引用本文： 謝錦偉, 魯凌云, 余希杰. 細胞衰老在骨關節炎發病機制中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(4): 519-526. doi: 10.7507/1002-1892.202011065 復制
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是由全身易感因素和局部機械因素相互作用導致的一種以關節軟骨退變為主要病理特征的關節疾病，與衰老、性別、肥胖、創傷及遺傳等多種因素相關[1]。OA 最常累及膝關節、髖關節及遠端指間關節。研究顯示 OA 在全球疾病負擔中排名第 11 位，是引起關節疼痛與致殘的首位關節疾病[2]。在我國，由于人口基數大、老齡化社會形成，該問題尤為突出。我國大型流行病學調查結果顯示，40 歲以上人群雙膝 OA 患病率達 15.6%[3]。研究顯示，隨著社會進步，膝關節 OA 患病率較早期工業時代升高了 2 倍[4]。OA 引起的疼痛、畸形及功能障礙嚴重影響患者的生產能力及生活質量，導致了巨大醫療衛生支出[5]，我國每年因膝關節 OA 產生的醫療費用超過 5 萬億人民幣（約占 2018 年 GDP 總量的 4%）。目前針對 OA 的治療手段大多僅為對癥處理，缺乏疾病干預性藥物，絕大部分患者最終仍需通過關節置換術緩解疼痛、恢復關節功能。這嚴重制約了人口健康的發展，因而急需加強對調控 OA 發生、發展分子信號網絡的研究，希望從根本上解決 OA 防治難題。本文將從細胞衰老的病理生理，軟骨細胞衰老、滑膜細胞衰老及 MSCs 衰老與 OA 的潛在因果關系及機制方面進行綜述。
1 細胞衰老的病理生理
細胞衰老現象最早于 1961 年由微生物學家 Leonard Hayflick 與 Paul Moorhead 在進行體外成纖維細胞傳代時發現。目前觀點認為，細胞衰老是細胞在 DNA 損傷、端粒短縮、腫瘤基因激活、表觀遺傳改變、氧化應激等情況下出現的一種自我保護機制，表現為永久性的生長停滯，細胞分裂周期停滯于 G1 期或 S 期，以避免將異常基因傳至下一代細胞，從而維持機體穩態[6-7]。根據引起衰老的原因，細胞衰老可分為復制性衰老與應激導致的早衰，后者可分為 DNA 損傷衰老、氧化應激衰老、表觀遺傳所致衰老、炎性衰老等多種類型[8]。
盡管各種衰老的始動因素不盡相同，但其最終的效應通路均一致，不同的是上游調控機制[9]。而調控最終效應的信號通路主要包括 p53-p21Cip1-視網膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma，Rb）通路（主要調控 S/G2 期）及 p16INK4A-Rb 通路（主要調控 G1/S 期）[9-10]；p21Cip1、p16INK4A激活后編碼的周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKi）1A 及 CDKi2A，可分別抑制周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）2 及 CDK4/6，從而抑制 Rb 蛋白去磷酸化。Rb 蛋白的活化可抑制 E2F 基因表達，從而阻止細胞進入分裂期（S 期）。細胞衰老的發生是一連續動態過程，在細胞衰老起始階段，為了響應 DNA 雙鏈斷裂及端粒不穩定，激活 DNA 損傷反應，可通過共濟失調毛細血管擴張突變蛋白（ATM）及酵母 Rad3 相關蛋白（ATR）介導的 p53 磷酸化，增強轉錄因子 p53 的穩定性，進一步上調 p21 的表達而抑制細胞周期。而在細胞衰老的維持階段，p16 可在 p38 MAPK 及 ERK 信號通路的作用下表達上調，從而發生永久性的分裂停滯[11]。這兩種效應通路激活的時空調控還受到外界刺激或應激種類及持續時間的影響。
衰老細胞的表型在不同器官和組織中存在較高異質性，尋找具有普適性和特異性的衰老細胞生物標志物，也一直是衰老領域研究的重點和難點；而這同時也限制了在體內及體外對衰老細胞的識別與分離。盡管如此，隨著研究深入與技術發展，現有研究也發現了衰老細胞的部分共性特征，如 DNA 損傷、細胞周期停滯、凋亡抵抗、溶酶體功能異常等[8]。① DNA 損傷反應：γ-組蛋白 H2AX（γ-H2AX）免疫熒光染色可發現連續、未修復的 DNA 損傷，測量磷酸化 p53 水平也可反映 DNA 損傷反應[12]。② 細胞周期停滯：可通過 BrdU 或 EdU 測定 DNA 合成率或測定 p16、p21 基因水平來反映[13]。③ 溶酶體功能異常：β-半乳糖苷酶是反映溶酶體活性的最常用標志物，也是用于評估細胞衰老的主要指標[14]。另外，應用流式細胞技術及磁珠分選技術識別衰老細胞表面的分子標志物，如細胞間黏附分子 1（ICAM-1）、NOTCH 蛋白 3（NOTCH3），從而實現在不破壞細胞基礎上分離細胞的目的[15]。這類細胞表面分子標記物的發現也有助于對衰老細胞的精準清除。
衰老細胞雖然停止了分裂，但仍具有代謝功能，可分泌一系列衰老相關因子（senescence-associated secretory phenotype，SASP），如細胞外基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）、生長因子、促炎性細胞因子及趨化因子等，從而通過旁分泌方式影響周圍的細胞和組織。急性細胞衰老有助于機體穩態的維持，分泌的生長因子可促進胚胎發育[16-17]、傷口愈合[18]及胰島素分泌[19]。然而持續存在的衰老細胞將加速組織器官失功能而發生老年退行性疾病[20]。見圖 1。
圖1
細胞衰老在OA中作用機制示意圖
Figure1.
