引用本文： 穆琳, 曾今實, 黃元亮, 林燕嫻, 蔣海越, 滕利. 3D 生物打印脂肪來源干細胞聯合甲基丙烯酰化明膠構建組織工程軟骨的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(7): 896-903. doi: 10.7507/1002-1892.202101049 復制
由出生缺陷、感染、創傷、燒傷或癌癥導致的耳廓畸形和缺損，對患者生理功能和心理狀態有顯著影響，耳廓重建是整形外科醫生的難題之一。軟骨細胞增殖率低、組織血管分布不良，成人耳廓軟骨的再生和康復能力有限[1]。軟骨組織工程技術為軟骨缺損修復和重建提供了應用前景廣闊的新選擇。傳統組織工程技術是將體外培養擴增的種子細胞種植到支架材料上，再進行體外培養或植入體內相應病損部位，對支架材料內部的細胞分布和密度難以精確控制。3D 生物打印技術能精確、快速實現支架復雜的宏觀外形與內部微細結構的一體化構建，制備個性化修復體[2-3]，目前已成功打印出骨、軟骨、肝單元、血管等組織器官[4-7]。
盡管 3D 生物打印在生物材料、生物分子及活細胞的精確空間分布和精細結構構建方面顯示出巨大潛力，有望用于功能性耳廓支架的制備，但選擇理想的生物材料和種子細胞組合用于軟骨生物打印仍是一個難題。目前國內外軟骨組織工程研究多采用軟骨細胞和 BMSCs 作為種子細胞[8]，但二者均存在來源受限、供區副損傷等問題，因此在臨床轉化方面存在不足。而脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有易獲得、創傷小、純化率高、體外擴增速度快和免疫原性低等優點，且 3D 打印立體結構有利于 ADSCs 成軟骨分化[9]。甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）水凝膠因具備可打印、可調節的黏度、流變和凝膠化的物理特性以及適宜的生物特性，被廣泛應用于各種生物醫學領域[10-11]。本研究采用人 ADSCs（human ADSCs，hADSCs）作為種子細胞，以 GelMA 水凝膠為載體，通過 3D 生物打印構建 hADSCs-GelMA 復合支架，并對其進行體內外成軟骨實驗研究，探討該方法構建具有特定三維結構和生物學性能組織工程軟骨的可行性，為應用 3D 生物打印技術構建組織工程軟骨奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
5 周齡健康雌性裸鼠 20 只，體質量 18～24 g，由中國醫學科學院整形外科醫院實驗動物中心提供。脂肪組織由在中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院接受脂肪抽吸手術患者自愿捐獻。
L-DMEM 培養基、FBS、青鏈霉素、0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA（GIBCO 公司，美國）；成軟骨、成脂、成骨誘導培養基（Cyagen 公司，美國）；人 MSCs 流式檢測試劑盒（BD 公司，美國）；0.22 μm 針頭過濾器（Millipore 公司，美國）；GelMA 凍干粉（上普博源北京生物科技有限公司）；一步法逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；活/死細胞活力檢測試劑盒（Invitrogen 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術有限公司）；番紅 O 染液（北京索萊寶科技有限公司）；抗Ⅱ型膠原抗體、山羊抗小鼠 IgG H&L（HRP）（Abcam 公司，英國）。
CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）；Bioplotter 3D 生物打印機（Envition tec 公司，德國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；共聚焦熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；PCR 儀（Eppendorf 公司，德國）；LightCycler R 480Ⅱ實時熒光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）系統（Roche 公司，瑞士）；NanoDrop2000c 微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；多功能酶標儀（EnSpire 公司，新加坡）。
1.2 hADSCs 分離、培養和鑒定
取脂肪組織加等體積 0.2%Ⅰ型膠原酶消化 60 min，離心后棄去含大量脂滴的上層及中間培養基層，加等體積 PBS 吹洗，100 μm 細胞濾網過濾；再次離心，棄上清，沉淀用適量完全培養基（含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基）重懸，接種于培養皿中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，每 2～3 天更換培養基。待細胞生長至 80% 融合時，以 0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA 消化后按 1∶3 比例傳代。取第 3 代細胞，倒置顯微鏡觀察細胞形態。
