引用本文： 謝興琴, 張怡, 趙新新, 劉瞳昕, 孫麗萍. 血小板衍生物在組織再生研究和應用中的標準化管理. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(3): 392-398. doi: 10.7507/1002-1892.202011023 復制
血小板具有凝血和組織修復兩大類功能。血小板衍生物是一類體外提取血小板經特殊工藝制成活性生物制劑后，用于組織再生修復的醫療技術產品。將外周血通過離心或者富集作用獲得的高度濃縮血小板（platelet concentrate，PC）進行有效激活，可促使 α 顆粒釋放多種蛋白質，進而應用于組織再生修復中。激活過程可釋放超過 4000 種蛋白[1]，基因信息分析發現其中至少有 125 種蛋白參與損傷修復過程[2]，包括 PDGF、TGF-β、FGF、EGF、IGF 和 VEGF 等促進細胞生長、趨化、黏附和免疫調節的生物活性物質。這種源于血小板的高度復雜活性生物制劑可用于局部損傷組織，尤其是人體血液達不到或供血不良的位置，通過協同作用刺激細胞的增殖、分化與遷移，并增強細胞外基質的合成和分泌能力，達到對多種機體損傷原位修復與再生重建的目的[3-4]。
從 1954 年開始發展起來的富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP），到富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）[5]，再到近年來組織工程修復中最前沿產品血小板裂解液（platelet lysates，PL）[6]，這些血小板衍生物逐漸從一種由臨床醫生根據經驗在病床邊自行制備的技術，走向規范化生產和應用的生物制劑或藥物。PRP 一般是血液經過 2 次離心后，去掉大部分紅細胞和乏血小板血漿后獲得，可直接應用，也可采用凝血酶、氯化鈣或膠原等激活成為 PRP 凝膠后應用。PRF 是一種將無抗凝劑的血液經離心激發血液凝集成膠后的富含血小板的纖維蛋白凝膠。由于此過程不添加任何外源物質激活，其制作工藝較 PRP 有很大優勢，因而被稱為第 2 代富血小板技術。PL 是將人血液進行血小板富集，或用采集而未回輸的 5～7 d 濃縮血小板經多步處理，最后裂解激活，充分釋放血小板顆粒和膜性結構中各種營養成分，被稱為第 3 代富血小板技術。因不同研究者在制作過程中采用的采集方式、離心次數、激活方法、治療療程、應用方式以及是否含有白細胞、是否做成凝膠、血小板濃縮倍數和關鍵活性物質濃度等參數有很大區別，加之供體存在個體差異，造成富血小板技術獲得的血小板衍生物終產品成分差別很大，極易導致同一類富血小板產品應用于同一種疾病時治療效果有很大差別[7]。另外，缺少技術規范成為富血小板技術和產品發展的瓶頸問題，因此近年來醫療行業對多成分活性生物制劑標準化和質量均一控制的需求迫切，在一些國家已經逐步建立相應的管理要求和規范[8]。本文將從分類命名的標準化管理、對血小板衍生物發表論文的標準化管理、血小板衍生物制備技術的質量標準化管理及血小板衍生物臨床應用的規范化管理 4 個方面，對血小板衍生物在組織再生研究和應用中的標準化管理進行綜述。
1 分類命名的標準化管理
由于制備工藝和關鍵組成成分的復雜性，不同研究者試圖通過標準化命名和分類，對血小板衍生物進行標準化管理和比較。2009 年—2020 年，多位研究者從制備工藝角度對血小板衍生物進行分類，見表 1。Dohan 等[9]根據產品中是否含有白細胞將血小板衍生物分為不含白細胞的純 PRP（P-PRP）和富含白細胞的 PRP（L-PRP）；該方法目前被行業廣泛接受。另有 PAW 分類法[10]、PLRA 分類法[11]、DEPA 分類法[12]、MARSPILL 分類法[13]等。2018 年國際血栓和止血學會（ISTH）按照血小板活化等級、血小板濃度等級、制備方法等級以及紅細胞、白細胞的形式對不同 PRP 產品進行了相對完整的分類[14]。PRF 在骨缺損和頜面外科中廣泛應用，除了根據是否含有白細胞[5, 8]進行命名外，PRF 又可根據離心速度、時間、離心管材質和激活程度不同進一步分類[15]。從 2003 年開始 PL 作為再生醫學新產品，引起了再生修復領域研究工作者的廣泛興趣。PL 具有促進細胞生長、維持細胞原有良好性狀以及扭轉細胞老化等方面的作用。PL 已作為牛血清替代物廣泛用于細胞規模化培養，成為臨床級別的細胞，特別是干細胞培養的金標準；同時 PL 也可作為單獨治療制劑[16]或聯合細胞共同移植的治療產品，應用于骨科、抗衰老領域[17]；近年來負載人 PL（human PL，hPL）的生物活性材料也成為研究熱點[18]。PL 制備工藝存在濃縮、激活、裂解方式以及是否含有纖維蛋白原的區別，因此命名稍有不同[19-20]。
表1
用于再生修復的血小板衍生物分類
Table1.
