引用本文： 李媛媛, 陳丹, 吳蓓. 過表達低氧誘導因子 1α 對乳牙牙髓干細胞向血管內皮細胞分化影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(6): 761-768. doi: 10.7507/1002-1892.202012024 復制
MSCs 具有多向分化和自我更新特點，在胚胎發育和組織再生中發揮著重要作用[1]。目前研究已發現了一些與牙齒相關的 MSCs 群體，例如來自恒牙的牙髓干細胞、來自人類脫落乳牙的牙髓干細胞（stem cells derived from human exfoliated deciduous teeth，SHED）和來自多生牙頂端乳頭的干細胞。研究發現[2-3]，人牙髓 MSCs 可以分化為成骨細胞和內皮細胞，其中 CD31 和 CD146 呈陰性的亞群 SHED 能通過分泌 VEGF 等促血管生成因子刺激血管形成。有研究表明[4]，SHED 還具有分化為血管內皮細胞的能力。但目前對于促血管生成因子參與調控 SHED 分化的分子機制知之甚少。
低氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）是低氧條件下產生的具有轉錄活性的蛋白，能與 β 亞基結合形成二聚體復合物，進而調控下游多種靶基因的表達，參與調控細胞促血管生成蛋白的表達水平。研究表明[5-6]，HIF-1α 聯合 BMP-6 蛋白過表達能增強 BMSCs 在低氧狀態下的促血管生成能力，并促進細胞核內 β-連環蛋白（β-catenin）的表達。而 β-catenin 是經典 Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵因子，下調該信號通路能抑制血管新生[7]。但 HIF-1α 能否通過調控 Wnt/β-catenin 信號通路影響 SHED 分化尚不清楚。為此，本研究通過構建 HIF-1α 過表達 SHED，探討 HIF-1α 對 SHED 向血管內皮細胞定向分化的影響以及可能的分子機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
滯留乳牙來源于電子科技大學醫學院附屬婦女兒童醫院收治的 12 名 8～12 歲健康兒童，其家屬簽署知情同意書。
HIF-1α 過表達質粒及其陰性對照空載質粒的構建以及慢病毒（8×108 PFU/mL）包裝、濃縮及純化，均由吉滿生物科技（上海）有限公司完成。Wnt/β-catenin信號通路抑制劑 IWR-1（MedChemExpress 公司，美國）；胰蛋白酶、FBS、Ⅰ型膠原酶、DMEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；ECL 化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Trizol 試劑（Invitrogen 公司，美國）；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量 PCR 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；Matrigel（Sigma 公司，美國）；HIF-1α 抗體、β-catenin 抗體、GAPDH 抗體（CST 公司，美國）；磷酸化糖原合酶激酶 3β（phosphate-glycogen synthasc kinase 3β，p-GSK3β）抗體（Tyr216；Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；熒光標記流式抗體 PE-血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、PE-CD73、FITC-CD90、APC-CD105、APC-CD45、PE-STRO-1、FITC-CD31（BD Biosciences 公司，美國）。BX51 熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 SHED 分離培養及鑒定
1.2.1 SHED 分離培養
牙髓組織用無菌 PBS 和 1% 青霉素/鏈霉素清洗后，切成約 1 mm×1 mm 大小；加入 3 mg/mLⅠ型膠原酶和 4 mg/mL 中性蛋白酶，于 37℃ 消化 30 min；置于含 10%FBS、1% 青霉素/鏈霉素的 DMEM 培養基培養，待細胞融合達 70% 后，按 1∶2 比例傳代，取第 3 代 SHED 進行后續實驗。
1.2.2 SHED 鑒定
取第 3 代細胞，采用流式細胞儀檢測細胞表面分子標志物 CD73、CD90、CD105、CD45 和 STRO-1 表達水平；采用成骨誘導劑對細胞進行成骨誘導分化 14 d 后，行茜素紅和 ALP 染色觀察細胞成骨分化能力。
1.3 實驗分組及方法
1.3.1 實驗分組
實驗分為 5 組，分別為空白對照組（未經任何處理的 SHED）、空載組（感染空載慢病毒的 SHED）、HIF-1α 過表達組（感染 HIF-1α 過表達慢病毒的 SHED）、Wnt 抑制劑組（經 1 μmol/L IWR-1 干預的 SHED）和聯合組（感染 HIF-1α 過表達慢病毒并經 1 μmol/L IWR-1 干預的 SHED）。
1.3.2 慢病毒感染方法及觀測
① 感染方法：取對數生長期第 3 代 SHED，以 1×105個/孔密度接種于 6 孔板中，待細胞融合至 70% 時，以病毒感染復數值 50 加入 HIF-1α 過表達慢病毒或空載慢病毒感染 SHED，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 12 h 后，更換新鮮培養液，繼續培養 72 h。② 觀測指標：采用實時熒光定量 PCR 和 Western blot 法檢測空白對照組、空載組及 HIF-1α 過表達組 HIF-1α mRNA 和蛋白的表達水平，觀察轉染效率。相關引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 檢測各基因引物序列
Table1.
