引用本文： 黃元亮, 穆琳, 林燕嫻, 蔣海越, 滕利. 絲素蛋白-左旋聚乳酸微載體擴增脂肪來源干細胞的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(5): 611-619. doi: 10.7507/1002-1892.202101048 復制
MSCs 具有多向分化潛能，在組織工程及再生醫學中具有良好的應用前景[1-2]。但從人體直接獲得的 MSCs 有限，為了達到使用需求，常需進行體外擴增[3-4]。傳統細胞擴增通常借助于培養瓶或培養皿在二維平面條件下進行傳代培養，該法培養基利用率低，并且需要重復傳代及更換培養基等操作，增加了耗材、勞動成本與污染風險[5]。此外，該法無法模擬 MSCs 在生物機體內復雜的微環境，長期傳代培養的 MSCs 表現出增殖能力下降，并逐漸失去多向分化潛能[6-8]。基于多孔微載體三維動態培養的 MSCs 擴增策略，是將細胞接種于微載體上，進行攪拌懸浮培養或模擬微重力系統培養，不僅更加貼近細胞在體內的微環境[9-10]，而且由于微載體提供了大量供細胞生長貼附的表面面積，從而使空間及培養基利用率更大，更適合大范圍擴增細胞。
微載體可分為可降解型與不可降解型，不可降解型如 Cytodex 系列微載體，擴增后需將所得細胞消化收獲，該步驟常損失很大比例細胞。相比而言，可降解型如 CultiSpher 系列微載體，可不經消化收集細胞，直接用于組織工程移植，大大提高了細胞利用率。我們前期研究[11]發現，左旋聚乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）微載體在軟骨細胞擴增以及維持軟骨細胞表型方面均優于 CultiSpher G 微載體。然而，單獨使用 PLLA 作為微載體材料細胞親和力不夠，細胞貼附不佳。故在此基礎上，我們改進了微載體材料，將 PLLA 微載體被覆絲素蛋白（silk fibroin，SF）。脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有來源充足、易獲取、有多向分化能力等優點，是組織工程非常有前景的一類 MSCs。本研究采用 SF-PLLA 微載體擴增 ADSCs，以期探索一種更加適合 ADSCs 增殖并用于軟骨組織工程的可降解型微載體。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
人脂肪組織取自中國醫學科學院整形外科醫院行雙下肢脂肪抽吸術的健康女性，樣本獲取均經患者知情同意。
L-DMEM 培養基、FBS、青/鏈霉素、胰蛋白酶-0.25%EDTA（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（Sigma 公司，美國）；成骨培養基、成軟骨培養基、成脂培養基（Cyagen 公司，美國）；PicoGreenTM dsDNA 定量檢測試劑盒、Live/DeadTM 細胞活力檢測試劑盒（Thermo 公司，美國）；RNA 提取試劑盒（Qiagen 公司，德國）；逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；人 MSCs 流式檢測試劑盒（BD 公司，美國）；CultiSpher G 微載體（Percell Biolytica 公司，瑞典）；SF-PLLA 微載體（中國醫學科學院生物工程研究所）。
CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）；旋轉生物反應器（rotary cell culture system，RCCS；Synthecon 公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；共聚焦熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；LightCycler R 480Ⅱ實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）系統（Roche 公司，瑞士）。
1.2 ADSCs 分離、培養和鑒定
采用酶消化法獲取 ADSCs。具體方法：取 10 mL 無菌脂肪組織，PBS 洗滌 2 遍，加入 0.2%Ⅰ型膠原酶，置于 37℃ 恒溫搖床震蕩消化 40 min，加入等體積完全培養基（含 10%FBS、1% 青/鏈霉素的 L-DMEM 培養基）終止消化后，300×g 離心 5 min，棄上清。沉淀用 PBS 重懸后，使用 70 μm 細胞篩過濾，濾液以 150×g 離心 5 min，棄上清。適量完全培養基重懸細胞沉淀，接種于 10 cm 培養皿，于 37℃、5%CO2 培養箱培養，每 2～3 天換液，待細胞融合 90% 后傳代。
取第 3 代 ADSCs 行三系分化鑒定[12]，包括成骨誘導 21 d 行茜素紅染色，成脂誘導 21 d 行油紅 O 染色，細胞團成軟骨誘導 21 d 行阿利新藍染色；流式細胞儀檢測細胞表面標志物（CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR）表達。經鑒定提示培養后所得細胞為 ADSCs。
1.3 微載體形狀觀察
取 SF-PLLA 與 CultiSpher G 微載體各 150 mg，用 PBS 浸泡過夜后，高壓滅菌；將滅菌后的微載體采用完全培養基重懸預處理。取預處理后的微載體置于 24 孔板，采用倒置顯微鏡觀察其顆粒外觀。
1.4 微載體細胞培養及相關觀測
1.4.1 微載體細胞接種與培養
各取 1 mL 第 3 代 ADSCs 懸液（細胞濃度為 2.5×106 個/mL）分別與 150 mg 預處理完畢的兩種微載體充分混合，置于 50 mL 離心管中，加入完全培養基至 10 mL，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 4 h，每隔 30 min 輕微震蕩混勻。接種完畢后取出細胞-微載體復合物置于 50 mL 旋轉培養皿中，加滿完全培養基；將旋轉培養系統置于 37℃、5%CO2 培養箱中，靜置過夜后，調整旋轉培養系統以 10 r/min 速度開始轉動，培養基每 2～3 天更換 1 次。實驗重復 3 次。