Schematic diagram of the mechanism of cellular senescence in OA
2 細胞衰老與 OA
2.1 軟骨細胞衰老與 OA
2.1.1 軟骨細胞衰老與 OA 間的因果關系
OA 是一種常見的老年退行性關節疾病，其病理改變可累及包括軟骨、軟骨下骨、滑膜、髕下脂肪墊等在內的全關節結構，主要病理特征是軟骨細胞退變及細胞外基質崩解[1，21]。軟骨細胞是關節軟骨中的唯一細胞類型，它通過合成Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖來控制細胞外基質的穩態。年齡是 OA 的主要危險因素之一，研究結果也發現 OA 發病率隨年齡增加而升高[22]；近年研究表明 OA 與年齡增加發生的軟骨細胞衰老及后續的軟骨損傷修復異常密切相關[23-25]。
關節軟骨細胞是一類低增殖能力細胞，正常情況下處于靜止狀態[20]。關節損傷發生后，軟骨細胞可恢復增殖能力以修復軟骨，從而維持軟骨穩態，但這類重新進入分裂周期的軟骨細胞更容易發生細胞衰老，進而導致 OA 的發生、發展[26-27]。Gao 等[23]在膝關節 OA 受損軟骨組織周圍發現與衰老相關 β-半乳糖苷酶（senescence associated β galactosidase，SA-β-Gal）染色陽性的軟骨細胞增多，且陽性細胞數量與 OA 嚴重程度密切相關。Xu 等[24]將體外構建的帶熒光標記的衰老軟骨細胞移植入野生型小鼠膝關節中，通過 18-脫氧葡萄糖 PET-CT 示蹤衰老軟骨細胞，發現移植衰老軟骨細胞的小鼠表現出典型 OA 病理變化。Jeon 等[25]利用 p16-3MR 基因工程鼠定向調控軟骨細胞衰老后，發現 p16 激活后的小鼠表現出更嚴重的 OA，而定向抑制 p16 激活可延緩 OA 進展；在 p16 激活的小鼠體內應用 UBX0101（一種促凋亡劑）清除衰老軟骨細胞后同樣可延緩 OA 進展。由此可見，軟骨細胞衰老在 OA 病理生理過程中發揮了重要作用，但調控軟骨細胞衰老的具體機制暫不明確。
同時，關于衰老軟骨細胞與 OA 之間的因果關系也受到了部分學者質疑。Diekman 等[28]通過小鼠及人體標本體內外研究發現，p16INK4A基因在年老小鼠和人體膝關節軟骨細胞中上調明顯，而 p16INK4A陽性的人體軟骨細胞增殖能力下降；而在小鼠體細胞中沉默 p16INK4A基因后，并未延緩因年齡增加和創傷導致的 OA。因此，作者指出 p16 的表達僅僅是軟骨細胞增殖能力缺失的標志之一，而衰老細胞產生的 SASP 才是衰老軟骨細胞與 OA 之間的驅動因素。
2.1.2 軟骨細胞衰老的生物學機制
過去 30 年，衰老研究已經從衰老表型識別過渡到表型背后的遺傳機制研究。目前關于軟骨細胞衰老的分子機制研究主要集中于 3 個方面：一是衰老發生共同通路的上游調控機制；二是衰老細胞產生 SASP 的調控機制；三是衰老細胞如何影響周圍健康細胞的機制。而現有證據發現轉錄因子調控、表觀遺傳改變、胞漿環狀鳥苷單磷酸酯-單磷酸腺苷合酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-干擾素基因刺激物（stimulator of interferon genes，STING）通路調控 SASP、外泌體介導衰老細胞間信號交流在 OA 發生、發展中有著重要作用。
細胞外囊泡包括外泌體及微泡，是一種大小為 30 nm～1 μm 的膜微粒，主要作用是介導細胞間的信號交流。近年研究發現與正常細胞相比，衰老細胞會分泌更多細胞外囊泡[29]。而這些囊泡可作為交流信號介導鄰近健康細胞衰老發生，這種現象在 OA 軟骨細胞中也得到了證實。Jeon 等[30]發現人膝關節 OA 軟骨細胞分泌的囊泡可被正常軟骨細胞攝取，從而表現出 SA-β-Gal 染色陽性、蛋白聚糖分泌減少的衰老表型；這種作用與囊泡來源的軟骨細胞衰老程度呈典型的劑量-效應關系。進一步分析這些囊泡內容物發現，衰老軟骨細胞來源囊泡中的 miRNA 含量發生了變化，從而介導健康細胞的表觀遺傳改變及衰老發生，但具體機制仍有待進一步研究。同時，有研究發現衰老軟骨細胞表面介導信號交流的細胞交流網絡因子 1（CCN1）[31]、通道連接蛋白 Connexin43（Cx43）[32]表達增加，而抑制這些蛋白表達可逆轉軟骨細胞的衰老表型，促進軟骨細胞的去分化和再分化。
SASP 分泌是衰老細胞的重要特征之一，這些蛋白質的基因編碼方式雖然已明確，但對整個過程的初始階段知之甚少。研究發現，cGAS-STING 通路在 SASP 產生及細胞衰老中至關重要[33-34]。cGAS-STING 是新發現的先天性免疫途徑，主要通過識別釋放到細胞質中的外源性及內源性 DNA 片段，激活下游信號轉導級聯反應，導致Ⅰ型干擾素和其他免疫介質的產生。目前雖然無直接證據顯示 cGAS-STING 通路在軟骨細胞衰老中的作用，但其在 MSCs 衰老中的作用或許能揭示其在軟骨細胞中的潛在價值[33]。