The primer sequence of the genes by qRT-PCR
1.3.3 Wnt 抑制劑干預方法
取未經任何處理的 SHED 和感染 HIF-1α 過表達慢病毒的 SHED，以 2×105個/孔密度接種于 6 孔板中，置于 37℃、5% CO2 培養箱中培養 24 h 后，加入 1 μmol/L IWR-1 培養 48 h。
1.3.4 誘導 SHED 向血管內皮細胞分化
取 5 組 SHED 按照 1×105個/孔密度接種于 6 孔板中，采用 DMEM 培養基于 37℃、5%CO2 培養箱培養 24 h；待細胞完全貼壁后，更換誘導培養基[8]（含 2%FBS、50 μg/L VEGF、10 μg/L bFGF、0.1 mg/L 地塞米松、2 g/L 牛血清白蛋白、1% 青霉素/鏈霉素的 DMEM 培養基）進行定向誘導，每 2 天換液 1 次。其中，Wnt 抑制劑組和聯合組在換液時同時加入 IWR-1。定向誘導分化 14 d 后進行以下觀測。
1.4 觀測方法
1.4.1 實時熒光定量 PCR 檢測
各組 SHED 采用 Trizol 法提取總 RNA，分光光度儀測定總 RNA 含量及濃度，再使用逆轉錄酶試劑盒將 RNA 反轉錄到 cDNA，根據實時熒光定量 PCR 試劑盒說明書進行擴增。擴增條件：95℃ 預變性 5 min；94℃ 變性 15 s，56℃ 退火 15 s，72℃ 延伸 30 s，40 個循環。以 GAPDH 為內參，采用 2–ΔΔCt法計算血管細胞黏附分子 1（vascular cell adhesion protein 1，VACM-1）、VEGF 受體-2 KDR（Kinase-inserted domain containing receptor）、血管內皮鈣黏蛋白（VE-cadherin，VE）基因相對表達量。引物序列見表 1。實驗重復 3 次。
1.4.2 流式細胞儀檢測
各組 SHED 經胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，分別加入 PE-vWF 和 FITC-CD31，充分混勻后室溫避光孵育 20 min，PBS 洗滌 3 次；以離心半徑 10 cm、500 r/min 離心 5 min，加入 500 μL PBS 重懸，上流式細胞儀檢測，計算陽性細胞百分比。
1.4.3 Western blot 檢測
各組 SHED 加入細胞裂解液后于冰上靜置 30 min，4℃ 以離心半徑 10 cm、12 000 r/min 離心 20 min，取上清液，使用 BCA 試劑盒檢測上清液蛋白濃度。然后用 10%SDS-PAGE 進行電泳，將分離的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，分別加入一抗 p-GSK3β、β-catenin 和 GAPDH，4℃ 孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的 IgG 二抗，常溫孵育 1 h，加入 ECL 發光液，顯影和定影后將得到的膠片放入凝膠圖像分析儀曝光及拍照，分析目的條帶。以目的蛋白灰度值與 GAPDH 灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。
1.4.4 Matrigel 基質膠成管實驗
取 96 孔板，每孔滴加 50 μL Matrigel，37℃ 恒溫孵箱放置 30 min，待其凝固成膠狀后備用。取各組 SHED 按照 5×103個/孔密度接種于覆蓋 Matrigel 的 96 孔板，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 12 h。倒置顯微鏡下觀察細胞成管情況，隨機取 5 個視野統計小管形成數量，取均值。
1.4.5 DiI 標記的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-labeled acetylated low density lipoprotein，DiI-Ac-LDL）吞噬實驗
各組 SHED 以 5×103個/孔密度接種至 96 孔板中，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基，待細胞融合達 80%，棄培養液，加入含 10 μg/mL DiI-Ac-LDL 的無血清 DMEM 基礎培養基，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 6 h，滴加 DAPI 避光染核 5 min，預冷 PBS 浸洗 3 次。熒光顯微鏡下觀察，以紅色熒光強度值表示細胞吞噬脂質能力。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SHED 鑒定
流式細胞儀檢測示 SHED 表面抗原 CD73、CD90、CD105 以及 STRO-1 呈陽性，CD45 呈陰性（圖 1a）。成骨誘導培養 14 d 后，茜素紅染色呈陽性，鏡下可見大量紅色鈣化結節（圖 1b）；ALP 染色呈陽性，鏡下可見細胞質內出現大量藍黑色沉淀（圖 1c）。
圖1
SHED 鑒定觀察
a. 流式細胞儀檢測；b. 成骨誘導培養 14 d 后茜素紅染色（×200）；c. 成骨誘導培養 14 d 后 ALP 染色（×200）
Figure1. Identification observation of SHEDa. Flow cytometry detection; b. Alizarin red staining after 14 days of osteogenic induction culture (×200); c. ALP staining after 14 days of osteogenic induction culture (×200)
2.2 慢病毒感染細胞觀測
實時熒光定量 PCR 檢測示空白對照組、空載組及 HIF-1α 過表達組 HIF-1α mRNA 相對表達量分別為 1.02±0.42、1.42±0.62、248.75±43.55；Western blot 檢測示 HIF-1α 蛋白相對表達量分別 0.09±0.08、0.12±0.09、1.52±0.16。與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組 HIF-1α mRNA 和蛋白相對表達量均增加，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測慢病毒感染后各組 HIF-1α 蛋白表達1：空白對照組 2：空載組 3：HIF-1α 過表達組
Figure2.