1.4.2 掃描電鏡觀察
取接種前兩種微載體以及動態培養 18 d 的細胞-微載體復合物，PBS 清洗 2 次，2.5% 戊二醛固定，梯度乙醇脫水處理后臨界點干燥，真空噴濺鉑金離子，掃描電鏡觀察 ADSCs 在兩種微載體表面生長情況。
1.4.3 Live/Dead 染色觀察
取動態培養 1、7、14、18 d 的兩種細胞-微載體復合物，按照試劑盒說明書方法進行 Live/Dead 染色，室溫避光孵育 40 min 后，采用熒光共聚焦顯微鏡觀察細胞在微載體上分布及成活情況。
1.4.4 DNA 定量法檢測細胞增殖
取動態培養 1、4、7、10、14、18 d 的兩種細胞-微載體復合物，PBS 清洗 2 遍；加入 1 mL 0.5 mg/mL 蛋白激酶 K，56℃ 消化過夜；12 000×g 離心 10 min，取 100 μL 上清液加入 100 μL PicoGreen 工作液置入 96 孔板，每個樣品重復 3 孔；避光孵育 5 min，使用酶標儀于 520 nm 波長處檢測樣本吸光度（A）值，通過繪制增殖曲線，將 A 值轉化為細胞數量。
1.4.5 qRT-PCR 檢測成軟骨、成骨及成脂相關基因表達
實驗分為 3 組：CultiSpher G 微球組（A 組）、SF-PLLA 微球組（B 組）與對照組（C 組）。其中 C 組為常規二維平面培養的 ADSCs，具體方法為：初始接種密度為 5 000 個/cm2，待細胞生長至 90% 后傳代培養，傳代接種密度與初始接種密度相同。分別取培養 18 d 的兩種細胞-微載體復合物及二維平面培養至第 5 代的 ADSCs，按 RNA 提取試劑盒說明書提取樣本 RNA，并按逆轉錄試劑盒方法，采用 1 000 ng 體系進行逆轉錄，將逆轉錄所得 cDNA 進行 qPCR，檢測各組細胞成軟骨、成骨及成脂相關基因表達。其中成軟骨相關基因包括軟骨特異性基因 SOX9、Ⅱ型膠原（collagen type Ⅱ，COL2）、軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）、蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、Ⅹ型膠原（collagen type Ⅹ，COL10）；成骨相關基因包括 runt 相關轉錄因子 2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、骨粘連蛋白（osteonectin，ONN）；成脂相關基因包括過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）、脂聯素基因（ADIPOQ）。各基因引物序列見表 1。目的基因表達水平使用同一樣本 GAPDH 內參基因標準化，用 2?ΔΔCt 法計算各基因相對表達量。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes
1.4.6 擴增所得 ADSCs 鑒定
取各組培養 18 d 所得 ADSCs，采用流式細胞術檢測細胞表面標志物 CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR 表達；并采用 1.2 方法進行三系分化鑒定。
1.5 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；三組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 微載體形狀觀察
倒置顯微鏡觀察示，兩種預處理后的微載體均大致呈球形，CultiSpher G 微載體直徑為 130～380 μm，粒徑相對不均一，內部空隙較小；SF-PLLA 微載體直徑為 100～400 μm，粒徑較 CultiSpher G 微載體均一，內部結構疏松，空隙較大。見圖 1。
圖1
兩種微載體預處理后形狀觀察（倒置顯微鏡×100）a. CultiSpher G 微載體；b. SF-PLLA 微載體
Figure1.
Observation of the shape of two microcarriers after pretreatment (Inverted microscope×100)
a. CultiSpher G microcarriers; b. SF-PLLA microcarriers
2.2 微載體細胞培養與相關觀測
2.2.1 掃描電鏡觀察
CultiSpher G 微載體表面粗糙，孔徑不一，孔隙率較小；而 SF-PLLA 微載體孔隙率大，供細胞生長的空間更大。動態培養 18 d 時，兩種微載體均保持結構形態穩定，SF-PLLA 微載體上細胞呈球狀，細胞伸展程度以及細胞間相互連接不如 CultiSpher G 微載體。見圖 2。
圖2
掃描電鏡觀察（×200）
左為 CultiSpher G 微載體，右為 SF-PLLA 微載體 a. 接種細胞前；b. 接種細胞后動態培養 18 d
Figure2. Scanning electron microscope observation (×200)Left for CultiSpher G microcarriers, right for SF-PLLA microcarriersa. Pre-incubation; b. Dynamic culture for 18 days after ADSCs incubation
2.2.2 Live/Dead 染色觀察
熒光共聚焦顯微鏡觀察示，兩種微載體接種細胞后，細胞可順利黏附在微載體表面。動態培養 1 d，CultiSpher G 微載體上細胞數量多于 SF-PLLA 微載體。7 d，大量細胞增殖覆蓋兩種微載體表面，此時微載體之間尚無明顯細胞及細胞外基質連接，且 CultiSpher G 微載體上細胞分布更加均勻，SF-PLLA 微載體上細胞成團分布。14 d，兩種微載體表面被覆細胞均進一步增多，并出現微載體間融合、聚集現象，其中 Cultispher G 微載體間細胞連接結構較清晰、連接較多。18 d，細胞大量分泌細胞外基質，使得微載體緊密黏附在一起，形成團體。CultiSpher G 微載體上細胞形態舒展，呈多足狀貼附于微載體表面，并與其他細胞間形成連接；而 SF-PLLA 微載體上細胞間連接相對較少，細胞更多呈現散在成團分布；此時兩種微載體表面細胞分布均接近飽和。見圖 3。