在細胞衰老通路的上游信號調控網絡中，miRNA 和轉錄因子發揮著重要作用。miRNA 能特異性地與 mRNA 結合，負向調控 mRNA 的翻譯。目前已發現幾十種 miRNA 與細胞衰老密切相關[35-36]，主要作用于 p53/p21、p16/Rb 衰老細胞軸或 SASP 的產生。其中，與軟骨細胞衰老密切相關的 miRNA 包括 miR-140、miR-24、miR-146 等[37-38]，新發現的 miR-17-92 cluster 可能也參與軟骨細胞衰老的調控。miR-17-92 cluster 主要功能是調控細胞周期，參與骨骼的生長發育，其表達異常與細胞衰老及腫瘤發生、發展密切相關[39]；研究顯示 MIR17HG 突變或其上游轉錄因子 MYCN 突變是骨軟骨疾病 Feingold 綜合征的新遺傳機制，患者表現為小頭畸形、四肢短小與手指畸形[40-41]。
轉錄因子是細胞衰老通路上游的重要調控環節，其中包括叉頭框蛋白 O（forkhead-box class O，FoxO），FoxO 家族成員包括 FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6，FoxO 與生長發育、衰老及長壽密切相關[42]。FoxO 功能失調可導致老年性骨質疏松[43]與肌肉萎縮[44]，其機制可能與調控細胞周期的 p16、p53/p21 有關。而近年研究發現，外源性應用 FoxO4 細胞穿膜肽能競爭性干擾 FoxO4-p53 的結合，從而誘導衰老細胞發生凋亡，維持機體穩態[45]。關節軟骨中，通過對正常軟骨及 OA 軟骨的全基因組及轉錄組測序發現，FoxO 是差異最明顯的信號通路之一[46]；體外軟骨標本的免疫組織化學研究也發現，老年關節軟骨及 OA 軟骨中 FoxO1、FoxO3 表達均降低[47]；同時，體內條件性敲除軟骨細胞 FoxO1/3/4 的小鼠表現出軟骨發育異常、抗氧化應激能力降低及更嚴重的 OA 表型[48]。因此，深入探索以 FoxO 為核心的分子信號網絡在軟骨細胞衰老及 OA 中的病理作用，有助于疾病的精準防治。
2.2 滑膜細胞衰老與 OA
滑膜作為關節結構中的重要組成部分，通過滑膜成纖維細胞分泌滑液及滑膜巨噬細胞分泌促炎因子和抗炎因子，共同維持局部微環境的穩定。近年來，越來越多研究開始關注滑膜在 OA 發生、發展中的重要病理生理作用，特別是滑膜局部常駐巨噬細胞及循環巨噬細胞組成的先天性免疫在 OA 局部炎癥中的病理作用。最新研究通過三維熒光顯微鏡、譜系示蹤、單細胞轉錄組測序等技術，在滑膜襯里層發現了一組 CX3CR1+ 組織駐留型巨噬細胞，覆蓋于滑膜成纖維細胞上層，細胞間可通過緊密連接在滑膜毛細血管網與關節間隙之間構成動態的類膜結構，形成免疫屏障[49]。
目前關于滑膜細胞衰老與 OA 之間因果關系的研究尚處于起步階段，Zhang 等[50]發現滑膜成纖維細胞在缺氧環境容易誘發細胞衰老，從而發生促炎因子及 MMP 分泌增加；Jeon 等[25]構建的 p16 基因工程鼠 OA 模型中可觀察到滑膜中 p16 和 SA-β-Gal 染色陽性細胞數增加，但并未明確呈現 p16 陽性細胞是成纖維細胞還是巨噬細胞。而有研究發現 p16 和 SA-β-Gal 陽性的巨噬細胞可能是正常生理刺激下出現的細胞極化標志物[51]，同時這種巨噬細胞仍然保持了向 M2 樣巨噬細胞極化的潛能。這一結論在該團隊的另一項研究中也得到了證實[52]，作者通過向免疫缺陷小鼠腹腔注射藻酸鹽包被的衰老細胞，分析衰老細胞周圍的免疫細胞類型，發現主要是 F4/80 陽性的巨噬細胞，同時該群巨噬細胞也呈現出 p16 和 SA-β-Gal 陽性。但是，p16 與 SA-β-Gal 陽性滑膜巨噬細胞的分泌表型是否發生改變并未明確。
基于現有證據，滑膜巨噬細胞可通過以下兩方面參與 OA 的發生、發展：一方面，衰老軟骨細胞分泌的 SASP 及軟骨分解的細胞外基質片段激活駐留的滑膜巨噬細胞，吞噬衰老細胞從而維持穩態。如應激原持續存在，增齡導致的巨噬細胞衰老可使其喪失免疫監視功能而加速軟骨退變。另一方面，激活的巨噬細胞可高表達 NAD+ 降解酶 CD38，加速組織中 NAD 消耗[53]，使得軟骨組織能量代謝失衡而加速軟骨退變。
2.3 MSCs 衰老與 OA
在膝關節的滑膜組織、髕下脂肪墊及軟骨下骨等結構中，存在著一群具有自我更新能力及多向分化潛能的細胞，即 MSCs。根據其來源組織特異性又可分為滑膜來源 MSCs、關節液來源 MSCs、脂肪來源 MSCs （adipose-derived stem cells，ADSCs）及 BMSCs。現有觀點認為，軟骨下骨的 BMSCs 耗竭及修復能力異常參與了 OA 的發生、發展過程[54]，通過其潛在的軟骨分化能力、旁分泌作用及免疫調節作用，為 OA 治療提供了可能[55]。