細胞鑒定：① 流式細胞術鑒定：采用人 MSCs 流式檢測試劑盒檢測細胞表面標志物 CD73、CD90、CD105、CD34、CD11b、CD19、CD45 表達。② 誘導分化鑒定：取第 3 代細胞接種至 6 孔板中，完全培養基培養 72 h 后分別更換為成脂和成骨誘導培養基培養 21 d，行油紅 O 染色和茜素紅染色觀察；取第 3 代細胞置于 15 mL 離心管中，成軟骨誘導培養基培養 21 d，取細胞球制作石蠟切片，阿利新藍染色觀察。
1.3 3D 生物打印 hADSCs-GelMA 復合支架
采用完全培養基將 GelMA 配制成 10%（W/V）溶液，于 75℃ 水浴加熱至充分溶解后，用 0.22 μm 針頭過濾器過濾除菌，與第 3 代 hADSCs 和光引發劑（2.5%LAP）均勻混合，配置成細胞終濃度為 4×106個/mL 的生物墨水。將打印溫度設置為 21℃，氣壓 0.4 bar，打印線寬 320 μm，線間距 1.2 mm，打印的方形支架大小約為 1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm。按照上述參數逐層打印，每層打印后用 405 nm 紫外光光照交聯 3～5 s，使載細胞 GelMA 水凝膠充分固化，得到 hADSCs-GelMA 復合支架，將其轉移至培養皿中，加入完全培養基，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。48 h 后更換為成軟骨誘導培養基培養。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體及掃描電鏡觀察
大體觀察 hADSCs-GelMA 復合支架外觀；于完全培養基培養 1 d 及成軟骨誘導培養 14 d 行掃描電鏡觀察。
1.4.2 復合支架中細胞存活率檢測
分別于培養 1、4、7 d 取 hADSCs-GelMA 復合支架樣本，采用活/死細胞活力檢測試劑盒進行活/死細胞染色，共聚焦熒光顯微鏡觀察，綠色熒光為活細胞，紅色熒光為死細胞。每個樣本任意選取圖片中 5 個不同區域進行平均量化分析，用 Image pro plus 6.0 軟件對圖像進行色彩分類計數，按以下公式計算細胞存活率：活細胞總數/（活細胞總數+死細胞總數）×100%。同時采用共聚焦熒光顯微鏡全景拼圖掃描（垂直間隔 100 μm）多層擬合圖像，觀察樣本整體細胞分布及細胞密度變化。
1.4.3 復合支架中細胞增殖檢測
培養 1、4、7 d 采用 CCK-8 法檢測細胞增殖情況，每個時間點檢測 3 個樣本，每個樣本設 3 個復孔。以 10%CCK-8 溶液作為空白對照，酶標儀上測定 450 nm 波長處每孔吸光度（A）值，以所測 A 值減去空白對照A值作為樣本 A 值。
1.4.4 qRT-PCR 檢測成軟骨基因表達
取成軟骨誘導培養 14 d 的復合支架為實驗組，以 L-DMEM 完全培養基培養 14 d 的復合支架為對照組，用 Trizol 法提取復合支架中的總 RNA，NanoDrop 檢測 RNA 濃度及純度，并用一步法逆轉錄試劑盒行逆轉錄反應（1 000 ng RNA 體系），得到 cDNA。SYBR GREEN 法進行 qRT-PCR 檢測軟骨基質基因蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、成軟骨調節因子 SOX9、軟骨特異性基因Ⅱ型膠原蛋白（collagen typeⅡA1，COLⅡA1）、軟骨肥大標志基因Ⅹ型膠原蛋白（collagen typeⅩA1，COLⅩA1）mRNA 的相對表達量，以 GAPDH 作為內參基因，對樣本進行標準化校正，用 2–ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量，結果以實驗組相比對照組基因表達量倍數表示。基因引物序列見表1。
表1
各基因引物序列（5'
3'）
Table1.
Primer sequences of genes (5'
3')
1.4.5 裸鼠皮下植入實驗
取 20 只裸鼠經腹膜內注射 1% 戊巴比妥溶液麻醉后，于背部中線作一長約 1.2 cm 縱切口，向兩側側腹部皮下分離形成囊袋，一側植入體外成軟骨誘導培養 14 d 的 3D 打印 hADSCs-GelMA 復合支架（實驗組），另一側植入不含細胞的空白 GelMA 水凝膠支架（對照組），4-0 可吸收線縫合切口。4 周后頸椎脫臼法處死裸鼠后取材，大體觀察兩組支架形態、大小和色澤，是否降解，以及與周圍組織反應情況；兩組樣本以 4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，片厚 3 μm，常規行番紅 O、阿利新藍染色和Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，評估組織結構和軟骨細胞外基質沉積。
1.5 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Turkey 法；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hADSCs 形態學觀察及鑒定
倒置顯微鏡觀察示，第 3 代細胞呈長梭形貼壁生長（圖1）。流式細胞術鑒定示細胞表面標志物 CD73、CD90、CD105 表達為陽性，CD34、CD11b、CD19、CD45 表達為陰性（圖2）。成脂、成骨、成軟骨誘導培養 21 d，油紅 O 染色可見大量脂滴，茜素紅染色可見紅色鈣結節，阿利新藍染色可見細胞間質藍染（圖3）。經鑒定，培養細胞為 hADSCs。
圖1
第 3 代 hADSCs 形態觀察（倒置顯微鏡×100）
Figure1.