圖3
動態培養各時間點 Live/Dead 染色觀察（熒光共聚焦顯微鏡×100）
從左至右分別為動態培養 1、7、14、18 d a. CultiSpher G 微載體；b. SF-PLLA 微載體
Figure3. Live/Dead staining observation at each time point of dynamic culture (Confocal fluorescence microscope×100)From left to right for dynamic incubation for 1, 7, 14, and 18 days, respectively a. CultiSpher G microcarriers; b. SF-PLLA microcarriers
2.2.3 DNA 定量法檢測細胞增殖
增殖曲線示，細胞接種于兩種微載體后，細胞數量均呈逐漸增加趨勢。其中細胞接種于 CultiSpher G 微載體后可迅速進入快速增殖期，而 SF-PLLA 微載體上細胞需經過一段時間適應后才能達到相同增殖速度。動態培養各時間點 CultiSpher G 微載體上細胞均多于 SF-PLLA 微載體，其中 4、7、10 d 時兩種微載體上細胞數量比較差異有統計學意義（P<0.05）。10 d 時，兩種微載體上細胞生長均開始減緩，18 d 時兩種微載體上細胞數量差異無統計學意義（P>0.05），提示兩種微載體高效擴增 ADSCs 的能力相當。見圖 4。
圖4
兩種微載體上細胞增殖曲線
*與 SF-PLLA 微載體比較 P<0.05
Figure4. The cell proliferation curves on the two microcarriers*Compared with SF-PLLA microcarriers, P<0.052.2.4 qRT-PCR 檢測
① 成軟骨基因表達：培養 18 d，3 組均未檢測到 COL2 及 COL10 基因表達。B 組早期成軟骨轉錄因子 SOX9，COL2 上級調控因子 COMP 以及成軟骨成熟標志物 ACAN 基因相對表達量均顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間 COMP 基因相對表達量比較差異有統計學意義（P<0.05），而 SOX9 和 ACAN 基因相對表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5a～c。
圖5
培養 18 d qRT-PCR 檢測各組 ADSCs 三系分化相關基因相對表達量
*P<0.05 a. ACAN；b. SOX9；c. COMP；d. RUNX2；e. OCN；f. ONN；g. PPARγ；h. LPL；i. ADIPOQ
Figure5. The relative expression of differential-related genes in each group detected by qRT-PCR at 18 days after culture*P<0.05 a. ACAN; b. SOX9; c. COMP; d. RUNX2; e. OCN; f. ONN; g. PPARγ; h. LPL; i. ADIPOQ
② 成骨基因表達：A、B、C 組間成骨轉錄因子 RUNX2 基因相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。A、B 組細胞成骨早期標志物 ONN、成熟標志物 OCN 基因相對表達量均顯著低于 C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B 組 OCN 基因相對表達量顯著高于 A 組（P<0.05），而 ONN 基因相對表達量與 A 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5d～f。
③ 成脂基因表達：A 組成脂轉錄因子 PPARγ、成脂早期標記物 LPL 及成熟脂肪標記物 ADIPOQ 基因相對表達量均顯著高于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B 組 PPARγ、ADIPOQ 基因相對表達量顯著低于 C 組（P<0.05），LPL 基因相對表達量與 C 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5g～i。
2.2.5 擴增所得 ADSCs 鑒定
① 流式細胞術鑒定：B 組細胞 MSCs 陽性標記物 CD90、CD105 表達較 C 組降低，但仍表現出陽性結果；而 A 組各標志物表達量與 C 組相似。見圖 6。A、B 組 MSCs 陰性標記物 CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、HLA-DR 與 C 組相比未見明顯改變。② 三系誘導分化鑒定：3 組 ADSCs 成軟骨、成骨、成脂誘導 21 d 后，阿利新藍、茜素紅及油紅 O 染色均呈陽性，各組染色結果無明顯差異。見圖 7。
圖6
培養 18 d 3 組擴增所得 ADSCs 流式細胞術鑒定
藍色為同型對照，紅色為樣本；從上至下依次為 A、B、C 組 a. CD90；b. CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR；c. CD73；d. CD105
