引用本文： 張野, 夏輝強, 易威威, 藍海洋, 楊智杰, 韓非, 唐盼, 劉渤. 鋅指蛋白 A20 對兔腰椎間盤退變影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(3): 366-374. doi: 10.7507/1002-1892.202009057 復制
腰椎間盤退變是脊柱退行性疾病發生發展的重要原因，已有研究表明細胞外基質丟失、椎間盤細胞過度凋亡和炎癥反應在椎間盤退變過程中發揮重要作用[1-3]。其中，過量炎癥因子的產生不僅抑制細胞外基質合成，還會促進椎間盤髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPCs）凋亡，最終導致椎間盤退變[4]。目前，臨床常用的腰椎間盤退變治療方式只能在一定程度上緩解患者臨床癥狀，無法延緩或者逆轉椎間盤退變。隨著對椎間盤退變分子生物學研究的深入，通過促進 NPCs 細胞外基質合成或抑制其降解，進而延緩或者逆轉椎間盤退變，成為一種具有前景的治療方式[5]。
鋅指蛋白 A20 又被稱為 TNF-α 誘導蛋白 3（tumor necrosis factor alpha induced protein 3，TNFAIP3）[6]，是一類重要的細胞內源性保護蛋白。它主要通過一系列反應發揮去泛素化作用，從而對炎癥反應、免疫應答、細胞凋亡等進行調控。鋅指蛋白 A20 也是 NF-κB 活化的下游產物，能直接負反饋調節 NF-κB 通路的激活[7]。研究表明，鋅指蛋白 A20 基因缺失會導致機體發生極其嚴重的炎癥反應[8-9]，而過表達鋅指蛋白 A20 基因可調控 NF-κB 通路的活性，從而抑制炎癥反應[10]，這也提示該基因在機體抵抗炎癥反應中發揮了重要作用。
本課題組前期體外實驗發現，過表達鋅指蛋白 A20 基因可有效抑制 NF-κB 通路活性以及炎癥反應，從而延緩椎間盤退變[11]。本次研究旨在通過動物體內實驗，進一步明確鋅指蛋白 A20 表達對椎間盤退變的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3 月齡新西蘭大白兔 26 只，體質量 2.0～2.5 kg，雌雄不限，由重慶醫科大學動物實驗中心提供。
鋅指蛋白 A20 過表達腺病毒 pHBAd-EF1-MCS-GFP/TNFAIP3、空載體腺病毒 pHBAd-EF1-MCS-GFP、鋅指蛋白 A20 干擾腺病毒 pHBAd-EF1-MCS-GFP/sh-RNA-TNFAIP3，均由漢恒生物科技（上海）有限公司構建、測序并進行重組腺病毒的包裝，病毒滴度為 1×1010 PFU/mL。
阿利辛藍染色液（武漢博士德生物工程有限公司）；鋅指蛋白 A20 抗體（北京安諾倫生物科技有限公司）；P65、磷酸化 P65（phosphate P65，P-P65）和Ⅱ型膠原抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；蛋白聚糖抗體（Roche 公司，瑞士）；β-actin 抗體（北京博奧龍免疫技術有限公司）；免疫組織化學染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
MRI 機（Siemens 公司，德國）；18G 腰椎穿刺針、微量進樣器（上海玉研科學儀器有限公司）；RadiAnt DICOM Viewer 軟件（Medixant 公司，波蘭）；Image J 軟件（美國國立衛生研究院）；Fusion 軟件（VILBER 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（上海光密儀器有限公司）。
1.2 兔腰椎間盤退變模型的制備
26 只實驗兔取仰臥位并四肢固定，肌肉注射速眠新Ⅱ（0.2 mL/kg）聯合耳緣靜脈注射 10% 水合氯醛（1.0～1.5 mL/kg）麻醉。常規備皮消毒，取肋弓下緣至髂嵴水平腹部正中切口約 8 cm，逐層切開至腹腔。將腸管向右側翻出并用紗布覆蓋，暴露左側腹腔，自左側輸尿管及腹主動脈中間分離后腹膜，充分暴露左腎靜脈；左腎靜脈與下腔靜脈交匯處對應 L3 椎體，以此為定位標志，其下方第 1 個椎間盤即為 L3、4 椎間盤；分離椎體前方肌肉，依次暴露 L3、4、L4、5、L5、6 椎間盤，并用 18G 腰椎穿刺針依次穿刺，具體方法為于纖維環前方中點平行終板刺入，深度 5 mm，維持 5 s 后拔出穿刺針，見髓核組織沿穿刺孔道漏出提示穿刺成功，逐層縫合切口。
實驗動物術后當天禁飲食，術后第 1 天起正常飲食，連續 3 d 肌肉注射青霉素鈉 20 萬 U 預防感染，定期換藥。除 2 只動物因術中麻醉意外死亡外，其余 24 只術后 4 周復查 MRI 示處理節段髓核信號減弱并伴有高信號區域面積縮小，其余節段椎間盤髓核信號保持高亮狀態，提示腰椎間盤退變模型制備成功進行后續實驗。見圖1。
圖1
MRI 檢查腰椎間盤退變（箭頭）
Figure1.