Morphological observation of the third generation hADSCs (Inverted microscope×100)
圖2
hADSCs 流式細胞術鑒定
a. CD73；b. CD90；c. CD105；d. CD34、CD11b、CD19、CD45
Figure2. Flow cytometric identification of hADSCsa. CD73; b. CD90; c. CD105; d. CD34, CD11b, CD19, CD45
圖3
誘導培養 21 d hADSCs 三系分化鑒定（倒置顯微鏡×100）
a. 油紅 O 染色；b. 茜素紅染色；c. 阿利新藍染色
Figure3. Adipogenic, osteogenic, and chondrogenic induction of hADSCs after 21 days of culture (Inverted microscope×100)a. Oil red O staining; b. Alizarin red staining; c. Alcian blue staining
2.2 3D 生物打印 hADSCs-GelMA 復合支架相關觀測
2.2.1 大體及掃描電鏡觀察
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 復合支架大小約 1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，呈網格狀，色半透明，質軟；光鏡下觀察網格形狀規則，線寬及間隔均勻（圖4a）。掃描電鏡觀察示，完全培養基培養 1 d，支架形態穩定，網格狀結構清晰規則，支架表面較光滑，未見明顯孔隙；成軟骨誘導培養 14 d，支架網格狀結構仍清晰可見，但線寬和網格孔隙均縮小，細胞外基質緊密且均勻包裹支架，鏡下形成凹凸不平的表面（圖4b、c）。
圖4
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 復合支架大體及掃描電鏡觀察
a. 大體觀察；b. 培養 1 d 掃描電鏡觀察（×300）；c. 成軟骨誘導培養 14 d 掃描電鏡觀察（×300）
Figure4. Gross and scanning electron microscope observation of 3D bioprinted hADSCs-GelMA composite scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscope observation after cultured for 1 day (×300); c. Scanning electron microscope observation after chondrogenic induction cultured for 14 days (×300)
2.2.2 復合支架中細胞存活率檢測
培養 1、4、7 d 支架內細胞存活率分別為 83.20%±1.27%、89.13%±1.36%、79.80%±1.97%，各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。共聚焦熒光顯微鏡全景拼圖掃描多層擬合圖像示，支架內細胞分布均勻，培養 7 d 與 1 d 時比較，支架內細胞數量增加、密度增高（圖6）。
圖5
培養各時間點 hADSCs-GelMA 復合支架活/死細胞染色（共聚焦熒光顯微鏡×100）
a. 1 d；b. 4 d；c. 7 d
Figure5. Live/dead staining of hADSCs-GelMA composite scaffold cultured for different time points (Confocal fluorescence microscope×100)a. One day; b. Four days; c. Seven days
圖6
hADSCs-GelMA 復合支架培養 1、7 d 共聚焦熒光顯微鏡全景拼圖掃描多層擬合圖像（×100）
a. 1 d；b. 7 d
Figure6. Confocal fluorescence microscope panoramic mosaic scanning multilayer fitting image of hADSCs-GelMA composite scaffold cultured for 1 and 7 days (×100)a. One day; b. Seven days
2.2.3 復合支架中細胞增殖檢測
CCK-8 法檢測示，培養 1、4、7 d 樣本 A 值分別為 0.155±0.002、0.325±0.026、0.410±0.004，各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.4 qRT-PCR 檢測成軟骨基因表達
培養 14 d qRT-PCR 檢測示，實驗組 ACAN、SOX9、COLⅡA1 和 COLⅩA1 mRNA 相對表達量分別為（6.976±2.739）×10-3、（2.641±1.250）×10-4、（1.712±0.491）×10-3、（2.337±0.013）×10-4，對照組分別為（6.203±1.395）×10-4、（1.821±0.085）×10-4、（1.034±0.056）×10-4、（3.570±0.141）×10-4，兩組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。實驗組上述基因相對表達量分別為對照組的（11.5±0.1）、（1.5±0.1）、（17.0±1.0）和（0.7±0.0）倍。
2.2.5 裸鼠皮下植入實驗
支架植入 4 周后大體觀察示，兩組裸鼠皮下植入區域仍可見方塊狀隆起。取材可見實驗組支架較植入時略縮小變薄，呈白色，網格間隙中可見組織形成，韌性增強，剝離表面軟組織可見有血管長入其中；對照組支架較植入時縮小變薄，呈半透明不規則凝膠狀。見圖7。
圖7