Figure6. Flow cytometric identification of ADSCs harvested from 3 groups after cultured for 18 daysBlue for isotype control, red for sample; from top to bottom for groups A, B, and C, respectively a. CD90; b. CD34, CD11b, CD19, CD45, HLA-DR; c. CD73; d. CD105
圖7
3 組 ADSCs 成軟骨、成骨、成脂誘導 21 d 后染色倒置顯微鏡觀察
從左至右依次為 A、B、C 組 a. 阿利新藍染色（×40）；b. 茜素紅染色（×100）；c. 油紅 O 染色（×100）
Figure7. ADSCs in 3 groups were observed by inverted microscope after 21 days of induction of chondrogenic, osteogenic, and adipogenic differentiationsFrom left to right for groups A, B, and C, respectively a. Alcian blue staining (×40); b. Alizarin red staining (×100); c. Oil red O staining (×100)
3 討論
組織工程研究及應用需要大量種子細胞，大規模擴增 MSCs 并維持其干性對于組織工程的研究具有重要意義。作為細胞培養載體，微載體為細胞擴增提供了大量細胞貼附面積與充足的營養物質交換，是大規模擴增細胞的首選方案。其中，開發適合細胞生長、貼附的微載體，是目前研究重點。此前，我們報道了自制多孔 PLLA 微載體應用于軟骨細胞擴增，發現該微載體雖在維持軟骨細胞表型上優于 CultiSpher G 微載體，但細胞黏附性不佳，導致細胞利用率較低[11]。為了解決這一問題，我們選擇蠶絲中提取的 SF 對 PLLA 微載體進行修飾，制成 SF-PLLA 微載體，以改進 PLLA 微載體的生物相容性、機械強度及降解速率。SF-PLLA 微載體直徑為 100～400 μm，與 CultiSpher G 微載體相似，適合細胞貼附增殖，而且兩者均能降解，是良好的組織工程研究材料。
本研究中，SF-PLLA 微載體可以很好地支持細胞附著和增殖。該微載體呈多孔結構、孔隙率較大，為細胞大量增殖提供了有效空間，也有利于營養物質的交換。動態培養 18 d 時，該微載體仍能保持穩定的形態結構，且細胞長入孔隙內部。材料降解方面，研究表明[13]CultiSpher G 微載體使用的明膠材料穩定性較差，蛋白酶即能將其分解；而 SF-PLLA 材料具有相對穩定的生物降解能力，體外降解時間約 1 年，能為細胞的大規模及長期培養提供更加穩定的支架環境。
細胞增殖實驗探究了兩種微載體擴增 ADSCs 的效率，結果顯示動態培養 18 d 后，兩種微載體上的細胞都得到了高效擴增。但在最初 10 d 內，CultiSpher G 微載體上細胞擴增效率高于 SF-PLLA 微載體，分析是 CultiSpher G 微載體為明膠材料，細胞黏附性強，可率先達到快速增殖的細胞密度；但后期隨著 SF-PLLA 微載體上細胞逐漸適應環境后，兩組細胞數量差距逐漸縮小。培養 18 d 時，兩種微載體上 ADSCs 均實現大量增殖，兩者細胞總量差異無統計學意義。
在驗證了 ADSCs 可在兩種微載體上高效擴增后，下一步實驗對擴增所得細胞進行 qRT-PCR 分析，檢測三系分化標志物相關基因表達情況，以確定其三系分化能力是否改變。迄今為止，尚無針對 MSCs 在 RCCS 微重力條件下培養收獲后進行三系誘導分化能力分析的研究報道。本研究結果表明，SF-PLLA 微載體擴增的細胞 SOX9、COMP、ACAN 基因均上調，提示 SF-PLLA 微載體擴增所得 ADSCs 的成軟骨能力增加，相較而言 CultiSpher G 微載體擴增細胞成軟骨相關基因未見上調。這與微載體種類相關，絲素材料作為軟骨組織工程良好的應用材料，其理化性能可能促使其負載的 ADSCs 向軟骨方向分化。其他學者也觀察到在絲素材料上培育 MSCs 向軟骨方向分化的現象[14-15]，我們研究結論與之相似。此外，兩組微載體上擴增所獲細胞成骨相關基因表達未見明顯上調，而成脂相關基因表達 SF-PLLA 組呈表達下調，CultiSpher G 組呈表達上調。然而，多項研究表明，經由攪拌式培養的 MSCs 成骨、成軟骨能力增加，而成脂潛力被抑制[16-20]。我們的研究結果與微載體攪拌式生物反應器培養的 MSCs 研究結論不同，其原因尚不明確，可能是由于我們選用了 RCCS 系統，微重力條件下液體提供剪應力小于攪拌式培養，而高剪應力可通過影響連接細胞骨架的整合素，產生相應生物化學信號，改變細胞內的 Ca2+ 濃度，從而啟動成骨、成軟骨分化[21-23]。
最后，我們根據國際細胞治療協會（ISCT）對 MSCs 鑒定的推薦標準[22]，對微載體上所獲細胞進行了 MSCs 鑒定。其中流式細胞術分析結果顯示，細胞表面標志物 CD90、CD105 均呈陽性，CD34、CD11b、CD19、CD45、CD73、HLA-DR 呈陰性，符合 MSCs 特征。三系分化誘導培養結果顯示，阿利新藍、茜素紅、油紅 O 染色均呈陽性，提示該細胞仍具有三系分化能力。綜合流式細胞術分析及三系誘導分化結果，證實擴增所獲細胞為 ADSCs。
綜上述，SF-PLLA 微載體擴增 ADSCs 能力與 CultiSpher G 微載體相當，且成軟骨分化能力上調，成脂能力下降，為后續軟骨組織工程的支架材料探索提供了研究基礎。但本研究僅針對 ADSCs 在 SF-PLLA 微載體上的擴增培養進行探索，未來需對其他來源 MSCs 進一步研究，以證明該類微載體在 MSCs 培養的普適性。此外，SF-PLLA 微載體孔徑仍較小，使細胞進入微載體內部貼附生長受到阻礙，未來需對其結構進行改進。
作者貢獻：黃元亮負責實驗設計、實施及文章撰寫；穆琳參與實驗設計與實施；林燕嫻參與實驗設計與數據分析；滕利、蔣海越負責實驗設計與評估，以及文章審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中國醫學科學院整形外科醫院醫學倫理委員會批準（2021-2）。