Classification of platelet derivatives for regeneration
2 對血小板衍生物發表論文的標準化管理
截止目前，同一類富血小板技術尚無最優制備工藝，獲得的血小板衍生物也無法達到完全一致的應用共識。因此，為方便讀者對研究結果進行理解和比較，在發表研究性論文時完整、準確和規范地描述制備工藝、產品性狀和研究結果尤為重要。既往發表的血小板衍生物研究和應用論文存在以下問題：① 缺乏對制備過程關鍵細節的描述，讀者無法重復實驗結果；② 工藝描述中以百分比或倍數等相對值代替絕對值，讀者無法對不同研究結果比較；③ 終產品中主要成分缺乏量化描述，令讀者無法判斷產品起效機制；④ 使用的語言和命名缺乏準確性和規范性，因此無法判定為何相似報道而研究結論卻相差懸殊等問題。
Chahla 等[21]分析了 105 篇相關論文后發現，只有 11 篇論文完整清晰地描述了制備方案，17 篇論文對最終 PRP 組成進行了量化描述。對于 PRP 的制備過程，有 4% 報道中缺失血液初始體積，78% 報道缺失血液中初始血小板濃度，48% 報道缺失采血用抗凝劑種類，28% 報道未寫明離心機種類，37% 報道中離心參數和時間不完整，36% 報道完全沒有描述 PRP 激活與否。在 PRP 組成方面，僅有 26% 報道分析了 PRP 中血小板濃度，56% 報道以血小板倍數于初始血液的形式體現，13% 報道了 EGF 等細胞因子含量，57% 報道了 PRP 終體積。因此 Chahla 等提出在撰寫富血小板技術文章時，需要將初始血液體積、抗凝劑種類及濃度、制備技術（包括離心機型號、轉子直徑、速度、離心時間）、激活劑種類、最終 PRP 產品中血小板濃度、單核細胞濃度、紅細胞濃度等 7 類參數作為基本參數進行報告。在 PRP 的血小板數量方面，多數研究者習慣以 3～7 倍于初始血液中血小板濃度的方式來報道 PRP 制備工藝，但這種相對標準會因患者基礎血小板濃度的巨大差別［（100～300）×109/L］，造成實際應用效果不同，因此將實際 PRP 中血小板濃度、注射 PRP 體積和到達組織內血小板總數作為重要標準化參數報道顯得尤其重要。
Fadadu 等[22]對比了 33 個制備方案，發現制備工藝差異導致無法從血小板濃度推論關鍵修復因子濃度的高低，因此他建議撰寫血小板衍生物研究與應用文章時，報告參數應盡量全面；同時，他也提出了最低報告參數的概念，其中特別要求將白細胞中的中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞比例作為最低報告參數，關鍵生長因子中將 PDGF-AB、TGF-β1 和 VEGF 含量作為最低報告參數，以便在無全面報告技術細節時也能獲得相對清晰的研究思路。
3 血小板衍生物制備技術的質量標準化管理
血小板衍生物的制備工藝差別很大，導致其質量的標準化管理難度較大。多數文獻推薦采用口徑大的采血針，以防止采血針過細、過長使得血小板在采血過程中即被激活或形成聚集[23]。在采血管選擇上，使用 ACD-A 抗凝劑更有利于防止因血小板聚團對產品質量的影響[24]，而玻璃采血管內壁會導致血液中血小板提前激活。在溫度控制方面，樣本處理過程中低溫可能會影響血小板活性，美國血庫協會（AABB）建議對血小板采集、處理和保存溫度均勿低于 20℃。不良的移液槍使用習慣將造成血小板提前激活，降低有效血小板濃度[25]。在離心操作中，離心速度或離心次數均會造成血小板一定程度激活；適中的離心速度有利于濃縮后血小板分散；離心力超過 800×g 后 TGF-β 釋放濃度將出現下降，而超過 3000×g 將破壞血小板活性。