引用本文： 任朋潔, 徐奕昊, 范飛, 田樂, 陸曉娜, 尤建軍, 王歡, 鄭若冰. 組織工程軟骨在鼻再造術中的臨床應用. 中國修復重建外科雜志, 2021, 35(2): 221-226. doi: 10.7507/1002-1892.202009053 復制
鼻位于面部中央，外鼻缺損或畸形對人的外貌有著顯著影響。鼻再造是修復鼻缺損或矯正鼻畸形的主要方法，外被、支架和襯里是鼻再造的 3 個重要組成部分[1]。支架是整個再造鼻的骨架核心，是將二維皮瓣轉化為三維立體結構的關鍵。本課題組前期采用 3D 打印技術在體外成功構建具有精細結構的組織工程鼻翼軟骨[2]。為進一步探索該組織工程軟骨用于鼻再造的安全性和有效性，2014 年 3 月—2015 年 10 月我們將其用于治療 5 例鼻缺損或畸形患者。現回顧 5 例患者治療過程，總結臨床觀察結果，為今后研究提供參考。
1 臨床資料
1.1 一般資料
本組 1 例 4 歲患兒為先天性鼻畸形。其余 4 例成年患者為外傷所致鼻部亞單位缺損，男 3 例、女 1 例；年齡 24～33 歲，平均 28.5 歲。既往均未對鼻畸形或缺損進行修復。患者臨床資料詳見表 1。
表1
患者臨床資料
Table1.
The clinical data of 5 patients
1.2 組織工程軟骨構建
1.2.1 種子細胞培養
局麻下，成年患者取耳甲腔軟骨約 0.12 mL，患兒取鼻中隔軟骨約 0.013 mL，置于 0～4℃ 培養液中，即刻轉送至實驗室。使用酶消化法獲得原代人耳軟骨細胞/鼻中隔軟骨細胞，用含 5.0 ng/mL bFGF（R&D 公司，美國）、10%FBS（HyClone 公司，美國）的 H-DMEM 培養基（GIBCO公司，美國）制成細胞懸液，以 1.5×104個/cm2密度接種至培養瓶后，置于 37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養。待細胞生長匯合至 70%～80% 進行傳代，收集第 2 代軟骨細胞，備用。
1.2.2 組織工程軟骨構建
① 應用 3D 打印技術制備與正常鼻翼、鼻背形態相似的塑料支架，利用塑料支架制備石膏陽模與陰模。
② 采用聚羥基乙酸（poly-glycolic acid，PGA）-聚乳酸（poly-lactic acid，PLA）復合材料構建組織工程軟骨支架。其中，PGA 相對分子質量約 30×103，由上海組織工程國家工程中心提供；PLA 相對分子質量約 10×103，購于美國 Sigma-Aldrich 公司。將無紡的絮狀 PGA 纖維均勻鋪在石膏陽模上，反復滴加含 0.5%PLA 的二氯甲烷溶液，直至 PLA 干重占支架材料總質量的 15%；待二氯甲烷大部分揮發后，扣上陰模加壓使其成型。
③ 取出制備的 PGA-PLA 支架材料，修剪周圍多余材料，獲得相應形態的支架；置于 75% 乙醇浸泡 1 h、紫外線照射 30 min 消毒，無血清 DMEM 培養液洗滌 5 次，加入常規細胞培養液預培養 48 h，確定無污染后吸干培養液備用。
④ 取 1.2.1 制備的第 2 代軟骨細胞，調整細胞濃度至 1×106個/mL 后接種于 PGA-PLA 支架材料上；采用軟骨分化培養液，于 37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養 12 周，體外構建組織工程軟骨。培養結束后，將其行 HE 染色檢測，確定無感染后植入人體內。其中，早期收治的例 1、2 鼻背部的組織工程軟骨制備為片狀；為進一步縮短術中支架雕刻時間，例 3、4、5 將鼻背部的組織工程軟骨形狀改為與隆鼻用硅膠 L 形支架一致。
1.3 手術方法
本組 1 例先天性鼻畸形患兒一期行鼻部畸形矯正術、硅膠假體植入術，二期取出假體同時植入組織工程軟骨；其余 4 例成年患者均采用額部皮瓣擴張法進行鼻再造。
1.3.1 一期手術
一期行額部擴張器植入。全麻下，標記發際內切口線及擴張器置入范圍。切開皮膚，在皮下層進行剝離，在帽狀腱膜下層分離至預定范圍。4 例成年患者均置入 300 mL 橢圓形擴張器，留置引流管 1 根，適當加壓包扎。本組例 4 同時行鼻孔開大術。
術后 14 d 切口愈合后拆線。拆線后 1 周開始向擴張器內注水，每周注水 2 次，每次 15～20 mL，待總注水量達 600～750 mL 后停止注水并靜置 1 個月。4 例患者注水及靜置共耗時 5～6 個月，平均 5.75 個月。
1.3.2 二期手術