MRI examination of lumbar intervertebral disc degene ration (arrow)
1.3 實驗分組及方法
將 24 只腰椎間盤退變動物模型隨機分為 4 組（n=6），分別為過表達 A20 組（鋅指蛋白 A20 過表達腺病毒）、空載體組（空載體腺病毒）、對照組（PBS 液）以及干擾 A20 組（鋅指蛋白 A20 干擾腺病毒）。
同 1.2 方法暴露 L3、4、L4、5、L5、6 椎間盤，應用微量進樣器將對應病毒液或 PBS 液注射至退變椎間盤內，每個椎間盤注射 10 μL，注射時間 3 min，進針深度 5 mm。
1.4 觀測指標
1.4.1 生物反應綜合評分
于注射前 1 d 及注射后 1、2、3、6 d，對各組實驗動物進行生物反應綜合評分。評價標準[12]：精神情況，神情機敏 2 分、神情緩慢 1 分、神情遲滯 0 分；進飲食量，正常 2 分、減半 1 分、極少或無進食 0 分；活動量，活動自如 2 分、活動適中 1 分、活動明顯減少 0 分；對外界刺激反應，反應明顯 2 分、不明顯 1 分、無反應 0 分。以上項目得分總和即為綜合評分。
1.4.2 MRI 觀測
注射后 2、4、8 周，各組實驗動物行正中矢狀位 MRI 檢查，評價椎間盤退變程度。具體參數：采用多重回波自旋回波序列，重復時間 2 500 ms，恢復時間 87.9 ms，矩陣 256×256，視野 170 mm，激勵次數 2 次，掃描層厚 1.5 mm、間隔 0.5 mm，總掃描時間 4 min 17 s。采用 RadiAnt DICOM Viewer 軟件測量各椎間盤 T2 弛豫時間（T2 信號值）。
MRI 觀察示注射后 2 周各組椎間盤退變不明顯，而 8 周時干擾 A20 組、對照組以及空載體組出現嚴重椎間盤退變，椎間隙明顯狹窄，導致實驗取材尤其是組織總蛋白提取困難，故后續組織學觀察取 4、8 周標本，免疫組織化學染色以及 Western blot 檢測僅取 4 周標本。
1.4.3 組織學觀察
注射后 4、8 周采用空氣栓塞法處死實驗動物，按照原腹部切口入路，完整切取 L3、4、L4、5、L5、6 椎間盤組織，置于 4% 多聚甲醛固定 48 h，10%EDTA 脫鈣液脫鈣處理 20 d，脫水，石蠟包埋后切片（片厚 5 μm）。各組取部分切片行阿利辛藍染色，倒置相差顯微鏡下觀察，使用 Image J 軟件測量椎間盤內蛋白聚糖陽性區域。
1.4.4 免疫組織化學染色觀察
取各組注射后 4 周部分切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，枸櫞酸鈉鹽抗原修復（95℃，15 min），純山羊血清封閉 10～15 min；滴加鋅指蛋白 A20、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原一抗（1∶50），4℃ 孵育過夜；滴加生物素二抗；DAB 顯色液（1∶20）室溫顯色，固定，封片，倒置相差顯微鏡下觀察，使用 Image J 軟件測量椎間盤內鋅指蛋白 A20、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原陽性區域，作為對應蛋白的表達水平。
1.4.5 Western blot 檢測
取各組注射后 4 周椎間盤髓核組織，利用液氮反復研磨，加入 RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度并配平，以蛋白上樣緩沖液混合煮沸 15 min 后上樣。取 30 μg 蛋白總量上樣，10% SDS-PAGE 膠電泳恒壓分離，250 mA 恒流轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉 2 h，加鋅指蛋白 A20、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原、P65、P-P65、TNF-α、IL-1β、LC3（LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ）、P62 一抗（1∶1 000），4℃ 孵育過夜；TBST 洗膜，加入相應二抗（1∶1 000），室溫孵育 2 h，TBST 洗膜，ECL 發光。采用 Fusion 軟件分析條帶，以目標蛋白與 β-actin 吸光度（A）值的比值作為其蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 生物反應綜合評分
各組實驗動物均存活至實驗完成。各組注射后各時間點生物反應綜合評分均明顯低于注射前 1 d，注射后組內生物反應綜合評分隨時間延長逐漸增高，差異均有統計學意義（P<0.05）。
各組注射前 1 d 生物反應綜合評分比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。注射后 1、2、3 d 比較，差異亦無統計學意義（P>0.05）；注射后 6 d 干擾 A20 組生物反應綜合評分明顯低于其他組，差異有統計學意義（P<0.05），其他組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），見圖2。
圖2
各組生物綜合反應評分比較
Figure2.
