引用本文： 許子星, 許衛紅, 陳薛敏, 周亦楠. 急性脊髓損傷大鼠血管重構與炎癥反應的相關性研究. 中國修復重建外科雜志, 2020, 34(11): 1429-1437. doi: 10.7507/1002-1892.202003186 復制
急性脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后，微血管破裂、神經元損害、脫髓鞘改變會引發一系列病理過程，包括炎癥細胞浸潤、炎癥介質釋放和膠質瘢痕形成等，從而抑制組織再生和功能恢復[1-2]。微血管網破壞和炎癥反應是 SCI 病理過程中至關重要的兩個環節。一項基于自身免疫性脊髓炎動物模型的研究發現，新生血管環繞炎癥反應區域，隨后鄰近血管的皮質脊髓束纖維萌生[3]。這一現象提示微血管網破壞及炎癥反應兩種病理狀態相互關聯，是 SCI 后干預治療的重要靶點。研究證實，微血管在 SCI 后 3 d 內即出現于損傷區域，其密度峰值可達正常的 5 倍以上[4]。普遍認為，內皮細胞可作為吞噬細胞吞噬大顆粒、髓鞘碎片和凋亡細胞等，有助于清除蓄積物而減輕炎癥反應。換句話說，一方面微循環障礙是炎癥性損害加劇的誘因；另一方面，過度的炎癥性損害是阻礙微循環重建的不利因素，二者互為因果，惡性循環終致神經修復障礙和功能喪失[3, 5]。
研究表明，促進微血管網重建，既有望抑制炎癥反應，又有利于神經修復[6]。因此揭示微血管重構的動態過程與炎癥反應之間的關系，有助于理解 SCI 后極其復雜的病理過程，對 SCI 精準治療具有重要意義。我們前期研究證實，以改善血管重構為目的的治療能夠減少炎癥細胞浸潤，促進軸突再生及功能恢復[7]。然而，SCI 發生后，微血管網破壞及重建的動態過程，及其與炎癥反應、炎癥因子表達的關系尚無深入研究報道。以此為切入點，本研究擬探索不同程度 SCI 后損傷區域微血管密度變化趨勢，及其與炎癥指標相關關系，研究微血管重構、炎癥反應與脊髓組織結構變化轉歸的關系，旨在為 SCI 研究提供一個血管-炎癥模型，為動物造模和靶點治療提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雌性 SD 大鼠 116 只，體質量 230～250 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠抗大鼠內皮細胞抗原 1（rat endothelial cell antigen 1，RECA1）抗體、兔抗 CD68 抗體、小鼠抗神經微絲（neurofilament-H，NF-H）抗體、兔抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（Abcam 公司，美國）；Alexa568/Alexa488 山羊抗小鼠（或兔）熒光二抗（Invitrogen 公司，美國）；TNF-α、IL-1β、IL-6 的 ELISA 試劑盒（Cusabio 公司，美國）；甲苯胺藍染液（武漢賽維爾生物技術有限公司）。
MASCIS Impactor-Ⅲ 脊髓撞擊器（紐約大學 W.M.Keck 神經科學研究中心，美國）。全自動酶聯免疫吸附分析儀（BioTek 公司，美國）；正置熒光顯微鏡及 DS-U3 成像系統（Nikon 公司，日本）；切片掃描及 Caseviewer2.0 成像系統（Pannoramic 250；3D HISTECH 公司，匈牙利）；Fiji image J 軟件（美國國立衛生研究院）。
1.2 實驗分組及方法
將 116 只大鼠隨機分為 4 組，每組 29 只。假手術組僅切除椎板暴露脊髓，不進行撞擊；輕度損傷組以 12.5 mm 高度撞擊脊髓；中度損傷組以 25.0 mm 高度撞擊脊髓；重度損傷組以 50.0 mm 高度撞擊脊髓[8-9]。
各組大鼠采用腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉（30～40 mg/kg）麻醉后，背部常規消毒、鋪巾。以 T9～11 棘突為中心，縱向切開長約 3 cm 皮膚，分離背部肌肉，暴露 T9～11 椎板及棘突。用顯微咬骨鉗咬除 T9～11 椎體棘突，咬除 T10 全椎板，充分暴露脊髓。假手術組直接縫合切口，輕、中、重度損傷組采用 MASCIS Impactor-Ⅲ脊髓撞擊器制備大鼠急性 SCI 模型。連接及調試脊髓撞擊器，選用質量為 10 g、直徑 2.5 mm 的圓形撞擊頭，調整立體定位儀將撞擊頭對準顯露的脊髓區域正中，調節對應撞擊高度，撥動撞擊開關，撞擊頭精確撞擊 T10 節段脊髓后迅速抬起，可見硬脊膜下充血。移去撞擊器，逐層縫合。急性 SCI 模型造模成功標準：撞擊后可見大鼠痙攣性擺尾、雙后肢抽動；麻醉清醒后 BBB 評分<4 分。所有動物均造模成功。
術后每天按摩大鼠膀胱 2 次直至恢復反射性排尿功能；每天皮下注射慶大霉素（0.05 mL/200 g）1 次，共 7 d。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察實驗過程大鼠存活情況。
1.3.2 免疫熒光雙染色觀測
造模后 12、24 h 以及 3、7、28 d 各組取 4 只大鼠，腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉（60 mg/kg）深度麻醉后，置于冰上，經主動脈灌注冰 PBS 溶液至右心耳流出液清亮后，改為 4% 多聚甲醛灌注，直至大鼠四肢肌肉抽動、尾巴翹起。冰上操作，以損傷區域為中心截取 1 cm 長脊髓組織，置于 4% 多聚甲醛 6 h 后，轉至 30% 蔗糖溶液、4℃ 過夜。常規脫水、透明、浸蠟、包埋及連續縱向切片（片厚 5 μm）。
各時間點檢測微血管密度及炎癥反應相關指標 RECA1 和 CD68，造模后 28 d 觀察神經軸突及膠質細胞改變指標 NF-H 及 GFAP。具體操作：取部分石蠟切片脫蠟至水、抗原修復、自發熒光淬滅、血清封閉后，滴加一抗 RECA1（1∶100）、CD68（1∶200）、NF-H（1∶100）、GFAP（1∶500），4℃ 孵育過夜；滴加相應二抗（1∶500），避光室溫孵育 50 min。最后滴加 DAPI 染液復染細胞核，避光室溫孵育 10 min 后封片、采集圖像。
