與內參蛋白 β-actin 的灰度值比值作為目標蛋白 p22phox、NOX5、LC3 相對表達量。其中，以 LC3Ⅱ/Ⅰ作為 LC3 表達量[11]，觀測細胞自噬水平的改變。實驗重復 3 次。
② 流式細胞儀檢測：使用熒光探針（DCFH-DA）檢測細胞內 ROS 水平[12]。取各時間點細胞，用不含血清培養基清洗 3 次，加入濃度為 10 μmol/L 的 DCFH-DA 孵育 30 min，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化后收集細胞，調整細胞濃度至 1×106個/mL，流式細胞儀測量細胞內 ROS 水平。
取各時間點細胞用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化后，調整細胞濃度至 1×106個/mL，使用 Annexin V/碘化丙啶染色[13]后，流式細胞儀測量各組細胞凋亡率。
根據上述檢測結果，選擇細胞內 ROS 水平最高時間作為最佳缺氧時間，進行后續實驗。
1.4 細胞轉染實驗
1.4.1 p22phox 和 NOX5 siRNA 抑制效率觀測
① 分組方法：將成骨細胞分成正常組和 si-p22phox 缺氧處理組、si-NOX5 缺氧處理組。其中，正常組為正常細胞，不作轉染處理；si-p22phox 缺氧處理組、si-NOX5 缺氧處理組：將 p22phox 和 NOX5 的 siRNA 分別按說明書使用脂質體轉染至成骨細胞中 12 h。然后，將 3 組細胞以 5×104個/孔接種于 6 孔板中過夜后，參照 1.3.1 方法進行缺氧處理。
② 抑制效率檢測：取缺氧處理 12 h 后細胞，提取總 RNA，采用 SYBR ExScript Q-PCR 試劑盒行 RT-PCR 檢測細胞抑制效率。
1.4.2 分別抑制成骨細胞 p22phox 或 NOX5 基因表達觀測
① 分組方法：將成骨細胞分成 4 組，正常組、si-NC 缺氧處理組、si-p22phox 缺氧處理組以及 si-NOX5 缺氧處理組。其中，后 3 組先按照 1.4.1 方法采用 si-NC（不含 siRNA 的脂質體）以及含 p22phox 或 NOX5 的 siRNA 轉染成骨細胞后，參照 1.3.1 方法將 4 組細胞缺氧處理 12 h。
② 觀測方法：參照 1.3.2 方法采用 Western blot 及流式細胞儀檢測細胞內 p22phox、NOX5、ROS 水平，與細胞自噬（LC3Ⅱ/Ⅰ和 Beclin）、凋亡（Bax 和 Bcl-2）相關的蛋白表達，以及細胞凋亡率。
1.4.3 同時抑制成骨細胞 p22phox 和 NOX5 基因表達觀測
① 分組方法：將成骨細胞分成 2 組，缺氧 12 h 組（缺氧組）以及同時轉染 si-p22phox 及 si-NOX5 并缺氧 12 h 組（抑制+缺氧組）。抑制+缺氧組成骨細胞同 1.4.1 方法使用脂質體轉染 si-p22phox 及 si-NOX5 后，將 2 組成骨細胞缺氧處理 12 h。
② 觀察方法：采用免疫熒光染色觀察 2 組細胞內 Beclin 及 Bax 表達變化，熒光顯微鏡下見 Beclin 呈綠色熒光，Bax 呈紅色熒光，Beclin、Bax 混合呈黃色熒光。
1.5 統計學方法
采用 R 語言 4.02 版本軟件中 stats 包進行統計分析。數據以均數±標準差表示；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Tukey 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 成骨細胞形態觀察及鑒定
倒置顯微鏡下見第 1 代細胞為梭形并呈鋪路石狀生長，細胞形態一致性較好。流式細胞儀檢測細胞純度達 95% 左右。HE 染色示細胞形態較完整，茜素紅染色可見紅色結節，ALP 染色可見細胞內藍紫色顆粒。見圖 1。經鑒定，培養獲得的細胞為成骨細胞。
圖1
成骨細胞形態觀察及鑒定
a. 第 1 代細胞形態（倒置顯微鏡×40）；b. 流式細胞儀鑒定；c. HE 染色（×100）；d. 茜素紅染色（×100）；e. ALP 染色（×100）
Figure1. Observation and identification of osteoblastsa. The morphology of the first generation cells (Inverted mircoscopy×40); b. Flow cytometry identification; c. HE staining (×100); d. Alizarin red staining (×100); e. ALP staining (×100)