因此，Ozer 等[26]建議采取短時間高速離心或長時間低速離心來保證血小板的穩定。目前有數十家生物醫療技術公司推出了商業化的血小板衍生物制備裝置，采用固定裝置和操作參數，可在一定程度上減少人為操作誤差，更易實現質量標準化管理。呂汝舉等[27]強調了商品化制備裝置的無菌性要求應該符合中國國家藥品監督管理局Ⅲ類器械管理規定。在自體化產品質量控制有難度的情況下，開展同種異體化產品的標準化管理，是未來發展趨勢。Rebulla 等[28]報道了意大利臍血網絡（ITCBN）通過標準化管理制備臍血血小板濃縮物的研究，該組織通過制定標準化離心速度和時間［第 1 次離心（200～210）×g、10～15 min，第 2 次離心（1800～2600）×g、15 min］，統一了 13 家臍血庫制備臍血來源血小板濃縮物的工藝。采用同種異體成人外周血或臍帶血進行 PL 制備，是最具標準化控制可行性的血小板衍生物生產方案[29]。Viau 等[30]對每批次制備 PL 時的供者數量與 hPL 產品間各參數變異率（coefficients of variation，CV）進行研究，通過蛋白組學分析和生物學特性分析，發現將血小板供者數量由 5 個增加至超過 200 個后，hPL 批次之間各參數 CV 值顯著下降，總蛋白 CV 值從 16.06% 降至 4.74%、TGF-β1 從 18.38% 降至 7.92%、IGF-1 從 30.67% 降至 5.51%、VEGF 從 30.80% 降至 6.41%。因此，超過 200 個供者的大規模 hPL 制備具有極強的產品均一化、標準化特性，用 hPL 培養獲得的 BMSCs 比 FBS+bFGF 培養獲得的細胞大小更均一、細胞表面顆粒明顯減少，批次之間細胞表面標志物 CD13、CD44、CD59、CD90 和 CD166 的 CV 值顯著降低。
長期以來，PRP 和 PRF 作為在病床邊分離、制備的自體產品，雖然不涉及病原微生物交叉傳染，但存在操作過程帶來的安全風險。迪拜國家衛生部門（DHA）和加拿大阿爾伯塔省外科醫師學院分別在 2014 年和 2018 年出臺了 PRP 管理指南，均特別強調了操作控制微生物污染的重要性。目前，PL 自體產品在臨床中的應用逐漸增加，其臨床安全控制也成為從研發到轉化的重要一環[31]。同種異體來源的 PL 產品，不管是作為臨床用細胞培養基添加物，還是作為單獨的臨床治療生物制劑，控制傳染性病原體都是質量標準化管理中的首要任務。各類文獻報道中，制備藥品生產質量管理規范（GMP）級別的 PL 產品供者數量在 4～200 個之間[30, 32]，雖然供者數量增加有助于實現 PL 批次之間的質量均一[30]，但也增加了病原體污染風險。因此，2019 年國際血液移植協會（ISBT）細胞治療工作組發表了 hPL 生產全過程質量控制的聲明[33]，建議生產每批次 PL 產品供者數量限制在 10～16 個。聲明同時推薦了一套完整的標準化安全控制流程，包括：① 供者血液層面的嚴格病原微生物檢測、篩選；② 小批量和規模化制備異體 hPL 中的過程病原體檢測、滅活及終產品病原體檢測、滅活。同時，為了實現標準化管理，聲明中推薦了 hPL 終產品的各類檢測參數及其范圍，檢測類別涵蓋無菌、生化分析、免疫學分析，以及 PDGF-AB 和 TGF-β1 兩個重要因子分析等內容，這是專業協會首次對 PL 產品公布的標準化聲明（表 2）。
表2
ISBT 推薦的 hPL 質量標準化管理參數
Table2.