免疫熒光圖像定量分析：將脊髓組織連續縱向切片編號 1～80 號，于 36～60 號切片按編號每 5 張選擇 1 張進行觀察。每張選中切片脊髓損傷部位隨機選擇 3 個 200 μm×200 μm 大小區域進行觀察和分析。使用 Fiji image J 軟件調節圖像達到陽性顆粒最佳適配，軟件記錄并自動計算陽性面積，結果以陽性面積占總面積的百分比（陽性面積比）表示，定量分析 RECA1 和 CD68 的表達。
1.3.3 ELISA 檢測脊髓 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平
造模后 12 h、24 h 及 3 d，各組取 3 只大鼠，同 1.3.2 方法處理后，以損傷區域為中心截取 0.6 cm 長脊髓組織。將組織置于 4℃ 裂解緩沖液中制備 10% 組織勻漿，以 1 500×g 離心 10 min。取上清液，參照 ELISA 試劑盒說明書檢測。采用酶標儀于 450 nm 處測量吸光度（A）值，根據標準品濃度和 A 值繪制標準曲線，標準曲線方程計算樣本濃度，結果以每毫克總蛋白中的目的蛋白量表示。實驗重復 3 次。
1.3.4 組織學觀察
造模后 12、24 h 以及 3、7、28 d 各組取 1.3.2 制備的部分切片行常規 HE 染色，光鏡下觀察脊髓組織結構完整性，出血、水腫及炎癥細胞浸潤情況。取 28 d 切片行尼氏體染色，切片常規脫蠟至水，浸入甲苯胺藍溶液 5 min，0.1% 冰醋酸快速分化 1 s，自來水洗終止反應。光鏡下控制分化程度至尼氏體呈深藍色顆粒、背景呈淺藍色。切片置于烤箱烤干，二甲苯透明 10 min，中性樹膠封片，光鏡下觀察神經元及其尼氏體大小、形態、著色及數量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方法分析，兩兩比較采用 LSD 法。組內 RECA1 與 CD68 表達相關性分析采用 Pearson 相關。微血管密度（RECA1）與炎癥因子（TNF-α、IL-1β 和 IL-6）水平作 Spearman 秩相關性分析，其中微血管密度以 RECA1 陽性面積比定量數值為依據，計算各組造模后 12、24 h 及 7 d 均值，并按照從小到大轉換成等級資料，微血管密度等級以 +、++、+++、++++ 表示。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗期間，中、重度損傷組各有 1、3 只大鼠因腹脹或感染死亡，均予以補充；其余大鼠均存活至實驗完成。
2.2 免疫熒光雙染色觀測
2.2.1 微血管密度及炎癥反應相關指標
① 免疫熒光染色顯示，假手術組各時間點在 SCI 相應區域僅見 RECA1 和 CD68 微弱表達。輕、中、重度損傷組 SCI 后 12 h 時均可見明顯的 RECA1 和 CD68 表達，隨時間推移，上述指標表達逐漸增強，其中 RECA1 于 7 d 時表達最強，CD68 于 24 h 時表達最強，之后表達逐漸減弱。見圖 1。
圖1
各組 RECA1（綠色）和 CD68（紅色）免疫熒光雙染色觀察 （正置熒光顯微鏡×40）
a. 假手術組術后 24 h；b. 輕度損傷組術后 12 h；c. 輕度損傷組術后 7 d；d. 中度損傷組術后 12 h；e. 中度損傷組術后 7 d；f. 重度損傷組術后 12 h；g. 重度損傷組術后 7 d
Figure1. DIF staining for RECA1 (green) and CD68 (red) in 4 groups (Fluorescence miroscopy×40)a. Sham group at 24 hours; b. Mild group at 12 hours; c. Mild group at 7 days; d. Moderate group at 12 hours; e. Moderate group at 7 days; f. Severe group at 12 hours; g. Severe group at 7 days
② 定量分析顯示，RECA1 陽性面積比中度損傷組最大，之后依次為輕度損傷組、重度損傷組，假手術組最小；各時間點組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。CD68 陽性面積比重度損傷組最大，之后依次為中度損傷組、輕度損傷組，假手術組最小。除 24 h、28 d 輕度損傷組和中度損傷組比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
免疫熒光定量分析各組 RECA1 和 CD68 陽性面積比（n=4，
，%）
Table1.
Immunofluorescent staining analysis for the ratios of RECA1 and CD68 positive areas in SCI regions (n=4, 
, %)
相關性分析顯示，各時間點假手術組 RECA1 和 CD68 表達無相關（P>0.05）。SCI 后 12、24 h，輕、中度損傷組 RECA1 和 CD68 表達成正相關（P<0.05），重度損傷組二者無相關（P>0.05）。3 d 時，輕、中、重度損傷組 RECA1 和 CD68 表達均無相關（P>0.05）。7 d 時，輕、中度損傷組 RECA1 和 CD68 表達成負相關（P<0.05），重度損傷組二者無相關性（P=0.153）；28 d 時各損傷組 RECA1 和 CD68 表達均成負相關（P<0.05）。見表 2。
表2
各時間點各組 RECA1 和 CD68 表達相關性分析
Table2.