Comparison of comprehensive score of biological response between groups
2.2 MRI 觀測
MRI 檢查示注射后 2 周，各組椎間盤均無明顯退變；4 周后各組均出現明顯的椎間盤退變，8 周時與過表達 A20 組相比，其他組均見嚴重的椎間盤退變反應，椎間隙明顯狹窄。見圖3。
圖3
注射后各時間點各組 MRI 觀察
從左至右分別為過表達 A20 組、空載體組、對照組、干擾 A20 組 a. 注射后 2 周；b. 注射后 4 周；c. 注射后 8 周
Figure3. MRI observation of each group at each time point after injectionFrom left to right for Ov-A20 group, NC group, control group, and ShRNA-A20 group a. At 2 weeks after injection; b. At 4 weeks after injection; c. At 8 weeks after injection
注射后 2、4 周，過表達 A20 組 T2 信號值最高，干擾 A20 組最低，與其他各組相比差異有統計學意義（P<0.05），空載體組與對照組間差異無統計學意義（P>0.05）；注射后 8 周，過表達 A20 組 T2 信號值仍明顯高于其他組（P<0.05），而空載體組、對照組及干擾 A20 組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖4。
圖4
注射后各時間點各組 T2 信號值
Figure4.
T2 signal value of each group at each time point after injection
2.3 組織學觀察
注射后 4 周，過表達 A20 組中椎間盤髓核組織周圍含有豐富的蛋白聚糖且呈彌漫性分布，顯著高于其他組（P<0.05）；干擾 A20 組中蛋白聚糖含量較少，顯著低于其他組（P<0.05）；對照組與空載體組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。注射后 8 周，過表達 A20 組蛋白聚糖含量仍顯著高于其他組（P<0.05），其他組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖5、6。
圖5
注射后各組阿利辛藍染色觀察（×100）
從左至右分別為過表達 A20 組、空載體組、對照組、干擾 A20 組 a. 注射后 4 周；b. 注射后 8 周
Figure5. Alician blue staining observation of each group after injection (×100)From left to right for Ov-A20 group, NC group, control group, and ShRNA-A20 group a. At 4 weeks after injection; b. At 8 weeks after injection
圖6
注射后各組椎間盤組織中蛋白聚糖表達
Figure6.
The expression of aggrecan in intervertebral disc tissues of each group after injection
2.4 免疫組織化學染色觀察
注射后 4 周，過表達 A20 組鋅指蛋白 A20、Ⅱ型膠原、蛋白聚糖表達較對照組、空載體組、干擾 A20 組明顯增高，干擾 A20 組上述蛋白表達較其他組明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；空載體組與對照組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖7、8。
圖7
注射后 4 周各組免疫組織化學染色觀察（×200）
從左至右分別為過表達 A20 組、空載體組、對照組、干擾 A20 組 a. 鋅指蛋白 A20；b. Ⅱ型膠原；c. 蛋白聚糖
Figure7. Immunohistochemical staining of each group at 4 weeks after injection (×200)From left to right for Ov-A20 group, NC group, control group, and ShRNA-A20 group a. Zinc finger protein A20; b. Collagen Ⅱ; c. Aggrecan
圖8
注射后 4 周各組鋅指蛋白 A20、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原 表達
Figure8.
Expressions of zinc finger protein A20, collagen Ⅱ, and aggrecan in each group at 4 weeks after injection
2.5 Western blot 檢測