在 OA 中，衰老的軟骨細胞可能影響 MSCs 的軟骨分化潛能，而衰老的 MSCs 又因喪失免疫調節作用，促進 OA 發展，從而進入互相促進的惡性循環。Cao 等[56]探索了衰老軟骨細胞與 BMSCs 之間的相互作用，結果發現衰老的軟骨細胞可抑制 BMSCs 的分化潛能及增殖能力，而 BMSCs 可促進衰老軟骨細胞凋亡。而另一項研究[57]則通過將體外誘導 p16INK4A陽性的人滑膜及軟骨下骨 MSCs 與 OA 軟骨細胞共培養，探索衰老 MSCs 對 OA 軟骨細胞的作用，結果發現衰老 MSCs 并不能逆轉 OA 軟骨細胞的代謝表型。作者進一步通過 SAMP8 小鼠衰老模型誘導滑膜及軟骨下骨 MSCs 衰老，同時將提取純化的衰老 MSCs 注射到 C57 小鼠膝關節腔中，C57 小鼠可發展成典型 OA 表型。Huang 等[58]研究首先證實了人 OA 滑膜及非 OA 滑膜組織中 MSCs 的分布情況及功能，結果發現所有滑膜組織中均含有大量 CD90+/CD105+ MSCs，但 OA 滑膜組織來源 MSCs 呈現出更高的 SA-β-Gal 染色陽性、更低的增殖活性（Edu）及更多炎癥介質（IL-1 及 IL-6）與 MMPs（MMP-1、MMP-13）。同時分別將 OA 來源及非 OA 來源的滑膜 MSCs 注射入正常小鼠關節腔，也發現正常滑膜 MSCs 可延緩 OA 進展，而 OA 樣的滑膜 MSCs 可加重 OA 進展。進一步分析發現非經典 WNT 信號通路中的 WNT10A 上調，WNT10A 表現出抗衰老及促炎癥因子釋放的雙重特點。另一方面，年齡本身也會導致細胞干性丟失而喪失軟骨分化及損傷修復能力。Mazzotti 等[59]提取并對比了不同年齡馬關節液中的 MSCs，發現隨著年齡增長，關節液來源 MSCs 出現增殖能力降低及內質網應激、自噬減弱等衰老表型。而 Neybecker 等[60]進一步對比了 OA 患者中的滑膜、關節液來源 MSCs 和 BMSCs 的干性差異及軟骨分化能力，結果也發現滑膜及關節液來源 MSCs 的軟骨分化能力低于 BMSCs。這些研究揭示了 BMSCs、滑膜 MSCs、關節液 MSCs 衰老與 OA 發生、發展的潛在相關性，但均未明確兩者之間的交流機制及衰老機制。
相較于 BMSCs 及滑膜 MSCs，包括髕下脂肪墊在內的 ADSCs 更易于獲取[61]；同時，年齡對 ADSCs 增殖能力、干性維持及多能性的影響更低[62]。最新研究發現，ADSCs 是軟骨損傷修復的理想種子細胞[63-64]。通過將 ADSCs 條件培養基與 IL-1β 誘導的衰老軟骨細胞進行間接共培養發現，SA-β-Gal 陽性軟骨細胞減少，p53、p21 等基因表達下調，其機制可能與 Sirtuin1 介導 p53 乙酰化有關，但未明確這種保護作用應歸功于條件培養基中何種物質[65]。而這也是目前外源性 MSCs 治療 OA 的共性問題，MSCs 產生保護作用的機制可能更多來源于其分泌的各種細胞因子及免疫調節作用，而非直接定向分化修復。
骨骼干細胞（skeletal stem cells，SSCs）是近年來新鑒定出的一群組織特異性 MSCs，可向骨、軟骨及間質分化，但不能分化為脂肪組織[66-67]。該群細胞被認為是骨、軟骨損傷后自行修復的責任細胞，而最新研究進一步發現軟骨中的 SSCs 衰老與 OA 密切相關[68]。Chan 等[68]應用不同顏色熒光標記小鼠體內不同來源的 MSCs（彩虹小鼠），對不同年齡段小鼠關節軟骨中的 SSCs 進行分析后發現，SSCs 數量隨年齡增長而顯著減少，同時這些 SSCs 所在區域的蛋白聚糖分泌也顯著降低。進一步通過微骨折刺激軟骨 SSCs 后，可出現典型的軟骨再生及 OA 進展延緩。這一研究揭示了 SSCs 衰老在 OA 中的重要病理作用，同時也為內源性 SSCs 治療提供了新的研究方向。
3 診療進展及展望
針對軟骨細胞衰老在 OA 發生、發展中的病理環節，特異性清除衰老細胞、中和 SASP 中的促炎因子及蛋白酶、激活內源性 SSCs 的再年輕化，是 OA 治療的重要途徑。目前已發現可靶向清除的衰老細胞小分子化合物或天然植物提取物多達 10 余種，其中橄欖提取物橄欖苦苷[69]、Bcl-2 抑制劑 ABT-263[70]、小鼠雙微體 2 同系物（MDM2）蛋白抑制劑 UBX0101[25]在 OA 治療的實驗研究中顯示了較好療效。Varela-Eirín 等[69]發現植物提取物可以下調 OA 軟骨細胞 Cx43 基因表達，促進衰老軟骨細胞再分化而延緩 OA 進展。而 Bcl2 抑制劑 ABT-263 可通過誘導 p16 高表達的衰老軟骨細胞凋亡，從而抑制關節的炎癥微環境，促進軟骨修復[71]。UBX0101 主要作用于 MDM2，抑制其與 p53 的相互作用，促進 p53 通過泛素化途徑降解而促進衰老細胞凋亡。體內研究顯示，關節腔注射 UBX0101 后可減少軟骨細胞外基質降解及疼痛等 OA 癥狀的發生[25]，目前該小分子化合物已進入了Ⅱ期臨床研究[72]。同時，最新研究顯示嵌合抗原受體 T 細胞可識別衰老細胞表面的尿激酶型纖溶酶原激活物受體，從而定向清除肺腺癌組織及肝纖維組織中的衰老細胞[73]。這些新型治療方式也為 OA 的治療提供了新的視角。
通過清除衰老細胞，可避免鄰近健康細胞進入衰老的惡性循環；而如何促進已存在的軟骨損傷修復，是需要解決的另一重要問題。研究發現通過基因編輯工具 Crispr/cas9 或腺相關病毒技術上調 MSCs 年輕化因子 YAP、CBX4、DGCR8 的表達，可促進 MSCs 向軟骨分化，達到修復軟骨的目的[74]。未來除了深入研究不同來源 MSCs 對 OA 關節微環境的調節作用及與衰老軟骨細胞之間的串話機制以外，探索 SSCs 衰老的分子機制可為 MSCs 年輕化及軟骨損傷和 OA 原位修復提供新思路。
作者貢獻：謝錦偉負責綜述構思、資料搜集、觀點形成、文章撰寫及修改；余希杰負責綜述立題、構思建議，文章初稿修改；魯凌云對綜述構思提出建議。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點。