ISBT suggested standardized quality control of hPL
4 血小板衍生物臨床應用的規范化管理
復雜的血小板衍生物組成、多樣的制備工藝以及頗具難度的質量標準化控制，促使富血小板技術領域專業協會也試圖通過分析大數據和積累的經驗，根據不同疾病特點總結并發布臨床應用指南或共識，為更好地發揮產品的臨床價值提供參考。國際細胞醫療學會（ICMS）推薦[34]在臨床應用中血小板激活過程不宜過于強烈，特別是在軟組織修復中，可以不采用體外激活方式，而是通過組織中膠原對血小板自發激活方式，實現生物活性因子連續 3 d 釋放。同時 ICMS 將富血小板產物應用的禁忌證分為絕對禁忌證和相對禁忌證，并在醫生培訓、用針、隨訪、風險等方面均進行了規范性描述。2018 年，中國醫療保健國際交流促進會骨科分會提出了 PRP 在骨關節外科中應用的專家共識[35]，共識提出了盡量使用新鮮制備的 PRP，采用直視或者利用超聲引導方式向關節腔內多次注射 PRP 產品，每次注射劑量為 3～5 mL 等建議。同年，該學會按照循證醫學證據，還發布了治療膝骨關節炎的臨床實踐指南[8]，指南中提到關節腔內注射 PRP 更適用于年輕、嚴重程度輕的膝骨關節炎患者；關節注射次數不少于 2 次，間隔時間不少于 1 周；針對伴有關節腔積液的膝骨關節炎患者，建議抽吸積液后再接受關節腔注射治療。在臨床應用適應證方面，Le 等[3]根據文獻報道的臨床研究結果，建議采用富含白細胞的 PRP 治療肱骨外上髁炎，而去白細胞 PRP 更適用于骨關節炎的治療。
在臨床應用政策監管方面，美國食品藥品監督管理局（FDA）對 PRP 的制備套裝按照醫療器械 510（K）實施放行管理[36]，對用于臨床細胞培養添加物的 PL 按照細胞培養輔助成分進行分類和風險管理[33]。中國國家藥品監督管理局對 PRP 制備用套裝按照Ⅲ類醫療器械進行審批管理[27]。歐盟將 PRP、PRF 按照血液成分的制備、使用和質量保證方式管理[37]，將用于臨床細胞培養的 PL 按照藥典中生物來源的原材料進行管理[38]。作為歐盟成員之一的西班牙，在歐盟規范基礎上，2015 年更是將 PRP 提升至按藥物進行管理[39-40]。日本厚生勞動省則根據再生醫學產品安全法案將 PC 按照以細胞為基礎的醫學產品中第三風險級別（涉及細胞的、進行最小操作的低風險治療產品）進行管理[41]。由此看來，目前大多數國家是按照自體醫療技術對自體富血小板產品進行管理，部分國家逐漸開始建立新的更趨向于藥物管理的方式進行監管，而對更易實現質量標準化、制備規模化的同種異體 PL 產品，按照再生醫學藥物管理模式的方向發展[33]。
5 總結
血小板衍生物含有 PDGF、TGF-β、FGF、EGF、IGF 和 VEGF 等大量促進細胞生長、趨化、黏附、免疫調節和組織修復成分，屬于再生醫學技術產品。PRP 和 PRF 長期被用于骨科、皮膚損傷、頜面外科、神經損傷等領域的組織修復和再生，而 PL 作為血小板衍生物家族的新成員在細胞培養和組織損傷修復中發揮越來越大的作用。血小板衍生物由于受供者差異、操作個性化強、工藝參數差距大等因素影響，其標準化和量化控制問題一直是制約臨床效果的關鍵。采用標準化命名和標準化撰寫報告系統，將促進研究者報道的準確性和完整性，從而獲得可重復性驗證；采用良好操作模式以及質量標準化控制，并利用產品異體化來獲得安全性和穩定性效果，是血小板衍生物實現量化、標準化以及從技術發展為再生醫學藥物的必經之路。
作者貢獻：謝興琴負責稿件撰寫；張怡負責綜述構思、設計和邏輯把控；趙新新負責文獻檢索；劉瞳昕負責資料歸納、整理；孫麗萍負責修訂、校對。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費沒有影響文章觀點。