注射后 4 周，鋅指蛋白 A20、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相對表達量過表達 A20 組最高、干擾 A20 組最低，而 P-P65、TNF-α、IL-1β、P62 蛋白相對表達量過表達 A20 組最低、干擾 A20 組最高，與其他組比較差異均有統計學意義（P<0.05）；空載體組與對照組上述蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。各組 P65 蛋白相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖9。
圖9
注射后 4 周 Western blot 檢測各組目的蛋白表達
a. 條帶圖 1：過表達 A20 組 2：空載體組 3：對照組 4：干擾 A20 組；b. 目的蛋白相對表達量
Figure9. The expressions of target proteins by Western blot at 4 weeks after injectiona. Electrophoretogram 1: Ov-A20 group 2: NC group3: Control group 4: ShRNA-A20 group; b. Relative expression of target protein
3 討論
腰椎間盤退變的細胞學表現為退變椎間盤內 NPCs 功能降低和數量減少，軟骨相關特異基因的產物（如蛋白聚糖、Ⅱ型膠原等功能性基質大分子）合成下降[13]，最終導致椎間盤機械應力功能及維持椎間隙高度的生物學功能喪失。大量研究表明炎癥反應是引起椎間盤退變的重要因素之一[14-15]，因此找到炎癥信號傳導途徑的關鍵靶點，阻斷炎癥信號傳導通路，可能成為控制椎間盤退變的一種有效方法。
鋅指蛋白 A20 是一類特殊的細胞內源性保護蛋白，能夠抑制 NF-κB 活性以及負反饋調控多種信號傳導途徑介導的炎癥反應[16]。相關研究發現，鋅指蛋白 A20 缺陷小鼠表現出嚴重自發性多器官炎癥反應、惡病質和圍產期死亡[17-18]。Li 等[19]研究發現，鋅指蛋白 A20 過表達小鼠可以抑制炎癥介質的產生，從而防止狼瘡性炎癥導致的腎臟損傷。因此，鋅指蛋白 A20 對預防體內炎癥反應至關重要，是機體不可或缺的重要組成成分。
本研究采用經腹細針穿刺法制備兔腰椎間盤退變模型，MRI 觀察提示腰椎間盤退變模型制備成功。采用鋅指蛋白 A20 過表達腺病毒以及干擾腺病毒分別轉染 NPCs，使其過表達以及干擾鋅指蛋白 A20 基因。為觀察鋅指蛋白 A20 的轉染效率，我們采用免疫組織化學染色及 Western blot 檢測了各組鋅指蛋白 A20 表達情況，結果提示相較于對照組，過表達 A20 組中鋅指蛋白 A20 表達明顯增高，干擾 A20 組中表達降低，表明通過腺病毒轉染兔退變 NPCs 能夠成功過表達或者干擾鋅指蛋白 A20 基因的表達。
經分組處理后，我們發現注射后 6 d 干擾 A20 組實驗動物生物反應綜合評分顯著低于其他組，分析可能是該組實驗動物腰椎間盤退變程度較其他組嚴重，進而影響了行為反應能力。MRI 檢測示各時間點過表達 A20 組 T2 信號值均顯著高于其他組，而干擾 A20 組最低，結合生物反應綜合評分分析干擾鋅指蛋白 A20 表達后，實驗早期動物椎間盤即可發生嚴重退變。這表明鋅指蛋白 A20 作為一種內源性保護蛋白，在椎間盤退變過程中起到了重要作用。但隨時間延長，過表達 A20 組 T2 信號值會有不同程度降低，表明鋅指蛋白 A20 作用的局限性，即作為一種基因治療手段，通過腺病毒轉染使兔 NPCs 過表達鋅指蛋白 A20 僅能在一定程度上延緩椎間盤退變，但無法起到逆轉作用。
NF-κB 是一種多功能轉錄因子，屬于 NF-κB/REL 蛋白家族成員。哺乳動物有 5 個亞基，但最常見形式為 P65/P50 二聚體復合物，在細胞炎癥反應、細胞增殖與凋亡中起到重要作用[20]。NF-κB 通常以不活躍形式存在于細胞質中，在各種炎癥因子如 IL-1β、IL-6、TNF-α 的刺激下，NF-κB 會迅速轉移到細胞核，調節靶基因的轉錄和表達。而各種炎癥刺激均可誘導鋅指蛋白 A20 表達。本研究通過檢測細胞中 P65、P-P65 以及炎癥因子 TNF-α、IL-1β 的表達，來進一步探索炎癥與椎間盤退變的關系。結果顯示相較于對照組，干擾 A20 組的 P-P65、TNF-α、IL-1β 蛋白表達顯著增加，說明干擾鋅指蛋白 A20 基因表達會顯著增加 NF-κB 通路的活性，導致組織內部發生嚴重炎癥反應。與此同時，過表達 A20 組 P-P65、TNF-α、IL-1β 蛋白表達則出現相反情況，表明鋅指蛋白 A20 對 NF-κB 的活化具有重要的負性調節作用，過表達鋅指蛋白 A20 基因能夠有效抑制炎性通路，弱化炎癥反應。Yi 等[21]研究發現，通過抑制 NF-κB 活性能有效抑制人椎間盤 NPCs 內的炎癥反應、促進細胞內自噬以及抑制細胞凋亡的發生，最終達到延緩椎間盤退變的目的。
同時，阿利辛藍染色顯示各組椎間盤均有不同程度退變，其中過表達 A20 組退變程度較輕，而干擾 A20 組退變尤為顯著。免疫組織化學染色及 Western blot 檢測轉染病毒后細胞退變相關指標，結果顯示過表達 A20 組的Ⅱ型膠原、蛋白聚糖表達顯著增高，而干擾 A20 組表達顯著降低，表明鋅指蛋白 A20 對調控 NPCs 退變具有重要作用，這也說明有效抑制炎癥通路可能是延緩椎間盤退變發生的重要研究方向。
自噬是一種關鍵的適應性反應以及保守的細胞過程，可以降解和循環細胞內受損的細胞器和蛋白質[22]。本研究檢測了各組自噬相關蛋白 LC3 以及 P62 表達，發現過表達鋅指蛋白 A20 能夠有效促進細胞自噬發生，而干擾鋅指蛋白 A20 表達后細胞自噬明顯減弱，提示鋅指蛋白 A20 調控椎間盤退變與自噬存在某種關聯，涉及的具體機制是下一步研究方向。