2.2 成骨細胞最佳缺氧時間選擇
2.2.1 Western blot 檢測
隨著缺氧時間延長，p22phox、NOX5、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對表達量均逐漸增加，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測缺氧后各時間點成骨細胞 p22phox、NOX5 及 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達
a. 電泳圖 1～5 分別為缺氧培養 0、3、6、12、24 hMr：相對分子質量；b. 各目標蛋白相對表達量
Figure2. The expressions of p22phox, NOX5, and LC3Ⅱ/Ⅰ proteins in osteoblasts at each hypoxia time point detected by Western blota. Electrophoresis 1-5 for hypoxia culture for 0, 3, 6, 12, and 24 hours, respectively Mr: Relative molecular mass; b. Relative expression of each target protein
2.2.2 流式細胞儀檢測
隨缺氧時間延長，成骨細胞內 ROS 水平逐漸升高，12 h 達峰值，之后開始下降；各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。細胞凋亡率也隨著缺氧時間延長逐漸升高，各時間點間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
流式細胞儀檢測缺氧后各時間點成骨細胞內 ROS 水平及細胞凋亡率
a. ROS 水平；b. 細胞凋亡率
Figure3. The level of ROS and apoptosis rate of osteoblasts at each time point after hypoxia detected by flow cytometrya. Level of ROS; b. Apoptosis rate
綜合 Western blot 檢測及流式細胞儀檢測結果，選擇缺氧 12 h 模型進行后續實驗。
2.3 細胞轉染實驗
2.3.1 p22phox 和 NOX5 siRNA 抑制效率觀測
RT-PCR 檢測 p22phox 及 NOX5 的 siRNA 抑制效率均達 98% 以上，其中 si-p22phox 缺氧處理組 p22phox 抑制效率 99.45%，si-NOX5 缺氧處理組 NOX5 抑制效率 98.36%，按照 siRNA 轉染使用說明，抑制效率達 95% 即可用于實驗。
2.3.2 分別抑制成骨細胞 p22phox、NOX5 基因表達觀測
① Western blot 檢測：與 si-NC 缺氧處理組相比，si-p22phox 缺氧處理組 NOX5 蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05），而 p22phox 蛋白相對表達量差異有統計學意義（P<0.05）；si-NOX5 缺氧處理組 p22phox 蛋白相對表達量差異無統計學意義（P>0.05），NOX5 蛋白相對表達量差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
Western blot 檢測缺氧并轉染處理后各組相關目的蛋白表達
1～4 分別為正常組、si-NC 缺氧處理組、si-p22phox 缺氧處理組、si-NOX5 缺氧處理組 a. 電泳圖 Mr：相對分子質量；b. 各目標蛋白相對表達量 *P<0.05
Figure4. The target protein expression detected by Western blot after hypoxia and transfection treatment1-4 for the normal group, si-NC hypoxia group, si-p22phox hypoxia group, and si-NOX5 hypoxia group, respectively a. Electrophoresis Mr: Relative molecular mass; b. Relative expression of each target protein *P<0.05