骨關節炎（osteoarthritis，OA）是由全身易感因素和局部機械因素相互作用導致的一種以關節軟骨退變為主要病理特征的關節疾病，與衰老、性別、肥胖、創傷及遺傳等多種因素相關[1]。OA 最常累及膝關節、髖關節及遠端指間關節。研究顯示 OA 在全球疾病負擔中排名第 11 位，是引起關節疼痛與致殘的首位關節疾病[2]。在我國，由于人口基數大、老齡化社會形成，該問題尤為突出。我國大型流行病學調查結果顯示，40 歲以上人群雙膝 OA 患病率達 15.6%[3]。研究顯示，隨著社會進步，膝關節 OA 患病率較早期工業時代升高了 2 倍[4]。OA 引起的疼痛、畸形及功能障礙嚴重影響患者的生產能力及生活質量，導致了巨大醫療衛生支出[5]，我國每年因膝關節 OA 產生的醫療費用超過 5 萬億人民幣（約占 2018 年 GDP 總量的 4%）。目前針對 OA 的治療手段大多僅為對癥處理，缺乏疾病干預性藥物，絕大部分患者最終仍需通過關節置換術緩解疼痛、恢復關節功能。這嚴重制約了人口健康的發展，因而急需加強對調控 OA 發生、發展分子信號網絡的研究，希望從根本上解決 OA 防治難題。本文將從細胞衰老的病理生理，軟骨細胞衰老、滑膜細胞衰老及 MSCs 衰老與 OA 的潛在因果關系及機制方面進行綜述。
1 細胞衰老的病理生理
細胞衰老現象最早于 1961 年由微生物學家 Leonard Hayflick 與 Paul Moorhead 在進行體外成纖維細胞傳代時發現。目前觀點認為，細胞衰老是細胞在 DNA 損傷、端粒短縮、腫瘤基因激活、表觀遺傳改變、氧化應激等情況下出現的一種自我保護機制，表現為永久性的生長停滯，細胞分裂周期停滯于 G1 期或 S 期，以避免將異常基因傳至下一代細胞，從而維持機體穩態[6-7]。根據引起衰老的原因，細胞衰老可分為復制性衰老與應激導致的早衰，后者可分為 DNA 損傷衰老、氧化應激衰老、表觀遺傳所致衰老、炎性衰老等多種類型[8]。
盡管各種衰老的始動因素不盡相同，但其最終的效應通路均一致，不同的是上游調控機制[9]。而調控最終效應的信號通路主要包括 p53-p21Cip1-視網膜母細胞瘤蛋白（retinoblastoma，Rb）通路（主要調控 S/G2 期）及 p16INK4A-Rb 通路（主要調控 G1/S 期）[9-10]；p21Cip1、p16INK4A激活后編碼的周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKi）1A 及 CDKi2A，可分別抑制周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）2 及 CDK4/6，從而抑制 Rb 蛋白去磷酸化。Rb 蛋白的活化可抑制 E2F 基因表達，從而阻止細胞進入分裂期（S 期）。細胞衰老的發生是一連續動態過程，在細胞衰老起始階段，為了響應 DNA 雙鏈斷裂及端粒不穩定，激活 DNA 損傷反應，可通過共濟失調毛細血管擴張突變蛋白（ATM）及酵母 Rad3 相關蛋白（ATR）介導的 p53 磷酸化，增強轉錄因子 p53 的穩定性，進一步上調 p21 的表達而抑制細胞周期。而在細胞衰老的維持階段，p16 可在 p38 MAPK 及 ERK 信號通路的作用下表達上調，從而發生永久性的分裂停滯[11]。這兩種效應通路激活的時空調控還受到外界刺激或應激種類及持續時間的影響。
衰老細胞的表型在不同器官和組織中存在較高異質性，尋找具有普適性和特異性的衰老細胞生物標志物，也一直是衰老領域研究的重點和難點；而這同時也限制了在體內及體外對衰老細胞的識別與分離。盡管如此，隨著研究深入與技術發展，現有研究也發現了衰老細胞的部分共性特征，如 DNA 損傷、細胞周期停滯、凋亡抵抗、溶酶體功能異常等[8]。① DNA 損傷反應：γ-組蛋白 H2AX（γ-H2AX）免疫熒光染色可發現連續、未修復的 DNA 損傷，測量磷酸化 p53 水平也可反映 DNA 損傷反應[12]。② 細胞周期停滯：可通過 BrdU 或 EdU 測定 DNA 合成率或測定 p16、p21 基因水平來反映[13]。③ 溶酶體功能異常：β-半乳糖苷酶是反映溶酶體活性的最常用標志物，也是用于評估細胞衰老的主要指標[14]。另外，應用流式細胞技術及磁珠分選技術識別衰老細胞表面的分子標志物，如細胞間黏附分子 1（ICAM-1）、NOTCH 蛋白 3（NOTCH3），從而實現在不破壞細胞基礎上分離細胞的目的[15]。這類細胞表面分子標記物的發現也有助于對衰老細胞的精準清除。
衰老細胞雖然停止了分裂，但仍具有代謝功能，可分泌一系列衰老相關因子（senescence-associated secretory phenotype，SASP），如細胞外基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）、生長因子、促炎性細胞因子及趨化因子等，從而通過旁分泌方式影響周圍的細胞和組織。急性細胞衰老有助于機體穩態的維持，分泌的生長因子可促進胚胎發育[16-17]、傷口愈合[18]及胰島素分泌[19]。然而持續存在的衰老細胞將加速組織器官失功能而發生老年退行性疾病[20]。見圖 1。
圖1
細胞衰老在OA中作用機制示意圖
Figure1.