綜上述，通過體內過表達鋅指蛋白 A20 能夠在一定程度上延緩兔腰椎間盤退變，為基因治療椎間盤退變提供了一種全新切入點。然而，本研究采用的是經腹纖維環穿刺制備椎間盤退變模型，致病機制與人椎間盤退變不同；同時，本研究依托低劑量腺病毒為基因載體，未評估大劑量轉染病毒對機體的免疫性損害，相關實驗仍有待進一步完善。
作者貢獻：張野參與研究設計及實驗操作、數據收集整理及統計分析，文章撰寫；劉渤參與研究設計，對文章的知識性內容作批評性審閱；夏輝強、易威威、藍海洋協助實驗操作及負責實驗數據收集整理；楊智杰、韓非、唐盼協助實驗操作。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究經重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。實驗動物生產許可證號：SCXK（渝）2018-0003，實驗動物使用許可證號：SYXK（渝）2018-0003。
腰椎間盤退變是脊柱退行性疾病發生發展的重要原因，已有研究表明細胞外基質丟失、椎間盤細胞過度凋亡和炎癥反應在椎間盤退變過程中發揮重要作用[1-3]。其中，過量炎癥因子的產生不僅抑制細胞外基質合成，還會促進椎間盤髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPCs）凋亡，最終導致椎間盤退變[4]。目前，臨床常用的腰椎間盤退變治療方式只能在一定程度上緩解患者臨床癥狀，無法延緩或者逆轉椎間盤退變。隨著對椎間盤退變分子生物學研究的深入，通過促進 NPCs 細胞外基質合成或抑制其降解，進而延緩或者逆轉椎間盤退變，成為一種具有前景的治療方式[5]。
鋅指蛋白 A20 又被稱為 TNF-α 誘導蛋白 3（tumor necrosis factor alpha induced protein 3，TNFAIP3）[6]，是一類重要的細胞內源性保護蛋白。它主要通過一系列反應發揮去泛素化作用，從而對炎癥反應、免疫應答、細胞凋亡等進行調控。鋅指蛋白 A20 也是 NF-κB 活化的下游產物，能直接負反饋調節 NF-κB 通路的激活[7]。研究表明，鋅指蛋白 A20 基因缺失會導致機體發生極其嚴重的炎癥反應[8-9]，而過表達鋅指蛋白 A20 基因可調控 NF-κB 通路的活性，從而抑制炎癥反應[10]，這也提示該基因在機體抵抗炎癥反應中發揮了重要作用。
本課題組前期體外實驗發現，過表達鋅指蛋白 A20 基因可有效抑制 NF-κB 通路活性以及炎癥反應，從而延緩椎間盤退變[11]。本次研究旨在通過動物體內實驗，進一步明確鋅指蛋白 A20 表達對椎間盤退變的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3 月齡新西蘭大白兔 26 只，體質量 2.0～2.5 kg，雌雄不限，由重慶醫科大學動物實驗中心提供。
鋅指蛋白 A20 過表達腺病毒 pHBAd-EF1-MCS-GFP/TNFAIP3、空載體腺病毒 pHBAd-EF1-MCS-GFP、鋅指蛋白 A20 干擾腺病毒 pHBAd-EF1-MCS-GFP/sh-RNA-TNFAIP3，均由漢恒生物科技（上海）有限公司構建、測序并進行重組腺病毒的包裝，病毒滴度為 1×1010 PFU/mL。
阿利辛藍染色液（武漢博士德生物工程有限公司）；鋅指蛋白 A20 抗體（北京安諾倫生物科技有限公司）；P65、磷酸化 P65（phosphate P65，P-P65）和Ⅱ型膠原抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；蛋白聚糖抗體（Roche 公司，瑞士）；β-actin 抗體（北京博奧龍免疫技術有限公司）；免疫組織化學染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
MRI 機（Siemens 公司，德國）；18G 腰椎穿刺針、微量進樣器（上海玉研科學儀器有限公司）；RadiAnt DICOM Viewer 軟件（Medixant 公司，波蘭）；Image J 軟件（美國國立衛生研究院）；Fusion 軟件（VILBER 公司，美國）；倒置相差顯微鏡（上海光密儀器有限公司）。
1.2 兔腰椎間盤退變模型的制備
26 只實驗兔取仰臥位并四肢固定，肌肉注射速眠新Ⅱ（0.2 mL/kg）聯合耳緣靜脈注射 10% 水合氯醛（1.0～1.5 mL/kg）麻醉。常規備皮消毒，取肋弓下緣至髂嵴水平腹部正中切口約 8 cm，逐層切開至腹腔。將腸管向右側翻出并用紗布覆蓋，暴露左側腹腔，自左側輸尿管及腹主動脈中間分離后腹膜，充分暴露左腎靜脈；左腎靜脈與下腔靜脈交匯處對應 L3 椎體，以此為定位標志，其下方第 1 個椎間盤即為 L3、4 椎間盤；分離椎體前方肌肉，依次暴露 L3、4、L4、5、L5、6 椎間盤，并用 18G 腰椎穿刺針依次穿刺，具體方法為于纖維環前方中點平行終板刺入，深度 5 mm，維持 5 s 后拔出穿刺針，見髓核組織沿穿刺孔道漏出提示穿刺成功，逐層縫合切口。
實驗動物術后當天禁飲食，術后第 1 天起正常飲食，連續 3 d 肌肉注射青霉素鈉 20 萬 U 預防感染，定期換藥。除 2 只動物因術中麻醉意外死亡外，其余 24 只術后 4 周復查 MRI 示處理節段髓核信號減弱并伴有高信號區域面積縮小，其余節段椎間盤髓核信號保持高亮狀態，提示腰椎間盤退變模型制備成功進行后續實驗。見圖1。
圖1
MRI 檢查腰椎間盤退變（箭頭）
Figure1.