Expression of HIF-1α protein after lentivirus transfection detected by Western blot
1: Blank control group 2: Empty group 3: HIF-1α overexpression group
2.3 SHED 向內皮細胞誘導分化后檢測
2.3.1 實時熒光定量 PCR 檢測
與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組 VCAM-1、KDR、VE mRNA 相對表達量增加（P<0.05），而 Wnt 抑制劑組相對表達量降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 HIF-1α 過表達組比較，聯合組上述指標 mRNA 相對表達量均降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
各組 VCAM-1、KDR 和 VE mRNA 相對表達量比較
Figure3.
Comparison of VCAM-1, KDR, and VE mRNA relative expressions between groups
2.3.2 流式細胞儀檢測
與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組 vWF 和 CD31 陽性細胞百分比增加，而 Wnt 抑制劑組降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 HIF-1α 過表達組比較，聯合組 vWF 和 CD31 陽性細胞百分比降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4、5。
圖4
流式細胞儀檢測各組 vWF 和 CD31 表達
從左至右分別為空白對照組、空載組、HIF-1α 過表達組、Wnt 抑制劑組、聯合組 a. vWF；b. CD31
Figure4. The expressions of vWF and CD31 detected by flow cytometryFrom left to right for blank control group, empty group, HIF-1α overexpression group, Wnt inhibitor group, and combination group, respectively a. vWF; b. CD31
圖5
各組 vWF 和 CD31 陽性細胞百分比比較
Figure5.
Comparison of percentages of vWF and CD31 positive cells between groups
2.3.3 Western blot 檢測
與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組細胞中 β-catenin 蛋白相對表達量增加、p-GSK3β 蛋白相對表達量降低，而 Wnt 抑制劑組 β-catenin 蛋白相對表達量降低、p-GSK3β 蛋白相對表達量增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 HIF-1α 過表達組比較，聯合組 β-catenin 蛋白相對表達量降低、p-GSK3β 蛋白相對表達量增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
Western blot 檢測各組 β-catenin 及 p-GSK3β 蛋白表達
a. 電泳圖 1：空白對照組 2：空載組 3：HIF-1α 過表達組 4：Wnt 抑制劑組 5：聯合組；b. 目的蛋白相對表達量比較
Figure6. Expressions of β-catenin and p-GSK3β proteins in each group detected by Western blota. Electrophoretogram 1: Blank control group 2: Empty group 3: HIF-1α overexpression group 4: Wnt inhibitor group 5: Combination group; b. Comparison of relative expressions of target proteins
2.3.4 Matrigel 基質膠成管實驗
空白對照組、空載組、HIF-1α 過表達組、Wnt 抑制劑組及聯合組小管形成數量分別為（27.33±4.56）、（28.66±5.21）、（89.00±6.62）、（8.00±3.15）、（51.33±7.52）個。與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組小管形成數量增加，而 Wnt 抑制劑組降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；與 HIF-1α 過表達組比較，聯合組小管形成數量明顯降低（P<0.05）。見圖 7。
圖7
各組小管形成觀察（倒置顯微鏡×200）
a. 空白對照組；b. 空載組；c. HIF-1α 過表達組；d. Wnt 抑制劑組；e. 聯合組
Figure7. Observation of tubule formation in each group (Inverted microscope×200)a. Blank control group; b. Empty group; c. HIF-1α overexpression group; d. Wnt inhibitor group; e. Combination group