血小板具有凝血和組織修復兩大類功能。血小板衍生物是一類體外提取血小板經特殊工藝制成活性生物制劑后，用于組織再生修復的醫療技術產品。將外周血通過離心或者富集作用獲得的高度濃縮血小板（platelet concentrate，PC）進行有效激活，可促使 α 顆粒釋放多種蛋白質，進而應用于組織再生修復中。激活過程可釋放超過 4000 種蛋白[1]，基因信息分析發現其中至少有 125 種蛋白參與損傷修復過程[2]，包括 PDGF、TGF-β、FGF、EGF、IGF 和 VEGF 等促進細胞生長、趨化、黏附和免疫調節的生物活性物質。這種源于血小板的高度復雜活性生物制劑可用于局部損傷組織，尤其是人體血液達不到或供血不良的位置，通過協同作用刺激細胞的增殖、分化與遷移，并增強細胞外基質的合成和分泌能力，達到對多種機體損傷原位修復與再生重建的目的[3-4]。
從 1954 年開始發展起來的富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP），到富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）[5]，再到近年來組織工程修復中最前沿產品血小板裂解液（platelet lysates，PL）[6]，這些血小板衍生物逐漸從一種由臨床醫生根據經驗在病床邊自行制備的技術，走向規范化生產和應用的生物制劑或藥物。PRP 一般是血液經過 2 次離心后，去掉大部分紅細胞和乏血小板血漿后獲得，可直接應用，也可采用凝血酶、氯化鈣或膠原等激活成為 PRP 凝膠后應用。PRF 是一種將無抗凝劑的血液經離心激發血液凝集成膠后的富含血小板的纖維蛋白凝膠。由于此過程不添加任何外源物質激活，其制作工藝較 PRP 有很大優勢，因而被稱為第 2 代富血小板技術。PL 是將人血液進行血小板富集，或用采集而未回輸的 5～7 d 濃縮血小板經多步處理，最后裂解激活，充分釋放血小板顆粒和膜性結構中各種營養成分，被稱為第 3 代富血小板技術。因不同研究者在制作過程中采用的采集方式、離心次數、激活方法、治療療程、應用方式以及是否含有白細胞、是否做成凝膠、血小板濃縮倍數和關鍵活性物質濃度等參數有很大區別，加之供體存在個體差異，造成富血小板技術獲得的血小板衍生物終產品成分差別很大，極易導致同一類富血小板產品應用于同一種疾病時治療效果有很大差別[7]。另外，缺少技術規范成為富血小板技術和產品發展的瓶頸問題，因此近年來醫療行業對多成分活性生物制劑標準化和質量均一控制的需求迫切，在一些國家已經逐步建立相應的管理要求和規范[8]。本文將從分類命名的標準化管理、對血小板衍生物發表論文的標準化管理、血小板衍生物制備技術的質量標準化管理及血小板衍生物臨床應用的規范化管理 4 個方面，對血小板衍生物在組織再生研究和應用中的標準化管理進行綜述。
1 分類命名的標準化管理
由于制備工藝和關鍵組成成分的復雜性，不同研究者試圖通過標準化命名和分類，對血小板衍生物進行標準化管理和比較。2009 年—2020 年，多位研究者從制備工藝角度對血小板衍生物進行分類，見表 1。Dohan 等[9]根據產品中是否含有白細胞將血小板衍生物分為不含白細胞的純 PRP（P-PRP）和富含白細胞的 PRP（L-PRP）；該方法目前被行業廣泛接受。另有 PAW 分類法[10]、PLRA 分類法[11]、DEPA 分類法[12]、MARSPILL 分類法[13]等。2018 年國際血栓和止血學會（ISTH）按照血小板活化等級、血小板濃度等級、制備方法等級以及紅細胞、白細胞的形式對不同 PRP 產品進行了相對完整的分類[14]。PRF 在骨缺損和頜面外科中廣泛應用，除了根據是否含有白細胞[5, 8]進行命名外，PRF 又可根據離心速度、時間、離心管材質和激活程度不同進一步分類[15]。從 2003 年開始 PL 作為再生醫學新產品，引起了再生修復領域研究工作者的廣泛興趣。PL 具有促進細胞生長、維持細胞原有良好性狀以及扭轉細胞老化等方面的作用。PL 已作為牛血清替代物廣泛用于細胞規模化培養，成為臨床級別的細胞，特別是干細胞培養的金標準；同時 PL 也可作為單獨治療制劑[16]或聯合細胞共同移植的治療產品，應用于骨科、抗衰老領域[17]；近年來負載人 PL（human PL，hPL）的生物活性材料也成為研究熱點[18]。PL 制備工藝存在濃縮、激活、裂解方式以及是否含有纖維蛋白原的區別，因此命名稍有不同[19-20]。
表1
用于再生修復的血小板衍生物分類
Table1.