MRI examination of lumbar intervertebral disc degene ration (arrow)
1.3 實驗分組及方法
將 24 只腰椎間盤退變動物模型隨機分為 4 組（n=6），分別為過表達 A20 組（鋅指蛋白 A20 過表達腺病毒）、空載體組（空載體腺病毒）、對照組（PBS 液）以及干擾 A20 組（鋅指蛋白 A20 干擾腺病毒）。
同 1.2 方法暴露 L3、4、L4、5、L5、6 椎間盤，應用微量進樣器將對應病毒液或 PBS 液注射至退變椎間盤內，每個椎間盤注射 10 μL，注射時間 3 min，進針深度 5 mm。
1.4 觀測指標
1.4.1 生物反應綜合評分
于注射前 1 d 及注射后 1、2、3、6 d，對各組實驗動物進行生物反應綜合評分。評價標準[12]：精神情況，神情機敏 2 分、神情緩慢 1 分、神情遲滯 0 分；進飲食量，正常 2 分、減半 1 分、極少或無進食 0 分；活動量，活動自如 2 分、活動適中 1 分、活動明顯減少 0 分；對外界刺激反應，反應明顯 2 分、不明顯 1 分、無反應 0 分。以上項目得分總和即為綜合評分。
1.4.2 MRI 觀測
注射后 2、4、8 周，各組實驗動物行正中矢狀位 MRI 檢查，評價椎間盤退變程度。具體參數：采用多重回波自旋回波序列，重復時間 2 500 ms，恢復時間 87.9 ms，矩陣 256×256，視野 170 mm，激勵次數 2 次，掃描層厚 1.5 mm、間隔 0.5 mm，總掃描時間 4 min 17 s。采用 RadiAnt DICOM Viewer 軟件測量各椎間盤 T2 弛豫時間（T2 信號值）。
MRI 觀察示注射后 2 周各組椎間盤退變不明顯，而 8 周時干擾 A20 組、對照組以及空載體組出現嚴重椎間盤退變，椎間隙明顯狹窄，導致實驗取材尤其是組織總蛋白提取困難，故后續組織學觀察取 4、8 周標本，免疫組織化學染色以及 Western blot 檢測僅取 4 周標本。
1.4.3 組織學觀察
注射后 4、8 周采用空氣栓塞法處死實驗動物，按照原腹部切口入路，完整切取 L3、4、L4、5、L5、6 椎間盤組織，置于 4% 多聚甲醛固定 48 h，10%EDTA 脫鈣液脫鈣處理 20 d，脫水，石蠟包埋后切片（片厚 5 μm）。各組取部分切片行阿利辛藍染色，倒置相差顯微鏡下觀察，使用 Image J 軟件測量椎間盤內蛋白聚糖陽性區域。
1.4.4 免疫組織化學染色觀察
取各組注射后 4 周部分切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，枸櫞酸鈉鹽抗原修復（95℃，15 min），純山羊血清封閉 10～15 min；滴加鋅指蛋白 A20、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原一抗（1∶50），4℃ 孵育過夜；滴加生物素二抗；DAB 顯色液（1∶20）室溫顯色，固定，封片，倒置相差顯微鏡下觀察，使用 Image J 軟件測量椎間盤內鋅指蛋白 A20、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原陽性區域，作為對應蛋白的表達水平。
1.4.5 Western blot 檢測
取各組注射后 4 周椎間盤髓核組織，利用液氮反復研磨，加入 RIPA 裂解液和蛋白酶抑制劑提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度并配平，以蛋白上樣緩沖液混合煮沸 15 min 后上樣。取 30 μg 蛋白總量上樣，10% SDS-PAGE 膠電泳恒壓分離，250 mA 恒流轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉 2 h，加鋅指蛋白 A20、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原、P65、P-P65、TNF-α、IL-1β、LC3（LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ）、P62 一抗（1∶1 000），4℃ 孵育過夜；TBST 洗膜，加入相應二抗（1∶1 000），室溫孵育 2 h，TBST 洗膜，ECL 發光。采用 Fusion 軟件分析條帶，以目標蛋白與 β-actin 吸光度（A）值的比值作為其蛋白相對表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS22.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 生物反應綜合評分
各組實驗動物均存活至實驗完成。各組注射后各時間點生物反應綜合評分均明顯低于注射前 1 d，注射后組內生物反應綜合評分隨時間延長逐漸增高，差異均有統計學意義（P<0.05）。
各組注射前 1 d 生物反應綜合評分比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。注射后 1、2、3 d 比較，差異亦無統計學意義（P>0.05）；注射后 6 d 干擾 A20 組生物反應綜合評分明顯低于其他組，差異有統計學意義（P<0.05），其他組間比較差異均無統計學意義（P>0.05），見圖2。
圖2
各組生物綜合反應評分比較
Figure2.