Correlation analysis of RECA1 and CD68 expressions at different time points
2.2.2 神經軸突及膠質細胞改變相關指標
免疫熒光染色顯示，造模后 28 d 假手術組 SCI 相應區域 NF-H 染色陽性軸突呈連續性的細長條狀結構，GFAP 染色陽性的星形膠質細胞可見多個長而分支的突起，呈放射狀，另可見大量星形膠質細胞與軸突交錯排列，形態規則；輕度損傷組可見星形膠質細胞增生，膠質瘢痕致密，而軸突連續性中斷，形態短縮呈粗點狀甚至融合成團，軸突較假手術組減少；中度損傷組星形膠質細胞突起變短，數量減少，形態不規則，軸突除類似輕度損傷組的改變外，數量明顯減少；重度損傷組由于大量組織空洞形成，星形膠質細胞最少，膠質瘢痕致密，在損傷區域 NF-H 染色陽性的軸突稀少，未見連續性軸突存在。見圖 2。
圖2
造模后 28 d 各組 NF-H（紅色）和 GFAP（綠色）免疫熒光雙染色觀察（正置熒光顯微鏡×20）
a. 假手術組；b. 輕度損傷組；c. 中度損傷組；d. 重度損傷組
Figure2. DIF staining for NF-H (red) and GFAP (green) at 28 days after SCI (Fluorescence microscopy×20)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
2.3 ELISA 檢測
假手術組各時間點 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均低于其他 3 組，差異有統計學意義（P<0.05）。中、重度損傷組 TNF-α 水平在 12 h 即達峰值，其余各組各炎癥因子水平均在 24 h 達峰值。除 12 h 時輕、中度損傷組 IL-1β 水平差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點各組炎癥因子水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
ELISA 檢測各組 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平
a. TNF-α；b. IL-1β；c. IL-6
Figure3. TNF-α, IL-1β, and IL-6 levels in 4 groups detected by ELISA assaya. TNF-α; b. IL-1β; c. IL-6
基于 RECA1 陽性面積比定量數據，假手術組以及輕、中、重度損傷組 RECA1 陽性面積比均值依次為 1.34%、4.78%、7.22% 和 3.71%，微血管密度等級依次為 +、+++、++++ 和 ++，與 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平分別作秩相關性分析。結果表明，脊髓勻漿中 TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平與 SCI 區域微血管密度均成弱相關（r=0.412，P=0.000；r=0.416，P=0.000；r=0.382，P=0.000）。
2.4 組織學觀察
2.4.1 HE 染色
各時間點假手術組脊髓形態正常，組織致密有序，灰、白質界限清楚，神經元外形規則、飽滿、細胞核清晰。SCI 后 12 h，隨損傷程度增加，脊髓腫脹、內出血及炎癥細胞浸潤逐級加重，灰、白質界限模糊，神經元胞體皺縮、細胞核碎裂甚至崩解消失；各損傷組隨時間推移，組織腫脹、出血逐步加重，尤其重度損傷組大面積組織空洞出現，神經元消失。各損傷組 SCI 后 3、7 d，脊髓內紅細胞、炎癥細胞浸潤逐漸減少，至 28 d 時表現為不同程度神經元殘留及空洞形成，損傷程度越重，組織破壞越明顯，空洞越大；各組紅細胞及炎癥細胞均少見。見圖 4。
圖4
造模后 12 h 各組 HE 染色觀察（×10）
a. 假手術組；b. 輕度損傷組；c. 中度損傷組；d. 重度損傷組
Figure4. HE staining for tissue structures in 4 groups at 12 hours after SCI (×10)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
2.4.2 尼氏體染色
造模后 28 d SCI 區域尼氏體染色顯示，假手術組呈多邊形或梭形的正常神經元，尼氏體呈藍染、斑塊狀；輕度損傷組神經元減少，胞體縮小，尼氏體染色變淺、部分融合；中度損傷組上述病理改變加重；而重度損傷組極少見正常神經元結構，胞體縮小、分解，核固縮、崩裂，尼氏體完全融合甚至溶解。見圖 5。
圖5
造模后 28 d 各組尼氏體染色觀察（×40）
a. 假手術組；b. 輕度損傷組；c. 中度損傷組；d. 重度損傷組
Figure5. Nissl’s staining for neurons in 4 groups at 28 days after SCI (×40)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
3 討論