Schematic diagram of the mechanism of cellular senescence in OA
2 細胞衰老與 OA
2.1 軟骨細胞衰老與 OA
2.1.1 軟骨細胞衰老與 OA 間的因果關系
OA 是一種常見的老年退行性關節疾病，其病理改變可累及包括軟骨、軟骨下骨、滑膜、髕下脂肪墊等在內的全關節結構，主要病理特征是軟骨細胞退變及細胞外基質崩解[1，21]。軟骨細胞是關節軟骨中的唯一細胞類型，它通過合成Ⅱ型膠原及聚集蛋白聚糖來控制細胞外基質的穩態。年齡是 OA 的主要危險因素之一，研究結果也發現 OA 發病率隨年齡增加而升高[22]；近年研究表明 OA 與年齡增加發生的軟骨細胞衰老及后續的軟骨損傷修復異常密切相關[23-25]。
關節軟骨細胞是一類低增殖能力細胞，正常情況下處于靜止狀態[20]。關節損傷發生后，軟骨細胞可恢復增殖能力以修復軟骨，從而維持軟骨穩態，但這類重新進入分裂周期的軟骨細胞更容易發生細胞衰老，進而導致 OA 的發生、發展[26-27]。Gao 等[23]在膝關節 OA 受損軟骨組織周圍發現與衰老相關 β-半乳糖苷酶（senescence associated β galactosidase，SA-β-Gal）染色陽性的軟骨細胞增多，且陽性細胞數量與 OA 嚴重程度密切相關。Xu 等[24]將體外構建的帶熒光標記的衰老軟骨細胞移植入野生型小鼠膝關節中，通過 18-脫氧葡萄糖 PET-CT 示蹤衰老軟骨細胞，發現移植衰老軟骨細胞的小鼠表現出典型 OA 病理變化。Jeon 等[25]利用 p16-3MR 基因工程鼠定向調控軟骨細胞衰老后，發現 p16 激活后的小鼠表現出更嚴重的 OA，而定向抑制 p16 激活可延緩 OA 進展；在 p16 激活的小鼠體內應用 UBX0101（一種促凋亡劑）清除衰老軟骨細胞后同樣可延緩 OA 進展。由此可見，軟骨細胞衰老在 OA 病理生理過程中發揮了重要作用，但調控軟骨細胞衰老的具體機制暫不明確。
同時，關于衰老軟骨細胞與 OA 之間的因果關系也受到了部分學者質疑。Diekman 等[28]通過小鼠及人體標本體內外研究發現，p16INK4A基因在年老小鼠和人體膝關節軟骨細胞中上調明顯，而 p16INK4A陽性的人體軟骨細胞增殖能力下降；而在小鼠體細胞中沉默 p16INK4A基因后，并未延緩因年齡增加和創傷導致的 OA。因此，作者指出 p16 的表達僅僅是軟骨細胞增殖能力缺失的標志之一，而衰老細胞產生的 SASP 才是衰老軟骨細胞與 OA 之間的驅動因素。
2.1.2 軟骨細胞衰老的生物學機制
過去 30 年，衰老研究已經從衰老表型識別過渡到表型背后的遺傳機制研究。目前關于軟骨細胞衰老的分子機制研究主要集中于 3 個方面：一是衰老發生共同通路的上游調控機制；二是衰老細胞產生 SASP 的調控機制；三是衰老細胞如何影響周圍健康細胞的機制。而現有證據發現轉錄因子調控、表觀遺傳改變、胞漿環狀鳥苷單磷酸酯-單磷酸腺苷合酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-干擾素基因刺激物（stimulator of interferon genes，STING）通路調控 SASP、外泌體介導衰老細胞間信號交流在 OA 發生、發展中有著重要作用。
細胞外囊泡包括外泌體及微泡，是一種大小為 30 nm～1 μm 的膜微粒，主要作用是介導細胞間的信號交流。近年研究發現與正常細胞相比，衰老細胞會分泌更多細胞外囊泡[29]。而這些囊泡可作為交流信號介導鄰近健康細胞衰老發生，這種現象在 OA 軟骨細胞中也得到了證實。Jeon 等[30]發現人膝關節 OA 軟骨細胞分泌的囊泡可被正常軟骨細胞攝取，從而表現出 SA-β-Gal 染色陽性、蛋白聚糖分泌減少的衰老表型；這種作用與囊泡來源的軟骨細胞衰老程度呈典型的劑量-效應關系。進一步分析這些囊泡內容物發現，衰老軟骨細胞來源囊泡中的 miRNA 含量發生了變化，從而介導健康細胞的表觀遺傳改變及衰老發生，但具體機制仍有待進一步研究。同時，有研究發現衰老軟骨細胞表面介導信號交流的細胞交流網絡因子 1（CCN1）[31]、通道連接蛋白 Connexin43（Cx43）[32]表達增加，而抑制這些蛋白表達可逆轉軟骨細胞的衰老表型，促進軟骨細胞的去分化和再分化。
SASP 分泌是衰老細胞的重要特征之一，這些蛋白質的基因編碼方式雖然已明確，但對整個過程的初始階段知之甚少。研究發現，cGAS-STING 通路在 SASP 產生及細胞衰老中至關重要[33-34]。cGAS-STING 是新發現的先天性免疫途徑，主要通過識別釋放到細胞質中的外源性及內源性 DNA 片段，激活下游信號轉導級聯反應，導致Ⅰ型干擾素和其他免疫介質的產生。目前雖然無直接證據顯示 cGAS-STING 通路在軟骨細胞衰老中的作用，但其在 MSCs 衰老中的作用或許能揭示其在軟骨細胞中的潛在價值[33]。