支架植入裸鼠體內 4 周后大體觀察
a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Gross observation after 4 weeks of scaffold implanted into nude micea. Control group; b. Experimental group
番紅 O 染色和阿利辛藍染色示，實驗組支架中分別可見紅染和藍染的軟骨基質；對照組僅見材料染色，未見軟骨細胞或基質沉積。免疫組織化學染色示，實驗組支架中可見棕黃色Ⅱ型膠原特異性染色，且可見有軟骨陷窩形成；對照組僅見材料非特異性染色。見圖8。
圖8
支架植入裸鼠后 4 周組織學和免疫組織化學染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
上、下分別為實驗組和對照組 a. 番紅 O 染色；b. 阿利新藍染色；c. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色
Figure8. Histological and immunohistochemical observations after 4 weeks of scaffold implanted into nude mice (Inverted fluorescence microscope×200)The upper and lower for the experimental group and the control group, respectively a. Safranin O staining; b. Alcian blue staining; c. Collagen type Ⅱ immunohistochemical staining
3 討論
耳廓再造是整形外科醫生面臨的最大挑戰之一。目前主要方法是基于自體軟骨或人工合成支架的耳廓再造術。然而，自體移植物存在吸收和供區并發癥問題，人工合成的硅酮或聚乙烯移植物存在感染、擠壓、生物相容性差和長期耐久性不確定等風險[12]。3D 生物打印是組織工程技術發展過程中興起的一種新型增材制造技術，應用細胞、生物材料和生物分子在計算機輔助下進行分層打印，能夠形成大小和形狀精確、分辨率高、細胞分布均勻的具有生物學活性的三維組織結構，在軟骨組織工程中具有巨大研究價值和應用前景。與其他組織工程研究的關鍵問題相似，選擇理想的生物材料和種子細胞組合用于軟骨生物打印是至關重要的一環。Kilian 等[13]應用人軟骨細胞與一種基于海藻酸鹽-甲基纖維素的生物墨水混合進行 3D 生物打印，證實在體外培養條件下有軟骨細胞外基質產生，但細胞存活率僅 45%～75%。干細胞具有良好的增殖和分化潛能，為生物打印載細胞軟骨支架提供了新的細胞類型，但打印過程中的細胞損傷給細胞存活、增殖和分化能力帶來的影響亦不容忽視。
早期研究表明，光敏化水凝膠 GelMA 支持 BMSCs 的增殖和成軟骨分化[14-15]，10%（W/V）GelMA 在打印后能維持良好的物理結構，并使 BMSCs 和人軟骨細胞保持高細胞活性[16-17]。De Moor 等[18]采用高通量微孔培養系統培養人 BMSCs 球體，混合 GelMA 進行生物打印，結果表明 GelMA 具有良好的適打印性，且能維持人 BMSCs 球體的活性和軟骨形成表型；該研究還表明，較低的水凝膠硬度可以進一步促進打印后的成軟骨分化。因此，本研究選用 10%（W/V）GelMA 作為細胞載體構建 hADSCs-GelMA 復合支架，結果表明，3D 生物打印復合支架體外培養 14 d 三維結構穩定，未發生明顯變形或塌陷；7 d 內細胞存活率保持在約 80%。本研究中，該復合支架細胞存活率先上升后下降，考慮與更換誘導分化培養基和靜態培養方式有關，也可能是隨體外培養時間延長，細胞外基質的沉積導致材料孔隙率下降，從而影響支架內部物質交換，進而導致長期培養后細胞死亡增加。
在種子細胞選擇方面，本研究選用 hADSCs 進行成軟骨研究。雖然目前國內外軟骨組織工程研究多采用軟骨細胞和 BMSCs 作為種子細胞，但二者在臨床應用的轉化均受到不同限制。健康人軟骨細胞來源受限，往往需要獲取大量自體軟骨組織才能獲得足夠細胞進行組織構建，將會造成供區部位組織缺損和功能障礙，違背了研究的初衷。BMSCs 的優點在于可持續擴增，保持良好的多向分化潛能，但抽取骨髓既存在一定風險又給患者帶來痛苦，且每個成人能獲取的骨髓量有限（10～20 mL），因此限制了其應用。而 ADSCs 則具有以下優越性：① 脂肪組織容易獲得，創傷小；② 相同培養條件下 ADSCs 增殖率更高；③ 在疾病微環境中，ADSCs 能夠更好地維持細胞狀態，發揮調節微環境的作用[19]；④ ADSCs 的人類白細胞抗原-ABC 表達較少，免疫排斥反應更低，更適用于同種異體移植[20]。在適打印性方面，本研究結果顯示，hADSCs 在打印后細胞存活率與類似應用 BMSCs 的文獻一致[16，21-22]，表明其細胞活力受打印過程剪切力、溫度及光交聯等因素影響不大，適用于 3D 生物打印。此外，本研究通過檢測成軟骨相關基因的表達，分析了 hADSCs 在打印后的分化能力。成軟骨誘導培養 14 d 后，復合支架的軟骨基質基因 ACAN、成軟骨調節因子 SOX9 和軟骨特異性基因 COLⅡA1 表達均顯著上調，表明 hADSCs 在打印后仍具有良好的成軟骨分化能力。而軟骨肥大標志基因 ColⅩA1 表達下調，表明在成軟骨誘導培養條件下，復合支架內的 hADSCs 分化形成的軟骨細胞能夠維持其表型，未出現早期肥大化的問題，可用于軟骨組織工程支架的制備。