SCI 后脊髓微血管的結構和功能會出現迅速且永久的改變，包括微循環喪失、血-脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）破壞、內皮細胞死亡和血管重塑[10]。這些改變加劇了脊髓繼發性損害的程度，尤其是 BSCB 破壞，炎癥細胞進入脊髓實質，加劇了炎癥反應的程度。另外，內皮細胞死亡加劇血管網惡化，神經元及其他細胞因缺血而凋亡、壞死[11-12]。本研究中，我們應用 RECA1 作為血管內皮細胞的標記物，它不僅能顯示受損塌陷的血管，還能顯示血管萌芽及早期的內皮細胞遷移，可充分展現 SCI 后局部微血管密度的動態變化[13-14]。造模后 12 h，SCI 區域即可觀察到 RECA1 陽性的內皮細胞表達增加，這可能與內皮細胞早期遷移有關[15]。本研究結果表明，不論何種程度的 SCI 均可啟發自身的血管再生修復機制，但程度不同。分析原因可能為：① SCI 在一定程度之內，自身血管新生重建隨著致傷程度加重而增加；② SCI 程度超過機體自我修復能力之外時，組織結構極大破壞，血管新生遭受明顯抑制。損傷后期隨著脊髓內空洞形成及血管網重構結束，增生的血管因重塑而吸收減少，這與我們之前報道的脊髓半切模型的血管研究結果類似[16]。
炎癥是免疫系統對創傷的反應，可在損傷數分鐘內開始，持續數天、數月甚至更久。神經炎癥在脊髓繼發性損傷中的作用是雙刃劍，既通過支持神經再生獲益，也會放大局部破壞作用產生危害[17]。SCI 后小膠質細胞被激活，釋放趨化因子、細胞因子和其他炎癥介質，募集外周血中的中性粒細胞和巨噬細胞進入損傷區域。而活化的小膠質細胞在形態和功能上均與循環血中的巨噬細胞類似[18-19]。巨噬細胞在微環境中通過釋放蛋白水解酶、活性氧和炎癥因子（包括 INF、TNF 和其他炎癥介質等）加重炎癥損傷，也發揮清除細胞碎片、細胞重塑和產生促再生因子的功能[20]。本研究選擇 CD68 作為觀察炎癥反應的標記物，可顯示活化的小膠質細胞和巨噬細胞[21]。CD68 表達分析表明，SCI 后各組炎癥反應隨時間延長發生變化，造模后 24 h 是細胞表達的高峰；且小膠質細胞活化/巨噬細胞浸潤程度與 SCI 程度大致平行，即損傷程度越重，炎癥反應越劇烈。ELISA 測定的炎癥因子水平證實了炎癥反應與損傷程度的平行關系。
相關性分析揭示了不同程度 SCI 后血管重構與炎癥反應之間均有內在規律可循。TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均與 SCI 區域微血管密度存在相關關系；CD68 與 RECA1 表達的相關分析展現了具體的關聯細節。SCI 后 12、24 h，輕、中度損傷組新生血管越豐富，則可見越多的炎癥細胞浸潤，提示損傷急性期，內皮細胞遷移可帶來大量炎癥細胞浸潤。而重度損傷組二者無明顯相關性。這種現象可能與重度 SCI 造成血管新生障礙，且 BSCB 破壞，大量炎癥細胞浸潤有關。SCI 后 7、28 d，除 7 d 時重度損傷組外，均可見局部新生血管越豐富、炎癥細胞浸潤越少。究其原因，可能為 SCI 后期血管重構完畢，豐富的血管有助于清除巨噬細胞吞噬的細胞碎片及組織殘渣。而血管重構與炎癥反應作為相互關聯、相互影響的兩個方面，上述結果亦可反映炎癥反應對血管新生的作用。據報道，炎癥反應對血管新生的作用是雙向的[22]。巨噬細胞及其他炎癥細胞可釋放促血管相關細胞因子，如 VEGF 對血管內皮細胞遷移、重組起促進作用，我們的研究結果亦提示在輕、中度 SCI 模型中，可見到血管密度隨著損傷程度上升而增加；而重度的炎癥反應則抑制血管新生，這可能與炎癥介質過度釋放，大量組織細胞凋亡、崩解，微血管阻塞有關，同時早期的內皮細胞遷移受到抑制[23]。重度損傷模型中，反而見到比輕、中度損傷更低的微血管密度。掌握以上血管新生、重構與炎癥反應之間的關系，可為以微血管或炎癥反應為靶點的 SCI 研究提供參考，如微血管干預中出現過激的炎癥表現，或炎癥干預中出現微血管新生遲緩，則提示干預措施未達預期。
血管新生速度、炎癥反應程度及其相關關系，均對 SCI 遠期的神經組織完整性和神經纖維束的連續性造成直接影響。血管重構過程越快完善，對炎癥反應的抑制作用越明顯，炎癥損害程度越輕微，相應的組織修復能力就越強；另一方面，炎癥反應輕微，血管網的損害程度越低，即使局部微血管密度不大，組織結構也能得到較好保留，表現為膠質瘢痕生長受到遏制，軸突連續性恢復，空洞形成較小[24]。組織學分析表明，SCI 后脊髓組織結構的破壞與損傷程度相關，早期表現為組織腫脹、局部出血和炎癥細胞浸潤，后期表現為組織空洞形成，尤其在重度損傷組，灰/白質界限完全消失，幾乎不可見正常的神經元結構。另外，重度損傷組大量組織空洞形成，膠質瘢痕致密，軸突稀少，未見連續性軸突結構存在。組織學研究提示，輕度損傷的 SCI 有部分自主修復能力，而重度損傷 SCI 由于脊髓組織的大量破壞和神經元、軸突廣泛壞死及致密膠質瘢痕的形成，嚴重阻礙自主神經修復。因此，SCI 研究選擇損傷程度時，可以充分考慮上述結果，例如重度 SCI 可能導致不可逆的損傷，從而使干預治療措施產生假陰性結果。
作者貢獻：許子星負責實驗設計、實施、數據收集分析及論文撰寫；許衛紅對文章的知識性內容作批評性審閱；陳薛敏、周亦楠參與研究實施過程，包括動物實驗、標本取材及檢測。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經福建醫科大學實驗動物倫理委員會批準（FJMU IACUC 2018-046）。實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2016-0006。