在細胞衰老通路的上游信號調控網絡中，miRNA 和轉錄因子發揮著重要作用。miRNA 能特異性地與 mRNA 結合，負向調控 mRNA 的翻譯。目前已發現幾十種 miRNA 與細胞衰老密切相關[35-36]，主要作用于 p53/p21、p16/Rb 衰老細胞軸或 SASP 的產生。其中，與軟骨細胞衰老密切相關的 miRNA 包括 miR-140、miR-24、miR-146 等[37-38]，新發現的 miR-17-92 cluster 可能也參與軟骨細胞衰老的調控。miR-17-92 cluster 主要功能是調控細胞周期，參與骨骼的生長發育，其表達異常與細胞衰老及腫瘤發生、發展密切相關[39]；研究顯示 MIR17HG 突變或其上游轉錄因子 MYCN 突變是骨軟骨疾病 Feingold 綜合征的新遺傳機制，患者表現為小頭畸形、四肢短小與手指畸形[40-41]。
轉錄因子是細胞衰老通路上游的重要調控環節，其中包括叉頭框蛋白 O（forkhead-box class O，FoxO），FoxO 家族成員包括 FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6，FoxO 與生長發育、衰老及長壽密切相關[42]。FoxO 功能失調可導致老年性骨質疏松[43]與肌肉萎縮[44]，其機制可能與調控細胞周期的 p16、p53/p21 有關。而近年研究發現，外源性應用 FoxO4 細胞穿膜肽能競爭性干擾 FoxO4-p53 的結合，從而誘導衰老細胞發生凋亡，維持機體穩態[45]。關節軟骨中，通過對正常軟骨及 OA 軟骨的全基因組及轉錄組測序發現，FoxO 是差異最明顯的信號通路之一[46]；體外軟骨標本的免疫組織化學研究也發現，老年關節軟骨及 OA 軟骨中 FoxO1、FoxO3 表達均降低[47]；同時，體內條件性敲除軟骨細胞 FoxO1/3/4 的小鼠表現出軟骨發育異常、抗氧化應激能力降低及更嚴重的 OA 表型[48]。因此，深入探索以 FoxO 為核心的分子信號網絡在軟骨細胞衰老及 OA 中的病理作用，有助于疾病的精準防治。
2.2 滑膜細胞衰老與 OA
滑膜作為關節結構中的重要組成部分，通過滑膜成纖維細胞分泌滑液及滑膜巨噬細胞分泌促炎因子和抗炎因子，共同維持局部微環境的穩定。近年來，越來越多研究開始關注滑膜在 OA 發生、發展中的重要病理生理作用，特別是滑膜局部常駐巨噬細胞及循環巨噬細胞組成的先天性免疫在 OA 局部炎癥中的病理作用。最新研究通過三維熒光顯微鏡、譜系示蹤、單細胞轉錄組測序等技術，在滑膜襯里層發現了一組 CX3CR1+ 組織駐留型巨噬細胞，覆蓋于滑膜成纖維細胞上層，細胞間可通過緊密連接在滑膜毛細血管網與關節間隙之間構成動態的類膜結構，形成免疫屏障[49]。
目前關于滑膜細胞衰老與 OA 之間因果關系的研究尚處于起步階段，Zhang 等[50]發現滑膜成纖維細胞在缺氧環境容易誘發細胞衰老，從而發生促炎因子及 MMP 分泌增加；Jeon 等[25]構建的 p16 基因工程鼠 OA 模型中可觀察到滑膜中 p16 和 SA-β-Gal 染色陽性細胞數增加，但并未明確呈現 p16 陽性細胞是成纖維細胞還是巨噬細胞。而有研究發現 p16 和 SA-β-Gal 陽性的巨噬細胞可能是正常生理刺激下出現的細胞極化標志物[51]，同時這種巨噬細胞仍然保持了向 M2 樣巨噬細胞極化的潛能。這一結論在該團隊的另一項研究中也得到了證實[52]，作者通過向免疫缺陷小鼠腹腔注射藻酸鹽包被的衰老細胞，分析衰老細胞周圍的免疫細胞類型，發現主要是 F4/80 陽性的巨噬細胞，同時該群巨噬細胞也呈現出 p16 和 SA-β-Gal 陽性。但是，p16 與 SA-β-Gal 陽性滑膜巨噬細胞的分泌表型是否發生改變并未明確。
基于現有證據，滑膜巨噬細胞可通過以下兩方面參與 OA 的發生、發展：一方面，衰老軟骨細胞分泌的 SASP 及軟骨分解的細胞外基質片段激活駐留的滑膜巨噬細胞，吞噬衰老細胞從而維持穩態。如應激原持續存在，增齡導致的巨噬細胞衰老可使其喪失免疫監視功能而加速軟骨退變。另一方面，激活的巨噬細胞可高表達 NAD+ 降解酶 CD38，加速組織中 NAD 消耗[53]，使得軟骨組織能量代謝失衡而加速軟骨退變。
2.3 MSCs 衰老與 OA
在膝關節的滑膜組織、髕下脂肪墊及軟骨下骨等結構中，存在著一群具有自我更新能力及多向分化潛能的細胞，即 MSCs。根據其來源組織特異性又可分為滑膜來源 MSCs、關節液來源 MSCs、脂肪來源 MSCs （adipose-derived stem cells，ADSCs）及 BMSCs。現有觀點認為，軟骨下骨的 BMSCs 耗竭及修復能力異常參與了 OA 的發生、發展過程[54]，通過其潛在的軟骨分化能力、旁分泌作用及免疫調節作用，為 OA 治療提供了可能[55]。
在 OA 中，衰老的軟骨細胞可能影響 MSCs 的軟骨分化潛能，而衰老的 MSCs 又因喪失免疫調節作用，促進 OA 發展，從而進入互相促進的惡性循環。Cao 等[56]探索了衰老軟骨細胞與 BMSCs 之間的相互作用，結果發現衰老的軟骨細胞可抑制 BMSCs 的分化潛能及增殖能力，而 BMSCs 可促進衰老軟骨細胞凋亡。而另一項研究[57]則通過將體外誘導 p16INK4A陽性的人滑膜及軟骨下骨 MSCs 與 OA 軟骨細胞共培養，探索衰老 MSCs 對 OA 軟骨細胞的作用，結果發現衰老 MSCs 并不能逆轉 OA 軟骨細胞的代謝表型。作者進一步通過 SAMP8 小鼠衰老模型誘導滑膜及軟骨下骨 MSCs 衰老，同時將提取純化的衰老 MSCs 注射到 C57 小鼠膝關節腔中，C57 小鼠可發展成典型 OA 表型。