MSCs 具有多向分化潛能，在組織工程及再生醫學中具有良好的應用前景[1-2]。但從人體直接獲得的 MSCs 有限，為了達到使用需求，常需進行體外擴增[3-4]。傳統細胞擴增通常借助于培養瓶或培養皿在二維平面條件下進行傳代培養，該法培養基利用率低，并且需要重復傳代及更換培養基等操作，增加了耗材、勞動成本與污染風險[5]。此外，該法無法模擬 MSCs 在生物機體內復雜的微環境，長期傳代培養的 MSCs 表現出增殖能力下降，并逐漸失去多向分化潛能[6-8]。基于多孔微載體三維動態培養的 MSCs 擴增策略，是將細胞接種于微載體上，進行攪拌懸浮培養或模擬微重力系統培養，不僅更加貼近細胞在體內的微環境[9-10]，而且由于微載體提供了大量供細胞生長貼附的表面面積，從而使空間及培養基利用率更大，更適合大范圍擴增細胞。
微載體可分為可降解型與不可降解型，不可降解型如 Cytodex 系列微載體，擴增后需將所得細胞消化收獲，該步驟常損失很大比例細胞。相比而言，可降解型如 CultiSpher 系列微載體，可不經消化收集細胞，直接用于組織工程移植，大大提高了細胞利用率。我們前期研究[11]發現，左旋聚乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）微載體在軟骨細胞擴增以及維持軟骨細胞表型方面均優于 CultiSpher G 微載體。然而，單獨使用 PLLA 作為微載體材料細胞親和力不夠，細胞貼附不佳。故在此基礎上，我們改進了微載體材料，將 PLLA 微載體被覆絲素蛋白（silk fibroin，SF）。脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）具有來源充足、易獲取、有多向分化能力等優點，是組織工程非常有前景的一類 MSCs。本研究采用 SF-PLLA 微載體擴增 ADSCs，以期探索一種更加適合 ADSCs 增殖并用于軟骨組織工程的可降解型微載體。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑及儀器
人脂肪組織取自中國醫學科學院整形外科醫院行雙下肢脂肪抽吸術的健康女性，樣本獲取均經患者知情同意。
L-DMEM 培養基、FBS、青/鏈霉素、胰蛋白酶-0.25%EDTA（GIBCO 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（Sigma 公司，美國）；成骨培養基、成軟骨培養基、成脂培養基（Cyagen 公司，美國）；PicoGreenTM dsDNA 定量檢測試劑盒、Live/DeadTM 細胞活力檢測試劑盒（Thermo 公司，美國）；RNA 提取試劑盒（Qiagen 公司，德國）；逆轉錄試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；人 MSCs 流式檢測試劑盒（BD 公司，美國）；CultiSpher G 微載體（Percell Biolytica 公司，瑞典）；SF-PLLA 微載體（中國醫學科學院生物工程研究所）。
CO2 培養箱（Thermo 公司，美國）；旋轉生物反應器（rotary cell culture system，RCCS；Synthecon 公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；共聚焦熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；流式細胞儀（BD 公司，美國）；LightCycler R 480Ⅱ實時熒光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）系統（Roche 公司，瑞士）。
1.2 ADSCs 分離、培養和鑒定
采用酶消化法獲取 ADSCs。具體方法：取 10 mL 無菌脂肪組織，PBS 洗滌 2 遍，加入 0.2%Ⅰ型膠原酶，置于 37℃ 恒溫搖床震蕩消化 40 min，加入等體積完全培養基（含 10%FBS、1% 青/鏈霉素的 L-DMEM 培養基）終止消化后，300×g 離心 5 min，棄上清。沉淀用 PBS 重懸后，使用 70 μm 細胞篩過濾，濾液以 150×g 離心 5 min，棄上清。適量完全培養基重懸細胞沉淀，接種于 10 cm 培養皿，于 37℃、5%CO2 培養箱培養，每 2～3 天換液，待細胞融合 90% 后傳代。
取第 3 代 ADSCs 行三系分化鑒定[12]，包括成骨誘導 21 d 行茜素紅染色，成脂誘導 21 d 行油紅 O 染色，細胞團成軟骨誘導 21 d 行阿利新藍染色；流式細胞儀檢測細胞表面標志物（CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR）表達。經鑒定提示培養后所得細胞為 ADSCs。
1.3 微載體形狀觀察
取 SF-PLLA 與 CultiSpher G 微載體各 150 mg，用 PBS 浸泡過夜后，高壓滅菌；將滅菌后的微載體采用完全培養基重懸預處理。取預處理后的微載體置于 24 孔板，采用倒置顯微鏡觀察其顆粒外觀。
1.4 微載體細胞培養及相關觀測
1.4.1 微載體細胞接種與培養
各取 1 mL 第 3 代 ADSCs 懸液（細胞濃度為 2.5×106 個/mL）分別與 150 mg 預處理完畢的兩種微載體充分混合，置于 50 mL 離心管中，加入完全培養基至 10 mL，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 4 h，每隔 30 min 輕微震蕩混勻。接種完畢后取出細胞-微載體復合物置于 50 mL 旋轉培養皿中，加滿完全培養基；將旋轉培養系統置于 37℃、5%CO2 培養箱中，靜置過夜后，調整旋轉培養系統以 10 r/min 速度開始轉動，培養基每 2～3 天更換 1 次。實驗重復 3 次。
1.4.2 掃描電鏡觀察