2.3.5 DiI-Ac-LDL 吞噬實驗
空白對照組、空載組、HIF-1α 過表達組、Wnt 抑制劑組及聯合組紅色熒光強度值分別為 100.00±10.82、103.33±14.56、756.66±88.42、21.00±9.84、234.66±70.43。與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組細胞吞噬脂質能力明顯提高（P<0.05），而 Wnt 抑制劑組明顯降低（P<0.05）。與 HIF-1α 過表達組比較，聯合組細胞吞噬脂質能力明顯降低（P<0.05）。見圖 8。
圖8
各組細胞吞噬能力觀察（熒光顯微鏡×400）
a. 空白對照組；b. 空載組；c. HIF-1α 過表達組；d. Wnt 抑制劑組；e. 聯合組
Figure8. Observation of phagocytic capacity of cells in each group (Fluorescence microscope×400)a. Blank control group; b. Empty group; c. HIF-1α overexpression group; d. Wnt inhibitor group; e. Combination group
3 討論
乳牙向成人恒牙的過渡是一個非常獨特的動態過程，恒牙發育和萌出與乳牙牙根的吸收相協調。人類可能需要超過 7 年才能完成 20 顆乳牙的有序替換[9]。自然脫落的乳牙在某些方面類似于無髓牙，含有干細胞，可能作為臨床獨特的干細胞來源[10]。血管生成是形成新血管的過程，被定義為前體細胞向內皮細胞的分化[11]。有研究表明[12]，牙髓干細胞參與了血管生成過程，但相關作用機制鮮少報道。
HIF 是細胞適應低氧過程中的關鍵效應因子。HIF-1 對血管發育至關重要，HIF-1α 或 HIF-1β 缺失會影響血管系統的形成[13]。HIF-1α 是公認的血管生成途徑關鍵因子，在血管生成過程中起著重要作用。研究表明[14]，以 HIF-1α 通路為靶點，上調其表達水平能促進血管生成，可以成功修復大面積損傷。HIF-1α 不僅對細胞具有促血管生成作用，還對 MSCs 的分化過程起重要調控作用。研究發現，在 HIF-1α 介導的長期缺氧條件下，BMSCs 出現脂肪細胞樣的表型和細胞內脂滴的積聚，其向脂肪細胞分化得到促進[15]。另外，HIF-1α 參與介導的低強度間歇負壓通過促進膠原纖維蛋白Ⅰ、VEGF 以及骨保護素的表達水平，誘導 MSCs 向骨細胞分化[16]。本研究首先采用 vWF 和 CD31 作為鑒定血管內皮細胞表型標志物，結果顯示 HIF-1α 過表達組 vWF 和 CD31 陽性細胞百分比明顯增加，VCAM-1、KDR 和 VE mRNA 相對表達量也明顯增加，細胞體外成管能力以及吞噬能力均提高，表明 HIF-1α 過表達能夠促進 SHED 向血管內皮細胞分化。
Wnt/β-catenin 是經典的 Wnt 信號通路，也是進化上十分保守的信號通路，在胚胎發生和成體動物組織內穩態維持過程中，對干細胞更新、細胞增殖和細胞分化具有重要調控作用[17]。研究發現，抑制 Wnt/β-catenin 信號通路能抑制 BMSCs 的分化潛能[18]。GSK3β 是 Wnt/β-catenin 信號通路中重要調控因子，作為一種多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能促進 β-catenin 降解，使 Wnt/β-catenin 信號通路失活[19]，但在 SHED 分化過程中 GSK3β 與 Wnt/β-catenin 信號通路活性的相關機制尚不清楚。本研究結果顯示，HIF-1α 過表達能夠上調 SHED 向血管內皮細胞分化過程中 β-catenin 蛋白表達，抑制 GSK3β 蛋白磷酸化水平，提示 HIF-1α 促進 SHED 向血管內皮細胞分化的機制可能與 Wnt/β-catenin 信號通路激活有關。有研究顯示[20]，激活 Wnt/β-catenin 信號通路能夠促進 SHED 的多向分化。相反，用小分子抑制劑或 β-catenin 基因沉默阻斷 Wnt/β-catenin 信號通路，可阻止牙髓干細胞的血管生成分化[21]。這些研究表明，牙髓干細胞可以通過一個與早期胚胎發育過程中血管生成過程非常相似的過程，被誘導分化為血管內皮細胞，形成新生血管，而 Wnt/β-catenin 信號通路在調節這一過程中起著關鍵作用，即該信號通路是決定調節成骨細胞/成牙本質細胞分化或血管內皮細胞分化的“開關”。本研究結果也提示，Wnt 抑制劑 IWR-1 干預能夠抑制 SHED 向血管內皮細胞定向分化過程中 vWF、CD31、VCAM-1、KDR 和 VE 的表達，同時也降低細胞體外成管能力以及吞噬能力。但進一步觀察發現采用 Wnt 抑制劑 IWR-1 干預能夠抑制 HIF-1α 過表達對 SHED 向血管內皮細胞分化的促進作用，表明 HIF-1α 可能通過激活 Wnt/β-catenin 信號通路促進 SHED 向血管內皮細胞分化。
綜上述，HIF-1α 過表達能明顯促進 SHED 向血管內皮細胞分化，上調血管內皮細胞因子表達，這可能是通過激活 Wnt/β-catenin 信號通路來實現的。
作者貢獻：陳丹負責實驗設計；李媛媛和吳蓓負責實驗實施、文獻查詢以及實驗結果整理；李媛媛負責實驗結果的分析和文章撰寫。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。