與正常組比較，si-NC 缺氧處理組 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、Bax 蛋白相對表達量上升，Bcl-2 蛋白相對表達量表達下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 si-NC 缺氧處理組比較，si-p22phox 缺氧處理組以及 si-NOX5 缺氧處理組的 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin、Bax 蛋白相對表達量下降，而 Bcl-2 蛋白相對表達量上升，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖 4。
② 流式細胞儀檢測：與正常組比較，si-NC 缺氧組 ROS 水平及細胞凋亡率上升，差異有統計學意義（P<0.05）；與 si-NC 缺氧組比較，si-p22phox 缺氧處理組以及 si-NOX5 缺氧處理組 ROS 水平及細胞凋亡率下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 5。
圖5
流式細胞儀檢測缺氧并轉染處理后各組 ROS 水平及細胞凋亡情況
1～4 分別為正常組、si-NC 缺氧處理組、si-p22phox 缺氧處理組、si-NOX5 缺氧處理組 *P<0.05 a. ROS 水平；b. 細胞凋亡率
Figure5. The level of ROS and apoptosis rate of osteoblasts at each time point after hypoxia and transfection treatment detected by flow cytometry1-4 for the normal group, si-NC hypoxia group, si-p22phox hypoxia group, and si-NOX5 hypoxia group, respectively *P<0.05 a. Level of ROS; b. Apoptosis rate
2.3.3 同時抑制成骨細胞 p22phox 和 NOX5 基因表達觀察
免疫熒光染色顯示缺氧組細胞中與自噬相關基因 Beclin 以及與凋亡相關基因 Bax 呈強熒光，抑制+缺氧組上述基因熒光均較弱，見圖 6。
圖6
免疫熒光染色觀察同時抑制 p22phox、NOX5 基因表達后細胞內 Beclin、Bax 表達情況（熒光顯微鏡×100）
從左至右分別為 DAPI、Beclin、Bax 及重疊圖片 a. 缺氧組；b. 抑制+缺氧組
Figure6. The expressions of Beclin and Bax after simultaneously inhibiting the expressions of p22phox and NOX5 genes by immunofluorescence staining (Fluorescent microscope×100)From left to right for DAPI, Beclin, Bax, and merge images, respectively a. Hypoxia group; b. Inhibition+hypoxia group
3 討論
研究表明體內骨質疏松區域內的成骨細胞會長期處于缺血缺氧環境[14]，而缺血缺氧又會引發成骨細胞自噬和凋亡[15]。本研究在體外實驗中初步觀察到抑制 p22phox、NOX5 基因表達，可以降低成骨細胞在缺氧環境中自噬和凋亡。自噬和凋亡對于成骨細胞的增殖和礦化具有重要意義。凋亡勢必降低成骨細胞的礦化以及增殖能力；輕度自噬利于細胞維持正常生理狀態，包括增殖、分化等，而過度自噬對原細胞生理環境破壞較大。
研究表明 ROS 在細胞周期以及細胞增殖、凋亡、自噬中具有重要作用[16]，多項研究均表明抗骨質疏松藥物具有清除細胞內 ROS 的作用，并且在骨質疏松模型中檢測到 ROS 表達升高[17]。本研究也觀察到缺氧可導致細胞內 ROS 水平上升，而缺氧是骨質疏松發生的重要一環[18]。本研究將成骨細胞置于缺氧培養箱中培養，發現在一定時間內，隨著缺氧時間增加，細胞中 ROS 水平增加，當缺氧時間超過一定時間閾值，細胞內 ROS 水平開始下降。與此同時，對上述不同缺氧時間點 p22phox 和 NOX5 蛋白表達變化進行檢測，發現與細胞內 ROS 水平具有相同變化趨勢，這說明 p22phox、NOX5 和成骨細胞 ROS 的產生可能存在上、下游分子作用關系，p22phox、NOX5 可以影響細胞內 ROS 水平，同時也初步驗證了 p22phox、NOX5 是 ROS 產生的重要輔酶。