二期行全鼻再造。全麻下，于鼻部受區切開松解瘢痕，依據局部瘢痕及黏膜情況制作襯里皮瓣，于鼻背正中皮下徹底松解組織，并于骨膜上方剝離形成腔隙。然后取出擴張器，設計額部帶蒂皮瓣。局麻后，切開皮瓣并向下旋轉至受區。將構建的組織工程軟骨適當修剪，分別置于鼻翼及鼻背，并與周圍組織固定。將皮瓣與制備的襯里皮瓣縫合，最后縫合額部供區。
術后放置引流管，密切觀察皮瓣血運及引流情況，2 d 后拔出引流管，14 d 后拆線。術后 1 個月開始使用腸鉗夾持再造鼻蒂部血運進行鍛煉，待血運阻斷可達 2 h 以上時，行皮瓣斷蒂術。
1.3.3 三期手術
全麻后，患者取平臥位，采用局部浸潤麻醉后切斷鼻根蒂部，舒展皮瓣，形成鼻根，并將多余的蒂部組織放回原處，矯正雙眉位置不對稱。斷蒂后 6 個月左右水腫消退、皮瓣收縮和瘢痕穩定后[3]，根據患者鼻部外形行再造鼻修整術，包括修薄皮瓣形成鼻部精細結構、調整軟骨支架、修復切口瘢痕等。本組 5 例患者行 1～4 次鼻修整術，平均 2.2 次。
1.4 組織學觀察
本組 2 例患者在后期鼻修整術中取組織工程軟骨進行組織學觀察，其中例 3 分別于術后 1 年 6 個月、5 年取材，例 4 分別于術后 4、5 年取材。上述標本均行 HE 染色、EvG 彈性纖維染色以及 Ⅰ、Ⅱ 型膠原免疫組織化學染色。為方便表述，觀察結果以術后早期（植入時間<2 年）和遠期（植入時間>2 年）來區分。
2 結果
2.1 臨床觀察結果
4 例成年患者二期術后 72 h 內皮瓣遠端均未出現靜脈淤血現象，皮瓣全部成活，切口 Ⅰ 期愈合，無急性期感染、明顯排斥反應等并發癥發生。額部供區切口均 Ⅰ 期愈合。4 例成年患者中，2 例（例 3、4）術后出現一過性低熱，未予特殊處理，自行緩解；2 例（例 1、2）鼻部腫脹程度較其余 2 例明顯，經常規口服消腫藥物處理后，切口均按時拆線。另 1 例患兒（例 5）二期組織工程軟骨植入術后出現持續性低熱，鼻部腫脹明顯，術后 2 d 拔除引流管后引流管口延遲愈合，滲出液較多，分泌物細菌培養呈陰性；6 d 時體溫突然升高，考慮為扁桃體炎，給予抗生素后體溫恢復正常，切口按時拆線。
術后 5 例患者均獲隨訪，隨訪時間 9～74 個月，平均 54.8 個月。隨訪期間患者鼻部無明顯不適，無組織工程軟骨感染、移位或變形等并發癥發生，鼻部形態明顯改善，皮瓣色澤與正常皮膚相似，質地柔軟，鼻部無明顯通氣障礙。患者對鼻部外形基本滿意。見圖 1、2。
圖1
例 3 患者臨床觀察
a. 一期擴張器植入術后 6 個月（二期鼻再造術前）；b. 構建的組織工程軟骨；c-e. 二期鼻再造術操作過程；f. 二期術后即刻；g. 二期術后 1 年 6 個月（第 1 次鼻修整術前）；h. 二期術后 5 年（第 3 次鼻修整術前）；i. 第 3 次鼻修整術中于左側鼻翼植入組織工程軟骨位置完整分離出質軟組織；j. 二期術后 5 年 10 個月
Figure1. The clinical observation of case 3a. At 6 months after the expander implantation in the first stage (before the second nasal reconstruction); b. The tissue engineered cartilage; c-e. The surgery procedure of the second nasal reconstruction; f. At immediate after the second nasal reconstruction; g. At 1 year and 6 months after the second nasal reconstruction (before the first nasal revision); h. At 5 years after the second nasal reconstruction (before the third nasal revision); i. The soft tissue was separated from the place where tissue engineered cartilage had been implanted during the third nasal revision; j. At 5 years and 10 months after the second nasal reconstruction
圖2
組織工程軟骨鼻再造序列治療及隨訪