機構倫理問題：研究方案經電子科技大學醫學院附屬婦女兒童醫院醫學倫理委員會批準（D20200113JL）。
MSCs 具有多向分化和自我更新特點，在胚胎發育和組織再生中發揮著重要作用[1]。目前研究已發現了一些與牙齒相關的 MSCs 群體，例如來自恒牙的牙髓干細胞、來自人類脫落乳牙的牙髓干細胞（stem cells derived from human exfoliated deciduous teeth，SHED）和來自多生牙頂端乳頭的干細胞。研究發現[2-3]，人牙髓 MSCs 可以分化為成骨細胞和內皮細胞，其中 CD31 和 CD146 呈陰性的亞群 SHED 能通過分泌 VEGF 等促血管生成因子刺激血管形成。有研究表明[4]，SHED 還具有分化為血管內皮細胞的能力。但目前對于促血管生成因子參與調控 SHED 分化的分子機制知之甚少。
低氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor，HIF-1α）是低氧條件下產生的具有轉錄活性的蛋白，能與 β 亞基結合形成二聚體復合物，進而調控下游多種靶基因的表達，參與調控細胞促血管生成蛋白的表達水平。研究表明[5-6]，HIF-1α 聯合 BMP-6 蛋白過表達能增強 BMSCs 在低氧狀態下的促血管生成能力，并促進細胞核內 β-連環蛋白（β-catenin）的表達。而 β-catenin 是經典 Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵因子，下調該信號通路能抑制血管新生[7]。但 HIF-1α 能否通過調控 Wnt/β-catenin 信號通路影響 SHED 分化尚不清楚。為此，本研究通過構建 HIF-1α 過表達 SHED，探討 HIF-1α 對 SHED 向血管內皮細胞定向分化的影響以及可能的分子機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
滯留乳牙來源于電子科技大學醫學院附屬婦女兒童醫院收治的 12 名 8～12 歲健康兒童，其家屬簽署知情同意書。
HIF-1α 過表達質粒及其陰性對照空載質粒的構建以及慢病毒（8×108 PFU/mL）包裝、濃縮及純化，均由吉滿生物科技（上海）有限公司完成。Wnt/β-catenin信號通路抑制劑 IWR-1（MedChemExpress 公司，美國）；胰蛋白酶、FBS、Ⅰ型膠原酶、DMEM 培養基（GIBCO 公司，美國）；ECL 化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Trizol 試劑（Invitrogen 公司，美國）；逆轉錄試劑盒、實時熒光定量 PCR 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；Matrigel（Sigma 公司，美國）；HIF-1α 抗體、β-catenin 抗體、GAPDH 抗體（CST 公司，美國）；磷酸化糖原合酶激酶 3β（phosphate-glycogen synthasc kinase 3β，p-GSK3β）抗體（Tyr216；Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；熒光標記流式抗體 PE-血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、PE-CD73、FITC-CD90、APC-CD105、APC-CD45、PE-STRO-1、FITC-CD31（BD Biosciences 公司，美國）。BX51 熒光顯微鏡（Olympus 公司，日本）。
1.2 SHED 分離培養及鑒定
1.2.1 SHED 分離培養
牙髓組織用無菌 PBS 和 1% 青霉素/鏈霉素清洗后，切成約 1 mm×1 mm 大小；加入 3 mg/mLⅠ型膠原酶和 4 mg/mL 中性蛋白酶，于 37℃ 消化 30 min；置于含 10%FBS、1% 青霉素/鏈霉素的 DMEM 培養基培養，待細胞融合達 70% 后，按 1∶2 比例傳代，取第 3 代 SHED 進行后續實驗。
1.2.2 SHED 鑒定
取第 3 代細胞，采用流式細胞儀檢測細胞表面分子標志物 CD73、CD90、CD105、CD45 和 STRO-1 表達水平；采用成骨誘導劑對細胞進行成骨誘導分化 14 d 后，行茜素紅和 ALP 染色觀察細胞成骨分化能力。
1.3 實驗分組及方法
1.3.1 實驗分組
實驗分為 5 組，分別為空白對照組（未經任何處理的 SHED）、空載組（感染空載慢病毒的 SHED）、HIF-1α 過表達組（感染 HIF-1α 過表達慢病毒的 SHED）、Wnt 抑制劑組（經 1 μmol/L IWR-1 干預的 SHED）和聯合組（感染 HIF-1α 過表達慢病毒并經 1 μmol/L IWR-1 干預的 SHED）。
1.3.2 慢病毒感染方法及觀測
① 感染方法：取對數生長期第 3 代 SHED，以 1×105個/孔密度接種于 6 孔板中，待細胞融合至 70% 時，以病毒感染復數值 50 加入 HIF-1α 過表達慢病毒或空載慢病毒感染 SHED，于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 12 h 后，更換新鮮培養液，繼續培養 72 h。② 觀測指標：采用實時熒光定量 PCR 和 Western blot 法檢測空白對照組、空載組及 HIF-1α 過表達組 HIF-1α mRNA 和蛋白的表達水平，觀察轉染效率。相關引物序列見表 1。
表1
實時熒光定量 PCR 檢測各基因引物序列
Table1.