Classification of platelet derivatives for regeneration
2 對血小板衍生物發表論文的標準化管理
截止目前，同一類富血小板技術尚無最優制備工藝，獲得的血小板衍生物也無法達到完全一致的應用共識。因此，為方便讀者對研究結果進行理解和比較，在發表研究性論文時完整、準確和規范地描述制備工藝、產品性狀和研究結果尤為重要。既往發表的血小板衍生物研究和應用論文存在以下問題：① 缺乏對制備過程關鍵細節的描述，讀者無法重復實驗結果；② 工藝描述中以百分比或倍數等相對值代替絕對值，讀者無法對不同研究結果比較；③ 終產品中主要成分缺乏量化描述，令讀者無法判斷產品起效機制；④ 使用的語言和命名缺乏準確性和規范性，因此無法判定為何相似報道而研究結論卻相差懸殊等問題。
Chahla 等[21]分析了 105 篇相關論文后發現，只有 11 篇論文完整清晰地描述了制備方案，17 篇論文對最終 PRP 組成進行了量化描述。對于 PRP 的制備過程，有 4% 報道中缺失血液初始體積，78% 報道缺失血液中初始血小板濃度，48% 報道缺失采血用抗凝劑種類，28% 報道未寫明離心機種類，37% 報道中離心參數和時間不完整，36% 報道完全沒有描述 PRP 激活與否。在 PRP 組成方面，僅有 26% 報道分析了 PRP 中血小板濃度，56% 報道以血小板倍數于初始血液的形式體現，13% 報道了 EGF 等細胞因子含量，57% 報道了 PRP 終體積。因此 Chahla 等提出在撰寫富血小板技術文章時，需要將初始血液體積、抗凝劑種類及濃度、制備技術（包括離心機型號、轉子直徑、速度、離心時間）、激活劑種類、最終 PRP 產品中血小板濃度、單核細胞濃度、紅細胞濃度等 7 類參數作為基本參數進行報告。在 PRP 的血小板數量方面，多數研究者習慣以 3～7 倍于初始血液中血小板濃度的方式來報道 PRP 制備工藝，但這種相對標準會因患者基礎血小板濃度的巨大差別［（100～300）×109/L］，造成實際應用效果不同，因此將實際 PRP 中血小板濃度、注射 PRP 體積和到達組織內血小板總數作為重要標準化參數報道顯得尤其重要。
Fadadu 等[22]對比了 33 個制備方案，發現制備工藝差異導致無法從血小板濃度推論關鍵修復因子濃度的高低，因此他建議撰寫血小板衍生物研究與應用文章時，報告參數應盡量全面；同時，他也提出了最低報告參數的概念，其中特別要求將白細胞中的中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞比例作為最低報告參數，關鍵生長因子中將 PDGF-AB、TGF-β1 和 VEGF 含量作為最低報告參數，以便在無全面報告技術細節時也能獲得相對清晰的研究思路。
3 血小板衍生物制備技術的質量標準化管理
血小板衍生物的制備工藝差別很大，導致其質量的標準化管理難度較大。多數文獻推薦采用口徑大的采血針，以防止采血針過細、過長使得血小板在采血過程中即被激活或形成聚集[23]。在采血管選擇上，使用 ACD-A 抗凝劑更有利于防止因血小板聚團對產品質量的影響[24]，而玻璃采血管內壁會導致血液中血小板提前激活。在溫度控制方面，樣本處理過程中低溫可能會影響血小板活性，美國血庫協會（AABB）建議對血小板采集、處理和保存溫度均勿低于 20℃。不良的移液槍使用習慣將造成血小板提前激活，降低有效血小板濃度[25]。在離心操作中，離心速度或離心次數均會造成血小板一定程度激活；適中的離心速度有利于濃縮后血小板分散；離心力超過 800×g 后 TGF-β 釋放濃度將出現下降，而超過 3000×g 將破壞血小板活性。