從左至右分別為組織工程軟骨植入術前、構建的組織工程軟骨以及再造術后即刻、遠期a. 例 4（二期術后 4 年 3 個月，第 3 次修整術后）；b. 例 5（二期術后 4 年 10 個月，第 1 次修整術后）
Figure2. Sequential treatment and follow-up of tissue engineered cartilage nasal reconstructionFrom left to right for the view before implantation of tissue engineered cartilage, the morphology of tissue engineered cartilage, the view at immediate after nasal reconstruction, and the long-term effectiveness, respectively a. Case 4 (at 4 years and 3 months after the second nasal reconstruction and after the third nasal revision); b. Case 5 (at 4 years and 10 months after the nasal reconstruction and after the first nasal revision)
2.2 組織學檢測結果
鏡下觀察：術后早期（例 3）取材 HE 染色可見散在的軟骨組織結構，EvG 彈性纖維染色陽性，Ⅰ 型膠原免疫組織化學染色陽性，Ⅱ 型膠原免疫組織化學染色為弱陽性。其余周圍大部分組織與纖維結締組織表現相同，可見散在的無結構組織，旁邊可見多核巨噬細胞浸潤，考慮為 PGA-PLA 殘余支架成分。術后遠期取材中，例 3 患者 HE 染色呈纖維結締組織特點，未見明顯軟骨組織結構，EvG 彈性纖維染色呈陰性，Ⅰ 型膠原免疫組織化學染色呈強陽性，Ⅱ 型膠原免疫組織化學染色呈陰性，同樣可見散在的無結構組織。例 4 患者術后 4 年的標本呈明顯骨化表現；術后 5 年的標本可見明顯軟骨組織結構，HE 染色、EvG 彈性纖維染色以及 Ⅰ、Ⅱ 型膠原免疫組織化學染色結果與例 3 術后早期結果相似。見圖 3。
圖3
例 3 患者組織學觀察（×200）
從左至右分別為 HE 染色、EvG 彈性纖維染色以及 Ⅰ 、Ⅱ 型膠原免疫組織化學染色 箭頭示無結構組織 a. 第 1 次鼻修整術取材；b. 第 3 次鼻修整術取材
Figure3. Histological characterization of tissue biopsy from the case 3 (×200)From left to right for HE staining, EvG staining, immunohistochemical staining of collagen type Ⅰ, and immunohistochemical staining of collagen type Ⅱ, respectively Arrow indicated the dispersed amorphous material a. The sample from the first revision; b. The sample from the third revision
3 討論
理想化的鼻部組織工程軟骨是在減少患者損傷的同時，提供更好的支架材料，降低手術難度，減少手術時間和鼻修整次數。Fulco 等[4]首次在癌癥術后患者中使用片狀組織工程軟骨進行單側鼻翼重建，獲得了較好的鼻翼功能與外形重建。除此之外，其他用于鼻部的組織工程軟骨人體體內研究非常有限[5]。
我們經過 5 年術后隨訪的臨床試驗，結果已初步證實了自體耳軟骨細胞或鼻中隔軟骨細胞復合 PGA-PLA 支架體外構建的組織工程軟骨用于鼻再造的安全性。在 3D 打印技術輔助下，可以較精確地獲得鼻翼和鼻背形狀的組織工程軟骨，但是隨訪發現植入后仍存在一些問題。組織學檢測顯示，組織工程軟骨在植入鼻部后，軟骨組織逐漸被吸收，取而代之的是纖維結締組織，有少量 PGA-PLA 支架材料殘留。例 4 患者 CT 復查示組織工程軟骨植入體內 8 個月后出現明顯鈣化現象[6]，與本研究中臨床觀察以及免疫組織化學染色結果一致，但具體原因尚不清楚。在本課題組同期進行的組織工程軟骨耳廓再造臨床試驗中，結果顯示軟骨支架移植入體內最早 2 個月就開始出現變形、坍塌，解剖結構模糊，MRI 也顯示植入的軟骨被吸收[7-8]。盡管植入的組織工程軟骨外形和力學性能尚能滿足臨床需求，但植入體內后出現的這種吸收、纖維化及鈣化趨勢，必然會導致不可預測的剛度變化及原位變形，最終對頭面部再造器官外形產生影響。已有研究證實軟骨微環境及種子細胞來源均對再生軟骨類型有一定調控作用[9]，肋軟骨來源種子細胞構建的組織工程軟骨表現肋軟骨的骨化傾向[10]。但是，目前對于維持組織工程軟骨機變性的特異性生化成分尚不清楚，細胞生化、免疫學以及生物力學間的復雜關系也需進一步研究。