The primer sequence of the genes by qRT-PCR
1.3.3 Wnt 抑制劑干預方法
取未經任何處理的 SHED 和感染 HIF-1α 過表達慢病毒的 SHED，以 2×105個/孔密度接種于 6 孔板中，置于 37℃、5% CO2 培養箱中培養 24 h 后，加入 1 μmol/L IWR-1 培養 48 h。
1.3.4 誘導 SHED 向血管內皮細胞分化
取 5 組 SHED 按照 1×105個/孔密度接種于 6 孔板中，采用 DMEM 培養基于 37℃、5%CO2 培養箱培養 24 h；待細胞完全貼壁后，更換誘導培養基[8]（含 2%FBS、50 μg/L VEGF、10 μg/L bFGF、0.1 mg/L 地塞米松、2 g/L 牛血清白蛋白、1% 青霉素/鏈霉素的 DMEM 培養基）進行定向誘導，每 2 天換液 1 次。其中，Wnt 抑制劑組和聯合組在換液時同時加入 IWR-1。定向誘導分化 14 d 后進行以下觀測。
1.4 觀測方法
1.4.1 實時熒光定量 PCR 檢測
各組 SHED 采用 Trizol 法提取總 RNA，分光光度儀測定總 RNA 含量及濃度，再使用逆轉錄酶試劑盒將 RNA 反轉錄到 cDNA，根據實時熒光定量 PCR 試劑盒說明書進行擴增。擴增條件：95℃ 預變性 5 min；94℃ 變性 15 s，56℃ 退火 15 s，72℃ 延伸 30 s，40 個循環。以 GAPDH 為內參，采用 2–ΔΔCt法計算血管細胞黏附分子 1（vascular cell adhesion protein 1，VACM-1）、VEGF 受體-2 KDR（Kinase-inserted domain containing receptor）、血管內皮鈣黏蛋白（VE-cadherin，VE）基因相對表達量。引物序列見表 1。實驗重復 3 次。
1.4.2 流式細胞儀檢測
各組 SHED 經胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，分別加入 PE-vWF 和 FITC-CD31，充分混勻后室溫避光孵育 20 min，PBS 洗滌 3 次；以離心半徑 10 cm、500 r/min 離心 5 min，加入 500 μL PBS 重懸，上流式細胞儀檢測，計算陽性細胞百分比。
1.4.3 Western blot 檢測
各組 SHED 加入細胞裂解液后于冰上靜置 30 min，4℃ 以離心半徑 10 cm、12 000 r/min 離心 20 min，取上清液，使用 BCA 試劑盒檢測上清液蛋白濃度。然后用 10%SDS-PAGE 進行電泳，將分離的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，分別加入一抗 p-GSK3β、β-catenin 和 GAPDH，4℃ 孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的 IgG 二抗，常溫孵育 1 h，加入 ECL 發光液，顯影和定影后將得到的膠片放入凝膠圖像分析儀曝光及拍照，分析目的條帶。以目的蛋白灰度值與 GAPDH 灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。
1.4.4 Matrigel 基質膠成管實驗
取 96 孔板，每孔滴加 50 μL Matrigel，37℃ 恒溫孵箱放置 30 min，待其凝固成膠狀后備用。取各組 SHED 按照 5×103個/孔密度接種于覆蓋 Matrigel 的 96 孔板，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 12 h。倒置顯微鏡下觀察細胞成管情況，隨機取 5 個視野統計小管形成數量，取均值。
1.4.5 DiI 標記的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-labeled acetylated low density lipoprotein，DiI-Ac-LDL）吞噬實驗
各組 SHED 以 5×103個/孔密度接種至 96 孔板中，加入含 10%FBS 的 DMEM 培養基，待細胞融合達 80%，棄培養液，加入含 10 μg/mL DiI-Ac-LDL 的無血清 DMEM 基礎培養基，置于 37℃、5%CO2 培養箱中培養 6 h，滴加 DAPI 避光染核 5 min，預冷 PBS 浸洗 3 次。熒光顯微鏡下觀察，以紅色熒光強度值表示細胞吞噬脂質能力。
1.5 統計學方法
采用 SPSS20.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SHED 鑒定
流式細胞儀檢測示 SHED 表面抗原 CD73、CD90、CD105 以及 STRO-1 呈陽性，CD45 呈陰性（圖 1a）。成骨誘導培養 14 d 后，茜素紅染色呈陽性，鏡下可見大量紅色鈣化結節（圖 1b）；ALP 染色呈陽性，鏡下可見細胞質內出現大量藍黑色沉淀（圖 1c）。
圖1
SHED 鑒定觀察
a. 流式細胞儀檢測；b. 成骨誘導培養 14 d 后茜素紅染色（×200）；c. 成骨誘導培養 14 d 后 ALP 染色（×200）
Figure1. Identification observation of SHEDa. Flow cytometry detection; b. Alizarin red staining after 14 days of osteogenic induction culture (×200); c. ALP staining after 14 days of osteogenic induction culture (×200)
2.2 慢病毒感染細胞觀測
實時熒光定量 PCR 檢測示空白對照組、空載組及 HIF-1α 過表達組 HIF-1α mRNA 相對表達量分別為 1.02±0.42、1.42±0.62、248.75±43.55；Western blot 檢測示 HIF-1α 蛋白相對表達量分別 0.09±0.08、0.12±0.09、1.52±0.16。與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組 HIF-1α mRNA 和蛋白相對表達量均增加，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 2。
圖2
Western blot 檢測慢病毒感染后各組 HIF-1α 蛋白表達1：空白對照組 2：空載組 3：HIF-1α 過表達組
Figure2.