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 復合支架的體內成軟骨能力也通過動物實驗得到了證實。支架植入裸鼠體內 4 周后，實驗組和對照組支架均較植入時縮小、變薄，雖然經組織學和免疫組織化學染色提示實驗組有軟骨細胞及基質形成，但軟骨組織生成的速度較緩慢，與此同時水凝膠材料在動物體內被吸收并且發生降解，所以當材料的吸收和降解速度快于新生組織生成速度時，支架即可能出現體積縮小和形態變化的現象。因此，材料降解和吸收速度與組織形成速度不匹配是其作為組織工程材料需解決的一大難題。同時，本研究中制備的復合支架為膠凍狀，雖三維結構穩定，但其力學強度遠遠未達到臨床轉化耳軟骨的要求。有其他研究在生物墨水中加入磷酸三鈣、生物玻璃、納米纖維素和納米復合材料等，以增強打印體的力學強度[23-26]。本研究可在此基礎上進一步優化生物墨水材料及配比，以改進材料的生物力學性能，降低降解速率。我們也將繼續評估支架內細胞的表型和遷移、蛋白水解活性以及材料吸收和降解速率，并與新的軟骨組織形成相關聯，以更好地理解 hADSCs 和交聯 GelMA 水凝膠之間的相互作用，進一步解決組織形成和材料吸收降解速率相匹配的難題。
綜上述，本研究通過 3D 生物打印技術制備了 hADSCs-GelMA 復合支架，其結構穩定，細胞存活率高，可于體內、外成軟骨分化形成軟骨組織，為應用 3D 生物打印技術構建組織工程軟骨提供了一定的思路和研究基礎。
作者貢獻：穆琳負責實驗設計、實施及文章撰寫；曾今實參與實驗設計與實施；黃元亮、林燕嫻參與原材料的收集及制備，實驗細胞的培養；滕利、蔣海越負責實驗設計與評估以及文章審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中國醫學科學院整形外科醫院醫學倫理委員會批準［（2021）注冊第（2）號］。實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2020-0018。
由出生缺陷、感染、創傷、燒傷或癌癥導致的耳廓畸形和缺損，對患者生理功能和心理狀態有顯著影響，耳廓重建是整形外科醫生的難題之一。軟骨細胞增殖率低、組織血管分布不良，成人耳廓軟骨的再生和康復能力有限[1]。軟骨組織工程技術為軟骨缺損修復和重建提供了應用前景廣闊的新選擇。傳統組織工程技術是將體外培養擴增的種子細胞種植到支架材料上，再進行體外培養或植入體內相應病損部位，對支架材料內部的細胞分布和密度難以精確控制。3D 生物打印技術能精確、快速實現支架復雜的宏觀外形與內部微細結構的一體化構建，制備個性化修復體[2-3]，目前已成功打印出骨、軟骨、肝單元、血管等組織器官[4-7]。
盡管 3D 生物打印在生物材料、生物分子及活細胞的精確空間分布和精細結構構建方面顯示出巨大潛力，有望用于功能性耳廓支架的制備，但選擇理想的生物材料和種子細胞組合用于軟骨生物打印仍是一個難題。目前國內外軟骨組織工程研究多采用軟骨細胞和 BMSCs 作為種子細胞[8]，但二者均存在來源受限、供區副損傷等問題，因此在臨床轉化方面存在不足。而脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有易獲得、創傷小、純化率高、體外擴增速度快和免疫原性低等優點，且 3D 打印立體結構有利于 ADSCs 成軟骨分化[9]。甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA）水凝膠因具備可打印、可調節的黏度、流變和凝膠化的物理特性以及適宜的生物特性，被廣泛應用于各種生物醫學領域[10-11]。本研究采用人 ADSCs（human ADSCs，hADSCs）作為種子細胞，以 GelMA 水凝膠為載體，通過 3D 生物打印構建 hADSCs-GelMA 復合支架，并對其進行體內外成軟骨實驗研究，探討該方法構建具有特定三維結構和生物學性能組織工程軟骨的可行性，為應用 3D 生物打印技術構建組織工程軟骨奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
5 周齡健康雌性裸鼠 20 只，體質量 18～24 g，由中國醫學科學院整形外科醫院實驗動物中心提供。脂肪組織由在中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院接受脂肪抽吸手術患者自愿捐獻。
L-DMEM 培養基、FBS、青鏈霉素、0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA（GIBCO 公司，美國）；成軟骨、成脂、成骨誘導培養基（Cyagen 公司，美國）；人 MSCs 流式檢測試劑盒（BD 公司，美國）；0.22 μm 針頭過濾器（Millipore 公司，美國）；GelMA 凍干粉（上普博源北京生物科技有限公司）；一步法逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；活/死細胞活力檢測試劑盒（Invitrogen 公司，美國）；細胞計數試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；上海碧云天生物技術有限公司）；番紅 O 染液（北京索萊寶科技有限公司）；抗Ⅱ型膠原抗體、山羊抗小鼠 IgG H&L（HRP）（Abcam 公司，英國）。
CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）；Bioplotter 3D 生物打印機（Envition tec 公司，德國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）；共聚焦熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；PCR 儀（Eppendorf 公司，德國）；LightCycler R 480Ⅱ實時熒光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）系統（Roche 公司，瑞士）；NanoDrop2000c 微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；多功能酶標儀（EnSpire 公司，新加坡）。
1.2 hADSCs 分離、培養和鑒定