取接種前兩種微載體以及動態培養 18 d 的細胞-微載體復合物，PBS 清洗 2 次，2.5% 戊二醛固定，梯度乙醇脫水處理后臨界點干燥，真空噴濺鉑金離子，掃描電鏡觀察 ADSCs 在兩種微載體表面生長情況。
1.4.3 Live/Dead 染色觀察
取動態培養 1、7、14、18 d 的兩種細胞-微載體復合物，按照試劑盒說明書方法進行 Live/Dead 染色，室溫避光孵育 40 min 后，采用熒光共聚焦顯微鏡觀察細胞在微載體上分布及成活情況。
1.4.4 DNA 定量法檢測細胞增殖
取動態培養 1、4、7、10、14、18 d 的兩種細胞-微載體復合物，PBS 清洗 2 遍；加入 1 mL 0.5 mg/mL 蛋白激酶 K，56℃ 消化過夜；12 000×g 離心 10 min，取 100 μL 上清液加入 100 μL PicoGreen 工作液置入 96 孔板，每個樣品重復 3 孔；避光孵育 5 min，使用酶標儀于 520 nm 波長處檢測樣本吸光度（A）值，通過繪制增殖曲線，將 A 值轉化為細胞數量。
1.4.5 qRT-PCR 檢測成軟骨、成骨及成脂相關基因表達
實驗分為 3 組：CultiSpher G 微球組（A 組）、SF-PLLA 微球組（B 組）與對照組（C 組）。其中 C 組為常規二維平面培養的 ADSCs，具體方法為：初始接種密度為 5 000 個/cm2，待細胞生長至 90% 后傳代培養，傳代接種密度與初始接種密度相同。分別取培養 18 d 的兩種細胞-微載體復合物及二維平面培養至第 5 代的 ADSCs，按 RNA 提取試劑盒說明書提取樣本 RNA，并按逆轉錄試劑盒方法，采用 1 000 ng 體系進行逆轉錄，將逆轉錄所得 cDNA 進行 qPCR，檢測各組細胞成軟骨、成骨及成脂相關基因表達。其中成軟骨相關基因包括軟骨特異性基因 SOX9、Ⅱ型膠原（collagen type Ⅱ，COL2）、軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）、蛋白聚糖（aggrecan，ACAN）、Ⅹ型膠原（collagen type Ⅹ，COL10）；成骨相關基因包括 runt 相關轉錄因子 2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）、骨粘連蛋白（osteonectin，ONN）；成脂相關基因包括過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）、脂聯素基因（ADIPOQ）。各基因引物序列見表 1。目的基因表達水平使用同一樣本 GAPDH 內參基因標準化，用 2?ΔΔCt 法計算各基因相對表達量。
表1
各基因引物序列
Table1.
Primer sequences of genes
1.4.6 擴增所得 ADSCs 鑒定
取各組培養 18 d 所得 ADSCs，采用流式細胞術檢測細胞表面標志物 CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-DR 表達；并采用 1.2 方法進行三系分化鑒定。
1.5 統計學方法
采用 SPSS21.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗；三組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 微載體形狀觀察
倒置顯微鏡觀察示，兩種預處理后的微載體均大致呈球形，CultiSpher G 微載體直徑為 130～380 μm，粒徑相對不均一，內部空隙較小；SF-PLLA 微載體直徑為 100～400 μm，粒徑較 CultiSpher G 微載體均一，內部結構疏松，空隙較大。見圖 1。
圖1
兩種微載體預處理后形狀觀察（倒置顯微鏡×100）a. CultiSpher G 微載體；b. SF-PLLA 微載體
Figure1.
Observation of the shape of two microcarriers after pretreatment (Inverted microscope×100)
a. CultiSpher G microcarriers; b. SF-PLLA microcarriers
2.2 微載體細胞培養與相關觀測
2.2.1 掃描電鏡觀察
CultiSpher G 微載體表面粗糙，孔徑不一，孔隙率較小；而 SF-PLLA 微載體孔隙率大，供細胞生長的空間更大。動態培養 18 d 時，兩種微載體均保持結構形態穩定，SF-PLLA 微載體上細胞呈球狀，細胞伸展程度以及細胞間相互連接不如 CultiSpher G 微載體。見圖 2。
圖2
掃描電鏡觀察（×200）
左為 CultiSpher G 微載體，右為 SF-PLLA 微載體 a. 接種細胞前；b. 接種細胞后動態培養 18 d
Figure2. Scanning electron microscope observation (×200)Left for CultiSpher G microcarriers, right for SF-PLLA microcarriersa. Pre-incubation; b. Dynamic culture for 18 days after ADSCs incubation
2.2.2 Live/Dead 染色觀察
熒光共聚焦顯微鏡觀察示，兩種微載體接種細胞后，細胞可順利黏附在微載體表面。動態培養 1 d，CultiSpher G 微載體上細胞數量多于 SF-PLLA 微載體。7 d，大量細胞增殖覆蓋兩種微載體表面，此時微載體之間尚無明顯細胞及細胞外基質連接，且 CultiSpher G 微載體上細胞分布更加均勻，SF-PLLA 微載體上細胞成團分布。14 d，兩種微載體表面被覆細胞均進一步增多，并出現微載體間融合、聚集現象，其中 Cultispher G 微載體間細胞連接結構較清晰、連接較多。18 d，細胞大量分泌細胞外基質，使得微載體緊密黏附在一起，形成團體。CultiSpher G 微載體上細胞形態舒展，呈多足狀貼附于微載體表面，并與其他細胞間形成連接；而 SF-PLLA 微載體上細胞間連接相對較少，細胞更多呈現散在成團分布；此時兩種微載體表面細胞分布均接近飽和。見圖 3。