Comparison of comprehensive score of biological response between groups
2.2 MRI 觀測
MRI 檢查示注射后 2 周，各組椎間盤均無明顯退變；4 周后各組均出現明顯的椎間盤退變，8 周時與過表達 A20 組相比，其他組均見嚴重的椎間盤退變反應，椎間隙明顯狹窄。見圖3。
圖3
注射后各時間點各組 MRI 觀察
從左至右分別為過表達 A20 組、空載體組、對照組、干擾 A20 組 a. 注射后 2 周；b. 注射后 4 周；c. 注射后 8 周
Figure3. MRI observation of each group at each time point after injectionFrom left to right for Ov-A20 group, NC group, control group, and ShRNA-A20 group a. At 2 weeks after injection; b. At 4 weeks after injection; c. At 8 weeks after injection
注射后 2、4 周，過表達 A20 組 T2 信號值最高，干擾 A20 組最低，與其他各組相比差異有統計學意義（P<0.05），空載體組與對照組間差異無統計學意義（P>0.05）；注射后 8 周，過表達 A20 組 T2 信號值仍明顯高于其他組（P<0.05），而空載體組、對照組及干擾 A20 組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖4。
圖4
注射后各時間點各組 T2 信號值
Figure4.
T2 signal value of each group at each time point after injection
2.3 組織學觀察
注射后 4 周，過表達 A20 組中椎間盤髓核組織周圍含有豐富的蛋白聚糖且呈彌漫性分布，顯著高于其他組（P<0.05）；干擾 A20 組中蛋白聚糖含量較少，顯著低于其他組（P<0.05）；對照組與空載體組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。注射后 8 周，過表達 A20 組蛋白聚糖含量仍顯著高于其他組（P<0.05），其他組間差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖5、6。
圖5
注射后各組阿利辛藍染色觀察（×100）
從左至右分別為過表達 A20 組、空載體組、對照組、干擾 A20 組 a. 注射后 4 周；b. 注射后 8 周
Figure5. Alician blue staining observation of each group after injection (×100)From left to right for Ov-A20 group, NC group, control group, and ShRNA-A20 group a. At 4 weeks after injection; b. At 8 weeks after injection
圖6
注射后各組椎間盤組織中蛋白聚糖表達
Figure6.
The expression of aggrecan in intervertebral disc tissues of each group after injection
2.4 免疫組織化學染色觀察
注射后 4 周，過表達 A20 組鋅指蛋白 A20、Ⅱ型膠原、蛋白聚糖表達較對照組、空載體組、干擾 A20 組明顯增高，干擾 A20 組上述蛋白表達較其他組明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05）；空載體組與對照組間比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖7、8。
圖7
注射后 4 周各組免疫組織化學染色觀察（×200）
從左至右分別為過表達 A20 組、空載體組、對照組、干擾 A20 組 a. 鋅指蛋白 A20；b. Ⅱ型膠原；c. 蛋白聚糖
Figure7. Immunohistochemical staining of each group at 4 weeks after injection (×200)From left to right for Ov-A20 group, NC group, control group, and ShRNA-A20 group a. Zinc finger protein A20; b. Collagen Ⅱ; c. Aggrecan
圖8
注射后 4 周各組鋅指蛋白 A20、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原 表達
Figure8.
Expressions of zinc finger protein A20, collagen Ⅱ, and aggrecan in each group at 4 weeks after injection
2.5 Western blot 檢測
注射后 4 周，鋅指蛋白 A20、蛋白聚糖、Ⅱ型膠原、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相對表達量過表達 A20 組最高、干擾 A20 組最低，而 P-P65、TNF-α、IL-1β、P62 蛋白相對表達量過表達 A20 組最低、干擾 A20 組最高，與其他組比較差異均有統計學意義（P<0.05）；空載體組與對照組上述蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。各組 P65 蛋白相對表達量差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖9。
圖9
注射后 4 周 Western blot 檢測各組目的蛋白表達