例 5 患兒在組織工程軟骨植入后出現低熱、鼻部腫脹、滲出液增多等情況，但分泌物細菌培養結果為陰性，因組織工程軟骨的種子細胞為自體來源，所以考慮無菌性炎癥可能是由支架材料的體內代謝或其他相關因素引起。本試驗中采用 PGA 和 PLA 作為支架材料，其在降解過程中產生的低 pH 環境會影響軟骨細胞的生長、增殖和表型維持，甚至導致細胞壞死[11]。本研究軟骨構建過程，只有細胞材料復合物體外培養階段，未經裸鼠體內培養階段，PGA-PLA 支架未能充分降解，即使在術后 5 年，構建的組織工程軟骨中仍散在支架材料。
與傳統肋軟骨鼻再造法相比，采用組織工程軟骨行鼻再造減少了受區損傷，同時因避免了繁瑣的肋軟骨支架搭建，大大縮短手術時間，根據目前患者隨訪情況，遠期手術效果與肋軟骨支架鼻再造法無明顯差異。但組織工程軟骨構建較繁瑣、價格昂貴，其在鼻再造中的應用仍處于探索階段，臨床推廣應用仍有一定差距。
要實現組織工程軟骨在頭面部器官重建中的大規模臨床應用，需要解決更多問題。例如，如何解決組織工程軟骨纖維化及骨化、如何將可能引發的免疫反應和炎癥程度控制在最低。針對以上問題，我們依據組織工程三要素總結了可能的解決措施。① 種子細胞。除成體軟骨細胞外，BMSCs 和脂肪 MSCs 也具有成軟骨能力，它們是目前種子細胞的研究熱點。有必要對 MSCs 分化調控及遠期轉歸進行研究，以避免可能存在的風險[5]。② 支架材料。為避免上述支架材料植入體內后的不良反應可不使用支架，采用細胞膜片技術[12]進行組織工程軟骨培養；或不植入支架，即加快支架材料在體外培養階段的代謝速率；或者探索其他新的支架材料。還可通過不同方式提高天然材料的可塑性及力學強度，或將天然材料和人工合成材料進行復合，從而獲得組織相容性較好、形態可控、力學性能合適的復合材料[13]，如 PLA-羥基乙酸共聚物/脫細胞軟骨細胞外基質支架材料、殼聚糖/絲素蛋白/納米羥基磷灰石多層支架復合體[14]等，但這些支架材料在人體內的長期安全性及用于頭面部器官重建的有效性尚不明確。③ 培養條件。動態培養環境比靜態培養環境能更好地模擬人體內狀態，動態生物反應器因而也更適宜組織工程軟骨的生長。不同種子細胞來源及所構建的軟骨用途不同，所適宜的最佳動態軟骨培養條件也存在差異[15]。本課題組自主研發了一種組合式組織工程動態培養儀[16]，但構建鼻部組織工程軟骨的具體條件仍在探索中。
綜上述，本研究結果已經初步表明組織工程軟骨行鼻再造術的安全性，但其有效性仍需進一步驗證。為確保組織工程軟骨在長期植入體內后仍有足夠軟骨存留，提高體外構建軟骨的質量及功能是后續研究的重要方向。
作者貢獻：任朋潔參與實驗設計，臨床及組織學數據收集、整理、分析，撰寫文章；徐奕昊、田樂、陸曉娜參與實驗設計，手術實施，收集實驗原始數據；王歡、尤建軍、鄭若冰參與手術實施；范飛參與指導實驗設計，手術實施，文章撰寫及修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。
機構倫理問題：研究方案經中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院醫學倫理委員會批準（2016 注冊第 05 號）。
鼻位于面部中央，外鼻缺損或畸形對人的外貌有著顯著影響。鼻再造是修復鼻缺損或矯正鼻畸形的主要方法，外被、支架和襯里是鼻再造的 3 個重要組成部分[1]。支架是整個再造鼻的骨架核心，是將二維皮瓣轉化為三維立體結構的關鍵。本課題組前期采用 3D 打印技術在體外成功構建具有精細結構的組織工程鼻翼軟骨[2]。為進一步探索該組織工程軟骨用于鼻再造的安全性和有效性，2014 年 3 月—2015 年 10 月我們將其用于治療 5 例鼻缺損或畸形患者。現回顧 5 例患者治療過程，總結臨床觀察結果，為今后研究提供參考。
1 臨床資料
1.1 一般資料
本組 1 例 4 歲患兒為先天性鼻畸形。其余 4 例成年患者為外傷所致鼻部亞單位缺損，男 3 例、女 1 例；年齡 24～33 歲，平均 28.5 歲。既往均未對鼻畸形或缺損進行修復。患者臨床資料詳見表 1。
表1
患者臨床資料
Table1.