我們進一步研究在缺氧成骨細胞中 p22phox、NOX5 基因是否相互影響表達，結果發現缺氧誘導的成骨細胞 p22phox、NOX5 可能互不干擾。與 si-NC 缺氧處理組相比，當抑制 p22phox 基因表達時，NOX5 表達變化無統計學意義；而抑制 NOX5 基因表達時，p22phox 表達變化無統計學意義。由于細胞實驗存在抑制效率問題，該結論還需進一步驗證。
和 p22phox、NOX5 相似，p47phox、NOX2 協同產生的 ROS 在成骨細胞增殖和礦化方面也具有重要作用[6]。抑制 p47phox、NOX2 基因表達可導致骨質疏松模型皮質區成骨細胞增多、骨量增加，并促進和成骨密切相關的基因轉換生長因子 RUNX-2[19]的表達，而 p22phox、p47phox、NOX2 和 NOX5 具有同源性，因此我們分析抑制 p22phox、NOX5 基因表達時，成骨細胞 ROS 降至接近生理水平，有利于成骨細胞增殖和礦化。實驗結果證明抑制 p22phox 和 NOX5 基因表達后，可將缺氧成骨細胞內 ROS 控制在較低水平，進而降低細胞自噬，減少細胞凋亡，從而提高細胞增殖和礦化能力。
LC3 反映細胞自噬能力，細胞自噬增強時會促進 LC3 前體 LC3Ⅰ向 LC3Ⅱ轉化[20]。本研究發現隨著成骨細胞缺氧時間增加，自噬蛋白 LC3Ⅰ轉化為 LC3Ⅱ增加，說明細胞內自噬水平增強。同時，我們發現細胞凋亡也持續增加，并未出現下降或者穩定情況，而這種變化與 ROS 累積量變化趨勢有所不同。根據既往研究[21-22]，我們分析這可能是隨著成骨細胞缺氧程度加重，細胞自噬進一步加強，由于細胞內大量 ROS 積累，細胞損傷進一步加強，使得自噬抑制 ROS 生成以降低細胞損傷，但由于外在缺氧條件沒有改變，p22phox、NOX5 可能通過其他途徑進一步促進細胞凋亡所致。另外，流式細胞儀檢測發現，缺氧所引起的成骨細胞凋亡大部分在早期以及晚期，抑制 p22phox、NOX5 基因表達可以降低成骨細胞在早期以及晚期凋亡，提示缺氧極易引起成骨細胞從早期凋亡直接過渡到晚期凋亡，并且 p22phox、NOX5 可有效減弱這一環節。
為了進一步探究 p22phox、NOX5 與成骨細胞 ROS 產生的上、下游分子關系，本研究通過抑制 p22phox 和 NOX5 基因表達，觀察 p22phox 和 NOX5 基因對缺氧條件下成骨細胞 ROS 形成的影響。成骨細胞 p22phox 和 NOX5 基因表達被抑制后，其 ROS 水平較 si-NC 缺氧處理組明顯下降，我們分析可能是通過抑制成骨細胞內 p22phox、NOX5 的生成，從而進一步抑制了 ROS 形成中重要輔酶 NADPH 氧化酶的形成，進而影響成骨細胞內 ROS 形成。最后，我們檢測了和細胞自噬相關蛋白 LC3Ⅱ/Ⅰ以及 Beclin 表達變化，發現抑制 p22phox、NOX5 基因表達后，Beclin 蛋白表達下降，而 LC3Ⅰ轉化成 LC3Ⅱ的進程受到部分抑制[23]。與此同時，還檢測了和細胞凋亡相關蛋白 Bcl-2、Bax 表達變化，發現 Bax 表達下降，Bcl-2 表達上升。免疫熒光染色發現在單個細胞內，同時抑制 p22phox、NOX5 基因表達后，相對于缺氧組，Beclin 和 Bax 表達下降。另外，Bcl-2 雖然和凋亡相關，但其反映的是細胞增殖能力，Bcl-2 表達上升則表示細胞增殖能力升高。另外我們發現抑制 p22phox 和 NOX5 基因表達能明顯降低成骨細胞晚期凋亡，提示抑制 p22phox 和 NOX5 的表達可降低成骨細胞內 ROS 水平，從而促進細胞內環境穩態，降低細胞凋亡，而 Bcl-2 表達上升從側面證明這種抑制作用。
綜上述，本研究初步觀察到抑制 p22phox、NOX5 基因表達可以降低缺氧條件下成骨細胞自噬和凋亡，從而促進成骨細胞增殖。然而，隨著缺氧時間延長，成骨細胞內 ROS 水平出現下降趨勢，其原因有待進一步研究。而且本研究僅在體外驗證了 p22phox、NOX5 在缺氧成骨細胞中的作用，還需要進一步進行體內實驗。另外，成骨細胞缺氧自噬與 ROS 之間的具體分子作用關系也有待進一步研究。
作者貢獻：何鵬杰負責實驗、數據收集、圖片處理及撰稿；李楊、張若天、任茂賢、劉和棟負責部分實驗數據收集；楊民負責實驗經費、實驗思路、文章構架及校稿。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經皖南醫學院附屬弋磯山醫院動物實驗倫理委員會批準。實驗動物使用許可證號：SYXK（皖）2018-004。