取脂肪組織加等體積 0.2%Ⅰ型膠原酶消化 60 min，離心后棄去含大量脂滴的上層及中間培養基層，加等體積 PBS 吹洗，100 μm 細胞濾網過濾；再次離心，棄上清，沉淀用適量完全培養基（含 10%FBS 的 L-DMEM 培養基）重懸，接種于培養皿中，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養，每 2～3 天更換培養基。待細胞生長至 80% 融合時，以 0.25% 胰蛋白酶-0.1%EDTA 消化后按 1∶3 比例傳代。取第 3 代細胞，倒置顯微鏡觀察細胞形態。
細胞鑒定：① 流式細胞術鑒定：采用人 MSCs 流式檢測試劑盒檢測細胞表面標志物 CD73、CD90、CD105、CD34、CD11b、CD19、CD45 表達。② 誘導分化鑒定：取第 3 代細胞接種至 6 孔板中，完全培養基培養 72 h 后分別更換為成脂和成骨誘導培養基培養 21 d，行油紅 O 染色和茜素紅染色觀察；取第 3 代細胞置于 15 mL 離心管中，成軟骨誘導培養基培養 21 d，取細胞球制作石蠟切片，阿利新藍染色觀察。
1.3 3D 生物打印 hADSCs-GelMA 復合支架
采用完全培養基將 GelMA 配制成 10%（W/V）溶液，于 75℃ 水浴加熱至充分溶解后，用 0.22 μm 針頭過濾器過濾除菌，與第 3 代 hADSCs 和光引發劑（2.5%LAP）均勻混合，配置成細胞終濃度為 4×106個/mL 的生物墨水。將打印溫度設置為 21℃，氣壓 0.4 bar，打印線寬 320 μm，線間距 1.2 mm，打印的方形支架大小約為 1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm。按照上述參數逐層打印，每層打印后用 405 nm 紫外光光照交聯 3～5 s，使載細胞 GelMA 水凝膠充分固化，得到 hADSCs-GelMA 復合支架，將其轉移至培養皿中，加入完全培養基，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養。48 h 后更換為成軟骨誘導培養基培養。
1.4 觀測指標
1.4.1 大體及掃描電鏡觀察
大體觀察 hADSCs-GelMA 復合支架外觀；于完全培養基培養 1 d 及成軟骨誘導培養 14 d 行掃描電鏡觀察。
1.4.2 復合支架中細胞存活率檢測
分別于培養 1、4、7 d 取 hADSCs-GelMA 復合支架樣本，采用活/死細胞活力檢測試劑盒進行活/死細胞染色，共聚焦熒光顯微鏡觀察，綠色熒光為活細胞，紅色熒光為死細胞。每個樣本任意選取圖片中 5 個不同區域進行平均量化分析，用 Image pro plus 6.0 軟件對圖像進行色彩分類計數，按以下公式計算細胞存活率：活細胞總數/（活細胞總數+死細胞總數）×100%。同時采用共聚焦熒光顯微鏡全景拼圖掃描（垂直間隔 100 μm）多層擬合圖像，觀察樣本整體細胞分布及細胞密度變化。
1.4.3 復合支架中細胞增殖檢測
培養 1、4、7 d 采用 CCK-8 法檢測細胞增殖情況，每個時間點檢測 3 個樣本，每個樣本設 3 個復孔。以 10%CCK-8 溶液作為空白對照，酶標儀上測定 450 nm 波長處每孔吸光度（A）值，以所測 A 值減去空白對照A值作為樣本 A 值。
1.4.4 qRT-PCR 檢測成軟骨基因表達
取成軟骨誘導培養 14 d 的復合支架為實驗組，以 L-DMEM 完全培養基培養 14 d 的復合支架為對照組，用 Trizol 法提取復合支架中的總 RNA，NanoDrop 檢測 RNA 濃度及純度，并用一步法逆轉錄試劑盒行逆轉錄反應（1 000 ng RNA 體系），得到 cDNA。SYBR GREEN 法進行 qRT-PCR 檢測軟骨基質基因蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、成軟骨調節因子 SOX9、軟骨特異性基因Ⅱ型膠原蛋白（collagen typeⅡA1，COLⅡA1）、軟骨肥大標志基因Ⅹ型膠原蛋白（collagen typeⅩA1，COLⅩA1）mRNA 的相對表達量，以 GAPDH 作為內參基因，對樣本進行標準化校正，用 2–ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量，結果以實驗組相比對照組基因表達量倍數表示。基因引物序列見表1。
表1
各基因引物序列（5'3'）
Table1.
Primer sequences of genes (5'3')
1.4.5 裸鼠皮下植入實驗
取 20 只裸鼠經腹膜內注射 1% 戊巴比妥溶液麻醉后，于背部中線作一長約 1.2 cm 縱切口，向兩側側腹部皮下分離形成囊袋，一側植入體外成軟骨誘導培養 14 d 的 3D 打印 hADSCs-GelMA 復合支架（實驗組），另一側植入不含細胞的空白 GelMA 水凝膠支架（對照組），4-0 可吸收線縫合切口。4 周后頸椎脫臼法處死裸鼠后取材，大體觀察兩組支架形態、大小和色澤，是否降解，以及與周圍組織反應情況；兩組樣本以 4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，片厚 3 μm，常規行番紅 O、阿利新藍染色和Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，評估組織結構和軟骨細胞外基質沉積。
1.5 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 Turkey 法；兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 hADSCs 形態學觀察及鑒定
倒置顯微鏡觀察示，第 3 代細胞呈長梭形貼壁生長（圖1）。流式細胞術鑒定示細胞表面標志物 CD73、CD90、CD105 表達為陽性，CD34、CD11b、CD19、CD45 表達為陰性（圖2）。成脂、成骨、成軟骨誘導培養 21 d，油紅 O 染色可見大量脂滴，茜素紅染色可見紅色鈣結節，阿利新藍染色可見細胞間質藍染（圖3）。經鑒定，培養細胞為 hADSCs。
圖1
第 3 代 hADSCs 形態觀察（倒置顯微鏡×100）
Figure1.