a. 條帶圖 1：過表達 A20 組 2：空載體組 3：對照組 4：干擾 A20 組；b. 目的蛋白相對表達量
Figure9. The expressions of target proteins by Western blot at 4 weeks after injectiona. Electrophoretogram 1: Ov-A20 group 2: NC group3: Control group 4: ShRNA-A20 group; b. Relative expression of target protein
3 討論
腰椎間盤退變的細胞學表現為退變椎間盤內 NPCs 功能降低和數量減少，軟骨相關特異基因的產物（如蛋白聚糖、Ⅱ型膠原等功能性基質大分子）合成下降[13]，最終導致椎間盤機械應力功能及維持椎間隙高度的生物學功能喪失。大量研究表明炎癥反應是引起椎間盤退變的重要因素之一[14-15]，因此找到炎癥信號傳導途徑的關鍵靶點，阻斷炎癥信號傳導通路，可能成為控制椎間盤退變的一種有效方法。
鋅指蛋白 A20 是一類特殊的細胞內源性保護蛋白，能夠抑制 NF-κB 活性以及負反饋調控多種信號傳導途徑介導的炎癥反應[16]。相關研究發現，鋅指蛋白 A20 缺陷小鼠表現出嚴重自發性多器官炎癥反應、惡病質和圍產期死亡[17-18]。Li 等[19]研究發現，鋅指蛋白 A20 過表達小鼠可以抑制炎癥介質的產生，從而防止狼瘡性炎癥導致的腎臟損傷。因此，鋅指蛋白 A20 對預防體內炎癥反應至關重要，是機體不可或缺的重要組成成分。
本研究采用經腹細針穿刺法制備兔腰椎間盤退變模型，MRI 觀察提示腰椎間盤退變模型制備成功。采用鋅指蛋白 A20 過表達腺病毒以及干擾腺病毒分別轉染 NPCs，使其過表達以及干擾鋅指蛋白 A20 基因。為觀察鋅指蛋白 A20 的轉染效率，我們采用免疫組織化學染色及 Western blot 檢測了各組鋅指蛋白 A20 表達情況，結果提示相較于對照組，過表達 A20 組中鋅指蛋白 A20 表達明顯增高，干擾 A20 組中表達降低，表明通過腺病毒轉染兔退變 NPCs 能夠成功過表達或者干擾鋅指蛋白 A20 基因的表達。
經分組處理后，我們發現注射后 6 d 干擾 A20 組實驗動物生物反應綜合評分顯著低于其他組，分析可能是該組實驗動物腰椎間盤退變程度較其他組嚴重，進而影響了行為反應能力。MRI 檢測示各時間點過表達 A20 組 T2 信號值均顯著高于其他組，而干擾 A20 組最低，結合生物反應綜合評分分析干擾鋅指蛋白 A20 表達后，實驗早期動物椎間盤即可發生嚴重退變。這表明鋅指蛋白 A20 作為一種內源性保護蛋白，在椎間盤退變過程中起到了重要作用。但隨時間延長，過表達 A20 組 T2 信號值會有不同程度降低，表明鋅指蛋白 A20 作用的局限性，即作為一種基因治療手段，通過腺病毒轉染使兔 NPCs 過表達鋅指蛋白 A20 僅能在一定程度上延緩椎間盤退變，但無法起到逆轉作用。
NF-κB 是一種多功能轉錄因子，屬于 NF-κB/REL 蛋白家族成員。哺乳動物有 5 個亞基，但最常見形式為 P65/P50 二聚體復合物，在細胞炎癥反應、細胞增殖與凋亡中起到重要作用[20]。NF-κB 通常以不活躍形式存在于細胞質中，在各種炎癥因子如 IL-1β、IL-6、TNF-α 的刺激下，NF-κB 會迅速轉移到細胞核，調節靶基因的轉錄和表達。而各種炎癥刺激均可誘導鋅指蛋白 A20 表達。本研究通過檢測細胞中 P65、P-P65 以及炎癥因子 TNF-α、IL-1β 的表達，來進一步探索炎癥與椎間盤退變的關系。結果顯示相較于對照組，干擾 A20 組的 P-P65、TNF-α、IL-1β 蛋白表達顯著增加，說明干擾鋅指蛋白 A20 基因表達會顯著增加 NF-κB 通路的活性，導致組織內部發生嚴重炎癥反應。與此同時，過表達 A20 組 P-P65、TNF-α、IL-1β 蛋白表達則出現相反情況，表明鋅指蛋白 A20 對 NF-κB 的活化具有重要的負性調節作用，過表達鋅指蛋白 A20 基因能夠有效抑制炎性通路，弱化炎癥反應。Yi 等[21]研究發現，通過抑制 NF-κB 活性能有效抑制人椎間盤 NPCs 內的炎癥反應、促進細胞內自噬以及抑制細胞凋亡的發生，最終達到延緩椎間盤退變的目的。
同時，阿利辛藍染色顯示各組椎間盤均有不同程度退變，其中過表達 A20 組退變程度較輕，而干擾 A20 組退變尤為顯著。免疫組織化學染色及 Western blot 檢測轉染病毒后細胞退變相關指標，結果顯示過表達 A20 組的Ⅱ型膠原、蛋白聚糖表達顯著增高，而干擾 A20 組表達顯著降低，表明鋅指蛋白 A20 對調控 NPCs 退變具有重要作用，這也說明有效抑制炎癥通路可能是延緩椎間盤退變發生的重要研究方向。
自噬是一種關鍵的適應性反應以及保守的細胞過程，可以降解和循環細胞內受損的細胞器和蛋白質[22]。本研究檢測了各組自噬相關蛋白 LC3 以及 P62 表達，發現過表達鋅指蛋白 A20 能夠有效促進細胞自噬發生，而干擾鋅指蛋白 A20 表達后細胞自噬明顯減弱，提示鋅指蛋白 A20 調控椎間盤退變與自噬存在某種關聯，涉及的具體機制是下一步研究方向。
綜上述，通過體內過表達鋅指蛋白 A20 能夠在一定程度上延緩兔腰椎間盤退變，為基因治療椎間盤退變提供了一種全新切入點。然而，本研究采用的是經腹纖維環穿刺制備椎間盤退變模型，致病機制與人椎間盤退變不同；同時，本研究依托低劑量腺病毒為基因載體，未評估大劑量轉染病毒對機體的免疫性損害，相關實驗仍有待進一步完善。
作者貢獻：張野參與研究設計及實驗操作、數據收集整理及統計分析，文章撰寫；劉渤參與研究設計，對文章的知識性內容作批評性審閱；夏輝強、易威威、藍海洋協助實驗操作及負責實驗數據收集整理；楊智杰、韓非、唐盼協助實驗操作。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究經重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。實驗動物生產許可證號：SCXK（渝）2018-0003，實驗動物使用許可證號：SYXK（渝）2018-0003。