Expression of HIF-1α protein after lentivirus transfection detected by Western blot
1: Blank control group 2: Empty group 3: HIF-1α overexpression group
2.3 SHED 向內皮細胞誘導分化后檢測
2.3.1 實時熒光定量 PCR 檢測
與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組 VCAM-1、KDR、VE mRNA 相對表達量增加（P<0.05），而 Wnt 抑制劑組相對表達量降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 HIF-1α 過表達組比較，聯合組上述指標 mRNA 相對表達量均降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
各組 VCAM-1、KDR 和 VE mRNA 相對表達量比較
Figure3.
Comparison of VCAM-1, KDR, and VE mRNA relative expressions between groups
2.3.2 流式細胞儀檢測
與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組 vWF 和 CD31 陽性細胞百分比增加，而 Wnt 抑制劑組降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 HIF-1α 過表達組比較，聯合組 vWF 和 CD31 陽性細胞百分比降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4、5。
圖4
流式細胞儀檢測各組 vWF 和 CD31 表達
從左至右分別為空白對照組、空載組、HIF-1α 過表達組、Wnt 抑制劑組、聯合組 a. vWF；b. CD31
Figure4. The expressions of vWF and CD31 detected by flow cytometryFrom left to right for blank control group, empty group, HIF-1α overexpression group, Wnt inhibitor group, and combination group, respectively a. vWF; b. CD31
圖5
各組 vWF 和 CD31 陽性細胞百分比比較
Figure5.
Comparison of percentages of vWF and CD31 positive cells between groups
2.3.3 Western blot 檢測
與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組細胞中 β-catenin 蛋白相對表達量增加、p-GSK3β 蛋白相對表達量降低，而 Wnt 抑制劑組 β-catenin 蛋白相對表達量降低、p-GSK3β 蛋白相對表達量增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。與 HIF-1α 過表達組比較，聯合組 β-catenin 蛋白相對表達量降低、p-GSK3β 蛋白相對表達量增加，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 6。
圖6
Western blot 檢測各組 β-catenin 及 p-GSK3β 蛋白表達
a. 電泳圖 1：空白對照組 2：空載組 3：HIF-1α 過表達組 4：Wnt 抑制劑組 5：聯合組；b. 目的蛋白相對表達量比較
Figure6. Expressions of β-catenin and p-GSK3β proteins in each group detected by Western blota. Electrophoretogram 1: Blank control group 2: Empty group 3: HIF-1α overexpression group 4: Wnt inhibitor group 5: Combination group; b. Comparison of relative expressions of target proteins
2.3.4 Matrigel 基質膠成管實驗
空白對照組、空載組、HIF-1α 過表達組、Wnt 抑制劑組及聯合組小管形成數量分別為（27.33±4.56）、（28.66±5.21）、（89.00±6.62）、（8.00±3.15）、（51.33±7.52）個。與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組小管形成數量增加，而 Wnt 抑制劑組降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；與 HIF-1α 過表達組比較，聯合組小管形成數量明顯降低（P<0.05）。見圖 7。
圖7
各組小管形成觀察（倒置顯微鏡×200）
a. 空白對照組；b. 空載組；c. HIF-1α 過表達組；d. Wnt 抑制劑組；e. 聯合組
Figure7. Observation of tubule formation in each group (Inverted microscope×200)a. Blank control group; b. Empty group; c. HIF-1α overexpression group; d. Wnt inhibitor group; e. Combination group