The clinical data of 5 patients
1.2 組織工程軟骨構建
1.2.1 種子細胞培養
局麻下，成年患者取耳甲腔軟骨約 0.12 mL，患兒取鼻中隔軟骨約 0.013 mL，置于 0～4℃ 培養液中，即刻轉送至實驗室。使用酶消化法獲得原代人耳軟骨細胞/鼻中隔軟骨細胞，用含 5.0 ng/mL bFGF（R&D 公司，美國）、10%FBS（HyClone 公司，美國）的 H-DMEM 培養基（GIBCO公司，美國）制成細胞懸液，以 1.5×104個/cm2密度接種至培養瓶后，置于 37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱內培養。待細胞生長匯合至 70%～80% 進行傳代，收集第 2 代軟骨細胞，備用。
1.2.2 組織工程軟骨構建
① 應用 3D 打印技術制備與正常鼻翼、鼻背形態相似的塑料支架，利用塑料支架制備石膏陽模與陰模。
② 采用聚羥基乙酸（poly-glycolic acid，PGA）-聚乳酸（poly-lactic acid，PLA）復合材料構建組織工程軟骨支架。其中，PGA 相對分子質量約 30×103，由上海組織工程國家工程中心提供；PLA 相對分子質量約 10×103，購于美國 Sigma-Aldrich 公司。將無紡的絮狀 PGA 纖維均勻鋪在石膏陽模上，反復滴加含 0.5%PLA 的二氯甲烷溶液，直至 PLA 干重占支架材料總質量的 15%；待二氯甲烷大部分揮發后，扣上陰模加壓使其成型。
③ 取出制備的 PGA-PLA 支架材料，修剪周圍多余材料，獲得相應形態的支架；置于 75% 乙醇浸泡 1 h、紫外線照射 30 min 消毒，無血清 DMEM 培養液洗滌 5 次，加入常規細胞培養液預培養 48 h，確定無污染后吸干培養液備用。
④ 取 1.2.1 制備的第 2 代軟骨細胞，調整細胞濃度至 1×106個/mL 后接種于 PGA-PLA 支架材料上；采用軟骨分化培養液，于 37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養 12 周，體外構建組織工程軟骨。培養結束后，將其行 HE 染色檢測，確定無感染后植入人體內。其中，早期收治的例 1、2 鼻背部的組織工程軟骨制備為片狀；為進一步縮短術中支架雕刻時間，例 3、4、5 將鼻背部的組織工程軟骨形狀改為與隆鼻用硅膠 L 形支架一致。
1.3 手術方法
本組 1 例先天性鼻畸形患兒一期行鼻部畸形矯正術、硅膠假體植入術，二期取出假體同時植入組織工程軟骨；其余 4 例成年患者均采用額部皮瓣擴張法進行鼻再造。
1.3.1 一期手術
一期行額部擴張器植入。全麻下，標記發際內切口線及擴張器置入范圍。切開皮膚，在皮下層進行剝離，在帽狀腱膜下層分離至預定范圍。4 例成年患者均置入 300 mL 橢圓形擴張器，留置引流管 1 根，適當加壓包扎。本組例 4 同時行鼻孔開大術。
術后 14 d 切口愈合后拆線。拆線后 1 周開始向擴張器內注水，每周注水 2 次，每次 15～20 mL，待總注水量達 600～750 mL 后停止注水并靜置 1 個月。4 例患者注水及靜置共耗時 5～6 個月，平均 5.75 個月。
1.3.2 二期手術
二期行全鼻再造。全麻下，于鼻部受區切開松解瘢痕，依據局部瘢痕及黏膜情況制作襯里皮瓣，于鼻背正中皮下徹底松解組織，并于骨膜上方剝離形成腔隙。然后取出擴張器，設計額部帶蒂皮瓣。局麻后，切開皮瓣并向下旋轉至受區。將構建的組織工程軟骨適當修剪，分別置于鼻翼及鼻背，并與周圍組織固定。將皮瓣與制備的襯里皮瓣縫合，最后縫合額部供區。
術后放置引流管，密切觀察皮瓣血運及引流情況，2 d 后拔出引流管，14 d 后拆線。術后 1 個月開始使用腸鉗夾持再造鼻蒂部血運進行鍛煉，待血運阻斷可達 2 h 以上時，行皮瓣斷蒂術。
1.3.3 三期手術