圖3
動態培養各時間點 Live/Dead 染色觀察（熒光共聚焦顯微鏡×100）
從左至右分別為動態培養 1、7、14、18 d a. CultiSpher G 微載體；b. SF-PLLA 微載體
Figure3. Live/Dead staining observation at each time point of dynamic culture (Confocal fluorescence microscope×100)From left to right for dynamic incubation for 1, 7, 14, and 18 days, respectively a. CultiSpher G microcarriers; b. SF-PLLA microcarriers
2.2.3 DNA 定量法檢測細胞增殖
增殖曲線示，細胞接種于兩種微載體后，細胞數量均呈逐漸增加趨勢。其中細胞接種于 CultiSpher G 微載體后可迅速進入快速增殖期，而 SF-PLLA 微載體上細胞需經過一段時間適應后才能達到相同增殖速度。動態培養各時間點 CultiSpher G 微載體上細胞均多于 SF-PLLA 微載體，其中 4、7、10 d 時兩種微載體上細胞數量比較差異有統計學意義（P<0.05）。10 d 時，兩種微載體上細胞生長均開始減緩，18 d 時兩種微載體上細胞數量差異無統計學意義（P>0.05），提示兩種微載體高效擴增 ADSCs 的能力相當。見圖 4。
圖4
兩種微載體上細胞增殖曲線
*與 SF-PLLA 微載體比較 P<0.05
Figure4. The cell proliferation curves on the two microcarriers*Compared with SF-PLLA microcarriers, P<0.052.2.4 qRT-PCR 檢測
① 成軟骨基因表達：培養 18 d，3 組均未檢測到 COL2 及 COL10 基因表達。B 組早期成軟骨轉錄因子 SOX9，COL2 上級調控因子 COMP 以及成軟骨成熟標志物 ACAN 基因相對表達量均顯著高于 A、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；A、C 組間 COMP 基因相對表達量比較差異有統計學意義（P<0.05），而 SOX9 和 ACAN 基因相對表達量比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5a～c。
圖5
培養 18 d qRT-PCR 檢測各組 ADSCs 三系分化相關基因相對表達量
*P<0.05 a. ACAN；b. SOX9；c. COMP；d. RUNX2；e. OCN；f. ONN；g. PPARγ；h. LPL；i. ADIPOQ
Figure5. The relative expression of differential-related genes in each group detected by qRT-PCR at 18 days after culture*P<0.05 a. ACAN; b. SOX9; c. COMP; d. RUNX2; e. OCN; f. ONN; g. PPARγ; h. LPL; i. ADIPOQ
② 成骨基因表達：A、B、C 組間成骨轉錄因子 RUNX2 基因相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05）。A、B 組細胞成骨早期標志物 ONN、成熟標志物 OCN 基因相對表達量均顯著低于 C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B 組 OCN 基因相對表達量顯著高于 A 組（P<0.05），而 ONN 基因相對表達量與 A 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5d～f。
③ 成脂基因表達：A 組成脂轉錄因子 PPARγ、成脂早期標記物 LPL 及成熟脂肪標記物 ADIPOQ 基因相對表達量均顯著高于 B、C 組，差異有統計學意義（P<0.05）；B 組 PPARγ、ADIPOQ 基因相對表達量顯著低于 C 組（P<0.05），LPL 基因相對表達量與 C 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 5g～i。
2.2.5 擴增所得 ADSCs 鑒定
① 流式細胞術鑒定：B 組細胞 MSCs 陽性標記物 CD90、CD105 表達較 C 組降低，但仍表現出陽性結果；而 A 組各標志物表達量與 C 組相似。見圖 6。A、B 組 MSCs 陰性標記物 CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、HLA-DR 與 C 組相比未見明顯改變。② 三系誘導分化鑒定：3 組 ADSCs 成軟骨、成骨、成脂誘導 21 d 后，阿利新藍、茜素紅及油紅 O 染色均呈陽性，各組染色結果無明顯差異。見圖 7。
圖6
培養 18 d 3 組擴增所得 ADSCs 流式細胞術鑒定
藍色為同型對照，紅色為樣本；從上至下依次為 A、B、C 組 a. CD90；b. CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR；c. CD73；d. CD105
Figure6. Flow cytometric identification of ADSCs harvested from 3 groups after cultured for 18 daysBlue for isotype control, red for sample; from top to bottom for groups A, B, and C, respectively a. CD90; b. CD34, CD11b, CD19, CD45, HLA-DR; c. CD73; d. CD105