Morphological observation of the third generation hADSCs (Inverted microscope×100)
圖2
hADSCs 流式細胞術鑒定
a. CD73；b. CD90；c. CD105；d. CD34、CD11b、CD19、CD45
Figure2. Flow cytometric identification of hADSCsa. CD73; b. CD90; c. CD105; d. CD34, CD11b, CD19, CD45
圖3
誘導培養 21 d hADSCs 三系分化鑒定（倒置顯微鏡×100）
a. 油紅 O 染色；b. 茜素紅染色；c. 阿利新藍染色
Figure3. Adipogenic, osteogenic, and chondrogenic induction of hADSCs after 21 days of culture (Inverted microscope×100)a. Oil red O staining; b. Alizarin red staining; c. Alcian blue staining
2.2 3D 生物打印 hADSCs-GelMA 復合支架相關觀測
2.2.1 大體及掃描電鏡觀察
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 復合支架大小約 1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm，呈網格狀，色半透明，質軟；光鏡下觀察網格形狀規則，線寬及間隔均勻（圖4a）。掃描電鏡觀察示，完全培養基培養 1 d，支架形態穩定，網格狀結構清晰規則，支架表面較光滑，未見明顯孔隙；成軟骨誘導培養 14 d，支架網格狀結構仍清晰可見，但線寬和網格孔隙均縮小，細胞外基質緊密且均勻包裹支架，鏡下形成凹凸不平的表面（圖4b、c）。
圖4
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 復合支架大體及掃描電鏡觀察
a. 大體觀察；b. 培養 1 d 掃描電鏡觀察（×300）；c. 成軟骨誘導培養 14 d 掃描電鏡觀察（×300）
Figure4. Gross and scanning electron microscope observation of 3D bioprinted hADSCs-GelMA composite scaffolda. Gross observation; b. Scanning electron microscope observation after cultured for 1 day (×300); c. Scanning electron microscope observation after chondrogenic induction cultured for 14 days (×300)
2.2.2 復合支架中細胞存活率檢測
培養 1、4、7 d 支架內細胞存活率分別為 83.20%±1.27%、89.13%±1.36%、79.80%±1.97%，各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖5。共聚焦熒光顯微鏡全景拼圖掃描多層擬合圖像示，支架內細胞分布均勻，培養 7 d 與 1 d 時比較，支架內細胞數量增加、密度增高（圖6）。
圖5
培養各時間點 hADSCs-GelMA 復合支架活/死細胞染色（共聚焦熒光顯微鏡×100）
a. 1 d；b. 4 d；c. 7 d
Figure5. Live/dead staining of hADSCs-GelMA composite scaffold cultured for different time points (Confocal fluorescence microscope×100)a. One day; b. Four days; c. Seven days
圖6
hADSCs-GelMA 復合支架培養 1、7 d 共聚焦熒光顯微鏡全景拼圖掃描多層擬合圖像（×100）
a. 1 d；b. 7 d
Figure6. Confocal fluorescence microscope panoramic mosaic scanning multilayer fitting image of hADSCs-GelMA composite scaffold cultured for 1 and 7 days (×100)a. One day; b. Seven days
2.2.3 復合支架中細胞增殖檢測
CCK-8 法檢測示，培養 1、4、7 d 樣本 A 值分別為 0.155±0.002、0.325±0.026、0.410±0.004，各時間點間差異均有統計學意義（P<0.05）。
2.2.4 qRT-PCR 檢測成軟骨基因表達
培養 14 d qRT-PCR 檢測示，實驗組 ACAN、SOX9、COLⅡA1 和 COLⅩA1 mRNA 相對表達量分別為（6.976±2.739）×10-3、（2.641±1.250）×10-4、（1.712±0.491）×10-3、（2.337±0.013）×10-4，對照組分別為（6.203±1.395）×10-4、（1.821±0.085）×10-4、（1.034±0.056）×10-4、（3.570±0.141）×10-4，兩組比較差異均有統計學意義（P<0.05）。實驗組上述基因相對表達量分別為對照組的（11.5±0.1）、（1.5±0.1）、（17.0±1.0）和（0.7±0.0）倍。
2.2.5 裸鼠皮下植入實驗
支架植入 4 周后大體觀察示，兩組裸鼠皮下植入區域仍可見方塊狀隆起。取材可見實驗組支架較植入時略縮小變薄，呈白色，網格間隙中可見組織形成，韌性增強，剝離表面軟組織可見有血管長入其中；對照組支架較植入時縮小變薄，呈半透明不規則凝膠狀。見圖7。
圖7
支架植入裸鼠體內 4 周后大體觀察
a. 對照組；b. 實驗組
Figure7. Gross observation after 4 weeks of scaffold implanted into nude micea. Control group; b. Experimental group
番紅 O 染色和阿利辛藍染色示，實驗組支架中分別可見紅染和藍染的軟骨基質；對照組僅見材料染色，未見軟骨細胞或基質沉積。免疫組織化學染色示，實驗組支架中可見棕黃色Ⅱ型膠原特異性染色，且可見有軟骨陷窩形成；對照組僅見材料非特異性染色。見圖8。
圖8
支架植入裸鼠后 4 周組織學和免疫組織化學染色觀察（倒置熒光顯微鏡×200）