全麻后，患者取平臥位，采用局部浸潤麻醉后切斷鼻根蒂部，舒展皮瓣，形成鼻根，并將多余的蒂部組織放回原處，矯正雙眉位置不對稱。斷蒂后 6 個月左右水腫消退、皮瓣收縮和瘢痕穩定后[3]，根據患者鼻部外形行再造鼻修整術，包括修薄皮瓣形成鼻部精細結構、調整軟骨支架、修復切口瘢痕等。本組 5 例患者行 1～4 次鼻修整術，平均 2.2 次。
1.4 組織學觀察
本組 2 例患者在后期鼻修整術中取組織工程軟骨進行組織學觀察，其中例 3 分別于術后 1 年 6 個月、5 年取材，例 4 分別于術后 4、5 年取材。上述標本均行 HE 染色、EvG 彈性纖維染色以及 Ⅰ、Ⅱ 型膠原免疫組織化學染色。為方便表述，觀察結果以術后早期（植入時間<2 年）和遠期（植入時間>2 年）來區分。
2 結果
2.1 臨床觀察結果
4 例成年患者二期術后 72 h 內皮瓣遠端均未出現靜脈淤血現象，皮瓣全部成活，切口 Ⅰ 期愈合，無急性期感染、明顯排斥反應等并發癥發生。額部供區切口均 Ⅰ 期愈合。4 例成年患者中，2 例（例 3、4）術后出現一過性低熱，未予特殊處理，自行緩解；2 例（例 1、2）鼻部腫脹程度較其余 2 例明顯，經常規口服消腫藥物處理后，切口均按時拆線。另 1 例患兒（例 5）二期組織工程軟骨植入術后出現持續性低熱，鼻部腫脹明顯，術后 2 d 拔除引流管后引流管口延遲愈合，滲出液較多，分泌物細菌培養呈陰性；6 d 時體溫突然升高，考慮為扁桃體炎，給予抗生素后體溫恢復正常，切口按時拆線。
術后 5 例患者均獲隨訪，隨訪時間 9～74 個月，平均 54.8 個月。隨訪期間患者鼻部無明顯不適，無組織工程軟骨感染、移位或變形等并發癥發生，鼻部形態明顯改善，皮瓣色澤與正常皮膚相似，質地柔軟，鼻部無明顯通氣障礙。患者對鼻部外形基本滿意。見圖 1、2。
圖1
例 3 患者臨床觀察
a. 一期擴張器植入術后 6 個月（二期鼻再造術前）；b. 構建的組織工程軟骨；c-e. 二期鼻再造術操作過程；f. 二期術后即刻；g. 二期術后 1 年 6 個月（第 1 次鼻修整術前）；h. 二期術后 5 年（第 3 次鼻修整術前）；i. 第 3 次鼻修整術中于左側鼻翼植入組織工程軟骨位置完整分離出質軟組織；j. 二期術后 5 年 10 個月
Figure1. The clinical observation of case 3a. At 6 months after the expander implantation in the first stage (before the second nasal reconstruction); b. The tissue engineered cartilage; c-e. The surgery procedure of the second nasal reconstruction; f. At immediate after the second nasal reconstruction; g. At 1 year and 6 months after the second nasal reconstruction (before the first nasal revision); h. At 5 years after the second nasal reconstruction (before the third nasal revision); i. The soft tissue was separated from the place where tissue engineered cartilage had been implanted during the third nasal revision; j. At 5 years and 10 months after the second nasal reconstruction
圖2
組織工程軟骨鼻再造序列治療及隨訪
從左至右分別為組織工程軟骨植入術前、構建的組織工程軟骨以及再造術后即刻、遠期a. 例 4（二期術后 4 年 3 個月，第 3 次修整術后）；b. 例 5（二期術后 4 年 10 個月，第 1 次修整術后）