因此，Ozer 等[26]建議采取短時間高速離心或長時間低速離心來保證血小板的穩定。目前有數十家生物醫療技術公司推出了商業化的血小板衍生物制備裝置，采用固定裝置和操作參數，可在一定程度上減少人為操作誤差，更易實現質量標準化管理。呂汝舉等[27]強調了商品化制備裝置的無菌性要求應該符合中國國家藥品監督管理局Ⅲ類器械管理規定。在自體化產品質量控制有難度的情況下，開展同種異體化產品的標準化管理，是未來發展趨勢。Rebulla 等[28]報道了意大利臍血網絡（ITCBN）通過標準化管理制備臍血血小板濃縮物的研究，該組織通過制定標準化離心速度和時間［第 1 次離心（200～210）×g、10～15 min，第 2 次離心（1800～2600）×g、15 min］，統一了 13 家臍血庫制備臍血來源血小板濃縮物的工藝。采用同種異體成人外周血或臍帶血進行 PL 制備，是最具標準化控制可行性的血小板衍生物生產方案[29]。Viau 等[30]對每批次制備 PL 時的供者數量與 hPL 產品間各參數變異率（coefficients of variation，CV）進行研究，通過蛋白組學分析和生物學特性分析，發現將血小板供者數量由 5 個增加至超過 200 個后，hPL 批次之間各參數 CV 值顯著下降，總蛋白 CV 值從 16.06% 降至 4.74%、TGF-β1 從 18.38% 降至 7.92%、IGF-1 從 30.67% 降至 5.51%、VEGF 從 30.80% 降至 6.41%。因此，超過 200 個供者的大規模 hPL 制備具有極強的產品均一化、標準化特性，用 hPL 培養獲得的 BMSCs 比 FBS+bFGF 培養獲得的細胞大小更均一、細胞表面顆粒明顯減少，批次之間細胞表面標志物 CD13、CD44、CD59、CD90 和 CD166 的 CV 值顯著降低。
長期以來，PRP 和 PRF 作為在病床邊分離、制備的自體產品，雖然不涉及病原微生物交叉傳染，但存在操作過程帶來的安全風險。迪拜國家衛生部門（DHA）和加拿大阿爾伯塔省外科醫師學院分別在 2014 年和 2018 年出臺了 PRP 管理指南，均特別強調了操作控制微生物污染的重要性。目前，PL 自體產品在臨床中的應用逐漸增加，其臨床安全控制也成為從研發到轉化的重要一環[31]。同種異體來源的 PL 產品，不管是作為臨床用細胞培養基添加物，還是作為單獨的臨床治療生物制劑，控制傳染性病原體都是質量標準化管理中的首要任務。各類文獻報道中，制備藥品生產質量管理規范（GMP）級別的 PL 產品供者數量在 4～200 個之間[30, 32]，雖然供者數量增加有助于實現 PL 批次之間的質量均一[30]，但也增加了病原體污染風險。因此，2019 年國際血液移植協會（ISBT）細胞治療工作組發表了 hPL 生產全過程質量控制的聲明[33]，建議生產每批次 PL 產品供者數量限制在 10～16 個。聲明同時推薦了一套完整的標準化安全控制流程，包括：① 供者血液層面的嚴格病原微生物檢測、篩選；② 小批量和規模化制備異體 hPL 中的過程病原體檢測、滅活及終產品病原體檢測、滅活。同時，為了實現標準化管理，聲明中推薦了 hPL 終產品的各類檢測參數及其范圍，檢測類別涵蓋無菌、生化分析、免疫學分析，以及 PDGF-AB 和 TGF-β1 兩個重要因子分析等內容，這是專業協會首次對 PL 產品公布的標準化聲明（表 2）。
表2
ISBT 推薦的 hPL 質量標準化管理參數
Table2.