上、下分別為實驗組和對照組 a. 番紅 O 染色；b. 阿利新藍染色；c. Ⅱ型膠原免疫組織化學染色
Figure8. Histological and immunohistochemical observations after 4 weeks of scaffold implanted into nude mice (Inverted fluorescence microscope×200)The upper and lower for the experimental group and the control group, respectively a. Safranin O staining; b. Alcian blue staining; c. Collagen type Ⅱ immunohistochemical staining
3 討論
耳廓再造是整形外科醫生面臨的最大挑戰之一。目前主要方法是基于自體軟骨或人工合成支架的耳廓再造術。然而，自體移植物存在吸收和供區并發癥問題，人工合成的硅酮或聚乙烯移植物存在感染、擠壓、生物相容性差和長期耐久性不確定等風險[12]。3D 生物打印是組織工程技術發展過程中興起的一種新型增材制造技術，應用細胞、生物材料和生物分子在計算機輔助下進行分層打印，能夠形成大小和形狀精確、分辨率高、細胞分布均勻的具有生物學活性的三維組織結構，在軟骨組織工程中具有巨大研究價值和應用前景。與其他組織工程研究的關鍵問題相似，選擇理想的生物材料和種子細胞組合用于軟骨生物打印是至關重要的一環。Kilian 等[13]應用人軟骨細胞與一種基于海藻酸鹽-甲基纖維素的生物墨水混合進行 3D 生物打印，證實在體外培養條件下有軟骨細胞外基質產生，但細胞存活率僅 45%～75%。干細胞具有良好的增殖和分化潛能，為生物打印載細胞軟骨支架提供了新的細胞類型，但打印過程中的細胞損傷給細胞存活、增殖和分化能力帶來的影響亦不容忽視。
早期研究表明，光敏化水凝膠 GelMA 支持 BMSCs 的增殖和成軟骨分化[14-15]，10%（W/V）GelMA 在打印后能維持良好的物理結構，并使 BMSCs 和人軟骨細胞保持高細胞活性[16-17]。De Moor 等[18]采用高通量微孔培養系統培養人 BMSCs 球體，混合 GelMA 進行生物打印，結果表明 GelMA 具有良好的適打印性，且能維持人 BMSCs 球體的活性和軟骨形成表型；該研究還表明，較低的水凝膠硬度可以進一步促進打印后的成軟骨分化。因此，本研究選用 10%（W/V）GelMA 作為細胞載體構建 hADSCs-GelMA 復合支架，結果表明，3D 生物打印復合支架體外培養 14 d 三維結構穩定，未發生明顯變形或塌陷；7 d 內細胞存活率保持在約 80%。本研究中，該復合支架細胞存活率先上升后下降，考慮與更換誘導分化培養基和靜態培養方式有關，也可能是隨體外培養時間延長，細胞外基質的沉積導致材料孔隙率下降，從而影響支架內部物質交換，進而導致長期培養后細胞死亡增加。
在種子細胞選擇方面，本研究選用 hADSCs 進行成軟骨研究。雖然目前國內外軟骨組織工程研究多采用軟骨細胞和 BMSCs 作為種子細胞，但二者在臨床應用的轉化均受到不同限制。健康人軟骨細胞來源受限，往往需要獲取大量自體軟骨組織才能獲得足夠細胞進行組織構建，將會造成供區部位組織缺損和功能障礙，違背了研究的初衷。BMSCs 的優點在于可持續擴增，保持良好的多向分化潛能，但抽取骨髓既存在一定風險又給患者帶來痛苦，且每個成人能獲取的骨髓量有限（10～20 mL），因此限制了其應用。而 ADSCs 則具有以下優越性：① 脂肪組織容易獲得，創傷小；② 相同培養條件下 ADSCs 增殖率更高；③ 在疾病微環境中，ADSCs 能夠更好地維持細胞狀態，發揮調節微環境的作用[19]；④ ADSCs 的人類白細胞抗原-ABC 表達較少，免疫排斥反應更低，更適用于同種異體移植[20]。在適打印性方面，本研究結果顯示，hADSCs 在打印后細胞存活率與類似應用 BMSCs 的文獻一致[16，21-22]，表明其細胞活力受打印過程剪切力、溫度及光交聯等因素影響不大，適用于 3D 生物打印。此外，本研究通過檢測成軟骨相關基因的表達，分析了 hADSCs 在打印后的分化能力。成軟骨誘導培養 14 d 后，復合支架的軟骨基質基因 ACAN、成軟骨調節因子 SOX9 和軟骨特異性基因 COLⅡA1 表達均顯著上調，表明 hADSCs 在打印后仍具有良好的成軟骨分化能力。而軟骨肥大標志基因 ColⅩA1 表達下調，表明在成軟骨誘導培養條件下，復合支架內的 hADSCs 分化形成的軟骨細胞能夠維持其表型，未出現早期肥大化的問題，可用于軟骨組織工程支架的制備。
3D 生物打印 hADSCs-GelMA 復合支架的體內成軟骨能力也通過動物實驗得到了證實。支架植入裸鼠體內 4 周后，實驗組和對照組支架均較植入時縮小、變薄，雖然經組織學和免疫組織化學染色提示實驗組有軟骨細胞及基質形成，但軟骨組織生成的速度較緩慢，與此同時水凝膠材料在動物體內被吸收并且發生降解，所以當材料的吸收和降解速度快于新生組織生成速度時，支架即可能出現體積縮小和形態變化的現象。因此，材料降解和吸收速度與組織形成速度不匹配是其作為組織工程材料需解決的一大難題。同時，本研究中制備的復合支架為膠凍狀，雖三維結構穩定，但其力學強度遠遠未達到臨床轉化耳軟骨的要求。有其他研究在生物墨水中加入磷酸三鈣、生物玻璃、納米纖維素和納米復合材料等，以增強打印體的力學強度[23-26]。本研究可在此基礎上進一步優化生物墨水材料及配比，以改進材料的生物力學性能，降低降解速率。我們也將繼續評估支架內細胞的表型和遷移、蛋白水解活性以及材料吸收和降解速率，并與新的軟骨組織形成相關聯，以更好地理解 hADSCs 和交聯 GelMA 水凝膠之間的相互作用，進一步解決組織形成和材料吸收降解速率相匹配的難題。
綜上述，本研究通過 3D 生物打印技術制備了 hADSCs-GelMA 復合支架，其結構穩定，細胞存活率高，可于體內、外成軟骨分化形成軟骨組織，為應用 3D 生物打印技術構建組織工程軟骨提供了一定的思路和研究基礎。
作者貢獻：穆琳負責實驗設計、實施及文章撰寫；曾今實參與實驗設計與實施；黃元亮、林燕嫻參與原材料的收集及制備，實驗細胞的培養；滕利、蔣海越負責實驗設計與評估以及文章審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中國醫學科學院整形外科醫院醫學倫理委員會批準［（2021）注冊第（2）號］。實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2020-0018。