圖7
3 組 ADSCs 成軟骨、成骨、成脂誘導 21 d 后染色倒置顯微鏡觀察
從左至右依次為 A、B、C 組 a. 阿利新藍染色（×40）；b. 茜素紅染色（×100）；c. 油紅 O 染色（×100）
Figure7. ADSCs in 3 groups were observed by inverted microscope after 21 days of induction of chondrogenic, osteogenic, and adipogenic differentiationsFrom left to right for groups A, B, and C, respectively a. Alcian blue staining (×40); b. Alizarin red staining (×100); c. Oil red O staining (×100)
3 討論
組織工程研究及應用需要大量種子細胞，大規模擴增 MSCs 并維持其干性對于組織工程的研究具有重要意義。作為細胞培養載體，微載體為細胞擴增提供了大量細胞貼附面積與充足的營養物質交換，是大規模擴增細胞的首選方案。其中，開發適合細胞生長、貼附的微載體，是目前研究重點。此前，我們報道了自制多孔 PLLA 微載體應用于軟骨細胞擴增，發現該微載體雖在維持軟骨細胞表型上優于 CultiSpher G 微載體，但細胞黏附性不佳，導致細胞利用率較低[11]。為了解決這一問題，我們選擇蠶絲中提取的 SF 對 PLLA 微載體進行修飾，制成 SF-PLLA 微載體，以改進 PLLA 微載體的生物相容性、機械強度及降解速率。SF-PLLA 微載體直徑為 100～400 μm，與 CultiSpher G 微載體相似，適合細胞貼附增殖，而且兩者均能降解，是良好的組織工程研究材料。
本研究中，SF-PLLA 微載體可以很好地支持細胞附著和增殖。該微載體呈多孔結構、孔隙率較大，為細胞大量增殖提供了有效空間，也有利于營養物質的交換。動態培養 18 d 時，該微載體仍能保持穩定的形態結構，且細胞長入孔隙內部。材料降解方面，研究表明[13]CultiSpher G 微載體使用的明膠材料穩定性較差，蛋白酶即能將其分解；而 SF-PLLA 材料具有相對穩定的生物降解能力，體外降解時間約 1 年，能為細胞的大規模及長期培養提供更加穩定的支架環境。
細胞增殖實驗探究了兩種微載體擴增 ADSCs 的效率，結果顯示動態培養 18 d 后，兩種微載體上的細胞都得到了高效擴增。但在最初 10 d 內，CultiSpher G 微載體上細胞擴增效率高于 SF-PLLA 微載體，分析是 CultiSpher G 微載體為明膠材料，細胞黏附性強，可率先達到快速增殖的細胞密度；但后期隨著 SF-PLLA 微載體上細胞逐漸適應環境后，兩組細胞數量差距逐漸縮小。培養 18 d 時，兩種微載體上 ADSCs 均實現大量增殖，兩者細胞總量差異無統計學意義。
在驗證了 ADSCs 可在兩種微載體上高效擴增后，下一步實驗對擴增所得細胞進行 qRT-PCR 分析，檢測三系分化標志物相關基因表達情況，以確定其三系分化能力是否改變。迄今為止，尚無針對 MSCs 在 RCCS 微重力條件下培養收獲后進行三系誘導分化能力分析的研究報道。本研究結果表明，SF-PLLA 微載體擴增的細胞 SOX9、COMP、ACAN 基因均上調，提示 SF-PLLA 微載體擴增所得 ADSCs 的成軟骨能力增加，相較而言 CultiSpher G 微載體擴增細胞成軟骨相關基因未見上調。這與微載體種類相關，絲素材料作為軟骨組織工程良好的應用材料，其理化性能可能促使其負載的 ADSCs 向軟骨方向分化。其他學者也觀察到在絲素材料上培育 MSCs 向軟骨方向分化的現象[14-15]，我們研究結論與之相似。此外，兩組微載體上擴增所獲細胞成骨相關基因表達未見明顯上調，而成脂相關基因表達 SF-PLLA 組呈表達下調，CultiSpher G 組呈表達上調。然而，多項研究表明，經由攪拌式培養的 MSCs 成骨、成軟骨能力增加，而成脂潛力被抑制[16-20]。我們的研究結果與微載體攪拌式生物反應器培養的 MSCs 研究結論不同，其原因尚不明確，可能是由于我們選用了 RCCS 系統，微重力條件下液體提供剪應力小于攪拌式培養，而高剪應力可通過影響連接細胞骨架的整合素，產生相應生物化學信號，改變細胞內的 Ca2+ 濃度，從而啟動成骨、成軟骨分化[21-23]。
最后，我們根據國際細胞治療協會（ISCT）對 MSCs 鑒定的推薦標準[22]，對微載體上所獲細胞進行了 MSCs 鑒定。其中流式細胞術分析結果顯示，細胞表面標志物 CD90、CD105 均呈陽性，CD34、CD11b、CD19、CD45、CD73、HLA-DR 呈陰性，符合 MSCs 特征。三系分化誘導培養結果顯示，阿利新藍、茜素紅、油紅 O 染色均呈陽性，提示該細胞仍具有三系分化能力。綜合流式細胞術分析及三系誘導分化結果，證實擴增所獲細胞為 ADSCs。
綜上述，SF-PLLA 微載體擴增 ADSCs 能力與 CultiSpher G 微載體相當，且成軟骨分化能力上調，成脂能力下降，為后續軟骨組織工程的支架材料探索提供了研究基礎。但本研究僅針對 ADSCs 在 SF-PLLA 微載體上的擴增培養進行探索，未來需對其他來源 MSCs 進一步研究，以證明該類微載體在 MSCs 培養的普適性。此外，SF-PLLA 微載體孔徑仍較小，使細胞進入微載體內部貼附生長受到阻礙，未來需對其結構進行改進。
作者貢獻：黃元亮負責實驗設計、實施及文章撰寫；穆琳參與實驗設計與實施；林燕嫻參與實驗設計與數據分析；滕利、蔣海越負責實驗設計與評估，以及文章審閱。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。基金項目經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經中國醫學科學院整形外科醫院醫學倫理委員會批準（2021-2）。