急性脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后，微血管破裂、神經元損害、脫髓鞘改變會引發一系列病理過程，包括炎癥細胞浸潤、炎癥介質釋放和膠質瘢痕形成等，從而抑制組織再生和功能恢復[1-2]。微血管網破壞和炎癥反應是 SCI 病理過程中至關重要的兩個環節。一項基于自身免疫性脊髓炎動物模型的研究發現，新生血管環繞炎癥反應區域，隨后鄰近血管的皮質脊髓束纖維萌生[3]。這一現象提示微血管網破壞及炎癥反應兩種病理狀態相互關聯，是 SCI 后干預治療的重要靶點。研究證實，微血管在 SCI 后 3 d 內即出現于損傷區域，其密度峰值可達正常的 5 倍以上[4]。普遍認為，內皮細胞可作為吞噬細胞吞噬大顆粒、髓鞘碎片和凋亡細胞等，有助于清除蓄積物而減輕炎癥反應。換句話說，一方面微循環障礙是炎癥性損害加劇的誘因；另一方面，過度的炎癥性損害是阻礙微循環重建的不利因素，二者互為因果，惡性循環終致神經修復障礙和功能喪失[3, 5]。
研究表明，促進微血管網重建，既有望抑制炎癥反應，又有利于神經修復[6]。因此揭示微血管重構的動態過程與炎癥反應之間的關系，有助于理解 SCI 后極其復雜的病理過程，對 SCI 精準治療具有重要意義。我們前期研究證實，以改善血管重構為目的的治療能夠減少炎癥細胞浸潤，促進軸突再生及功能恢復[7]。然而，SCI 發生后，微血管網破壞及重建的動態過程，及其與炎癥反應、炎癥因子表達的關系尚無深入研究報道。以此為切入點，本研究擬探索不同程度 SCI 后損傷區域微血管密度變化趨勢，及其與炎癥指標相關關系，研究微血管重構、炎癥反應與脊髓組織結構變化轉歸的關系，旨在為 SCI 研究提供一個血管-炎癥模型，為動物造模和靶點治療提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年雌性 SD 大鼠 116 只，體質量 230～250 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠抗大鼠內皮細胞抗原 1（rat endothelial cell antigen 1，RECA1）抗體、兔抗 CD68 抗體、小鼠抗神經微絲（neurofilament-H，NF-H）抗體、兔抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（Abcam 公司，美國）；Alexa568/Alexa488 山羊抗小鼠（或兔）熒光二抗（Invitrogen 公司，美國）；TNF-α、IL-1β、IL-6 的 ELISA 試劑盒（Cusabio 公司，美國）；甲苯胺藍染液（武漢賽維爾生物技術有限公司）。
MASCIS Impactor-Ⅲ 脊髓撞擊器（紐約大學 W.M.Keck 神經科學研究中心，美國）。全自動酶聯免疫吸附分析儀（BioTek 公司，美國）；正置熒光顯微鏡及 DS-U3 成像系統（Nikon 公司，日本）；切片掃描及 Caseviewer2.0 成像系統（Pannoramic 250；3D HISTECH 公司，匈牙利）；Fiji image J 軟件（美國國立衛生研究院）。
1.2 實驗分組及方法
將 116 只大鼠隨機分為 4 組，每組 29 只。假手術組僅切除椎板暴露脊髓，不進行撞擊；輕度損傷組以 12.5 mm 高度撞擊脊髓；中度損傷組以 25.0 mm 高度撞擊脊髓；重度損傷組以 50.0 mm 高度撞擊脊髓[8-9]。
各組大鼠采用腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉（30～40 mg/kg）麻醉后，背部常規消毒、鋪巾。以 T9～11 棘突為中心，縱向切開長約 3 cm 皮膚，分離背部肌肉，暴露 T9～11 椎板及棘突。用顯微咬骨鉗咬除 T9～11 椎體棘突，咬除 T10 全椎板，充分暴露脊髓。假手術組直接縫合切口，輕、中、重度損傷組采用 MASCIS Impactor-Ⅲ脊髓撞擊器制備大鼠急性 SCI 模型。連接及調試脊髓撞擊器，選用質量為 10 g、直徑 2.5 mm 的圓形撞擊頭，調整立體定位儀將撞擊頭對準顯露的脊髓區域正中，調節對應撞擊高度，撥動撞擊開關，撞擊頭精確撞擊 T10 節段脊髓后迅速抬起，可見硬脊膜下充血。移去撞擊器，逐層縫合。急性 SCI 模型造模成功標準：撞擊后可見大鼠痙攣性擺尾、雙后肢抽動；麻醉清醒后 BBB 評分<4 分。所有動物均造模成功。
術后每天按摩大鼠膀胱 2 次直至恢復反射性排尿功能；每天皮下注射慶大霉素（0.05 mL/200 g）1 次，共 7 d。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察實驗過程大鼠存活情況。
1.3.2 免疫熒光雙染色觀測
造模后 12、24 h 以及 3、7、28 d 各組取 4 只大鼠，腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉（60 mg/kg）深度麻醉后，置于冰上，經主動脈灌注冰 PBS 溶液至右心耳流出液清亮后，改為 4% 多聚甲醛灌注，直至大鼠四肢肌肉抽動、尾巴翹起。冰上操作，以損傷區域為中心截取 1 cm 長脊髓組織，置于 4% 多聚甲醛 6 h 后，轉至 30% 蔗糖溶液、4℃ 過夜。常規脫水、透明、浸蠟、包埋及連續縱向切片（片厚 5 μm）。
各時間點檢測微血管密度及炎癥反應相關指標 RECA1 和 CD68，造模后 28 d 觀察神經軸突及膠質細胞改變指標 NF-H 及 GFAP。具體操作：取部分石蠟切片脫蠟至水、抗原修復、自發熒光淬滅、血清封閉后，滴加一抗 RECA1（1∶100）、CD68（1∶200）、NF-H（1∶100）、GFAP（1∶500），4℃ 孵育過夜；滴加相應二抗（1∶500），避光室溫孵育 50 min。最后滴加 DAPI 染液復染細胞核，避光室溫孵育 10 min 后封片、采集圖像。