Huang 等[58]研究首先證實了人 OA 滑膜及非 OA 滑膜組織中 MSCs 的分布情況及功能，結果發現所有滑膜組織中均含有大量 CD90+/CD105+ MSCs，但 OA 滑膜組織來源 MSCs 呈現出更高的 SA-β-Gal 染色陽性、更低的增殖活性（Edu）及更多炎癥介質（IL-1 及 IL-6）與 MMPs（MMP-1、MMP-13）。同時分別將 OA 來源及非 OA 來源的滑膜 MSCs 注射入正常小鼠關節腔，也發現正常滑膜 MSCs 可延緩 OA 進展，而 OA 樣的滑膜 MSCs 可加重 OA 進展。進一步分析發現非經典 WNT 信號通路中的 WNT10A 上調，WNT10A 表現出抗衰老及促炎癥因子釋放的雙重特點。另一方面，年齡本身也會導致細胞干性丟失而喪失軟骨分化及損傷修復能力。Mazzotti 等[59]提取并對比了不同年齡馬關節液中的 MSCs，發現隨著年齡增長，關節液來源 MSCs 出現增殖能力降低及內質網應激、自噬減弱等衰老表型。而 Neybecker 等[60]進一步對比了 OA 患者中的滑膜、關節液來源 MSCs 和 BMSCs 的干性差異及軟骨分化能力，結果也發現滑膜及關節液來源 MSCs 的軟骨分化能力低于 BMSCs。這些研究揭示了 BMSCs、滑膜 MSCs、關節液 MSCs 衰老與 OA 發生、發展的潛在相關性，但均未明確兩者之間的交流機制及衰老機制。
相較于 BMSCs 及滑膜 MSCs，包括髕下脂肪墊在內的 ADSCs 更易于獲取[61]；同時，年齡對 ADSCs 增殖能力、干性維持及多能性的影響更低[62]。最新研究發現，ADSCs 是軟骨損傷修復的理想種子細胞[63-64]。通過將 ADSCs 條件培養基與 IL-1β 誘導的衰老軟骨細胞進行間接共培養發現，SA-β-Gal 陽性軟骨細胞減少，p53、p21 等基因表達下調，其機制可能與 Sirtuin1 介導 p53 乙酰化有關，但未明確這種保護作用應歸功于條件培養基中何種物質[65]。而這也是目前外源性 MSCs 治療 OA 的共性問題，MSCs 產生保護作用的機制可能更多來源于其分泌的各種細胞因子及免疫調節作用，而非直接定向分化修復。
骨骼干細胞（skeletal stem cells，SSCs）是近年來新鑒定出的一群組織特異性 MSCs，可向骨、軟骨及間質分化，但不能分化為脂肪組織[66-67]。該群細胞被認為是骨、軟骨損傷后自行修復的責任細胞，而最新研究進一步發現軟骨中的 SSCs 衰老與 OA 密切相關[68]。Chan 等[68]應用不同顏色熒光標記小鼠體內不同來源的 MSCs（彩虹小鼠），對不同年齡段小鼠關節軟骨中的 SSCs 進行分析后發現，SSCs 數量隨年齡增長而顯著減少，同時這些 SSCs 所在區域的蛋白聚糖分泌也顯著降低。進一步通過微骨折刺激軟骨 SSCs 后，可出現典型的軟骨再生及 OA 進展延緩。這一研究揭示了 SSCs 衰老在 OA 中的重要病理作用，同時也為內源性 SSCs 治療提供了新的研究方向。
3 診療進展及展望
針對軟骨細胞衰老在 OA 發生、發展中的病理環節，特異性清除衰老細胞、中和 SASP 中的促炎因子及蛋白酶、激活內源性 SSCs 的再年輕化，是 OA 治療的重要途徑。目前已發現可靶向清除的衰老細胞小分子化合物或天然植物提取物多達 10 余種，其中橄欖提取物橄欖苦苷[69]、Bcl-2 抑制劑 ABT-263[70]、小鼠雙微體 2 同系物（MDM2）蛋白抑制劑 UBX0101[25]在 OA 治療的實驗研究中顯示了較好療效。Varela-Eirín 等[69]發現植物提取物可以下調 OA 軟骨細胞 Cx43 基因表達，促進衰老軟骨細胞再分化而延緩 OA 進展。而 Bcl2 抑制劑 ABT-263 可通過誘導 p16 高表達的衰老軟骨細胞凋亡，從而抑制關節的炎癥微環境，促進軟骨修復[71]。UBX0101 主要作用于 MDM2，抑制其與 p53 的相互作用，促進 p53 通過泛素化途徑降解而促進衰老細胞凋亡。體內研究顯示，關節腔注射 UBX0101 后可減少軟骨細胞外基質降解及疼痛等 OA 癥狀的發生[25]，目前該小分子化合物已進入了Ⅱ期臨床研究[72]。同時，最新研究顯示嵌合抗原受體 T 細胞可識別衰老細胞表面的尿激酶型纖溶酶原激活物受體，從而定向清除肺腺癌組織及肝纖維組織中的衰老細胞[73]。這些新型治療方式也為 OA 的治療提供了新的視角。
通過清除衰老細胞，可避免鄰近健康細胞進入衰老的惡性循環；而如何促進已存在的軟骨損傷修復，是需要解決的另一重要問題。研究發現通過基因編輯工具 Crispr/cas9 或腺相關病毒技術上調 MSCs 年輕化因子 YAP、CBX4、DGCR8 的表達，可促進 MSCs 向軟骨分化，達到修復軟骨的目的[74]。未來除了深入研究不同來源 MSCs 對 OA 關節微環境的調節作用及與衰老軟骨細胞之間的串話機制以外，探索 SSCs 衰老的分子機制可為 MSCs 年輕化及軟骨損傷和 OA 原位修復提供新思路。
作者貢獻：謝錦偉負責綜述構思、資料搜集、觀點形成、文章撰寫及修改；余希杰負責綜述立題、構思建議，文章初稿修改；魯凌云對綜述構思提出建議。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點。