Figure2. Sequential treatment and follow-up of tissue engineered cartilage nasal reconstructionFrom left to right for the view before implantation of tissue engineered cartilage, the morphology of tissue engineered cartilage, the view at immediate after nasal reconstruction, and the long-term effectiveness, respectively a. Case 4 (at 4 years and 3 months after the second nasal reconstruction and after the third nasal revision); b. Case 5 (at 4 years and 10 months after the nasal reconstruction and after the first nasal revision)
2.2 組織學檢測結果
鏡下觀察：術后早期（例 3）取材 HE 染色可見散在的軟骨組織結構，EvG 彈性纖維染色陽性，Ⅰ 型膠原免疫組織化學染色陽性，Ⅱ 型膠原免疫組織化學染色為弱陽性。其余周圍大部分組織與纖維結締組織表現相同，可見散在的無結構組織，旁邊可見多核巨噬細胞浸潤，考慮為 PGA-PLA 殘余支架成分。術后遠期取材中，例 3 患者 HE 染色呈纖維結締組織特點，未見明顯軟骨組織結構，EvG 彈性纖維染色呈陰性，Ⅰ 型膠原免疫組織化學染色呈強陽性，Ⅱ 型膠原免疫組織化學染色呈陰性，同樣可見散在的無結構組織。例 4 患者術后 4 年的標本呈明顯骨化表現；術后 5 年的標本可見明顯軟骨組織結構，HE 染色、EvG 彈性纖維染色以及 Ⅰ、Ⅱ 型膠原免疫組織化學染色結果與例 3 術后早期結果相似。見圖 3。
圖3
例 3 患者組織學觀察（×200）
從左至右分別為 HE 染色、EvG 彈性纖維染色以及 Ⅰ 、Ⅱ 型膠原免疫組織化學染色 箭頭示無結構組織 a. 第 1 次鼻修整術取材；b. 第 3 次鼻修整術取材
Figure3. Histological characterization of tissue biopsy from the case 3 (×200)From left to right for HE staining, EvG staining, immunohistochemical staining of collagen type Ⅰ, and immunohistochemical staining of collagen type Ⅱ, respectively Arrow indicated the dispersed amorphous material a. The sample from the first revision; b. The sample from the third revision
3 討論
理想化的鼻部組織工程軟骨是在減少患者損傷的同時，提供更好的支架材料，降低手術難度，減少手術時間和鼻修整次數。Fulco 等[4]首次在癌癥術后患者中使用片狀組織工程軟骨進行單側鼻翼重建，獲得了較好的鼻翼功能與外形重建。除此之外，其他用于鼻部的組織工程軟骨人體體內研究非常有限[5]。