免疫熒光圖像定量分析：將脊髓組織連續縱向切片編號 1～80 號，于 36～60 號切片按編號每 5 張選擇 1 張進行觀察。每張選中切片脊髓損傷部位隨機選擇 3 個 200 μm×200 μm 大小區域進行觀察和分析。使用 Fiji image J 軟件調節圖像達到陽性顆粒最佳適配，軟件記錄并自動計算陽性面積，結果以陽性面積占總面積的百分比（陽性面積比）表示，定量分析 RECA1 和 CD68 的表達。
1.3.3 ELISA 檢測脊髓 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平
造模后 12 h、24 h 及 3 d，各組取 3 只大鼠，同 1.3.2 方法處理后，以損傷區域為中心截取 0.6 cm 長脊髓組織。將組織置于 4℃ 裂解緩沖液中制備 10% 組織勻漿，以 1 500×g 離心 10 min。取上清液，參照 ELISA 試劑盒說明書檢測。采用酶標儀于 450 nm 處測量吸光度（A）值，根據標準品濃度和 A 值繪制標準曲線，標準曲線方程計算樣本濃度，結果以每毫克總蛋白中的目的蛋白量表示。實驗重復 3 次。
1.3.4 組織學觀察
造模后 12、24 h 以及 3、7、28 d 各組取 1.3.2 制備的部分切片行常規 HE 染色，光鏡下觀察脊髓組織結構完整性，出血、水腫及炎癥細胞浸潤情況。取 28 d 切片行尼氏體染色，切片常規脫蠟至水，浸入甲苯胺藍溶液 5 min，0.1% 冰醋酸快速分化 1 s，自來水洗終止反應。光鏡下控制分化程度至尼氏體呈深藍色顆粒、背景呈淺藍色。切片置于烤箱烤干，二甲苯透明 10 min，中性樹膠封片，光鏡下觀察神經元及其尼氏體大小、形態、著色及數量。
1.4 統計學方法
采用 SPSS19.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方法分析，兩兩比較采用 LSD 法。組內 RECA1 與 CD68 表達相關性分析采用 Pearson 相關。微血管密度（RECA1）與炎癥因子（TNF-α、IL-1β 和 IL-6）水平作 Spearman 秩相關性分析，其中微血管密度以 RECA1 陽性面積比定量數值為依據，計算各組造模后 12、24 h 及 7 d 均值，并按照從小到大轉換成等級資料，微血管密度等級以 +、++、+++、++++ 表示。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗期間，中、重度損傷組各有 1、3 只大鼠因腹脹或感染死亡，均予以補充；其余大鼠均存活至實驗完成。
2.2 免疫熒光雙染色觀測
2.2.1 微血管密度及炎癥反應相關指標
① 免疫熒光染色顯示，假手術組各時間點在 SCI 相應區域僅見 RECA1 和 CD68 微弱表達。輕、中、重度損傷組 SCI 后 12 h 時均可見明顯的 RECA1 和 CD68 表達，隨時間推移，上述指標表達逐漸增強，其中 RECA1 于 7 d 時表達最強，CD68 于 24 h 時表達最強，之后表達逐漸減弱。見圖 1。
圖1
各組 RECA1（綠色）和 CD68（紅色）免疫熒光雙染色觀察 （正置熒光顯微鏡×40）
a. 假手術組術后 24 h；b. 輕度損傷組術后 12 h；c. 輕度損傷組術后 7 d；d. 中度損傷組術后 12 h；e. 中度損傷組術后 7 d；f. 重度損傷組術后 12 h；g. 重度損傷組術后 7 d
Figure1. DIF staining for RECA1 (green) and CD68 (red) in 4 groups (Fluorescence miroscopy×40)a. Sham group at 24 hours; b. Mild group at 12 hours; c. Mild group at 7 days; d. Moderate group at 12 hours; e. Moderate group at 7 days; f. Severe group at 12 hours; g. Severe group at 7 days
② 定量分析顯示，RECA1 陽性面積比中度損傷組最大，之后依次為輕度損傷組、重度損傷組，假手術組最小；各時間點組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。CD68 陽性面積比重度損傷組最大，之后依次為中度損傷組、輕度損傷組，假手術組最小。除 24 h、28 d 輕度損傷組和中度損傷組比較差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點各組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
免疫熒光定量分析各組 RECA1 和 CD68 陽性面積比（n=4，，%）
Table1.
Immunofluorescent staining analysis for the ratios of RECA1 and CD68 positive areas in SCI regions (n=4, , %)
相關性分析顯示，各時間點假手術組 RECA1 和 CD68 表達無相關（P>0.05）。SCI 后 12、24 h，輕、中度損傷組 RECA1 和 CD68 表達成正相關（P<0.05），重度損傷組二者無相關（P>0.05）。3 d 時，輕、中、重度損傷組 RECA1 和 CD68 表達均無相關（P>0.05）。7 d 時，輕、中度損傷組 RECA1 和 CD68 表達成負相關（P<0.05），重度損傷組二者無相關性（P=0.153）；28 d 時各損傷組 RECA1 和 CD68 表達均成負相關（P<0.05）。見表 2。
表2
各時間點各組 RECA1 和 CD68 表達相關性分析
Table2.