2.3.5 DiI-Ac-LDL 吞噬實驗
空白對照組、空載組、HIF-1α 過表達組、Wnt 抑制劑組及聯合組紅色熒光強度值分別為 100.00±10.82、103.33±14.56、756.66±88.42、21.00±9.84、234.66±70.43。與空白對照組和空載組比較，HIF-1α 過表達組細胞吞噬脂質能力明顯提高（P<0.05），而 Wnt 抑制劑組明顯降低（P<0.05）。與 HIF-1α 過表達組比較，聯合組細胞吞噬脂質能力明顯降低（P<0.05）。見圖 8。
圖8
各組細胞吞噬能力觀察（熒光顯微鏡×400）
a. 空白對照組；b. 空載組；c. HIF-1α 過表達組；d. Wnt 抑制劑組；e. 聯合組
Figure8. Observation of phagocytic capacity of cells in each group (Fluorescence microscope×400)a. Blank control group; b. Empty group; c. HIF-1α overexpression group; d. Wnt inhibitor group; e. Combination group
3 討論
乳牙向成人恒牙的過渡是一個非常獨特的動態過程，恒牙發育和萌出與乳牙牙根的吸收相協調。人類可能需要超過 7 年才能完成 20 顆乳牙的有序替換[9]。自然脫落的乳牙在某些方面類似于無髓牙，含有干細胞，可能作為臨床獨特的干細胞來源[10]。血管生成是形成新血管的過程，被定義為前體細胞向內皮細胞的分化[11]。有研究表明[12]，牙髓干細胞參與了血管生成過程，但相關作用機制鮮少報道。
HIF 是細胞適應低氧過程中的關鍵效應因子。HIF-1 對血管發育至關重要，HIF-1α 或 HIF-1β 缺失會影響血管系統的形成[13]。HIF-1α 是公認的血管生成途徑關鍵因子，在血管生成過程中起著重要作用。研究表明[14]，以 HIF-1α 通路為靶點，上調其表達水平能促進血管生成，可以成功修復大面積損傷。HIF-1α 不僅對細胞具有促血管生成作用，還對 MSCs 的分化過程起重要調控作用。研究發現，在 HIF-1α 介導的長期缺氧條件下，BMSCs 出現脂肪細胞樣的表型和細胞內脂滴的積聚，其向脂肪細胞分化得到促進[15]。另外，HIF-1α 參與介導的低強度間歇負壓通過促進膠原纖維蛋白Ⅰ、VEGF 以及骨保護素的表達水平，誘導 MSCs 向骨細胞分化[16]。本研究首先采用 vWF 和 CD31 作為鑒定血管內皮細胞表型標志物，結果顯示 HIF-1α 過表達組 vWF 和 CD31 陽性細胞百分比明顯增加，VCAM-1、KDR 和 VE mRNA 相對表達量也明顯增加，細胞體外成管能力以及吞噬能力均提高，表明 HIF-1α 過表達能夠促進 SHED 向血管內皮細胞分化。
Wnt/β-catenin 是經典的 Wnt 信號通路，也是進化上十分保守的信號通路，在胚胎發生和成體動物組織內穩態維持過程中，對干細胞更新、細胞增殖和細胞分化具有重要調控作用[17]。研究發現，抑制 Wnt/β-catenin 信號通路能抑制 BMSCs 的分化潛能[18]。GSK3β 是 Wnt/β-catenin 信號通路中重要調控因子，作為一種多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能促進 β-catenin 降解，使 Wnt/β-catenin 信號通路失活[19]，但在 SHED 分化過程中 GSK3β 與 Wnt/β-catenin 信號通路活性的相關機制尚不清楚。本研究結果顯示，HIF-1α 過表達能夠上調 SHED 向血管內皮細胞分化過程中 β-catenin 蛋白表達，抑制 GSK3β 蛋白磷酸化水平，提示 HIF-1α 促進 SHED 向血管內皮細胞分化的機制可能與 Wnt/β-catenin 信號通路激活有關。有研究顯示[20]，激活 Wnt/β-catenin 信號通路能夠促進 SHED 的多向分化。相反，用小分子抑制劑或 β-catenin 基因沉默阻斷 Wnt/β-catenin 信號通路，可阻止牙髓干細胞的血管生成分化[21]。這些研究表明，牙髓干細胞可以通過一個與早期胚胎發育過程中血管生成過程非常相似的過程，被誘導分化為血管內皮細胞，形成新生血管，而 Wnt/β-catenin 信號通路在調節這一過程中起著關鍵作用，即該信號通路是決定調節成骨細胞/成牙本質細胞分化或血管內皮細胞分化的“開關”。本研究結果也提示，Wnt 抑制劑 IWR-1 干預能夠抑制 SHED 向血管內皮細胞定向分化過程中 vWF、CD31、VCAM-1、KDR 和 VE 的表達，同時也降低細胞體外成管能力以及吞噬能力。但進一步觀察發現采用 Wnt 抑制劑 IWR-1 干預能夠抑制 HIF-1α 過表達對 SHED 向血管內皮細胞分化的促進作用，表明 HIF-1α 可能通過激活 Wnt/β-catenin 信號通路促進 SHED 向血管內皮細胞分化。
綜上述，HIF-1α 過表達能明顯促進 SHED 向血管內皮細胞分化，上調血管內皮細胞因子表達，這可能是通過激活 Wnt/β-catenin 信號通路來實現的。
作者貢獻：陳丹負責實驗設計；李媛媛和吳蓓負責實驗實施、文獻查詢以及實驗結果整理；李媛媛負責實驗結果的分析和文章撰寫。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。
機構倫理問題：研究方案經電子科技大學醫學院附屬婦女兒童醫院醫學倫理委員會批準（D20200113JL）。