我們經過 5 年術后隨訪的臨床試驗，結果已初步證實了自體耳軟骨細胞或鼻中隔軟骨細胞復合 PGA-PLA 支架體外構建的組織工程軟骨用于鼻再造的安全性。在 3D 打印技術輔助下，可以較精確地獲得鼻翼和鼻背形狀的組織工程軟骨，但是隨訪發現植入后仍存在一些問題。組織學檢測顯示，組織工程軟骨在植入鼻部后，軟骨組織逐漸被吸收，取而代之的是纖維結締組織，有少量 PGA-PLA 支架材料殘留。例 4 患者 CT 復查示組織工程軟骨植入體內 8 個月后出現明顯鈣化現象[6]，與本研究中臨床觀察以及免疫組織化學染色結果一致，但具體原因尚不清楚。在本課題組同期進行的組織工程軟骨耳廓再造臨床試驗中，結果顯示軟骨支架移植入體內最早 2 個月就開始出現變形、坍塌，解剖結構模糊，MRI 也顯示植入的軟骨被吸收[7-8]。盡管植入的組織工程軟骨外形和力學性能尚能滿足臨床需求，但植入體內后出現的這種吸收、纖維化及鈣化趨勢，必然會導致不可預測的剛度變化及原位變形，最終對頭面部再造器官外形產生影響。已有研究證實軟骨微環境及種子細胞來源均對再生軟骨類型有一定調控作用[9]，肋軟骨來源種子細胞構建的組織工程軟骨表現肋軟骨的骨化傾向[10]。但是，目前對于維持組織工程軟骨機變性的特異性生化成分尚不清楚，細胞生化、免疫學以及生物力學間的復雜關系也需進一步研究。
例 5 患兒在組織工程軟骨植入后出現低熱、鼻部腫脹、滲出液增多等情況，但分泌物細菌培養結果為陰性，因組織工程軟骨的種子細胞為自體來源，所以考慮無菌性炎癥可能是由支架材料的體內代謝或其他相關因素引起。本試驗中采用 PGA 和 PLA 作為支架材料，其在降解過程中產生的低 pH 環境會影響軟骨細胞的生長、增殖和表型維持，甚至導致細胞壞死[11]。本研究軟骨構建過程，只有細胞材料復合物體外培養階段，未經裸鼠體內培養階段，PGA-PLA 支架未能充分降解，即使在術后 5 年，構建的組織工程軟骨中仍散在支架材料。
與傳統肋軟骨鼻再造法相比，采用組織工程軟骨行鼻再造減少了受區損傷，同時因避免了繁瑣的肋軟骨支架搭建，大大縮短手術時間，根據目前患者隨訪情況，遠期手術效果與肋軟骨支架鼻再造法無明顯差異。但組織工程軟骨構建較繁瑣、價格昂貴，其在鼻再造中的應用仍處于探索階段，臨床推廣應用仍有一定差距。
要實現組織工程軟骨在頭面部器官重建中的大規模臨床應用，需要解決更多問題。例如，如何解決組織工程軟骨纖維化及骨化、如何將可能引發的免疫反應和炎癥程度控制在最低。針對以上問題，我們依據組織工程三要素總結了可能的解決措施。① 種子細胞。除成體軟骨細胞外，BMSCs 和脂肪 MSCs 也具有成軟骨能力，它們是目前種子細胞的研究熱點。有必要對 MSCs 分化調控及遠期轉歸進行研究，以避免可能存在的風險[5]。② 支架材料。為避免上述支架材料植入體內后的不良反應可不使用支架，采用細胞膜片技術[12]進行組織工程軟骨培養；或不植入支架，即加快支架材料在體外培養階段的代謝速率；或者探索其他新的支架材料。還可通過不同方式提高天然材料的可塑性及力學強度，或將天然材料和人工合成材料進行復合，從而獲得組織相容性較好、形態可控、力學性能合適的復合材料[13]，如 PLA-羥基乙酸共聚物/脫細胞軟骨細胞外基質支架材料、殼聚糖/絲素蛋白/納米羥基磷灰石多層支架復合體[14]等，但這些支架材料在人體內的長期安全性及用于頭面部器官重建的有效性尚不明確。③ 培養條件。動態培養環境比靜態培養環境能更好地模擬人體內狀態，動態生物反應器因而也更適宜組織工程軟骨的生長。不同種子細胞來源及所構建的軟骨用途不同，所適宜的最佳動態軟骨培養條件也存在差異[15]。本課題組自主研發了一種組合式組織工程動態培養儀[16]，但構建鼻部組織工程軟骨的具體條件仍在探索中。
綜上述，本研究結果已經初步表明組織工程軟骨行鼻再造術的安全性，但其有效性仍需進一步驗證。為確保組織工程軟骨在長期植入體內后仍有足夠軟骨存留，提高體外構建軟骨的質量及功能是后續研究的重要方向。
作者貢獻：任朋潔參與實驗設計，臨床及組織學數據收集、整理、分析，撰寫文章；徐奕昊、田樂、陸曉娜參與實驗設計，手術實施，收集實驗原始數據；王歡、尤建軍、鄭若冰參與手術實施；范飛參與指導實驗設計，手術實施，文章撰寫及修改。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。
機構倫理問題：研究方案經中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院醫學倫理委員會批準（2016 注冊第 05 號）。