Correlation analysis of RECA1 and CD68 expressions at different time points
2.2.2 神經軸突及膠質細胞改變相關指標
免疫熒光染色顯示，造模后 28 d 假手術組 SCI 相應區域 NF-H 染色陽性軸突呈連續性的細長條狀結構，GFAP 染色陽性的星形膠質細胞可見多個長而分支的突起，呈放射狀，另可見大量星形膠質細胞與軸突交錯排列，形態規則；輕度損傷組可見星形膠質細胞增生，膠質瘢痕致密，而軸突連續性中斷，形態短縮呈粗點狀甚至融合成團，軸突較假手術組減少；中度損傷組星形膠質細胞突起變短，數量減少，形態不規則，軸突除類似輕度損傷組的改變外，數量明顯減少；重度損傷組由于大量組織空洞形成，星形膠質細胞最少，膠質瘢痕致密，在損傷區域 NF-H 染色陽性的軸突稀少，未見連續性軸突存在。見圖 2。
圖2
造模后 28 d 各組 NF-H（紅色）和 GFAP（綠色）免疫熒光雙染色觀察（正置熒光顯微鏡×20）
a. 假手術組；b. 輕度損傷組；c. 中度損傷組；d. 重度損傷組
Figure2. DIF staining for NF-H (red) and GFAP (green) at 28 days after SCI (Fluorescence microscopy×20)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
2.3 ELISA 檢測
假手術組各時間點 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均低于其他 3 組，差異有統計學意義（P<0.05）。中、重度損傷組 TNF-α 水平在 12 h 即達峰值，其余各組各炎癥因子水平均在 24 h 達峰值。除 12 h 時輕、中度損傷組 IL-1β 水平差異無統計學意義（P>0.05）外，其余各時間點各組炎癥因子水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖 3。
圖3
ELISA 檢測各組 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平
a. TNF-α；b. IL-1β；c. IL-6
Figure3. TNF-α, IL-1β, and IL-6 levels in 4 groups detected by ELISA assaya. TNF-α; b. IL-1β; c. IL-6
基于 RECA1 陽性面積比定量數據，假手術組以及輕、中、重度損傷組 RECA1 陽性面積比均值依次為 1.34%、4.78%、7.22% 和 3.71%，微血管密度等級依次為 +、+++、++++ 和 ++，與 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平分別作秩相關性分析。結果表明，脊髓勻漿中 TNF-α、IL-1β、IL-6 表達水平與 SCI 區域微血管密度均成弱相關（r=0.412，P=0.000；r=0.416，P=0.000；r=0.382，P=0.000）。
2.4 組織學觀察
2.4.1 HE 染色
各時間點假手術組脊髓形態正常，組織致密有序，灰、白質界限清楚，神經元外形規則、飽滿、細胞核清晰。SCI 后 12 h，隨損傷程度增加，脊髓腫脹、內出血及炎癥細胞浸潤逐級加重，灰、白質界限模糊，神經元胞體皺縮、細胞核碎裂甚至崩解消失；各損傷組隨時間推移，組織腫脹、出血逐步加重，尤其重度損傷組大面積組織空洞出現，神經元消失。各損傷組 SCI 后 3、7 d，脊髓內紅細胞、炎癥細胞浸潤逐漸減少，至 28 d 時表現為不同程度神經元殘留及空洞形成，損傷程度越重，組織破壞越明顯，空洞越大；各組紅細胞及炎癥細胞均少見。見圖 4。
圖4
造模后 12 h 各組 HE 染色觀察（×10）
a. 假手術組；b. 輕度損傷組；c. 中度損傷組；d. 重度損傷組
Figure4. HE staining for tissue structures in 4 groups at 12 hours after SCI (×10)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
2.4.2 尼氏體染色
造模后 28 d SCI 區域尼氏體染色顯示，假手術組呈多邊形或梭形的正常神經元，尼氏體呈藍染、斑塊狀；輕度損傷組神經元減少，胞體縮小，尼氏體染色變淺、部分融合；中度損傷組上述病理改變加重；而重度損傷組極少見正常神經元結構，胞體縮小、分解，核固縮、崩裂，尼氏體完全融合甚至溶解。見圖 5。
圖5
造模后 28 d 各組尼氏體染色觀察（×40）
a. 假手術組；b. 輕度損傷組；c. 中度損傷組；d. 重度損傷組
Figure5. Nissl’s staining for neurons in 4 groups at 28 days after SCI (×40)a. Sham group; b. Mild group; c. Moderate group; d. Severe group
3 討論