ISBT suggested standardized quality control of hPL
4 血小板衍生物臨床應用的規范化管理
復雜的血小板衍生物組成、多樣的制備工藝以及頗具難度的質量標準化控制，促使富血小板技術領域專業協會也試圖通過分析大數據和積累的經驗，根據不同疾病特點總結并發布臨床應用指南或共識，為更好地發揮產品的臨床價值提供參考。國際細胞醫療學會（ICMS）推薦[34]在臨床應用中血小板激活過程不宜過于強烈，特別是在軟組織修復中，可以不采用體外激活方式，而是通過組織中膠原對血小板自發激活方式，實現生物活性因子連續 3 d 釋放。同時 ICMS 將富血小板產物應用的禁忌證分為絕對禁忌證和相對禁忌證，并在醫生培訓、用針、隨訪、風險等方面均進行了規范性描述。2018 年，中國醫療保健國際交流促進會骨科分會提出了 PRP 在骨關節外科中應用的專家共識[35]，共識提出了盡量使用新鮮制備的 PRP，采用直視或者利用超聲引導方式向關節腔內多次注射 PRP 產品，每次注射劑量為 3～5 mL 等建議。同年，該學會按照循證醫學證據，還發布了治療膝骨關節炎的臨床實踐指南[8]，指南中提到關節腔內注射 PRP 更適用于年輕、嚴重程度輕的膝骨關節炎患者；關節注射次數不少于 2 次，間隔時間不少于 1 周；針對伴有關節腔積液的膝骨關節炎患者，建議抽吸積液后再接受關節腔注射治療。在臨床應用適應證方面，Le 等[3]根據文獻報道的臨床研究結果，建議采用富含白細胞的 PRP 治療肱骨外上髁炎，而去白細胞 PRP 更適用于骨關節炎的治療。
在臨床應用政策監管方面，美國食品藥品監督管理局（FDA）對 PRP 的制備套裝按照醫療器械 510（K）實施放行管理[36]，對用于臨床細胞培養添加物的 PL 按照細胞培養輔助成分進行分類和風險管理[33]。中國國家藥品監督管理局對 PRP 制備用套裝按照Ⅲ類醫療器械進行審批管理[27]。歐盟將 PRP、PRF 按照血液成分的制備、使用和質量保證方式管理[37]，將用于臨床細胞培養的 PL 按照藥典中生物來源的原材料進行管理[38]。作為歐盟成員之一的西班牙，在歐盟規范基礎上，2015 年更是將 PRP 提升至按藥物進行管理[39-40]。日本厚生勞動省則根據再生醫學產品安全法案將 PC 按照以細胞為基礎的醫學產品中第三風險級別（涉及細胞的、進行最小操作的低風險治療產品）進行管理[41]。由此看來，目前大多數國家是按照自體醫療技術對自體富血小板產品進行管理，部分國家逐漸開始建立新的更趨向于藥物管理的方式進行監管，而對更易實現質量標準化、制備規模化的同種異體 PL 產品，按照再生醫學藥物管理模式的方向發展[33]。
5 總結
血小板衍生物含有 PDGF、TGF-β、FGF、EGF、IGF 和 VEGF 等大量促進細胞生長、趨化、黏附、免疫調節和組織修復成分，屬于再生醫學技術產品。PRP 和 PRF 長期被用于骨科、皮膚損傷、頜面外科、神經損傷等領域的組織修復和再生，而 PL 作為血小板衍生物家族的新成員在細胞培養和組織損傷修復中發揮越來越大的作用。血小板衍生物由于受供者差異、操作個性化強、工藝參數差距大等因素影響，其標準化和量化控制問題一直是制約臨床效果的關鍵。采用標準化命名和標準化撰寫報告系統，將促進研究者報道的準確性和完整性，從而獲得可重復性驗證；采用良好操作模式以及質量標準化控制，并利用產品異體化來獲得安全性和穩定性效果，是血小板衍生物實現量化、標準化以及從技術發展為再生醫學藥物的必經之路。
作者貢獻：謝興琴負責稿件撰寫；張怡負責綜述構思、設計和邏輯把控；趙新新負責文獻檢索；劉瞳昕負責資料歸納、整理；孫麗萍負責修訂、校對。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費沒有影響文章觀點。