SCI 后脊髓微血管的結構和功能會出現迅速且永久的改變，包括微循環喪失、血-脊髓屏障（blood-spinal cord barrier，BSCB）破壞、內皮細胞死亡和血管重塑[10]。這些改變加劇了脊髓繼發性損害的程度，尤其是 BSCB 破壞，炎癥細胞進入脊髓實質，加劇了炎癥反應的程度。另外，內皮細胞死亡加劇血管網惡化，神經元及其他細胞因缺血而凋亡、壞死[11-12]。本研究中，我們應用 RECA1 作為血管內皮細胞的標記物，它不僅能顯示受損塌陷的血管，還能顯示血管萌芽及早期的內皮細胞遷移，可充分展現 SCI 后局部微血管密度的動態變化[13-14]。造模后 12 h，SCI 區域即可觀察到 RECA1 陽性的內皮細胞表達增加，這可能與內皮細胞早期遷移有關[15]。本研究結果表明，不論何種程度的 SCI 均可啟發自身的血管再生修復機制，但程度不同。分析原因可能為：① SCI 在一定程度之內，自身血管新生重建隨著致傷程度加重而增加；② SCI 程度超過機體自我修復能力之外時，組織結構極大破壞，血管新生遭受明顯抑制。損傷后期隨著脊髓內空洞形成及血管網重構結束，增生的血管因重塑而吸收減少，這與我們之前報道的脊髓半切模型的血管研究結果類似[16]。
炎癥是免疫系統對創傷的反應，可在損傷數分鐘內開始，持續數天、數月甚至更久。神經炎癥在脊髓繼發性損傷中的作用是雙刃劍，既通過支持神經再生獲益，也會放大局部破壞作用產生危害[17]。SCI 后小膠質細胞被激活，釋放趨化因子、細胞因子和其他炎癥介質，募集外周血中的中性粒細胞和巨噬細胞進入損傷區域。而活化的小膠質細胞在形態和功能上均與循環血中的巨噬細胞類似[18-19]。巨噬細胞在微環境中通過釋放蛋白水解酶、活性氧和炎癥因子（包括 INF、TNF 和其他炎癥介質等）加重炎癥損傷，也發揮清除細胞碎片、細胞重塑和產生促再生因子的功能[20]。本研究選擇 CD68 作為觀察炎癥反應的標記物，可顯示活化的小膠質細胞和巨噬細胞[21]。CD68 表達分析表明，SCI 后各組炎癥反應隨時間延長發生變化，造模后 24 h 是細胞表達的高峰；且小膠質細胞活化/巨噬細胞浸潤程度與 SCI 程度大致平行，即損傷程度越重，炎癥反應越劇烈。ELISA 測定的炎癥因子水平證實了炎癥反應與損傷程度的平行關系。
相關性分析揭示了不同程度 SCI 后血管重構與炎癥反應之間均有內在規律可循。TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平均與 SCI 區域微血管密度存在相關關系；CD68 與 RECA1 表達的相關分析展現了具體的關聯細節。SCI 后 12、24 h，輕、中度損傷組新生血管越豐富，則可見越多的炎癥細胞浸潤，提示損傷急性期，內皮細胞遷移可帶來大量炎癥細胞浸潤。而重度損傷組二者無明顯相關性。這種現象可能與重度 SCI 造成血管新生障礙，且 BSCB 破壞，大量炎癥細胞浸潤有關。SCI 后 7、28 d，除 7 d 時重度損傷組外，均可見局部新生血管越豐富、炎癥細胞浸潤越少。究其原因，可能為 SCI 后期血管重構完畢，豐富的血管有助于清除巨噬細胞吞噬的細胞碎片及組織殘渣。而血管重構與炎癥反應作為相互關聯、相互影響的兩個方面，上述結果亦可反映炎癥反應對血管新生的作用。據報道，炎癥反應對血管新生的作用是雙向的[22]。巨噬細胞及其他炎癥細胞可釋放促血管相關細胞因子，如 VEGF 對血管內皮細胞遷移、重組起促進作用，我們的研究結果亦提示在輕、中度 SCI 模型中，可見到血管密度隨著損傷程度上升而增加；而重度的炎癥反應則抑制血管新生，這可能與炎癥介質過度釋放，大量組織細胞凋亡、崩解，微血管阻塞有關，同時早期的內皮細胞遷移受到抑制[23]。重度損傷模型中，反而見到比輕、中度損傷更低的微血管密度。掌握以上血管新生、重構與炎癥反應之間的關系，可為以微血管或炎癥反應為靶點的 SCI 研究提供參考，如微血管干預中出現過激的炎癥表現，或炎癥干預中出現微血管新生遲緩，則提示干預措施未達預期。
血管新生速度、炎癥反應程度及其相關關系，均對 SCI 遠期的神經組織完整性和神經纖維束的連續性造成直接影響。血管重構過程越快完善，對炎癥反應的抑制作用越明顯，炎癥損害程度越輕微，相應的組織修復能力就越強；另一方面，炎癥反應輕微，血管網的損害程度越低，即使局部微血管密度不大，組織結構也能得到較好保留，表現為膠質瘢痕生長受到遏制，軸突連續性恢復，空洞形成較小[24]。組織學分析表明，SCI 后脊髓組織結構的破壞與損傷程度相關，早期表現為組織腫脹、局部出血和炎癥細胞浸潤，后期表現為組織空洞形成，尤其在重度損傷組，灰/白質界限完全消失，幾乎不可見正常的神經元結構。另外，重度損傷組大量組織空洞形成，膠質瘢痕致密，軸突稀少，未見連續性軸突結構存在。組織學研究提示，輕度損傷的 SCI 有部分自主修復能力，而重度損傷 SCI 由于脊髓組織的大量破壞和神經元、軸突廣泛壞死及致密膠質瘢痕的形成，嚴重阻礙自主神經修復。因此，SCI 研究選擇損傷程度時，可以充分考慮上述結果，例如重度 SCI 可能導致不可逆的損傷，從而使干預治療措施產生假陰性結果。
作者貢獻：許子星負責實驗設計、實施、數據收集分析及論文撰寫；許衛紅對文章的知識性內容作批評性審閱；陳薛敏、周亦楠參與研究實施過程，包括動物實驗、標本取材及檢測。
利益沖突：所有作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程中不存在利益沖突。課題經費支持沒有影響文章觀點和對研究數據客觀結果的統計分析及其報道。
機構倫理問題：研究方案經福建醫科大學實驗動物倫理委員會批準（FJMU IACUC 2018-046）。實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2016-0006。
